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特開2023-142296新規化合物、質量分析用誘導体化用組成物、および質量分析用誘導体化用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023142296
(43)【公開日】2023-10-05
(54)【発明の名称】新規化合物、質量分析用誘導体化用組成物、および質量分析用誘導体化用キット
(51)【国際特許分類】
C07D 213/20 20060101AFI20230928BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20230928BHJP
【ＦＩ】
C07D213/20
G01N27/62 V
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022049128
(22)【出願日】2022-03-24
(71)【出願人】
【識別番号】000003182
【氏名又は名称】株式会社トクヤマ
(71)【出願人】
【識別番号】000004271
【氏名又は名称】日本電子株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】花澤 菜摘
(72)【発明者】
【氏名】菊池 重俊
(72)【発明者】
【氏名】松重 操
(72)【発明者】
【氏名】福沢 世傑
(72)【発明者】
【氏名】滝脇 正貴
【テーマコード（参考）】
2G041
4C055
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041GA09
4C055AA04
4C055AA13
4C055BA01
4C055CA01
4C055DA01
4C055DA06
4C055FA09
(57)【要約】
【課題】質量分析用誘導体化試薬として有用である新規化合物の提供。
【解決手段】本発明の新規化合物は、下記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩である。
【化１】
式中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表し、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表し、Ｘ－はハロゲンイオンを表し、ｍは１または２である。
【選択図】図２
【解決手段】本発明の新規化合物は、下記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩である。
【化１】
式中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表し、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表し、Ｘ－はハロゲンイオンを表し、ｍは１または２である。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩。
式中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表し、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表し、Ｘ－はハロゲンイオンを表し、ｍは１または２である。
【化1】
式中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表し、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表し、Ｘ－はハロゲンイオンを表し、ｍは１または２である。
【請求項2】
Ａｒが置換されていてもよい２価のフェニル基である、請求項１に記載の化合物またはそのハロゲン化水素塩。
【請求項3】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がいずれも水素原子である、請求項１または２に記載の化合物またはそのハロゲン化水素塩。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物またはそのハロゲン化水素塩を含む、質量分析用誘導体化用組成物。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物またはそのハロゲン化水素塩を含む、質量分析用誘導体化用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規化合物ならびに当該新規化合物を含む質量分析用誘導体化用組成物および質量分析用誘導体化用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
臨床検査において、生体成分の分析は疾患の診断または病態の解析を行う上で重要である。生体成分の分析方法の１つとして質量分析法（ＭＳ）が知られている。質量分析法は分析試料に含まれる微量成分を高感度に検出可能であるため、生体成分の分析に有用であることが知られている。また、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で分析試料を分離し、分離された成分をＭＳでイオン化して分析する液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）が生体成分の分析ツールとして使用されている。
【0003】
ＬＣ－ＭＳにおいて、分析試料のイオン化効率を高めて感度を向上させる点、または、構造解析を容易にする点等で、誘導体化試薬による分析試料の前処理が行われている。例えば、特許文献１および２ならびに非特許文献１および２には、ステロイドホルモンの誘導体化試薬としてジラール試薬が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１５／０２３３９５３号明細書
【特許文献2】欧州特許出願公開第２８９３３５５号明細書
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 924-935
【非特許文献2】Journal of Chromatography B, 1092, 2018. 106-113
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
分析対象試料の数に応じて、誘導体化試薬のアイソトポログを準備し、各分析対象試料の分析を同時に行うことがある。当該分析によりハイスループットである分析が可能となる。一方、特許文献１および２ならびに非特許文献１および２に開示されている誘導体化試薬のアイソトポログによりそれぞれ分析対象成分を誘導体化すると、得られたそれぞれの誘導体の分子構造が同一となり、ＬＣによる分離が困難となる。また、得られたそれぞれ誘導体の分子量も類似していることにより、ＭＳによる分析も困難となる。さらに、得られたそれぞれの誘導体のフラグメントイオンが同一となることによって、ＭＳ／ＭＳによる分析（タンデム質量分析）も困難である。
【0007】
また、特許文献１および２ならびに非特許文献１および２に開示されている誘導体化試薬のアイソトポログの合成にコストがかかる。さらに、当該アイソトポログのバリエーションが限定的である。したがって、ＬＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に有用である質量分析用誘導体化試薬のさらなる開発が望まれている。
【0008】
本発明の一態様は、質量分析用誘導体化試薬として有用である新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る新規化合物は、下記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩である。
式中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表し、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表し、Ｘ－はハロゲンイオンを表し、ｍは１または２である。
【化1】
式中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表し、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表し、Ｘ－はハロゲンイオンを表し、ｍは１または２である。
【0010】
本発明の一態様に係る新規化合物は、Ａｒが置換されていてもよい２価のフェニル基であってもよい。
【0011】
本発明の一態様に係る新規化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がいずれも水素原子であってもよい。
【0012】
本発明の一態様に係る質量分析用誘導体化用組成物は、上記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩を含む。
【0013】
本発明の一態様に係る質量分析用誘導体化用キットは、上記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩を含む。
【発明の効果】
【0014】
本発明の一態様によれば、質量分析用誘導体化試薬として有用である新規化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】誘導体化されたテストステロン標品の検量線を示すグラフである。
【図2】実施例および対照の組成物によって誘導体化されたテストステロンのＳＲＭクロマトグラムである。
【図3】実施例および対照の組成物によって誘導体化されたテストステロンのＭＳクロマトグラムにおける面積値の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書において「Ａ～Ｂ」とは、特に指定しない限りＡ以上Ｂ以下であることを示している。
【0017】
本明細書において、「誘導体化」とは、分析対象成分に誘導体化試薬である化合物を付加することによって誘導体を形成させることを意味する。また、本明細書において、「誘導体」とは、分析対象成分に誘導体化試薬が付加されて形成する化合物を意味する。
【0018】
また、本明細書において、「アイソトポログ」とは、同位体組成のみ異なる複数の分子種を意味する。すなわち、同一化学組成を有するが、同位体の量が異なることにより分子量の異なる複数の分子種を意味する。
【0019】
〔新規化合物〕
本発明の一態様に係る新規化合物は、下記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩である。式（１）で示される化合物のハロゲン化水素塩の例として、当該化合物の塩化水素塩、臭化水素塩またはヨウ化水素塩等が挙げられる。
本発明の一態様に係る新規化合物は、下記式（１）で示される化合物またはそのハロゲン化水素塩である。式（１）で示される化合物のハロゲン化水素塩の例として、当該化合物の塩化水素塩、臭化水素塩またはヨウ化水素塩等が挙げられる。
【化2】
【0020】
式（１）中、Ａｒは置換されていてもよい２価のアリール基を表す。当該置換されていてもよい２価のアリール基における置換基としては、炭素数１～６の直鎖状、分岐状または環状のアルキル基、炭素数１～６の直鎖状、分岐状または環状のアルコキシ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。これら置換基は複数あってもよい。
【0021】
原料の入手の容易さや合成の容易さの点で、当該アリール基としては、無置換あるいは炭素数１～６のアルコキシ基またはハロゲン原子で置換されていることが好ましく、無置換あるいは炭素数１～６のアルコキシ基で置換されていることがより好ましく、無置換であるのが最も好ましい。また、アルキル基やアルコキシ基である場合には、直鎖状または分枝状であることが好ましく、直鎖状であることがより好ましい。
また、原料の入手の容易さの点で、当該２価のアリール基は２価のフェニル基であることが好ましい。
また、原料の入手の容易さの点で、当該２価のアリール基は２価のフェニル基であることが好ましい。
【0022】
特に好ましいＡｒは、無置換あるいは炭素数１～６の直鎖状または分枝状のアルコキシ基で置換されたフェニル基であり、さらに好ましくは無置換あるいは炭素数１～６の直鎖状のアルコキシ基で置換されたフェニル基であり、最も好ましくは無置換のフェニル基である。
【0023】
Ａｒの種類および置換基は、ＬＣの分離性、ＭＳでの選択性、および、ＭＳ／ＭＳで分析するフラグメントイオンの構造に寄与する。よって、Ａｒの置換基（種類または数）が異なる複数の新規化合物を後述する質量分析用誘導体化試薬として使用することによって、複数のそれぞれの分析対象試料で形成される誘導体の分子構造および物性が異なる。したがって、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による各誘導体の分離が可能になる。また、各誘導体の分子量が異なることによって、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による各誘導体の分析が可能になる。さらに、各誘導体のフラグメントイオンも異なることによって、ＭＳ／ＭＳによる各誘導体の分析も可能となる。
【0024】
式（１）中、Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基またはアルコキシ基を表す。当該アルキル基またはアルコキシ基は鎖状、分枝状、環状のいずれでもよい。Ｒ１～Ｒ５の例としてアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基等の直鎖状アルキル基、１－メチルエチル基、１－メチルプロピル基等の分岐状アルキル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基が挙げられる。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基およびｎ－ヘキシルオキシ基等の直鎖状アルキル基、１－メチルエトキシ基、１－メチルプロピルオキシ基等の分岐状アルキル基、シクロプロピルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等の環状アルキル基が挙げられる。
【0025】
合成の容易さの点で、Ｒ１～Ｒ５がアルキル基またはアルコキシ基である場合には、直鎖状のものであることが好ましい。また、同じ理由で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はいずれも水素原子であることが好ましい。さらにその際、Ｒ３は水素原子または炭素数１～６のアルキル基であることが好ましく、水素原子または炭素数１～４のアルキル基であることがより好ましい。
【0026】
Ｒ１～Ｒ５は、ＬＣの分離性およびＭＳでの選択性に寄与する。Ｒ１～Ｒ５の少なくとも１つの置換基が異なる複数の新規化合物を後述する質量分析用誘導体化試薬として使用することによって、複数のそれぞれの分析対象試料で形成される誘導体の分子構造および物性が異なる。したがって、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による各誘導体の分離が可能になる。また、各誘導体の分子量が異なることによって、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による各誘導体の分析が可能になる。
【0027】
式（１）中、Ｘ－はハロゲンイオンを表す。Ｘ－の例として、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－等が挙げられ、２種以上が併存していてもよい。
【0028】
式（１）中、ｍは１または２である。原料の入手の容易さ、およびコストの点で、ｍは１であることが好ましい。
【0029】
本発明の一態様に係る新規化合物は同位体によって標識されている化合物であってもよい。当該同位体の例として、２Ｈ（重水素、Ｄ）、１３Ｃ、１５Ｎおよび１８Ｏ等の安定同位体が挙げられる。
【0030】
本発明の一態様に係る新規化合物の例として、以下の化合物が挙げられる。以下の式（Ｐ－１）～（Ｐ－４）中、Ｍｅはメチル基を表し、Ｅｔはエチル基を表し、Ｐｒはプロピレン基を表す。
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【0031】
本発明の一態様に係る新規化合物の構造を特定する方法として、質量分析法、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）等による分析による特定が挙げられる。
【0032】
〔新規化合物の製造方法〕
例えば、以下のスキームによって、本発明の一態様に係る新規化合物を製造することができる。スキーム中、Ｌｖ１は脱離基（例えば、ハロゲン原子、メシル基、トシル基、等）を示す。
例えば、以下のスキームによって、本発明の一態様に係る新規化合物を製造することができる。スキーム中、Ｌｖ１は脱離基（例えば、ハロゲン原子、メシル基、トシル基、等）を示す。
【化7】
【0033】
次に、スキームの各工程について説明する。特に断り書きがない限り、各工程で使用される溶媒は１種であってもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0034】
＜第一工程＞
第一工程では、化合物Ｉと塩化チオニルまたは塩化オキサリル等の塩素化剤とを反応させることにより化合物ＩＩを得る。
第一工程では、化合物Ｉと塩化チオニルまたは塩化オキサリル等の塩素化剤とを反応させることにより化合物ＩＩを得る。
【0035】
第一工程で使用する溶媒の例として、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等が挙げられるが、通常はこのような反応で汎用されるジクロロメタンまたはトルエンを使用すればよい。また、反応を加速させるために触媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を使用することが好ましい。
【0036】
第一工程における反応系において、塩素化剤の量は１．０～２０当量であってもよい。触媒の量は、０．１～１０ｍｏｌ％であってもよい。
【0037】
第一工程における反応系の温度は、化合物の安定性および塩素化剤の揮発の抑制の点で、０～４０℃程度であることが好ましい。
【0038】
＜第二工程＞
第二工程では、化合物ＩＩとｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート（ＢｏｃＮＨＮＨ２）との縮合反応によって化合物ＩＩＩを得る。
第二工程では、化合物ＩＩとｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート（ＢｏｃＮＨＮＨ２）との縮合反応によって化合物ＩＩＩを得る。
【0039】
第二工程の縮合反応は塩基存在下で行ってもよい。塩基の例として、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピリジン、Ｋ２ＣＯ３およびＮａＨＣＯ３等が挙げられる。塩基は１種であってもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0040】
第二工程で使用する溶媒の例として、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、ケトン系溶媒、アルコール系溶媒、アセトニトリルおよび水等が挙げられる。化合物の溶解性および安定性の点で、ジクロロメタンまたはＴＨＦを溶媒として使用することが好ましい。
【0041】
第二工程における反応系において、ＢｏｃＮＨＮＨ２の量は１．０～３．０当量であってもよい。塩基の量は１．０～５．０当量であってもよい。
【0042】
第二工程における反応系の温度は、反応性の向上および副反応の抑制の点で、０～４０℃程度であることが好ましい。
【0043】
＜第三工程＞
第三工程では、化合物ＩＩＩとピリジン化合物との求核置換反応により化合物ＩＶを得る。
第三工程では、化合物ＩＩＩとピリジン化合物との求核置換反応により化合物ＩＶを得る。
【0044】
ピリジン化合物におけるＲ１～Ｒ５はそれぞれ、最終生成物（すなわち、前記式（Ｉ）で示される化合物）におけるＲ１～Ｒ５となる。したがって、製造を目的とする化合物の構造に従って、使用するピリジン化合物の種類を選択する。
【0045】
第三工程における反応系において、ピリジン化合物の量は、１．０～１００当量であってもよい。第三工程における反応系において、溶媒を使用してもよいし、使用しなくてもよい。第三工程で使用してもよい溶媒の例として、エーテル系溶媒、ケトン系溶媒、アセトニトリル、ＤＭＦおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。反応性および操作性の点で、溶媒はアセトニトリルであること、または、溶媒を使用しないことが好ましい。
【0046】
第三工程における反応系の温度は、反応性および試薬等の沸点を考慮すると０～１００℃程度であることが好ましい。
【0047】
＜第四工程＞
第四工程では、化合物ＩＶをプロトン酸（ＨＸ）による脱Ｂｏｃ反応に供することによって、式（Ｉ）の化合物に相当する化合物Ｐを得る。プロトン酸の例として、塩化水素等のハロゲン化水素酸、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）等が挙げられる。
第四工程では、化合物ＩＶをプロトン酸（ＨＸ）による脱Ｂｏｃ反応に供することによって、式（Ｉ）の化合物に相当する化合物Ｐを得る。プロトン酸の例として、塩化水素等のハロゲン化水素酸、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）等が挙げられる。
【0048】
第四工程の脱Ｂｏｃ反応で使用するプロトン酸を含む溶液の例として、入手の容易さの点で、塩化水素／酢酸エチル溶液（ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ）、塩化水素／ジオキサン溶液（ＨＣｌ／ジオキサン）、または、塩化水素／メタノール溶液（ＨＣｌ／ＭｅＯＨ）が好ましい。第四工程で使用する溶媒の例として、アルコール系溶媒、エーテル系溶媒、ケトン系溶媒および酢酸エチル等が挙げられ、化合物の溶解性の高さの点で、メタノール、エタノールまたは酢酸エチルが好ましい。
【0049】
第四工程における反応系において、プロトン酸の濃度は適宜設定できる。反応性の点で、例えばプロトン酸として塩化水素を用いる場合、その濃度は１Ｍ以上であることが好ましい。反応系の温度は０～５０℃であってもよく、反応性および操作性の点で、室温（例えば、２０～３０℃）であることが好ましい。
【0050】
〔質量分析用誘導体化用組成物〕
本発明の一態様に係る質量分析用誘導体化用組成物（以下、「本誘導体化用組成物」と略記する場合がある）は、上記新規化合物を含む。本誘導体化用組成物によって生体試料を誘導体化することによって、例えば、ＬＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる、高感度および高選択性な定量分析が可能となる。
本発明の一態様に係る質量分析用誘導体化用組成物（以下、「本誘導体化用組成物」と略記する場合がある）は、上記新規化合物を含む。本誘導体化用組成物によって生体試料を誘導体化することによって、例えば、ＬＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる、高感度および高選択性な定量分析が可能となる。
【0051】
本誘導体化用組成物は、上記新規化合物を含んでいればよく、その形態は特に限定されない。上記新規化合物は固体、液体または溶液であり得、本誘導体化用組成物は固体であってもよいし、液体であってもよい。
【0052】
本誘導体化用組成物は、必要に応じて、上記新規化合物を溶解または分散する液体（溶媒または分散媒）、安定化剤等の添加剤等を含んでいてもよい。本誘導体化用組成物は、好ましくは溶液（液体組成物）である。溶液とする場合に使用できる溶媒は、誘導体化試薬等が溶解し、誘導体化反応を阻害しない溶媒であれば制限はない。具体的には、メタノールやエタノールのようなアルコール類、酢酸、アセトニトリル、テトラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエン、水が例示され、メタノール、酢酸、アセトニトリルが好ましい。溶媒は２種以上が使用されていてもよい。本誘導体化用組成物は、必要に応じて、容器に格納されていてもよい。また、本誘導体化用組成物は、使用手順等が記載された使用説明書とともに提供されてもよい。
【0053】
本誘導体化用組成物は、新規化合物がヒドラジン構造を有することによって、カルボニル基を有する生体成分の誘導体化に適している。カルボニル基を有する生体成分の例として、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、コルチゾール、プロゲステロン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡＳ）等のステロイドホルモン；等が挙げられる。
【0054】
本誘導体化用組成物による誘導体化は、例えば、生体試料等の分析対象試料を被験者から採取および前処理を行った後に行えばよい。生体試料の例として、血漿および血清等の血液；尿；唾液；髄液；等が挙げられる。前処理は、例えば、分析対象試料に内部標準物質を添加および混合後、遠心分離し、上清を留去することにより行えばよい。必要に応じて、メタノール等の有機溶媒を用いた除タンパク、固相抽出、液液抽出、または、サポート型液体抽出法（ＳＬＥ；supported liquid extraction）を行うことが好ましい。
【0055】
例えば、分析対象試料および本誘導体化用組成物を混合後、例えば、１０～１００℃において、５分～１２０分反応させることによって、誘導体を形成させることができる。誘導体を形成させるときの温度は、使用する溶媒の沸点を考慮し、適宜決定すればよいが、例えば、アセトニトリルまたはメタノールを使用する場合は、２０℃～７０℃が好ましい。誘導体化中は、生体試料と本誘導体化用組成物との混合物を静置してもよいし、攪拌してもよい。
【0056】
本誘導体化用組成物によって誘導体が形成された生体試料は、ＬＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等に供することによって、定量分析等の分析を行うことができる。ＬＣ－ＭＳ等で行うイオン化法は、分析対象成分に応じて、適宜選択すればよい。イオン化法の例として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）および大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ法）等が挙げられる。
【0057】
本誘導体化用組成物に含まれる上記新規化合物は同位体によって標識されていてもよい。当該同位体の例として、２Ｈ（重水素、Ｄ）、１３Ｃ、１５Ｎおよび１８Ｏ等の安定同位体が挙げられる。同位体で標識された新規化合物を使用して誘導体化することによって、ＭＳによって分析する際の選択性を向上させることができる。
【0058】
また、分析対象試料の数に応じた上記新規化合物のアイソトポログを使用することによって、一度の測定で複数の分析対象試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同時に分析することが可能である。
【0059】
また、上記新規化合物による誘導体化によって形成された誘導体のフラグメントイオンとは異なるフラグメントイオンが生成させる誘導体化試薬と、当該新規化合物を組み合わせて、複数種類の分析対象試料の測定を行ってもよい。
【0060】
さらに、本発明の一態様に係る新規化合物の製造方法は、上述の通り、簡便であり、安価に新規化合物を製造することができる。したがって、分子構造、物性または分子量が異なる複数種類の新規化合物を簡便かつ安価に合成することができる。また、上記新規化合物のアイソトポログも簡便かつ安価に合成することができる。したがって、本発明の一態様に係る新規化合物によって分析対象試料を誘導体化することによって、ハイスループットである分析（特に、ハイスループットである定量分析）が可能となる。
【0061】
〔質量分析用誘導体化用キット〕
本発明の一態様に係る質量分析用誘導体化用キット（以下、「本誘導体化用キット」と略記する場合がある）は、上記新規化合物１を含む。その効果等は本質量分析用誘導体化用組成物について説明した通りであるのでここでは繰り返さない。
本発明の一態様に係る質量分析用誘導体化用キット（以下、「本誘導体化用キット」と略記する場合がある）は、上記新規化合物１を含む。その効果等は本質量分析用誘導体化用組成物について説明した通りであるのでここでは繰り返さない。
【0062】
本明細書において、「キット」とは、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、チューブ、バイアル等）を備えた包装物が意図される。本誘導体化用キットは、そこに含まれる各々の材料が独立して存在している形態であってもよく、複数の材料が混在している形態（例えば、組成物の形態）であってもよい。本誘導体化用キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。
【0063】
本誘導体化用キットにおいて、上記新規化合物は固体、液体または溶液として含まれ得る。新規化合物が固体または液体として含まれる場合、前記溶媒に溶解し、溶液（液体組成物）としてから使用することが好ましい。また、本誘導体化用キットは、上記新規化合物１の他に、被験者から採取した生体試料等の被検体試料を前処理するための材料（例えば、試薬、カラム、等）、新規化合物を調製するための溶媒等をさらに備えていてもよい。
【実施例0064】
以下の実施例中、特に記載がない限り、％は体積％を表す。
【0065】
下記実施例で合成した化合物の分析条件を以下に示す。
＜ＮＭＲ＞
下記装置および条件で、合成した化合物の分析を行った。
・装置：フーリエ変換核磁気共鳴装置（ＪＮＭ－ＥＣＡ４００ ＩＩ：ＪＥＯＬ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ社製）
・磁場：９．３９Ｔ
・１Ｈの共鳴周波数：３９９．７８ ＭＨｚ
・ＤＭＳＯ－ｄ６
＜ＮＭＲ＞
下記装置および条件で、合成した化合物の分析を行った。
・装置：フーリエ変換核磁気共鳴装置（ＪＮＭ－ＥＣＡ４００ ＩＩ：ＪＥＯＬ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ社製）
・磁場：９．３９Ｔ
・１Ｈの共鳴周波数：３９９．７８ ＭＨｚ
・ＤＭＳＯ－ｄ６
【0066】
〔実施例１〕化合物Ｐ－１の合成
以下のスキーム（合成例１－１～１－３）に従って、化合物Ｐ－１を合成した。なお各スキームに記載の％は収率である。
以下のスキーム（合成例１－１～１－３）に従って、化合物Ｐ－１を合成した。なお各スキームに記載の％は収率である。
【化8】
【0067】
（合成例１－１）化合物２および３の合成
化合物１（３．４ｇ）、ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（７．７μL）の混合物に、氷冷下、塩化チオニル（７．３ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌後、４０℃で５時間加熱攪拌した。室温まで放冷後、減圧下、溶媒を留去し、化合物２を粗生成物として得た。得られた化合物２の粗生成物とジクロロメタン（２０ｍＬ）との混合物に、氷冷下、ＤＩＰＥＡ（４．３ｍＬ）およびｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート（３．３ｇ）を加え、室温で終夜攪拌した。反応混合物に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム－メタノール）により精製し、化合物３を含む粗生成物を得た。得られた化合物３を含む粗生成物をメタノール（２５ｍＬ）に溶解し、水（１３０ｍＬ）に滴下後、室温で３０分間攪拌した。生じた固体をろ取し、得られた水を含有する固体をクロロホルムに溶解した。有機相を分離後、水相をクロロホルムで複数回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下、溶媒を留去し、化合物３（３．８ｇ）を淡黄色固体として得た。
化合物１（３．４ｇ）、ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（７．７μL）の混合物に、氷冷下、塩化チオニル（７．３ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌後、４０℃で５時間加熱攪拌した。室温まで放冷後、減圧下、溶媒を留去し、化合物２を粗生成物として得た。得られた化合物２の粗生成物とジクロロメタン（２０ｍＬ）との混合物に、氷冷下、ＤＩＰＥＡ（４．３ｍＬ）およびｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート（３．３ｇ）を加え、室温で終夜攪拌した。反応混合物に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム－メタノール）により精製し、化合物３を含む粗生成物を得た。得られた化合物３を含む粗生成物をメタノール（２５ｍＬ）に溶解し、水（１３０ｍＬ）に滴下後、室温で３０分間攪拌した。生じた固体をろ取し、得られた水を含有する固体をクロロホルムに溶解した。有機相を分離後、水相をクロロホルムで複数回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下、溶媒を留去し、化合物３（３．８ｇ）を淡黄色固体として得た。
【0068】
（合成例１－２）化合物４の合成
化合物３（３００ｍｇ）とピリジン（３．０ｍＬ）とを混合し、６０℃で終夜加熱攪拌した。室温まで放冷後、ヘキサンで希釈し、固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物４（３１０ｍｇ）を白色固体として得た。
化合物３（３００ｍｇ）とピリジン（３．０ｍＬ）とを混合し、６０℃で終夜加熱攪拌した。室温まで放冷後、ヘキサンで希釈し、固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物４（３１０ｍｇ）を白色固体として得た。
【0069】
（合成例１－３）化合物Ｐ－１の合成
化合物４（２００ｍｇ）と酢酸エチル（２．３ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（２．３ｍＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で１５時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－１（１６０ｍｇ）を白色固体として得た。
化合物４（２００ｍｇ）と酢酸エチル（２．３ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（２．３ｍＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で１５時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－１（１６０ｍｇ）を白色固体として得た。
【0070】
化合物Ｐ－１の分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 5.97 (s, 2H) 7.65 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.00 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.20 (dd, 2H J=6.6, 7.6 Hz) 8.65 (t, 2H J=7.6 Hz) 9.08 (d, 2H, J=6.6 Hz) 9.40-11.40 (brs, 2H) 11.64-11.84 (brs, 1H)
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 5.97 (s, 2H) 7.65 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.00 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.20 (dd, 2H J=6.6, 7.6 Hz) 8.65 (t, 2H J=7.6 Hz) 9.08 (d, 2H, J=6.6 Hz) 9.40-11.40 (brs, 2H) 11.64-11.84 (brs, 1H)
【0071】
〔実施例２〕化合物Ｐ－２の合成
以下のスキーム（合成例２－１～２－２）に従って、化合物Ｐ－２を合成した。
以下のスキーム（合成例２－１～２－２）に従って、化合物Ｐ－２を合成した。
【化9】
【0072】
（合成例２－１）化合物５の合成
合成例１－１で得られた化合物３（３００ｍｇ）と４－メチルピリジン（２．９ｇ）とを混合し、６０℃で６時間加熱攪拌した。トルエン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）／エタノール（０．２ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）／エタノール（１ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物５（２８０ｍｇ）を薄いピンク色固体として得た。
合成例１－１で得られた化合物３（３００ｍｇ）と４－メチルピリジン（２．９ｇ）とを混合し、６０℃で６時間加熱攪拌した。トルエン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）／エタノール（０．２ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）／エタノール（１ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物５（２８０ｍｇ）を薄いピンク色固体として得た。
【0073】
（合成例２－２）化合物Ｐ－２の合成
化合物５（２８０ｍｇ）と酢酸エチル（３．５ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩酸／酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２日間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－２（２００ｍｇ）を白色固体として得た。
化合物５（２８０ｍｇ）と酢酸エチル（３．５ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩酸／酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２日間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－２（２００ｍｇ）を白色固体として得た。
【0074】
化合物Ｐ－２の分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 2.60 (s, 3H) 5.88 (s, 2H) 7.62 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.00 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.02 (d, 2H J=6.6 Hz) 9.08 (d, 2H, J=6.6 Hz) 9.40-11.30 (brs, 2H) 11.70-11.92 (brs, 1H)
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 2.60 (s, 3H) 5.88 (s, 2H) 7.62 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.00 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.02 (d, 2H J=6.6 Hz) 9.08 (d, 2H, J=6.6 Hz) 9.40-11.30 (brs, 2H) 11.70-11.92 (brs, 1H)
【0075】
〔実施例３〕化合物Ｐ－３の合成
以下のスキーム（合成例３－１～３－２）に従って、化合物Ｐ－３を合成した。
以下のスキーム（合成例３－１～３－２）に従って、化合物Ｐ－３を合成した。
【化10】
【0076】
（合成例３－１）化合物６の合成
合成例１－１で得られた化合物３（３００ｍｇ）と４－エチルピリジン（３．４ｇ）とを混合し、６０℃で６時間加熱攪拌した。トルエン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物６（３９０ｍｇ）を白色固体として得た。
合成例１－１で得られた化合物３（３００ｍｇ）と４－エチルピリジン（３．４ｇ）とを混合し、６０℃で６時間加熱攪拌した。トルエン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物６（３９０ｍｇ）を白色固体として得た。
【0077】
（合成例３－２）化合物Ｐ－３の合成
化合物６（３９０ｍｇ）と酢酸エチル（３．５ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２日間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－３（３１０ｍｇ）を白色固体として得た。
化合物６（３９０ｍｇ）と酢酸エチル（３．５ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２日間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－３（３１０ｍｇ）を白色固体として得た。
【0078】
化合物Ｐ－３の分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 1.25 (t, 3H, J=7.4 Hz) 2.91 (q, 2H, J=7.4 Hz) 5.89 (s, 2H) 7.64 (d, 2H, J=8.4 Hz) 8.00 (d, 2H, J=8.4 Hz) 8.06 (d, 2H J=7.0 Hz) 9.12 (d, 2H, J=7.0 Hz) 9.45-11.30 (brs, 2H) 11.70-11.93 (brs, 1H)
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 1.25 (t, 3H, J=7.4 Hz) 2.91 (q, 2H, J=7.4 Hz) 5.89 (s, 2H) 7.64 (d, 2H, J=8.4 Hz) 8.00 (d, 2H, J=8.4 Hz) 8.06 (d, 2H J=7.0 Hz) 9.12 (d, 2H, J=7.0 Hz) 9.45-11.30 (brs, 2H) 11.70-11.93 (brs, 1H)
【0079】
〔実施例４〕化合物Ｐ－４の合成
以下のスキーム（合成例４－１～４－２）に従って、化合物Ｐ－４を合成した。
以下のスキーム（合成例４－１～４－２）に従って、化合物Ｐ－４を合成した。
【化11】
【0080】
（合成例４－１）化合物７の合成
合成例１－１で得られた化合物３（３００ｍｇ）と４－プロピルピリジン（３．８ｇ）を混合し、６０℃で６時間加熱攪拌した。トルエン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物７（３８０ｍｇ）を白色固体として得た。
合成例１－１で得られた化合物３（３００ｍｇ）と４－プロピルピリジン（３．８ｇ）を混合し、６０℃で６時間加熱攪拌した。トルエン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で２時間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物７（３８０ｍｇ）を白色固体として得た。
【0081】
（合成例４－２）化合物Ｐ－４の合成
化合物７（３８０ｍｇ）と酢酸エチル（３．５ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２日間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－４（３２０ｍｇ）を白色固体として得た。
化合物７（３８０ｍｇ）と酢酸エチル（３．５ｍＬ）との混合物に４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（５．０ｍＬ）を加え、室温で２日間攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥した。得られた固体に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、室温で終夜攪拌した。得られた固体をろ取し、減圧下乾燥し、化合物Ｐ－４（３２０ｍｇ）を白色固体として得た。
【0082】
化合物Ｐ－３の分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 0.91 (t, 3H, J=7.6 Hz) 1.68 (sext, 2H, J=7.6 Hz) 2.85 (t, 2H, J=7.6 Hz) 5.89 (s, 2H) 7.64 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.01 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.05 (d, 2H J=6.6 Hz) 9.12 (d, 2H, J=6.6 Hz) 9.40-11.40 (brs, 2H) 11.75-11.95 (brs, 1H)
1H NMR (DMSO-d6, 399.78 MHz): δ 0.91 (t, 3H, J=7.6 Hz) 1.68 (sext, 2H, J=7.6 Hz) 2.85 (t, 2H, J=7.6 Hz) 5.89 (s, 2H) 7.64 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.01 (d, 2H, J=8.2 Hz) 8.05 (d, 2H J=6.6 Hz) 9.12 (d, 2H, J=6.6 Hz) 9.40-11.40 (brs, 2H) 11.75-11.95 (brs, 1H)
【0083】
〔試験例１〕テストステロン標準試料溶液の誘導体化およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析
（１）標準試料溶液（キャリブレーター）の調製
テストステロン標品を３０％アセトニトリル水溶液で下記表１に示される濃度で調製した。
（１）標準試料溶液（キャリブレーター）の調製
テストステロン標品を３０％アセトニトリル水溶液で下記表１に示される濃度で調製した。
【0084】
【表1】
【0085】
（２）内部標準物質溶液の調製
内部標準物質（ＩＳ）として、テストステロン－１３Ｃ３の標品を使用した。ＩＳの濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように３０％アセトニトリル水溶液で調整し、ＩＳ溶液を調製した。
内部標準物質（ＩＳ）として、テストステロン－１３Ｃ３の標品を使用した。ＩＳの濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように３０％アセトニトリル水溶液で調整し、ＩＳ溶液を調製した。
【0086】
（３）質量分析用誘導体化用組成物の調製
質量分析用誘導体化試薬として、実施例で合成した化合物Ｐ－１（以下、「誘導体化試薬１４」と示す）を使用した。また、対照の質量分析用誘導体化試薬としてジラール試薬Ｔ（ベタインヒドラジド塩酸塩）を使用した。誘導体化試薬１４およびジラール試薬Ｔそれぞれ濃度が２ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬとなるようにメタノールに溶解し、質量分析用誘導体化試薬用組成物を調製した。以下、誘導体化試薬１４を含む質量分析用誘導体化試薬用組成物を実施例の組成物、ジラール試薬Ｔを含む質量分析用誘導体化試薬用組成物を対照の組成物とそれぞれ示す場合がある。
質量分析用誘導体化試薬として、実施例で合成した化合物Ｐ－１（以下、「誘導体化試薬１４」と示す）を使用した。また、対照の質量分析用誘導体化試薬としてジラール試薬Ｔ（ベタインヒドラジド塩酸塩）を使用した。誘導体化試薬１４およびジラール試薬Ｔそれぞれ濃度が２ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬとなるようにメタノールに溶解し、質量分析用誘導体化試薬用組成物を調製した。以下、誘導体化試薬１４を含む質量分析用誘導体化試薬用組成物を実施例の組成物、ジラール試薬Ｔを含む質量分析用誘導体化試薬用組成物を対照の組成物とそれぞれ示す場合がある。
【0087】
（４）サンプルの前処理
以下の（４－１）～（４－３）の手順でサンプルの前処理を行った。
（４－１）ＳＬＥによる前処理
所定の濃度に調整された各テストステロン標準試料溶液１００μＬとＩＳ溶液１００μＬとを混合した。得られた混合溶液２００μＬをＳＬＥカラム（型番：ＩＳＯＬＵＴＥ ＳＬＥ＋ ４００μＬ Ｓａｍｐｌｅ Ｖｏｌｕｍｅ、Ｂｉｏｔａｇｅ社製）にロードした。次に、ヘキサン／酢酸エチル溶液（ｖ／ｖ＝５０／５０）６００μＬをＳＬＥカラムに加え、サンプルを溶出させた。これらの操作を３回繰り返した。
以下の（４－１）～（４－３）の手順でサンプルの前処理を行った。
（４－１）ＳＬＥによる前処理
所定の濃度に調整された各テストステロン標準試料溶液１００μＬとＩＳ溶液１００μＬとを混合した。得られた混合溶液２００μＬをＳＬＥカラム（型番：ＩＳＯＬＵＴＥ ＳＬＥ＋ ４００μＬ Ｓａｍｐｌｅ Ｖｏｌｕｍｅ、Ｂｉｏｔａｇｅ社製）にロードした。次に、ヘキサン／酢酸エチル溶液（ｖ／ｖ＝５０／５０）６００μＬをＳＬＥカラムに加え、サンプルを溶出させた。これらの操作を３回繰り返した。
【0088】
（４－２）サンプルの乾固
ＳＬＥカラムから溶出されたサンプルを窒素吹付または遠心濃縮を約２０分間行うことによって、サンプルの乾固を行った。
ＳＬＥカラムから溶出されたサンプルを窒素吹付または遠心濃縮を約２０分間行うことによって、サンプルの乾固を行った。
【0089】
（４－３）サンプルの誘導体化
乾固したサンプルに実施例の組成物を２０μＬ加えた。次に、１０％酢酸含有メタノール５０μＬを加え、６０℃において６０分間静置し、サンプルの誘導体化を行った。
乾固したサンプルに実施例の組成物を２０μＬ加えた。次に、１０％酢酸含有メタノール５０μＬを加え、６０℃において６０分間静置し、サンプルの誘導体化を行った。
【0090】
反応終了後、溶媒を窒素吹付または遠心濃縮によって除去し、３０％メタノール水溶液１００μＬを加え、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析用サンプルを調製した。
【0091】
（５）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析
調製したＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析用サンプルについて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。ＬＣおよびＭＳ／ＭＳの条件を以下に示す。
調製したＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析用サンプルについて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。ＬＣおよびＭＳ／ＭＳの条件を以下に示す。
【0092】
（５－１）ＬＣの条件
装置：Waters社 ACQUITY UPLC I-Class
分析カラム：Waters社 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 mmI.D ×50mm
溶出条件：流速０．４ｍＬ／分
溶媒Ａ：０．１％ １０ｍＭギ酸アンモニウム－水
溶媒Ｂ：メタノール
溶出条件の詳細は以下の表２に示す。
装置：Waters社 ACQUITY UPLC I-Class
分析カラム：Waters社 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 mmI.D ×50mm
溶出条件：流速０．４ｍＬ／分
溶媒Ａ：０．１％ １０ｍＭギ酸アンモニウム－水
溶媒Ｂ：メタノール
溶出条件の詳細は以下の表２に示す。
【0093】
【表2】
【0094】
（５－２）ＭＳ／ＭＳの条件
装置：Waters社 Xevo TQ-XS 三連四重極型質量分析計
イオン化条件：ＥＳＩ正イオンモード
ＳＲＭパラメーターおよび衝突エネルギー（ＣＥ）の詳細は以下の表３に示す。
装置：Waters社 Xevo TQ-XS 三連四重極型質量分析計
イオン化条件：ＥＳＩ正イオンモード
ＳＲＭパラメーターおよび衝突エネルギー（ＣＥ）の詳細は以下の表３に示す。
【0095】
【表3】
【0096】
（６）結果
図１は、テストステロン標品の検量線（内部標準法）を示すグラフである。図１に示すように、テストステロン標品を実施例の質量分析用誘導体化試薬用組成物で誘導体化し質量分析した結果、１．２５～１０ｎｇ／ｍＬの範囲において、測定値からのＩＳ比と標準試料濃度との相関が、ｒ２＝０．９９８３となり、直線性があった。これらの結果から、実施例の質量分析用誘導体化試薬用組成物におけるテストステロンの定量可能領域を確認することができた。
図１は、テストステロン標品の検量線（内部標準法）を示すグラフである。図１に示すように、テストステロン標品を実施例の質量分析用誘導体化試薬用組成物で誘導体化し質量分析した結果、１．２５～１０ｎｇ／ｍＬの範囲において、測定値からのＩＳ比と標準試料濃度との相関が、ｒ２＝０．９９８３となり、直線性があった。これらの結果から、実施例の質量分析用誘導体化試薬用組成物におけるテストステロンの定量可能領域を確認することができた。
【0097】
〔試験例２〕実施例の組成物によるプール血清の誘導体化およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析
テストステロン標準試料溶液の代わりに市販のプール血清を使用する以外は、上記「（１－４）サンプルの前処理）」と同様の手順でサンプルの前処理を行った。そして、上記「（１－５）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析」と同様に分析を行った。
テストステロン標準試料溶液の代わりに市販のプール血清を使用する以外は、上記「（１－４）サンプルの前処理）」と同様の手順でサンプルの前処理を行った。そして、上記「（１－５）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析」と同様に分析を行った。
【0098】
〔試験例３〕対照の組成物によるプール血清の誘導体化およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析
実施例の組成物の代わりに対照の組成物によってサンプルの誘導体化を行った以外は、試験例２と同様にサンプルの前処理を行い、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。
実施例の組成物の代わりに対照の組成物によってサンプルの誘導体化を行った以外は、試験例２と同様にサンプルの前処理を行い、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。
【0099】
試験例２および３の分析結果を図２および３に示す。図２は実施例の組成物（誘導体化試薬１４）および対照の組成物（Girard's Reagent T）によって誘導体化されたテストステロンのＳＲＭクロマトグラムである。図３は、実施例および対照の組成物によって誘導体化されたテストステロンのＭＳクロマトグラムにおける面積値の比較を示すグラフである。
【0100】
図２に示す通り、実施例の組成物によって誘導体化されたテストステロンのピークが対照の組成物と同様に、ＳＲＭクロマトグラムでも観察された。したがって、実施例の組成物の誘導体化によって血清中のテストステロンの定量が可能であることが分かった。
【0101】
図３に示す通り、実施例の組成物によって誘導体化されたテストステロンのＭＳクロマトグラムの面積値は、対照の組成物の結果と比較して約６０％程度であるが、血清中のテストステロンを検出するためには十分な面積値が得られた。
【0102】
また、実施例の組成物および対照の組成物によって誘導体化されたテストステロンのフラグメントイオンが異なっていた。このことから、新規化合物とジラール試薬とを組み合わせて、複数の生体試料を同時分析することができることも分かった。
【産業上の利用可能性】
【0103】
本発明は、例えば、ステロイドホルモン等のカルボニル基を有する生体成分の定量分析に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】