特開 2023-151611 人工三次元組織灌流デバイス、人工皮膚組織の製造方法、人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023151611

(43)【公開日】2023-10-16

(54)【発明の名称】人工三次元組織灌流デバイス、人工皮膚組織の製造方法、人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20231005BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20231005BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231005BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 Z

C12N5/071

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022061317

(22)【出願日】2022-03-31

(71)【出願人】

【識別番号】000113470

【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100137338

【弁理士】

【氏名又は名称】辻田 朋子

(74)【代理人】

【識別番号】100196313

【弁理士】

【氏名又は名称】村松 大輔

(72)【発明者】

【氏名】竹内 昌治

(72)【発明者】

【氏名】ミャスニコヴァ ディーナ

(72)【発明者】

【氏名】森 将人

(72)【発明者】

【氏名】楊 一幸

(72)【発明者】

【氏名】豊田 明美

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029AA02

4B029AA04

4B029BB11

4B029DA03

4B029DG06

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QR77

4B065AA90X

4B065AC20

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】本発明の課題は、灌流流路を有する人工三次元組織を製造するためのデバイスであって、培養プレート等のウェル間を容易に移動可能な人工三次元組織灌流デバイスを提供することにある。
【解決手段】本発明は、内部に培養空間Ｓを有する筒状に形成された側壁２を備え、
前記側壁２の壁内には、その厚み方向を貫通する第１内通路３１と、該第１内通路３１の中途から延び前記側壁２の外部に向かって開放する第２内通路３２と、を含む、前記側壁２の壁内において一連の空間を形成する内通路ユニット３が２以上設けられており、
一の前記内通路ユニット３の前記第１内通路と、他の前記内通路ユニット３の前記第１内通路３１と、に流路形成部材を通し、前記培養空間Ｓに該流路形成部材を懸架可能に構成されている、人工三次元組織を培養するための人工三次元組織灌流デバイス１である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

内部に培養空間を有する筒状に形成された側壁を備え、
前記側壁の壁内には、その厚み方向を貫通する第１内通路と、該第１内通路の中途から延び前記側壁の外部に向かって開放する第２内通路と、を含む、前記側壁の壁内において一連の空間を形成する内通路ユニットが２以上設けられており、
一の前記内通路ユニットの前記第１内通路と、他の前記内通路ユニットの前記第１内通路と、に流路形成部材を通し、前記培養空間に該流路形成部材を懸架可能に構成されている、
人工三次元組織を培養するための人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項2】

前記内通路ユニットは、前記側壁の周方向に沿って並設された複数の第１内通路と、１つの第２内通路を備え、
前記第２内通路は、分岐することで、それぞれの前記第１内通路の中途に接続している、請求項１に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項3】

前記第２内通路は、前記側壁の内部において周方向に延びる貯留空間を備え、前記貯留空間から分岐し、それぞれの前記第１内通路の中途に接続している、請求項２に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項4】

前記貯留空間における前記側壁の厚み方向及び高さ方向の径は、前記第１内通路及び前記第２内通路のいずれの内径よりも大きい、請求項３に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項5】

前記側壁は、内向きフランジ状に形成された組織形成部を備え、前記第１内通路は該組織形成部を略水平方向に貫くように形成され、前記培養空間は該組織形成部により囲まれた空間である、請求項１～４の何れか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項6】

前記培養空間は略円筒状である、請求項５に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項7】

前記組織形成部は上下端の各々に組織脱落抑制手段が設けられている、請求項５又は６に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項8】

前記組織脱落抑制手段は突起である、請求項７に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項9】

さらに、前記側壁の下方開放空間を塞ぐための着脱可能な蓋を備える、請求項１～８の何れか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項10】

前記側壁が略円筒状である、請求項１～９の何れか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイス。

【請求項11】

請求項１～１０の何れか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイスと、前記第１内通路に挿通可能な前記流路形成部材と、を含む、人工三次元組織製造キット。

【請求項12】

請求項１～１０の何れか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイスを用いた人工皮膚組織の製造方法であって、
前記人工三次元組織灌流デバイスの前記側壁に設けられた前記第１内通路に、前記流路形成部材を挿入し、かつ、前記側壁の下方開放空間を蓋で封鎖する準備工程と、
前記人工三次元組織灌流デバイスを用いて真皮細胞を培養し、真皮組織層を形成させる第１の培養工程と、
前記真皮組織層の形成後、表皮細胞を培養し、表皮組織層を形成させる第２の培養工程と、
前記表皮組織層の形成後、前記流路形成部材を抜去し、前記真皮組織層を貫通する灌流流路を形成させる、流路形成工程と、
前記灌流流路内で血管内皮細胞を培養し、管腔層を形成させる第３の培養工程と、を含む、人工皮膚組織の製造方法。

【請求項13】

前記管腔層の形成後、角層を形成させる第４の培養工程をさらに含み、
前記第４の培養工程は、配管を前記第２内通路の開口に装着し、前記人工三次元組織灌流デバイスを複数連結させた状態で、前記灌流流路に培地を灌流させながら角層化の誘導を促進する、請求項１２に記載の人工皮膚組織の製造方法。

【請求項14】

請求項１２又は１３に記載の製造方法で製造した人工皮膚組織に、薬剤を添加する添加工程と、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工皮膚組織の応答、及び／又は前記人工皮膚組織に対する前記薬剤の浸透性を測定する評価工程を含む、人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人工三次元組織灌流デバイス、人工皮膚組織の製造方法、人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人工臓器の構築や動物実験に替わる薬剤実験等への適用を目的として、人工三次元組織の構築方法について広く研究が進められている。中でも、皮膚移植や化粧品、医薬品等の薬効試験、薬理試験及び安全性試験に用いるために、様々な培養皮膚モデルが開発されている。

【0003】

例えば、特許文献１には、細胞外マトリックス成分を含む被膜された細胞を培養して真皮組織層を形成すること、真皮組織層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成することを含む人工皮膚モデルの製造方法が開示されている。

【0004】

特許文献２には、線維芽細胞およびコラーゲンを混合して真皮模写層を形成させ、真皮模写層上に角化細胞を適用して培養した後、所定の培地でさらに培養を行うことで、皮膚色素沈着が示された人工皮膚の製造方法が開示されている。

【0005】

また、特許文献３には、血管様チャネルを有する人工皮膚組織を製造する方法、及び当該人工皮膚組織の製造に用いるデバイスが開示されている。血管様チャネルに培地を灌流させながら皮膚組織を培養することで、灌流する培地から供給される栄養分により、表皮層が厚く、より高品質な人工皮膚組織を製造することができることが記載されている。

【0006】

特許文献４には、上述の特許文献３に記載の方法で製造した灌流型の人工皮膚組織を用いて、経内皮電気抵抗の測定及びバリア機能の評価を行うためのシステムが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１２－２０５５１６号公報

【特許文献2】特開２０１９－１００８９号公報

【特許文献3】ＷＯ２０１７／１２６５３２

【特許文献4】特許第６９９１５７２号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

また、従来の非灌流型人工皮膚組織の製造キットには、マルチウェルプレート等に装着可能なインサートウェルに皮膚組織を形成させ、該インサートウェルごと皮膚組織を移動させることができるトランスウェル型のものが開発されている。
しかしながら、灌流流路を有する灌流型人工皮膚組織を製造するデバイスであって、トランスウェルに適した形状のものは存在しなかった。例えば、特許文献３に記載の灌流デバイスは、灌流流路に連通するチューブ取り付け口が多数存在し、且つ該取り付け口が突出して設けられているためウェル内に収めることが困難であり、トランスウェル用には適さない形状であった。

【0009】

また、特許文献３に記載のデバイスは、複数の灌流流路に灌流させる場合、培地を灌流させるためのチューブを流路の本数分装着しなければならず、デバイスの準備に手間がかかるという欠点があった。

【0010】

上記事情に鑑み、本発明は、灌流流路を有する人工三次元組織を製造するためのデバイスであって、培養プレート等のウェル内に容易に設置でき、形成した組織ごと移動が簡便な人工三次元組織灌流デバイスを提供することを課題とする。

【0011】

また、本発明は、上記デバイスを用いた人工皮膚の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することも課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記課題を解決する本発明は、
内部に培養空間を有する筒状に形成された側壁を備え、
前記側壁の壁内には、その厚み方向を貫通する第１内通路と、該第１内通路の中途から延び前記側壁の外部に向かって開放する第２内通路と、を含む、前記側壁の壁内において一連の空間を形成する内通路ユニットが２以上設けられており、
一の前記内通路ユニットの前記第１内通路と、他の前記内通路ユニットの前記第１内通路と、に流路形成部材を通し、前記培養空間に該流路形成部材を懸架可能に構成されている、人工三次元組織を培養するための人工三次元組織灌流デバイスである。

【0013】

上記構成を有する本発明の人工三次元組織灌流デバイスは、内通路ユニットが側壁内に設けられているため、デバイス本体を小型化することができ、さらに容易に培養プレート等の間を移動させることができる。

【0014】

本発明の好ましい形態では、前記内通路ユニットは、前記側壁の周方向に沿って並設された複数の第１内通路と、１つの第２内通路を備え、
前記第２内通路は、分岐することで、それぞれの前記第１内通路の中途に接続している。

【0015】

上記構成を有する人工三次元組織灌流デバイスを用いれば、後述する通り、人工三次元組織の製造時、内通路ユニットを構成する第１内通路及び第２内通路と、組織内を貫通する灌流流路とが連通した、一連の流路を形成させることができる。この時、側壁に設けられた第２内通路の開口が該流路の入口又は出口として機能することとなる。
すなわち、上記構成を有する本発明を用いれば、１の第２内通路の開口から複数に分岐した第１内通路へと培地が流入し、組織内の灌流流路に到達するため、灌流流路の本数分の配管を設置する手間がなく、灌流のための操作が容易となる。

【0016】

本発明の好ましい形態では、前記第２内通路は、前記側壁の内部において周方向に延びる貯留空間を備え、前記貯留空間から分岐し、それぞれの前記第１内通路の中途に接続している。
第２内通路が貯留空間を備えることで、第２内通路に流れ込んだ液体が一度貯留空間に蓄積されることから、貯留後分岐して第１内通路に流れ込む水流を一定にすることができる。

【0017】

本発明の好ましい形態では、前記貯留空間における前記側壁の厚み方向及び高さ方向の径は、前記第１内通路及び前記第２内通路のいずれの内径よりも大きい。
上記構成を有する貯留空間を有することで、貯留空間へ蓄積される水量が多くなるため、第１内通路に流入させる水流をより安定させることができる。

【0018】

本発明の好ましい形態では、前記側壁は、内向きフランジ状に形成された組織形成部を備え、前記第１内通路は該組織形成部を略水平方向に貫くように形成され、前記培養空間は該組織形成部により囲まれた空間である。
上記の組織形成部を備えることで、側壁に囲まれた空間は、組織形成部により上下に分断され、培養空間のみによって連通することとなる。これにより、人工三次元組織が形成された際、側壁に囲まれた空間を上下に完全に分断することができる。

【0019】

本発明の好ましい形態では、前記培養空間は略円筒状である。
培養空間を略円筒状とすることで、人工三次元組織の製造時に組織が収縮した場合であっても、側壁、より具体的には側壁に設けられた組織形成部と培養空間の間に隙間が生じにくくなる。これにより、デバイスから組織が脱落することを抑制できる。

【0020】

本発明の好ましい形態では、前記組織形成部は上下端の各々に組織脱落抑制手段が設けられている。
組織脱落抑制手段が設けられることにより、構築された人工三次元組織がデバイスから脱落することを抑制できる。

【0021】

本発明の好ましい形態では、前記組織脱落抑制手段は突起である。
組織脱落抑制手段として組織形成部に突起を設けることで、人工三次元組織のデバイスへの密着度が向上し、灌流時における組織の脱落を抑制することができる。

【0022】

本発明の好ましい形態では、本発明は、さらに、前記側壁の下方開放空間を塞ぐための着脱可能な蓋を備える。
着脱可能な蓋を備えることで、人工三次元組織の製造工程に応じて、デバイスの下方部を開放することができ、利便性に優れる。

【0023】

本発明の好ましい形態では、前記側壁が略円筒状である。
側壁の形状を略円筒状とすることで、本発明は、既存の丸底のマルチウェルプレート等内での使用性に優れる。

【0024】

また、本発明は、上述の人工三次元組織灌流デバイスと、前記第１内通路に挿通可能な前記流路形成部材と、を含む、人工三次元組織製造キットである。

【0025】

また、本発明は、上述の人工三次元組織灌流デバイスを用いた人工皮膚組織の製造方法であって、
前記人工三次元組織灌流デバイスの前記側壁に設けられた前記第１内通路に、前記流路形成部材を挿入し、かつ、前記側壁の下方開放空間を蓋で封鎖する準備工程と、
前記人工三次元組織灌流デバイスを用いて真皮細胞を培養し、真皮組織層を形成させる第１の培養工程と、
前記真皮組織層の形成後、表皮細胞を培養し、表皮組織層を形成させる第２の培養工程と、
前記表皮組織層の形成後、前記流路形成部材を抜去し、前記真皮組織層を貫通する灌流流路を形成させる、流路形成工程と、
前記灌流流路内で血管内皮細胞を培養し、管腔層を形成させる第３の培養工程と、を含む、人工皮膚組織の製造方法に関する。

【0026】

上記製造方法によれば、真皮組織層に灌流流路を有する人工皮膚組織を製造することができる。

【0027】

本発明の好ましい形態では、本発明は、前記管腔層の形成後、角層を形成させる第４の培養工程をさらに含み、
前記第４の培養工程は、配管を前記第２内通路の開口に装着し、前記人工三次元組織灌流デバイスを複数連結させた状態で、前記灌流流路に培地を灌流させながら角層化の誘導を促進する。
複数の人工三次元組織灌流デバイスを連結させて灌流を行いながら角層の形成を行うことで、複数の人工皮膚組織を同時に、かつ容易に製造することができる。

【0028】

また、本発明は、上述の人工皮膚の製造方法で製造した人工皮膚組織に、薬剤を添加する添加工程と、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工皮膚組織の応答、及び／又は前記人工皮膚組織に対する前記薬剤の浸透性を測定する評価工程を含む、人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法にも関する。

【発明の効果】

【0029】

本発明によれば、培養プレート等のウェル内に容易に設置でき、形成した組織ごとの移動が簡便な人工三次元組織灌流デバイスを提供することができる。

【0030】

また、本発明によれば、上記デバイスを用いた人工皮膚の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】本発明の一実施形態を示す人工三次元組織灌流デバイスの全体斜視図である。

【図2】本発明の一実施形態を示す人工三次元組織灌流デバイスの平面図である。

【図3】図２のＡ－Ａ’断面図である。

【図4】図２のＢ－Ｂ’断面図である。

【図5】本発明の一実施形態を示す人工三次元組織灌流デバイスの下方斜視図である。

【図6】本発明の一実施形態を示す人工三次元組織灌流デバイスの蓋の設置例を示す図である。

【図7】本発明の一実施形態を示す人工三次元組織灌流デバイスの使用状態を示す図である。

【図8】人工皮膚組織の製造工程を示す図であり、第１の培養工程における真皮細胞及び細胞外マトリックス成分をデバイス内に投入した状態を表す。

【図9】人工皮膚組織の製造工程を示す図であり、第１の培養工程後に真皮組織層Ｌ１が形成された状態を表す。

【図10】人工皮膚組織の製造工程を示す図であり、第２の培養工程後に表皮組織層Ｌ２が形成された状態を表す。

【図11】人工皮膚組織の製造工程を示す図であり、第３の培養工程後に管腔層Ｌ３が形成された状態を表す。

【図12】人工皮膚組織の製造工程を示す図であり、第４の培養工程後に角層Ｌ４が形成された状態を表す。

【図13】人工皮膚組織の製造において、複数の人工三次元組織灌流デバイスを連結させた状態を示す図である。

【図14】実施例にかかる本発明の製造方法で製造した人工皮膚組織の皮膚切片のＨＥ染色画像であり、ワイヤーの直径が（ａ）２００μｍの場合、（ｂ）５００μｍの場合をそれぞれ示す。

【図15】実施例にかかる本発明の製造方法で製造した人工皮膚組織の皮膚切片の免疫組織染色画像であり、（ａ）ＣＫ１０染色及びＣＫ１５染色結果、（ｂ）ＣＤ３１染色結果をそれぞれ示す。

【図16】実施例にかかる（ａ）人工皮膚組織のバリア機能の評価方法を示す概略図、及び（ｂ）人工皮膚組織の経皮吸収性の評価方法を示す概略図である。

【図17】実施例にかかる人工皮膚組織のバリア機能の評価結果を示す図であり、角層形成時に灌流を行った皮膚組織及び灌流を行わなかった皮膚組織における経皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）の測定結果を示す。

【図18】実施例にかかる人工皮膚組織の経皮吸収性の評価結果を示す図であり、（ａ）皮膚直下の溶液におけるカフェイン累積透過量、及び（ｂ）灌流液におけるカフェイン累積透過量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、本発明の人工三次元組織灌流デバイス、人工皮膚の製造方法、及び当該人工皮膚を用いた薬剤評価方法について説明を加えるが、本発明は下記実施形態に限定されず、適宜設計変更が可能である。また、添付の図面は概念図であり、各構成の相対的な寸法等は本発明を限定するものではなく、実際の縮尺等とは異なる場合がある。

【0033】

［人工三次元組織灌流デバイス］
以下、本発明の人工三次元組織灌流デバイスについて、図１～７を参照して説明を加える。

【0034】

なお、本発明において、側壁２の「内部」とは側壁２に囲まれた内側部分の空間を示し、側壁２の「壁内」とは側壁２内に内蔵されている状態を示す。

【0035】

図１は、本実施形態にかかる人工三次元組織灌流デバイス１（以下、灌流デバイス１という）の全体図を示す。灌流デバイス１は、人工三次元組織が形成される培養空間Ｓを内部に有し、筒状に形成された側壁２を備える。当該側壁２は、その壁内に設けられた内通路ユニット３と、人工三次元組織が形成される組織形成部４を備える（図２～４）。

【0036】

側壁２は、上下面が解放された略円筒状であり、側壁２の上方に向かって２つの装着部２１が突出している。装着部２１は、配管８を取り付け容易な円錐台形状となっている。当該装着部２１は、側壁２内部を連通する内通路ユニット３の上方開口３２１を有する。

【0037】

後述する通り、人工三次元組織の製造時、装着部２１にシリコンチューブ等の配管８を設置し、ポンプＰと接続することで、ポンプＰから送られる培地を人工三次元組織内に灌流させることができる。

【0038】

灌流デバイス１には、２つの内通路ユニット３が互いに対向するように、側壁２に設けられている。内通路ユニット３は、第１内通路３１と第２内通路３２の２つの内通路で構成されている。

【0039】

図３及び４は、側壁２に設けられた内通路ユニット３の形態を表す。内通路ユニット３を構成する第１内通路３１は、側壁２の厚み方向を貫通するよう設けられ、第２内通路３２は該第１内通路３１の中途から上方に向かって形成される。

【0040】

第１内通路３１は、側壁２の周方向に沿って複数個併設されている。本実施形態では、１単位の内通路ユニット３につき、第１内通路３１が３本設けられている。
内通路ユニット３を構成する計６個の第１内通路３１は、培養空間Ｓを介して対向するよう設けられている。すなわち、第１内通路３１は、対向する第１内通路３１に各々ワイヤー６（流路形成部材）を挿通した際、培養空間Ｓにワイヤー６が懸架されるように配置されている。

【0041】

また、図３に示す通り、第１内通路３１は、側壁２及び組織形成部４を貫通し、培養空間Ｓまで連通する。第１内通路３１は、側壁２の外周面で開口する外側開口３１１と、組織形成部４の内周面で開口する内側開口３１２を有する。

【0042】

後述するように、人工三次元組織の製造時、対向する第１内通路３１にワイヤー６を挿通し、培養空間Ｓにワイヤー６が懸架した状態で組織を培養する。その後該ワイヤー６を抜去することで、組織内部に該ワイヤー６の形状に沿った１又は２以上（本実施形態では３本）の灌流流路Ｃを形成させることができる。

【0043】

また、図４は、第１内通路３１へ連通する第２内通路３２の分岐の状態を示す。第２内通路３２は、側壁２の上方より開放する上方開口３２１から側壁２の壁内を略垂直方向に下降し、一定量の容積を有する貯留空間３２ａを形成する。そして、貯留空間３２ａの下方で第２内通路３２は３つに分岐し、３本の第１内通路３１に接続する。

【0044】

貯留空間３２ａは、側壁２の周方向に延びており、その側壁２の厚み方向及び高さ方向の径は、第１内通路３１及び第２内通路３２の何れの内径よりも大きくなるよう設けられている。

【0045】

内通路ユニット３を構成する第１内通路３１及び第２内通路３２は、人工三次元組織の製造時、培地が灌流する流路として機能する。上方開口３２１から流入した培地は、一度貯留空間３２ａに貯蔵された後に分岐するため、第２内通路３２から第１内通路３１を流れる水流を一定にすることができる。ここで、水流を一定にするとは、水量、及び／又は流速を一定にすることを含む。

【0046】

また、第２内通路３２は、側壁２の装着部２１の内部を通り、該装着部２１に上方開口３２１を形成する（図３及び４）。ここで、人工三次元組織の製造において、培地等の灌流は、外側開口３１１を封止し、上方開口３２１のみが灌流デバイス１の外界に開放された状態で実施される。すなわち、内通路ユニット３にそれぞれ設けられた上方開口３２１が、外界と接続し、流路の入口又は出口として機能する。よって、２か所の装着部２１に配管８を設置するだけで、該人工三次元組織に形成される複数の灌流流路Ｃ内に培地を灌流させることができる。

【0047】

また、側壁２が内通路ユニット３を内蔵し、かつ装着部２１を側壁２上部に設ける構成とすることで、灌流デバイス１全体の形状を小型化することができる。これにより、内径の小さいマルチウェルプレート等の培養プレート内で人工三次元組織の製造が可能となる。さらには、該ウェルの中に容易に移動及び設置が可能となることから、トランスウェル型の装置として用いることができる。

【0048】

さらに、側壁２の内部には、組織形成部４が内向きフランジ状に形成されている（図２、３参照）。組織形成部４の内部には、上下に開放した略円筒状の培養空間Ｓが形成される。
培養空間Ｓが略円筒状であることで、人工三次元組織の製造時、形成された組織が収縮した場合に、該組織と組織形成部４の間に隙間が生じにくくなる。

【0049】

また、組織形成部４が内向きフランジ状であることで、側壁２に囲まれた内部空間が組織形成部４により上下に分断され、分断された上下空間が培養空間Ｓによってのみ連通した状態とすることができる。

【0050】

人工三次元組織の製造時、組織形成部４の培養空間Ｓには、収縮した人工三次元組織が接着する。すなわち、灌流デバイス１を用いて人工三次元組織を製造すると、製造された人工三次元組織により灌流デバイス１の上方空間と下方空間が分断される。そのため、本発明の灌流デバイス１を用いれば、上方空間に直接添加した試験用薬剤等が下方空間に漏れ出ることがないといった利点を有する。

【0051】

一方で、従来の灌流デバイスは、製造された人工三次元組織と培養空間に隙間が存在するため、製造した人工三次元組織に薬剤を添加する際、別途薬剤を溜めるための囲い等を用意する必要があった。
すなわち、本実施形態に係る灌流デバイス１は、囲い等を設けることなく薬剤を直接添加することができ、従来の灌流デバイスよりも薬剤試験等への使用性が向上したものとなっている。

【0052】

組織形成部４には、第１内通路３１が略水平方向に貫通している。すなわち、第１内通路３１の有する内側開口３１２は、組織形成部４に設けられ、培養空間Ｓに向かって開放されている。
人工三次元組織が組織形成部４に形成されると、内側開口３１２は、組織内を貫通するよう設けられた灌流流路Ｃの末端と接続することとなる。

【0053】

組織形成部４は、その上下端の各々に、人工三次元組織が接着するための組織脱落抑制手段４１が設けられる。本実施形態の灌流デバイス１では、組織脱落抑制手段４１として、組織形成部４の上下端に複数の突起が設けられている。該突起は、略円筒状であり、組織脱落抑制手段４１の表面に均等に配置される。

【0054】

組織形成部４の上下端に、組織脱落抑制手段４１を各々備えることで、製造した人工三次元組織が組織形成部４へ密着し、灌流時の人工三次元組織の脱落を抑制することができる。

【0055】

本実施形態では、図３に示す通り、組織形成部４の鉛直断面がＴ字状である。このような形態とすることで、人工三次元組織の製造時、Ｔ字状の傘の裏部分（すなわち、側壁２の内部に構成され、培養空間Ｓを形成する円筒構造体の、側壁２側の面）にも組織が付着することから、組織形成部４に対する製造した組織の接着が強固となり、灌流時の人工三次元組織の脱落を抑制することができる。

【0056】

組織形成部４は、鉛直断面のＴ字状部分の先端に、側壁２の方向に突出した突起４２が設けられる。突起４２を備えることで、Ｔ字の傘の裏、すなわち突起４２の下部に空間が形成される。人工三次元組織は、後述するように、突起４２の全体を覆い、当該空間に入り込む形態で形成される。これにより、製造した組織の組織形成部４への接着性が向上し、灌流時の人工三次元組織の脱落をより抑制することができる。

【0057】

また、本実施形態の灌流デバイス１は、側壁２の下方に複数の凸部２２を有する。図５は、灌流デバイス１の下方斜視図であり、側壁２が４つの凸部２２を備える形態を示す。４つの凸部２２は、一定間隔で環状に配置される。

【0058】

灌流デバイス１は、図６に示す通り、側壁２の下方開放空間を塞ぐための蓋５を有する。蓋５の形状は特に特定されないが、板状であることが好ましい。

【0059】

本実施形態において、蓋５は、側壁２に着脱自在に設けられ、側壁２の凸部と合致する形状の凹部５１を備える。これにより、蓋５がずれることなく、側壁２の下方開放空間を封止することができる。

【0060】

また、灌流デバイス１の寸法を培養プレートＤのウェル内径に合わせて調節することで、マルチウェルの培養プレートＤ内での人工三次元組織の製造が可能となる。図７は、６ウェルプレート内に複数の灌流デバイス１を配置した例を示す。

【0061】

本発明の灌流デバイス１の寸法としては、縦横幅（本実施形態では底面の直径）が好ましくは３５ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以下である。６ウェルプレート内での使用性を考慮すると、縦横幅（本実施形態では底面の直径）が２５～３０ｍｍであることが好ましい。

【0062】

このように、本発明の灌流デバイス１は、培養プレート等の間を容易に移動することができるだけでなく、省スペースで複数の人工皮膚組織を一度に製造する場合に好適に用いることができる。

【0063】

また、本発明の灌流デバイス１において、培養空間Ｓの筒内径ｄ（図２参照）は、デバイス本体の寸法及び製造する人工三次元組織の大きさを考慮し適宜変更することができる。本実施形態では、培養空間Ｓの筒内径は、２ｃｍ以下が好ましく、１．３ｃｍ以下がより好ましい。具体的には、培養空間Ｓの筒内径は０．８～１．３ｃｍの範囲であることが好ましく、１ｃｍ程度であることがより好ましい。

【0064】

なお、本実施形態では、灌流デバイス１が２つの内通路ユニット３を備える形態を示したが、本発明はこれに限定されず、２以上、好ましくは偶数個の内通路ユニット３を備える形態とすることができる。
複数の灌流デバイス１を連結して使用するという観点からは、内通路ユニット３は２個以上であることが好ましい。また、複数の灌流デバイス１を連結して使用するという観点からは、内通路ユニット３が１対以上設けられる形態も好ましく挙げられる。

【0065】

また、本実施形態では、１単位の内通路ユニット３につき３本の第１内通路３１が設けられた形態を示したが、本発明はこれに限定されない。すなわち、１の内通路ユニット３あたりの第１内通路３１の数は、１、３、４、７個等の任意の数とすることができる。
本発明においては、第１内通路３１の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは４個以上である。また、第１内通路３１の数は、灌流デバイス１の使用性の観点から、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下である。

【0066】

ここで、流路形成部材の設置の容易性の観点から、複数の内通路ユニット３の備える第１内通路３１の本数は、それぞれ同数であることが好ましい。また、偶数個の内通路ユニット３が対となるように設けられている場合、内通路ユニット３の備える第１内通路３１の本数は、対となる内通路ユニット３同士で同数であることが好ましい。

【0067】

また、本実施形態では、第２内通路３２が第１内通路３１の中途から上方に延び、側壁２に設けられた上方開口３２１にて開放する形態を示したが、本発明はこれに限定されない。第２内通路３２は、側壁２内で第１内通路３１と連通する開口と、側壁の外部へ開放する開口を備える形態であればよい。他の実施の形態としては、例えば、第２内通路３２が第１内通路３１の中途から延び前記側壁２の下方より開放する形態が挙げられる。
ポンプＰへの配管８の接続等、灌流デバイス１の準備を迅速に行うという観点からは、第２内通路３２は、第１内通路３１の中途から上方に延び、側壁２の上方より開放する形態であることが好ましい。

【0068】

本発明の灌流デバイス１は、人工皮膚組織、人工筋組織、肝臓組織や膵臓組織等の人工消化器官系組織、腎臓組織等の人工泌尿器系組織、人工神経組織の製造に用いることができ、中でも人工皮膚組織の製造に好適に用いることができる。特に、後述するように、管腔層Ｌ３を有する灌流流路Ｃ（血管様チャネル）が貫通する真皮組織層Ｌ１、表皮組織層Ｌ２及び角層Ｌ４で構成される人工皮膚組織の製造に用いることができる。

【0069】

また、本発明は、上述の灌流デバイス１と、ワイヤー６等の流路形成部材を組み合わせた、人工三次元組織製造キットの形態とすることもできる。当該キットには、複数の灌流デバイス１が含まれることが好ましい。当該キットは、さらに、２以上のウェルを備え灌流デバイス１を収容可能な培養プレートＤ（例えば、マルチウェルプレート）、灌流デバイス１を連結するための配管８等を含んでもよい。

【0070】

本発明の灌流デバイス１は、３Ｄプリンタ等を用いて既存の手法により製造することができる。

【0071】

本発明の灌流デバイス１は、耐久性があり、アルコール等の殺菌処理に耐性のある素材からなることが好ましい。具体的には、ＡＢＳ樹脂、ＰＬＡ樹脂、ＡＳＡ樹脂、ＰＥＴ樹脂、ＰＥＴＧ樹脂、エポキシ系樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、熱硬化性樹脂、光硬化性アクリル樹脂等を用いることができる。本発明においては、取得が容易でありかつ成型加工性に優れるといった点から、光硬化樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＰＬＡ樹脂、ＰＥＴＧ樹脂を用いることが好ましい。

【0072】

［人工皮膚組織の製造方法］
本発明は、人工皮膚組織の製造方法に関する。本発明の好ましい形態では、人工皮膚組織の製造は、上述の人工三次元組織灌流デバイスを用いて実施する。

【0073】

本発明の人工皮膚組織の製造方法は、灌流デバイス１を準備する準備工程と、真皮組織層Ｌ１を形成させる第１の培養工程と、真皮組織層Ｌ１の形成後表皮組織層Ｌ２を形成させる第２の培養工程と、表皮組織層Ｌ２の形成後真皮組織層Ｌ１を貫通する灌流流路Ｃを形成させる流路形成工程と、灌流流路Ｃに管腔層Ｌ３を形成させる第３の培養工程と、灌流流路Ｃに培地を灌流させながら表皮組織上に角層Ｌ４を形成させる第４の培養工程を含む。

【0074】

以下、図８～１２を用いて、本発明の人工皮膚組織の製造方法について説明を加える。

【0075】

（準備工程）
準備工程では、人工皮膚組織の製造に使用する灌流デバイス１の使用準備を行う。
本工程では、初めに、灌流デバイス１に新液化処理を施すことが好ましい。新液化処理により、製造する組織の接着を強化することができる。真皮細胞及び細胞外マトリックス成分の播種及び培養は、新液化処理後１時間以内に開始することが好ましく、６０分以内に開始することがより好ましい。
新液化処理としては、酸素プラズマ処理が好適に挙げられる。酸素プラズマ処理は、１～１０分間行うことが好ましく、具体的には２分間行うことが好ましい。

【0076】

続いて、対向する第１内通路３１にワイヤー６（流路形成部材）を挿通し、培養空間Ｓにワイヤー６を懸架させる。用いるワイヤー６の材質は特に限定されないが、好ましくはポリアミド樹脂である。
次いで、側壁２の下方に蓋５を取り付けて、培養空間Ｓの下方空間を閉塞する。

【0077】

灌流デバイス１の準備の完了後、該灌流デバイス１を培養プレートＤに設置する。培養プレートＤは、細胞培養に用いられる複数のウェルを備えたプレートを用いることができ、具体的には６ウェルプレート等が好適に使用できる。培養プレートＤの各ウェルの直径は、３２～４０ｍｍの範囲であることが好ましい。

【0078】

（第１の培養工程）
第１の培養工程は、真皮細胞を培養し、真皮組織層Ｌ１を灌流デバイス１の組織形成部４に形成させる工程である（図８及び９）。
本工程では、初めに、真皮細胞と細胞外マトリックス成分の混合物を灌流デバイス１内に投入する（図８）。混合物は、好ましくは組織形成部４が浸漬する高さ以上まで注ぎ込まれる。

【0079】

本発明で用いる真皮細胞としては、線維芽細胞を用いることが好ましい。線維芽細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来線維芽細胞が好ましい。ヒト由来線維芽細胞としては、正常ヒト皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：ＮＨＤＦ）、ヒト肺線維芽細胞（Human Pulmonary Fibroblasts：ＨＰＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（Human Cardiac Fibroblasts：ＨＣＦ）、ヒト大動脈外膜線維芽細胞（Human Aortic Adventitial Fibroblasts：ＨＡｏＡＦ）、ヒト子宮線維芽細胞（Human Uterine Fibroblasts：ＨＵＦ）、ヒト絨毛間葉系線維芽細胞（Human Villous Mesenchymal Fibroblasts：ＨＶＭＦ）等が挙げられ、中でも正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を用いることが好ましい。

【0080】

本発明で用いる細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどが挙げられる。本発明では、Ｉ型コラーゲンを用いることが好ましい。

【0081】

灌流デバイスに真皮細胞及び細胞外マトリックス成分を投入後、所定の条件で培養（インキュベーション）する。培養条件は、公知の細胞培養条件を採用することができるが、３７℃の温度下で３０～６０分間行うことが好ましい。
上記期間の培養後、蓋５を取り外し、側壁２の下方を開放する。その後、ピペットチップなどを用いて、形成された真皮組織層Ｌ１を側壁２から剥離し、所定期間培養する。側壁２から剥離後の培養期間は、７日間程度であることが好ましい。

【0082】

培養後、細胞外マトリックス成分が収縮し、真皮組織層Ｌ１が灌流デバイス１の組織形成部４に密着する（図９）。この時、真皮組織層Ｌ１は、組織形成部４に設けられた突起（組織脱落抑制手段４１）を覆うように形成される。さらに、真皮組織層Ｌ１は、突起４２を覆い、突起４２の下部空間に入り込むように形成させる。これにより、皮膚組織の灌流デバイス１への接着性が高まる。

【0083】

（第２の培養工程）
第２の培養工程は、真皮組織層Ｌ１形成後、表皮細胞を培養し、表皮組織層Ｌ２を形成させる工程である（図１０）。本工程では、真皮組織層Ｌ１の上部に表皮細胞を播種し、所定時間静置した後、培養を行う。具体的には、表皮細胞を播種して１５分静置後、インキュベータで３０分間培養することが好ましい。
その後、皮膚組織全体を培地に浸漬して行う浸漬培養にて所定期間培養する。培養条件は、公知の細胞培養条件を採用することができるが、３７℃の温度下で４～５日間行うことが好ましい。

【0084】

本発明で用いる表皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来表皮細胞が好ましい。ヒト由来表皮細胞としては、表皮角化細胞、表皮メラノサイトが挙げられる。表皮角化細胞としては、正常ヒト表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes：ＮＨＥＫ）等の表皮角化細胞、正常ヒト表皮メラノサイト（Normal Human Epidermal Melanocytes：ＮＨＥＭ）等の表皮メラノサイトが挙げられる。本発明では、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を用いることが好ましい。

【0085】

（流路形成工程）
流路形成工程は、表皮組織層Ｌ２の形成後、真皮組織層Ｌ１を貫通する灌流流路Ｃを形成させる工程である。本工程では、第１内通路３１に挿入されたワイヤー６を抜去する。これにより、真皮組織層Ｌ１には空洞の灌流流路Ｃが形成される。

【0086】

（第３の培養工程）
第３の培養工程は、灌流流路Ｃの内部に管腔層Ｌ３を形成させる工程である。
本工程では、まず、灌流流路Ｃの内部に血管系細胞を注入する。血管系細胞の注入は、チューブを連結したシリンジ等を用いて行うことができる。

【0087】

血管系細胞は、一定期間振盪培養することにより、灌流流路Ｃの壁面に付着し、管腔層Ｌ３を形成する（図１１）。血管系細胞の培養は、３７℃で２～３日間行うことが好ましい。また、培養は、培地に浸漬して行う浸漬培養とすることが好ましい。

【0088】

本発明で用いる血管系細胞としては、血管上皮細胞、血管内皮細胞等が挙げられ、中でも血管内皮細胞を用いることが好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞がより好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：ＨＵＶＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（Human Umbilical Artery Endothelial Cells：ＨＵＡＥＣ）、ヒト冠状動脈内皮細胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells：ＨＣＡＥＣ）、ヒト伏在静脈内皮細胞（Human Saphenous Vein Endothelial Cells：ＨＳａＶＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（Human Pulmonary Artery Endothelial Cells：ＨＰＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells：ＨＡｏＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells：ＨＤＭＥＣ）、ヒト皮膚血管内皮細胞（Human Dermal Blood Endothelial Cells：ＨＤＢＥＣ）、ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells：ＨＤＬＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells：ＨＰＭＥＣ）、ヒト心臓微小血管内皮細胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells：ＨＣＭＥＣ）、ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Human Bladder Microvascular Endothelial Cells：ＨＢｄＭＥＣ）、ヒト子宮微小血管内皮細胞（Human Uterine Microvascular Endothelial Cells：ＨＵｔＭＥＣ）等が挙げられ、中でもヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）用いることが好ましい。

【0089】

また、第３の培養工程において、表皮組織層Ｌ２の角層Ｌ４への分化を促進するため、浸漬用の培地にカルシウムイオンを添加することが好ましい。カルシウムイオンの培地中濃度は、好ましくは１．０～３．０ｍＭ、より好ましくは１．５～２．０ｍＭである。添加する化合物の種類は塩化カルシウムが好ましい。

【0090】

（第４の培養工程）
第４の培養工程は、灌流流路Ｃに培地を灌流させた状態で、角層Ｌ４を形成させる工程である。角層Ｌ４の形成は、真皮組織層Ｌ１を介して灌流流路Ｃを流れる培地の栄養分を拡散させつつ、表皮組織層Ｌ２を気液界面で培養することにより行われる。培地を灌流させた状態で皮膚組織の培養を行うことで、表皮組織の角層化の誘導を促進することができる。

【0091】

本工程では、気液界面培養の実施前に、灌流デバイス１の第１内通路３１の有する外側開口３１１を、封止部材７で封止する。用いる封止部材７は、図１２に示すように外側開口３１１の開口を封止できる部材であれば特に限定されない。すなわち、予め外側開口３１１の形状に合わせ合成樹脂等で製造した部材を用いてもよいし、市販の接着剤等を封止部材７として塗り込み、外側開口３１１を封止してもよい。

【0092】

外側開口３１１を封止部材７で封止後、灌流デバイスの装着部２１に配管８を接続する。灌流デバイスに１対設けられた２つの内通路ユニット３について、一方の内通路ユニット３はポンプＰからの培地を受け取る入口として機能し、他方の内通路ユニット３は培地をポンプＰへ排出する出口として機能する。図１２において、内通路ユニット３の通路内に示した矢印は、培地の流入及び流出の方向を示す。

【0093】

配管８を介してポンプＰから送られた培地は、一方の内通路ユニット３内に流入し、灌流流路Ｃを通り真皮組織層Ｌ１を通過する。その後、当該培地は他方の内通路ユニット３を通過し、再びポンプＰへと回収される。このようにして、培地を灌流流路Ｃに循環させ、管腔層Ｌ３を通して培地成分を真皮組織層Ｌ１へ拡散させることができる。

【0094】

角層Ｌ４の形成は、３７℃で７～１４日間行うことが好ましい。

【0095】

角層Ｌ４の誘導において、灌流させる培地には、表皮組織層Ｌ２の角層Ｌ４への分化を促進するため、カルシウムイオンを添加することが好ましい。カルシウムイオンの培地中濃度は、好ましくは１．０～３．０ｍＭ、より好ましくは１．５～２．０ｍＭである。添加する化合物の種類は塩化カルシウムが好ましい。

【0096】

複数の灌流デバイスについて同時に角層Ｌ４の形成を行う場合、配管８を用いて複数の灌流デバイスをポンプＰに接続し、気液界面培養を行ってもよい（図１３）。図１３の矢印は、配管８を流れる培地の方向を示す。

【0097】

このように、本発明の人工三次元組織灌流デバイスを用いれば、６ウェルプレート等のマルチウェルプレート内で同時に複数の人工皮膚組織を製造することができる。これにより、同一品質の人工皮膚組織を多量に製造することが可能となる。

【0098】

本発明では、上述の第１の培養工程、第２の培養工程、流路形成工程、第３の培養工程、及び第４の培養工程を、上記の順に実施することが好ましい。特に、第１の培養工程及び第２の工程後に流路形成工程を行うことで、潰れにくく、十分な直径を保持した灌流流路Ｃを形成させることができる。

【0099】

また、灌流デバイスに挿入するワイヤー６（流路形成部材）の直径を変更することで、灌流流路Ｃの直径を容易に調節することができる。本発明では、流路形成部材として、直径が１００～５００μｍのナイロンワイヤーを好適に用いることができる。

【0100】

また、上記製造方法では、灌流流路Ｃを形成するための流路形成部材としてワイヤー等の線状部材を例示したが、流路形成部材は、ゲル材またはポリマーで作製した細胞付き又は細胞入りのファイバーを用いることもできる。この場合、第３の培養工程における血管系細胞を別途播種する工程を省くことができる。

【0101】

また、使用する流路形成部材は線状部材に限られず、面状部材を用いてもよい。面状部材としては、網目状の部材、メッシュ材等が挙げられる。

【0102】

［人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法］
本発明は、上述の方法で製造した人工皮膚組織を用いた薬剤評価方法（以下、薬剤評価方法という）に関する。
本発明の薬剤評価方法は、薬剤を前記人工皮膚組織に添加する添加工程と、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工皮膚組織の応答、及び／又は前記人工皮膚組織に対する前記薬剤の浸透性を測定する評価工程を含む。

【0103】

（添加工程）
添加工程では、人工皮膚組織に任意の薬剤を添加する。本発明における薬剤とは、有機化合物、無機化合物、動植物エキス等が挙げられ、医薬品等の薬剤だけでなく、化粧品、医薬部外品等を含むものとする。

【0104】

薬剤は、灌流デバイス１の上方空間から人工皮膚組織へ添加する。本発明における添加とは、具体的には、人工皮膚組織の表面への薬剤の塗布又は接触、皮内注射等の人工皮膚組織層内への薬剤の注入、及び、灌流流路内で薬剤を含む溶液を灌流させるといった灌流流路内への薬剤投与などが挙げられる。

【0105】

本発明の灌流デバイス１は、上述の通り、培養空間Ｓに皮膚組織が形成されると、側壁２内に囲まれた空間が上下に分断される。そのため、別途薬剤の流出を防ぐための囲い等を用意せずとも、上方空間から添加した薬剤が下方空間の培地等と混ざり合うことがないため、灌流デバイスの上方空間へ直接薬剤を添加できる。

【0106】

（評価工程）
評価工程では、薬剤を添加した人工皮膚の状態を評価する。具体的には、薬剤の接触による刺激に対する人工皮膚組織の応答、人工皮膚組織に対する薬剤の浸透性等測定が挙げられる。

【0107】

応答の測定とは、例えば、経皮電気抵抗の測定が挙げられる。具体的には、経内皮電気抵抗（Trans-endothelial electrical resistance；ＴＥＥＲ）、経上皮電気抵抗（Trans-epithelial electrical resistance；ＴＥＥＲ)を測定することができる。経皮電気抵抗の測定により、上皮のバリア機能を評価することができる。
本発明の灌流デバイス１を用いれば、上述の通り、形成された皮膚組織により側壁２内に囲まれた空間が上下に分断されるため、角層Ｌ４側の空間と真皮組織層Ｌ１下の組織深層側に通じる空間を生じさせることができる。そのため、別途囲い等を用意することなく、そのまま角層の経皮電気抵抗の測定に用いることが可能である。

【0108】

薬剤の浸透性の測定としては、皮膚組織（表皮組織、具体的には角層）の表面に薬剤を添加した後、灌流流路内及び／又は皮膚組織直下の薬剤の量を測定する方法が挙げられる。

【実施例0109】

以下、本発明の人工三次元組織灌流デバイスを用いた人工皮膚組織の製造、及び当該人工皮膚組織を用いた薬剤評価について実施例を示す。本実施例は本発明の一実施形態を示すものであり、本発明は当該実施例に限られるものではない。

【0110】

（１）人工皮膚組織の製造
（１－１）手順
本発明の人工三次元組織灌流デバイスを用いて、以下の手順で人工皮膚組織を製造した。灌流デバイスは、４対の第１内通路（計８個の第１内通路）を有するものを使用した。

【0111】

初めに、灌流デバイスについて、細胞接着向上のため、新液化処理を実施した。その後、第１内通路の外側開口部にナイロンワイヤー（流路形成部材）を計４本挿入し、蓋で底面を封鎖した。また、ナイロンワイヤーは、直径２００μｍ、及び５００μｍのものを用いた。
次いで、７０％エタノール等により滅菌した後、灌流デバイスを細胞培養プレート内へ静置した。

【0112】

６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製）を含むＨａｍ－Ｆ１２培地（新田ゼラチン株式会社製）：コラーゲンＩ型溶液（Ｔｙｐｅ Ｉ－Ａ Ｃｏｌｌａｇｅｎ、新田ゼラチン株式会社製）：再構成用緩衝液（新田ゼラチン株式会社製）＝８：１：１を灌流デバイス内部に充填し、コラーゲンが真皮様の層を形成するまで３７℃で３０分間培養した。
蓋を取り外し、ピペットチップを用いて真皮組織層をデバイスの側壁から剥がし、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．２５ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製）中で７日間培養して、真皮組織層の収縮を誘導した。

【0113】

培養後、上方の培地を取り除き、１×１０^６個の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製）を含むＫＧＭ２培地（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製）１００μＬを真皮組織層の上部に播種し、１５分静置後、３７℃で３０分培養した。
３０分培養後、等量のＨａｍ－Ｆ１２培地とＫＧＭ２培地を加え、３７℃で５日間培養した。

【0114】

培養後、皮膚組織からナイロンワイヤーを抜去し、シリンジポンプ（テルモシリンジＳＳ－０１Ｔ、テルモ社製）を用いて、第１内通路の外側開口から灌流流路内に１の第１内通路につき１×１０^５個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ロンザ社製）を含むＥＧＭ－２培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ Ｋｉｔ、ロンザ社製）を５０μＬ注入した。その後、１０分振盪培養した。さらにデバイスの上下を反転させ、１０分振盪培養した。
その後、上下を戻し表皮層の角層への分化を促進するために、ＤＭＥＭ培地とＫＧＭ２培地の等量混合後、カルシウム濃度１．８ｍＭに調製した培地（以下、カルシウム入り培地という）を添加し、３７℃で２日間培養して血管様チャネル（灌流流路）を形成させた。血管様チャネルの形成後、灌流デバイスについて、第１内通路の外側開口を全て接着剤で封止した。

【0115】

血管様チャネルの形成後、灌流デバイスの装着部にチューブを繋ぎ、ポンプ（ペリスタポンプ、アトー株式会社製）と接続した。形成した皮膚組織の上部が気液界面上から露出するように、灌流デバイスの上部に溜まった培地を廃棄した。
次いで、ポンプを稼働させ、０．１～０．５ｍＬ／ｍｉｎとなるように上述のカルシウム入り培地を灌流させながら、表皮組織層の上層の角層化の誘導を促進した。角層化の誘導は、３７℃で７日間行った。カルシウム入り培地の半分は２日または３日ごとに交換した。

【0116】

次いで、２００μｍのナイロンワイヤーを使用して製造した皮膚切片を用いて、ＨＥ染色、ＣＫ１０、ＣＫ１５、ＣＤ３１免疫組織染色を以下の手順で行った。

【0117】

（ＨＥ染色）
製造した皮膚組織を４％パラホルムアルデヒドで固定後、凍結皮膚切片を作製し、常法によりＨＥ染色を行った。得られた皮膚切片を顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｉｍａｇｅｒ、Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で観察した（図１４）。

【0118】

（ＣＫ１０、ＣＫ１５免疫組織染色）
製造した皮膚組織を４％パラホルムアルデヒドで固定後、凍結皮膚切片を作製した。切片をＰＢＳ洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング処理を行った。その後、以下の一次抗体を加えて室温で１時間培養した。皮膚切片をＰＢＳで洗浄後、二次抗体を加えて室温で２時間培養した。次いで、皮膚切片をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で核を染色し、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｉｍａｇｅｒ、Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で観察した（図１５（ａ））。
・一次抗体：ＣＫ１０抗体（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １０ 抗体、Ａｂｃａｍ製）を１％ＢＳＡで１：１５０に希釈、ＣＫ１５抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ５／１４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡで１：２００に希釈したもの
・二次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（ｏｒ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ （ｏｒ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧ Ｈ＋Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡで１：４００に希釈したもの

【0119】

（ＣＤ３１免疫組織染色）
製造した皮膚組織を、固定せずに瞬間凍結し、凍結切片を作製した。切片をＰＢＳで洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング処理を行った。その後、以下の一次抗体を加えて室温で１時間培養した。皮膚切片をＰＢＳで洗浄後、二次抗体を加えて室温で２時間培養した。次いで、皮膚切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで核を染色した。得られた皮膚切片を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｉｍａｇｅｒ、Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で観察した（図１５（ｂ））。
・一次抗体：ＣＤ３１抗体（Ａｎｔｉ－ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１％ＢＳＡで１：４００に希釈したもの
・二次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡで１：４００に希釈したもの

【0120】

（１－２）結果
図１４に示す通り、上述の方法により、血管様チャネル（灌流流路）を有する真皮組織層が製造されることが観察された。また、免疫組織染色の結果から、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１が血管様チャネルの内壁に沿って発現していることが確認された（図１５（ｂ））。また、角層マーカーのＣＫ１０及び上皮細胞のマーカーのＣＫ１５の免疫組織染色の結果から、表皮組織の上に角層が形成されていることが確認された（図１５（ａ））。

【0121】

また、血管様チャネルの直径は、直径２００μｍのナイロンワイヤーを用いた場合でもさほど収縮せず、十分な大きさが得られた（図１４（ａ））。直径５００μｍのナイロンワイヤーを使用した場合は、２００μｍのワイヤーを使用した場合よりも血管様チャネルの直径が大きくなった（図１４（ｂ））。
すなわち、本発明の製造方法によれば、ワイヤーの直径と比して血管様チャネルの直径が収縮しにくいことから、ワイヤーの直径を調節することで、血管様チャネルの直径を任意の大きさへと容易に調節することができる。

【0122】

以上より、上述の手順により、内部に血管様チャネルを有する真皮組織層、表皮組織層、及び角層を有する人工皮膚組織が製造できることが示された。

【0123】

（２）人工皮膚組織のバリア機能の評価
バリア機能は、角層インピーダンスメータ ＡＳ－ＴＺ１（日本アッシュ株式会社）を用いて経皮電気抵抗の測定にて評価した。製造した皮膚組織の角層側及び真皮側にＰＢＳを添加し、角層インピーダンスメータの銀電極を角層側のＰＢＳに浸し、塩化銀電極を真皮側（すなわち、灌流デバイス１の周囲）のＰＢＳに浸し測定した（図１６（ａ）参照）。経皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）は、電気抵抗値（ｋΩ）と製造した皮膚組織の角層側の面積の積にて算出した。角層形成時に灌流無しの場合と灌流有りの場合を比較した結果を、図１７に示す。

【0124】

図１７に示す通り、角層形成時に灌流を行った皮膚組織は、灌流を行わなかった皮膚組織と比較して高い経皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を示した。すなわち、角層形成時に灌流をすることで、高いバリア機能を持つ皮膚組織が製造されることが確認された。

【0125】

（３）人工皮膚の経皮吸収性の評価
製造した皮膚組織の皮膚直下に３ｍＬのＰＢＳを添加し、角層側に投与液（ＰＢＳにカフェインを１５ｍｇ／ｍＬ溶解した溶液）を２００μＬ添加した（図１６（ｂ）参照）。投与液添加後の１５分、３０分、４５分、及び６０分に、皮膚直下のＰＢＳ溶液及び灌流流路からの灌流液を回収した。ＰＢＳ回収後、皮膚直下においては回収量と等量の新鮮なＰＢＳを添加した。
回収した溶液は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＵＶ （Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ／ＭＳ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ社製））にて分析した。得られた分析結果について、灌流開始からの経過時間を横軸とし、カフェインの検出量を縦軸とした、カフェインの累積透過量を算出した（図１８）。

【0126】

図１８に示す通り、皮膚直下から回収したＰＢＳ溶液及び灌流液の何れからも、カフェインが検出された。すなわち、製造された皮膚組織は、表皮組織層、真皮組織層及び血管様チャネル（灌流流路）の全ての領域で経皮吸収性を有することが確認された。

【0127】

上記（２）及び（３）の結果より、本発明の灌流デバイス、及びこれを用いて作製した人工皮膚組織は、上皮のバリア機能評価、経皮吸収性評価といった評価に好適に用いることができることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0128】

本発明は、本発明は、化粧品、医薬、製薬の分野において、人工三次元組織の製造、及び、人工皮膚組織を用いた化粧品・医薬品等の薬剤評価等のために用いることができる。

【符号の説明】

【0129】

１ 人工三次元組織灌流デバイス（灌流デバイス）
２ 側壁
２１ 装着部
２２ 凸部
３ 内通路ユニット
３１ 第１内通路
３１１ 外側開口
３１２ 内側開口
３２ 第２内通路
３２１ 上方開口
３２ａ 貯留空間
４ 組織形成部
４１ 組織脱落抑制手段
４２ 突起
５ 蓋
５１ 凹部
６ ワイヤー
７ 封止部材
８ 配管
Ｌ１ 真皮組織層
Ｌ２ 表皮組織層
Ｌ３ 管腔層
Ｌ４ 角層
Ｃ 灌流流路
Ｐ ポンプ
Ｄ 培養プレート
Ｓ 培養空間

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】