特開2023-158350トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素発現ベクターおよび当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023158350
(43)【公開日】2023-10-30
(54)【発明の名称】トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素発現ベクターおよび当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231023BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20231023BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231023BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20231023BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20231023BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20231023BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/70 Z
C12N1/21
C12N9/10
C12N9/22
C12N15/55
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022068134
(22)【出願日】2022-04-18
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】野口 惇
(72)【発明者】
【氏名】服部 将人
(72)【発明者】
【氏名】大熊 里佳
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD01
4B050LL03
4B065AA26X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA29
4B065CA31
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】 遺伝子組換え大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なプラスミドベクターを提供すること。
【解決手段】 ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドとを含むプラスミドベクターにより、前記課題を解決する。
【選択図】 図２
【解決手段】 ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドとを含むプラスミドベクターにより、前記課題を解決する。
【選択図】 図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に付加する融合タグをコードするポリヌクレオチドとを含む、前記酵素を宿主で発現させるためのプラスミドベクターであって、
前記宿主が大腸菌であり、前記融合タグが少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む、前記ベクター。
前記宿主が大腸菌であり、前記融合タグが少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む、前記ベクター。
【請求項2】
融合タグをコードするポリヌクレオチドが、ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端に付加される、請求項１に記載のベクター。
【請求項3】
請求項１または２に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項4】
請求項３に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【請求項5】
以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかから選択されるＡＭＶ逆転写酵素と、当該ポリペプチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグとを含む、ポリペプチド；
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有するポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有するポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
【請求項6】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＭＶ逆転写酵素と、当該ポリペプチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグとを含む、ポリペプチド；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を宿主で発現させるためのベクター、および当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法に関する。特に本発明は、前記酵素を宿主で大量発現可能なベクター、および当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成等の用途で、遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬などに利用されている。
【0003】
ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、古くから、ニワトリを用いてＡＭＶを増殖させ、得られたＡＭＶから前記酵素を抽出・精製し、製造する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら生産性に課題があった。
【0004】
ＡＭＶを用いないＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、タンパク質を安定的に大量生産可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた製造方法が知られている。一例として、特許文献２には、融合ペプチド配列（融合タグ）なしでＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子（ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子）を発現させる方法が、特許文献３には、精製を容易にする目的で連続した８残基のアルギニン残基からなるアルギニンタグや連続した６残基のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグを融合させてＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を発現させる方法が、それぞれ記載されている。しかしながら、工業的にＡＭＶ逆転写酵素を大量生産するためには、さらなる発現量の向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開昭６０－０９１９８１号公報
【特許文献2】特開２０１３－１４６２３５号公報
【特許文献3】特開２００２－３１５５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、遺伝子組換え大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なプラスミドベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドと、当該酵素に付加する特定のアミノ酸配列からなる融合タグをコードするポリヌクレオチドとを含む、前記酵素を発現させるためのベクターにより、前記酵素を大量に発現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下＜１＞から＜６＞に記載の態様を包含する。
すなわち本発明は以下＜１＞から＜６＞に記載の態様を包含する。
【0008】
＜１＞ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に付加する融合タグをコードするポリヌクレオチドとを含む、前記酵素を宿主で発現させるためのプラスミドベクターであって、
前記宿主が大腸菌であり、前記融合タグが少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む、前記ベクター。
前記宿主が大腸菌であり、前記融合タグが少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む、前記ベクター。
【0009】
＜２＞融合タグをコードするポリヌクレオチドが、ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端に付加される、＜１＞に記載のベクター。
【0010】
＜３＞＜１＞または＜２＞に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる、形質転換体。
【0011】
＜４＞＜３＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【0012】
＜５＞
以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかから選択されるＡＭＶ逆転写酵素と、当該ポリペプチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグとを含む、ポリペプチド；
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有するポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかから選択されるＡＭＶ逆転写酵素と、当該ポリペプチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグとを含む、ポリペプチド；
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有するポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
【0013】
＜６＞
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＭＶ逆転写酵素と、当該ポリペプチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグとを含む、ポリペプチド；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＭＶ逆転写酵素と、当該ポリペプチドの末端に付加した、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグとを含む、ポリペプチド；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド。
【0014】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0015】
本発明においてＡＭＶ逆転写酵素とは、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ、トリ骨髄芽球症ウイルス等とも呼称される）が有する逆転写酵素のことである。ＡＭＶ逆転写酵素の一例として、
（Ｉ）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。
（Ｉ）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。
【0016】
前記（ＩＩ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはＡＭＶ逆転写酵素の天然型バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）であり、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基からなり、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示す３箇所のアミノ酸残基の置換が生じたポリペプチドである；
配列番号１の２８０番目（配列番号２では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号１の３１１番目（配列番号２では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号１の４０２番目（配列番号２では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。
配列番号１の２８０番目（配列番号２では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号１の３１１番目（配列番号２では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号１の４０２番目（配列番号２では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。
【0017】
前記（ＩＩＩ）において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸残基の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。相同性は７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していてもよい。
【0018】
なお前述したＡＭＶ逆転写酵素はβ鎖と呼ばれるポリペプチドである。一方、ＡＭＶ逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のポリペプチドであるα鎖も存在する。ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。
【0019】
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端側５７２残基からなるポリペプチドである、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
【0020】
ＡＭＶ逆転写酵素は、前述したβ鎖のモノマーやホモダイマー、前述したα鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（以下、「αβ体」とも表記する）などを構成することが知られているが、本発明のベクターを用いて宿主で発現させるＡＭＶ逆転写酵素はこれらのいずれの形態を有していてもよい。
【0021】
本発明では、ＡＭＶ逆転写酵素の末端（Ｎ末端および／またはＣ末端）に、少なくとも２残基以上２０残基以下の、好ましくは３残基以上１５残基以下の、より好ましくは３残基以上１０残基の、さらにより好ましくは４残基以上６残基以下の、連続したリジン残基を含むポリペプチド（融合タグ）を付加した態様で前記酵素を発現させることを特徴としており、前記酵素を大量に発現できる。
【0022】
連続したリジン残基が２残基以上存在し、かつＡＭＶ逆転写酵素の大量発現という機能を有している限り、当該融合タグに存在する連続したリジン残基の内部および／または末端に、リジン残基以外のアミノ酸残基を挿入しても良い。ただし融合タグのアミノ酸残基数が多すぎると、前記酵素の機能や特性、立体構造などに影響を及ぼす恐れがあるため、前記リジン残基以外のアミノ酸残基数は少ない方が好ましい。
【0023】
融合タグを付加する位置は、ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端またはＣ末端のいずれか一方でも良く、Ｎ末端およびＣ末端の両末端に付加しても良いが、Ｎ末端のみに付加すると前記融合タグの効果（ＡＭＶ逆転写酵素発現量向上）が最も発揮できる点で、好ましい。
【0024】
本発明では、融合タグに柔軟性を持たせることや、融合タグとＡＭＶ逆転写酵素との間に距離を置き相互作用を防止することなどを目的に、前記融合タグとＡＭＶ逆転写酵素との間に任意のポリペプチド（リンカー）を挿入しても良い。リンカーの長さは特に限定しないが、前述したリンカーの効果を発揮し、かつ融合タグやＡＭＶ逆転写酵素の機能や特性に与える影響を低くする点から、１残基以上５残基以下、好ましくは１残基以上３残基 以下からなるリンカーが例示できる。リンカーのアミノ酸配列についても特に限定はなく、一般的な例としてグリシン、セリン、および／またはプロリンを用いたリンカー配列が例示される。なお融合タグやＡＭＶ逆転写酵素の機能・特性に与える影響を低くする点から、立体障害が少なく柔軟性が高いグリシンやセリンを用いたリンカー（ＧＳリンカー）やグリシンの繰り返し配列などが好ましく、グリシン２残基からなるリンカーがより好ましい。
【0025】
本発明における融合タグを付加したＡＭＶ逆転写酵素は、その機能を損ねない範囲で、前記融合タグ以外のタグペプチドを、前記酵素の末端（Ｎ末端および／またはＣ末端）にさらに有しても良い。前記タグペプチドの一例として、分析・精製を容易にするためのタグペプチド（ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグなど）や、大腸菌での分泌発現を促すためのシグナルペプチド（ＯｍｐＡシグナルペプチド、ＰｅｌＢシグナルペプチドなど）、ベクターの開始コドン（メチオニン）やマルチクローニングサイト（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）由来のペプチドなどがあげられる。
【0026】
本発明においてＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とも表記する）とは、当該酵素と実質的に同一なタンパク質を発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。ここで「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの酵素活性（逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性）のうち少なくとも１つが、天然型ＡＭＶ逆転写酵素と同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。例えば、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％以上（好ましくは８０％以上、９０％以上、または９５％以上）の相同性を有したヌクレオチド配列を含む遺伝子から翻訳されたタンパク質であってよい。またここで「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、具体的には、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、または７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムが共存する条件が例示できる。
【0027】
本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一例として、
ＡＭＶ逆転写酵素（β鎖）である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号４）や、
ＡＭＶ逆転写酵素α鎖である、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号５）があげられる。
ＡＭＶ逆転写酵素（β鎖）である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号４）や、
ＡＭＶ逆転写酵素α鎖である、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号５）があげられる。
【0028】
本発明のベクターにおけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の位置は、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で適宜設定してよい。挿入するプラスミドベクターは、形質転換する大腸菌内で安定に存在し、複製できるものであれば特に制限はない。プラスミドベクターの具体例として、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られている、ｐＴｒｃ系プラスミドベクター、ｐＵＣ系プラスミドベクター、ｐＢＲ系プラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター、広宿主域（Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクターがあげられる。その中でもｐＴｒｃ系プラスミドベクターであるｐＴｒｃ９９Ａは、形質転換した大腸菌内で安定に存在できるため、好ましい。
【0029】
本発明のベクターは、前記ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に、前述した融合タグ（以降、「融合タグ」は前述したリンカーをさらに挿入した態様も含む）をコードするポリヌクレオチドを付加していることを特徴としている。なお本発明のベクターを用いてαβ体のＡＭＶ逆転写酵素を発現させる場合、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の遺伝子と同酵素β鎖の遺伝子とを、本発明の形質転換体内で共発現させてもよい。この場合、前記α鎖遺伝子および前記β鎖遺伝子の双方に前述した融合タグをコードするポリヌクレオチドを付加しても良いし、前記α鎖遺伝子の発現量と前記β鎖遺伝子の発現量とのバランスを調整する目的などから、どちらか一方にのみ前述した融合タグをコードするポリヌクレオチドを付加しても良い。また、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素を製造する方法として、後述した方法でＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子を含む本発明のプラスミドベクターで形質転換して得られた組換え大腸菌（形質転換体）を用いて、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖を発現後、大腸菌の内在性のプロテアーゼによってα鎖を形成することで、αβ体を製造する方法もあげられ、当該方法は本発明のベクター構築が容易な点で好ましい。
【0030】
本発明のベクターは、大腸菌内でＡＭＶ逆転写酵素を発現させるためのベクターである。当該大腸菌の好ましい態様として、大腸菌ＭＶ１１８４株（ＡＴＣＣ ４７１０８）、大腸菌ＧＭ３１株（ＮＢＲＰ ＭＥ７７４１）、大腸菌ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）、大腸菌ＪＭ１０１株（ＮＢＲＰ ＭＥ９０４３）および大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）があげられる。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。
【0031】
本発明のベクターを用いて大腸菌を形質転換するには、公知の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法）で行なえばよい。
【0032】
前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養は、公知の方法を利用すればよく、例えばＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２ＹＴ培地を用いる方法があげられる。なお本発明のベクターに薬剤耐性遺伝子を有している場合、当該遺伝子に対応した薬剤を選抜剤として培地に添加すると、本発明の形質転換体を選択して培養できる点で好ましい。例えば、本発明のベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩や、適当な栄養源を添加してもよい。培養温度は、例えば１０℃以上４０℃以下の範囲であればよく、好ましくは２５℃以上３７℃以下の範囲、より好ましくは３７℃付近である。ｐＨは例えば５．９以上８．１以下の範囲であればよく、好ましくはｐＨ６．０付近である。培養時間は、例えば３時間以上であればよく、好ましくは１６時間以上、より好ましくは５０時間以上、さらに好ましくは７２時間以上である。
【0033】
本発明のベクターがｔｒｃプロモーターなど誘導性のプロモーターを有している場合、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）などの誘導剤を培地に添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導してもよい。この場合、培養開始時に誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで菌体を増殖させた後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよい。好ましくは、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）が概ね０．１以上２０．０以下を示す増殖期間、より好ましくは濁度が０．５以上１０．０以下を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、一例として終濃度で概ね０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲、より好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ付近である。なお、誘導操作後（誘導剤添加後）の培養温度を大腸菌の至適培養温度よりも低い温度まで下げると好ましく、具体的には１０℃以上３０℃以下の範囲、より好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲、さらにより好ましくは２５℃付近である。具体的には、特開２０１４－１１３１０６号公報に記載の方法を用いると、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産できる点で好ましい。
【0034】
前述した方法で得られた形質転換体の培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出するには、当該形質転換体による発現の形態によって、適宜抽出方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が大腸菌内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出すればよい。なお前記抽出段階では核酸など種々の夾雑物が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリエチレンイミン（商品名：ポリミンＰ）などの除核酸剤を添加し、前記核酸と共沈させることで、効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収できる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製できる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖と、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖と、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素とを、分離精製できる。
【発明の効果】
【0035】
本発明のベクターは、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドを付加していることを特徴としている。本発明のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体（組換え大腸菌）は、従来のベクターで形質転換して得られる形質転換体と比較し、前記酵素の発現量が増大している。したがって本発明により、ＡＭＶ逆転写酵素の工業的な製造に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】実施例および比較例で用いたプラスミドベクターにより発現されるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の構造を示す図である。
【図2】ＡＭＶ逆転写酵素の発現量を、ウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。なお発現量は、融合タグを付加しなかったとき（比較例２）の前記酵素の発現量（ウェスタンブロッティングでのバンド輝度）を１とした、相対値で示している。
【実施例0037】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0038】
実施例１ 遺伝子組換え大腸菌を用いたトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素発現（融合タグ：５残基連続したリジン残基）
（１）以下に示す方法でＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのベクターを調製した。
（１－１）配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
（１－２）あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターに、（１）で合成したポリヌクレオチドを挿入し、プラスミドベクターｐＡＭＶｂを調製した。
（１－３）Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、（１－２）で調製したｐＡＭＶｂに、５残基連続したリジン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドを挿入することで、ＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのプラスミドベクターを構築した。なお構築したプラスミドベクターのうち、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の３’末端に、５残基連続したリジン残基を含む融合タグ（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を挿入したプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－Ｃ５Ｋと命名し、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に、５残基連続したリジン残基を含む融合タグ（配列番号８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を挿入したプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－Ｎ５Ｋと命名する（表１）。
（１）以下に示す方法でＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのベクターを調製した。
（１－１）配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
（１－２）あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターに、（１）で合成したポリヌクレオチドを挿入し、プラスミドベクターｐＡＭＶｂを調製した。
（１－３）Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、（１－２）で調製したｐＡＭＶｂに、５残基連続したリジン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドを挿入することで、ＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのプラスミドベクターを構築した。なお構築したプラスミドベクターのうち、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の３’末端に、５残基連続したリジン残基を含む融合タグ（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を挿入したプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－Ｃ５Ｋと命名し、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に、５残基連続したリジン残基を含む融合タグ（配列番号８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を挿入したプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－Ｎ５Ｋと命名する（表１）。
【0039】
【表1】
【0040】
（２）（１）で得られたプラスミドベクターを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、ＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌を作製した。作製した前記大腸菌が発現する、ＡＭＶ逆転写酵素の構造を図１に示す。
【0041】
（３）（２）で作製したＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を、適量のカルベニシリンを含む２ＹＴ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）３ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍで一晩前培養した。
【0042】
（４）（３）の前培養液０．２ｍＬを、適量のカルベニシリンを含む２ＹＴ－ＰＮａ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム・二水和物 １４．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物 ２．５ｇ／Ｌ）２０ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで３時間培養した。
【0043】
（５）ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２５℃、１５０ｒｐｍでさらに３日間培養した。
【0044】
（６）培養液を遠心分離し、ＡＭＶ逆転写酵素を発現した大腸菌を回収した。
【0045】
（７）（６）で回収した大腸菌が発現したＡＭＶ逆転写酵素の量を、以下に示す方法で評価した。
（７－１）（６）で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（グリセロール １０％（ｗ／ｖ）、リン酸カリウム ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ジチオトレイトール ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）２ｍＬに懸濁し、超音波破砕機ＵＤ－１００（トミー精工）で破砕した。
（７－２）（７－１）で得られた菌体破砕液を、ジチオトレイトールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液に添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％（ｗ／ｖ）から２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。
（７－３）電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブレンに転写した。
（７－４）（７－３）のメンブレンに対して、１次抗体として抗ＡＭＶ逆転写酵素ラビットポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ラビットＩｇＧ抗体－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）を、発色試薬としてＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（サーモフィッシャー）を用いて染色し、ウェスタンブロッティング解析を実施した。
（７－５）（７－４）で染色したメンブレンを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ８００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて各バンドの輝度を定量解析した。
（７－１）（６）で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（グリセロール １０％（ｗ／ｖ）、リン酸カリウム ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ジチオトレイトール ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）２ｍＬに懸濁し、超音波破砕機ＵＤ－１００（トミー精工）で破砕した。
（７－２）（７－１）で得られた菌体破砕液を、ジチオトレイトールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液に添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％（ｗ／ｖ）から２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。
（７－３）電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブレンに転写した。
（７－４）（７－３）のメンブレンに対して、１次抗体として抗ＡＭＶ逆転写酵素ラビットポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ラビットＩｇＧ抗体－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）を、発色試薬としてＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（サーモフィッシャー）を用いて染色し、ウェスタンブロッティング解析を実施した。
（７－５）（７－４）で染色したメンブレンを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ８００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて各バンドの輝度を定量解析した。
【0046】
比較例１ 遺伝子組換え大腸菌を用いたＡＭＶ逆転写酵素発現（融合タグ：５残基連続したアルギニン残基）
実施例１（１－３）でｐＡＭＶｂに挿入する、融合タグをコードするポリヌクレオチドとして、５残基連続したアルギニン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドとした他は、実施例１と同様な方法で、ＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのプラスミドベクターを構築し、前記酵素を発現可能な大腸菌を作製し、前記酵素を発現させた。
実施例１（１－３）でｐＡＭＶｂに挿入する、融合タグをコードするポリヌクレオチドとして、５残基連続したアルギニン残基を含む融合タグをコードするポリヌクレオチドとした他は、実施例１と同様な方法で、ＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのプラスミドベクターを構築し、前記酵素を発現可能な大腸菌を作製し、前記酵素を発現させた。
【0047】
なお構築したプラスミドベクターのうち、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の３’末端に、５残基連続したアルギニン残基を含む融合タグ（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を挿入したプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－Ｃ５Ｒと命名し、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に、５残基連続したアルギニン残基を含む融合タグ（配列番号１２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）を挿入したプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－Ｎ５Ｒと命名する（表１）。また本例で作製したＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌が発現する、ＡＭＶ逆転写酵素の構造を図１に示す。
【0048】
比較例２ 遺伝子組換え大腸菌を用いたＡＭＶ逆転写酵素発現（融合タグなし）
実施例１（２）で形質転換に用いるプラスミドベクターとして、ｐＡＭＶｂを用いた他は、実施例１と同様な方法で、ＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのプラスミドベクターを構築し、前記酵素を発現可能な大腸菌を作製し、前記酵素を発現させた。なお本例で作製したＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌が発現する、ＡＭＶ逆転写酵素の構造を図１に示す。
実施例１（２）で形質転換に用いるプラスミドベクターとして、ｐＡＭＶｂを用いた他は、実施例１と同様な方法で、ＡＭＶ逆転写酵素を発現するためのプラスミドベクターを構築し、前記酵素を発現可能な大腸菌を作製し、前記酵素を発現させた。なお本例で作製したＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌が発現する、ＡＭＶ逆転写酵素の構造を図１に示す。
【0049】
ウェスタンブロッティング解析に基づく、実施例１ならびに比較例１および２で得られたＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌による前記酵素の発現量を比較した結果を図２に示す。なお図２において発現量は、ｐＡＭＶｂ（融合タグなし、比較例２）で形質転換して得られたＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌での発現量（バンドの輝度に相当）を１とした相対値で表している。連続したリジン残基を含む融合タグ（Ｃ末端：配列番号６、Ｎ末端：配列番号８）をＡＭＶ逆転写酵素（実施例１）の末端に付加することで、融合タグなしのＡＭＶ逆転写酵素（比較例２）と比較し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量が向上した。特に、前記融合タグをＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端に付加して発現させる（ｐＡＭＶｂ－Ｎ５Ｋ、融合タグ：配列番号８）と、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量がさらに向上した。以上の結果から、ＡＭＶ逆転写酵素の末端（Ｎ末端および／またはＣ末端）に、少なくとも２残基以上２０残基以下の連続したリジン残基を含む融合タグを付加することで、前記酵素の発現量が向上することがわかる。
【0050】
一方、連続したアルギニン残基を含む融合タグ（Ｃ末端：配列番号１０、Ｎ末端：配列番号１２）をＡＭＶ逆転写酵素の末端に付加すると（比較例１）、融合タグなしのＡＭＶ逆転写酵素（比較例２）と比較し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量が減少した。
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明のベクターにより、大腸菌宿主を用いたＡＭＶ逆転写酵素の大量発現が可能となるため、工業規模でのＡＭＶ逆転写酵素の製造を効率的に行なえる。
【図1】
【図2】
【配列表】