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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023159469
(43)【公開日】2023-11-01
(54)【発明の名称】肥満症を予防又は治療するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/403 20060101AFI20231025BHJP
A61K 31/635 20060101ALI20231025BHJP
A61K 31/57 20060101ALI20231025BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20231025BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231025BHJP
【ＦＩ】
A61K31/403
A61K31/635
A61K31/57
A61P3/04
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020141252
(22)【出願日】2020-08-24
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り Ａ．２０１９年８月２４日 「第２４回アディポサイエンス・シンポジウム」（千里ライフサイエンスセンター 第２会場（サイエンスホール））にて公開 Ｂ．２０１９年８月２４日 「第２４回アディポサイエンス・シンポジウム」（千里ライフサイエンスセンター 第２会場（サイエンスホール））にて公開 Ｃ．２０１９年８月２９日 「２０１９ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＆ Ａｓｉａ－Ｏｃｅａｎｉａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｏｂｅｓｉｔｙ（ＩＣＯＭＥＳ ＆ ＡＯＣＯ ２０１９）講演要旨集」にて公開 Ｄ．２０１９年８月３０日 「２０１９ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＆ Ａｓｉａ－Ｏｃｅａｎｉａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｏｂｅｓｉｔｙ（ＩＣＯＭＥＳ ＆ ＡＯＣＯ ２０１９）」（大韓民国 ソウル Ｃｏｎｒａｄ Ｈｏｔｅｌ）にて公開 Ｅ．２０１９年１０月１８日 「第４０回日本肥満学会／第３７回日本肥満症治療学会学術集会 抄録集アプリ」にて公開 Ｆ．２０１９年１１月３日 「第４０回日本肥満学会／第３７回日本肥満症治療学会学術集会」（東京国際フォーラム）にて公開 Ｇ．２０２０年７月１５日 「日本内分泌学会雑誌第９６巻第１号１６３頁」（第９３回日本内分泌学会学術総会抄録集）にて公開 Ｈ．２０２０年７月２０日～８月３１日 「第９３回日本内分泌学会学術総会」（ＷＥＢ開催）にて公開
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業ユニットタイプ「エピゲノム研究に基づく診断・治療へ向けた新技術の創出」研究開発領域，「２型糖尿病・肥満における代謝制御機構とその破綻のエピゲノム解析」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(71)【出願人】
【識別番号】303010452
【氏名又は名称】株式会社ＬＴＴバイオファーマ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】脇 裕典
(72)【発明者】
【氏名】山内 敏正
(72)【発明者】
【氏名】平池 勇雄
(72)【発明者】
【氏名】笠井 智香
(72)【発明者】
【氏名】野田 友人
(72)【発明者】
【氏名】福田 耕一郎
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC12
4C086DA10
4C086DA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA70
(57)【要約】
【課題】ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現を増強させて、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞の数や働きを高めることによる肥満症の予防又は治療するための医薬組成物を提供すること。
【解決手段】サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含む、肥満症を予防又は治療するための医薬組成物。
【選択図】なし
【解決手段】サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含む、肥満症を予防又は治療するための医薬組成物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含む、肥満症を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項2】
前記肥満症が、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低いことに起因する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記肥満症が、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の発現が低いことに起因する、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記肥満症が、ＵＣＰ－１の発現が低いことに起因する、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記肥満症が、ＮＦＩＡの発現が低いことに起因する、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記肥満症を予防又は治療することが、脂肪前駆細胞からベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞への分化を促進することにより達成される、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記肥満症を予防又は治療することが、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞から脂肪前駆細胞への脱分化を阻害することにより達成される、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記肥満症を予防又は治療することが、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の発現増加を促進することにより達成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記肥満症を予防又は治療することが、ＵＣＰ－１の発現増加を促進することにより達成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記肥満症を予防又は治療することが、ＮＦＩＡの発現増加を促進することにより達成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肥満症を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
肥満症とそれに起因するメタボリックシンドロームや肥満２型糖尿病は、心血管疾患、腎疾患や悪性腫瘍のリスクを高めることから、健康寿命の延伸を目指す上で大きな障害と言われている。近年、エネルギーの貯蔵を担う白色脂肪組織以外に、細胞が使うエネルギーを生産する細胞内小器官であるミトコンドリアにおけるＵｎｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＵＣＰ－１）というタンパク質による熱産生を介してエネルギーを消費する褐色脂肪組織が、ヒト成人にも存在することがわかってきた。リニエージトレーシングの結果から（古典的）褐色脂肪細胞が実は骨格筋細胞と同一のＭｙｆ５陽性前駆細胞から分化し、白色脂肪細胞とは前駆細胞が異なることが報告されている一方、寒冷刺激や交感神経刺激に応じて白色脂肪細胞の一部もＵＣＰ－１陽性で発熱能を持つ「ベージュ脂肪細胞（誘導型褐色脂肪細胞）」に変化し得ることが知られている。既に肥満の度合いと褐色脂肪組織の活性が負に相関すること、加齢に伴い褐色脂肪組織の活性が低下することが報告されており、褐色脂肪組織の数や働きを高めることが肥満症の新しい治療につながり得るとして期待されている（非特許文献１～５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０，１５００-１５０８ （２００９）．
【非特許文献2】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０，１５０９-１７ （２００９）．
【非特許文献3】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０，１５１８-２５ （２００９）．
【非特許文献4】Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５８，１５２６-１５３１（２００９）．
【非特許文献5】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，３４０４-３４０８ （２０１３）．
【非特許文献6】Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１７ Ｓｅｐ；１９（９）：１０８１－１０９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
脂肪細胞においてはこれまで、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ（ＰＰＡＲγ）と呼ばれる転写因子がその分化に必要十分であり、脂肪細胞分化のマスター転写因子と考えられてきた。しかし、本発明者らは、褐色脂肪組織に特異的なＤＮＡ上のオープンクロマチン領域の解析から、褐色脂肪組織の新規制御因子としてＮｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ Ｉ－Ａ （ＮＦＩＡ）を同定した。ＮＦＩＡがＰＰＡＲγに先行してＤＮＡへ結合し、かつＰＰＡＲγのＤＮＡへの結合を促進することで、ＮＦＩＡとＰＰＡＲγが協調的に褐色脂肪細胞の遺伝子プログラムを活性化することを見出した。すなわち、褐色脂肪特異的な遺伝子プログラムの活性化はＰＰＡＲγのみでは達成できず、ＮＦＩＡの存在が必須であることを明らかにした（非特許文献６）。
本発明者らは、ＮＦＩＡを欠損させたマウスの褐色脂肪組織では褐色脂肪の遺伝子プログラムが著しく障害されていた一方、筋肉や白色脂肪の前駆細胞にＮＦＩＡを導入すると褐色脂肪の遺伝子プログラムが活性化されることを見出した。さらに、ヒト成人の褐色脂肪組織でも白色脂肪組織と比較してＮＦＩＡが高発現していることも見出した。
従って、本発明の課題は、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、Ｐｐａｒｇ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １α（ＰＧＣ１α）、Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－α－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａ（ＣＩＤＥＡ）、及びＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ８ｂ（ＣＯＸ８Ｂ）からなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現を増強させて、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞の数や働きを高めることによる肥満症の予防又は治療するための医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、ＮＦＩＡを欠損させたマウスの褐色脂肪組織では褐色脂肪の遺伝子プログラムが著しく障害されていた一方、筋肉や白色脂肪の前駆細胞にＮＦＩＡを導入すると褐色脂肪の遺伝子プログラムが活性化されることを見出した。さらに、ヒト成人の褐色脂肪組織でも白色脂肪組織と比較してＮＦＩＡが高発現していることも見出した。
従って、本発明の課題は、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、Ｐｐａｒｇ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １α（ＰＧＣ１α）、Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－α－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａ（ＣＩＤＥＡ）、及びＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ８ｂ（ＣＯＸ８Ｂ）からなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現を増強させて、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞の数や働きを高めることによる肥満症の予防又は治療するための医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
そこで本発明者らは、白色脂肪細胞前駆細胞から脂肪細胞へと分化誘導する実験系でＵＣＰ－１の発現を増加させる化合物をスクリーニングし、特定の化合物が、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現を増強させて、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞の数や働きを高めることによる肥満症の予防又は治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［１３］を提供するものである。
［１］サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含む、肥満症を予防又は治療するための医薬組成物。
［２］前記肥満症が、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低いことに起因する、［１］記載の医薬組成物。
［３］前記肥満症が、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の発現が低いことに起因する、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
［４］前記肥満症が、ＵＣＰ－１の発現が低いことに起因する、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
［５］前記肥満症が、ＮＦＩＡの発現が低いことに起因する、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
［６］前記肥満症を予防又は治療することが、脂肪前駆細胞からベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞への分化を促進することにより達成される、［１］～［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］前記肥満症を予防又は治療することが、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞から脂肪前駆細胞への脱分化を阻害することにより達成される、［１］～［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］前記肥満症を予防又は治療することが、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の発現増加を促進することにより達成される、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］前記肥満症を予防又は治療することが、ＵＣＰ－１の発現増加を促進することにより達成される、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］前記肥満症を予防又は治療することが、ＮＦＩＡの発現増加を促進することにより達成される、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１１］肥満症を予防又は治療するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物。
［１２］肥満症の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物の使用。
［１３］サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を投与することを特徴とする、肥満症を予防又は治療する方法。
［１］サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含む、肥満症を予防又は治療するための医薬組成物。
［２］前記肥満症が、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低いことに起因する、［１］記載の医薬組成物。
［３］前記肥満症が、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の発現が低いことに起因する、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
［４］前記肥満症が、ＵＣＰ－１の発現が低いことに起因する、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
［５］前記肥満症が、ＮＦＩＡの発現が低いことに起因する、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
［６］前記肥満症を予防又は治療することが、脂肪前駆細胞からベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞への分化を促進することにより達成される、［１］～［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］前記肥満症を予防又は治療することが、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞から脂肪前駆細胞への脱分化を阻害することにより達成される、［１］～［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］前記肥満症を予防又は治療することが、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の発現増加を促進することにより達成される、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］前記肥満症を予防又は治療することが、ＵＣＰ－１の発現増加を促進することにより達成される、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］前記肥満症を予防又は治療することが、ＮＦＩＡの発現増加を促進することにより達成される、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１１］肥満症を予防又は治療するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物。
［１２］肥満症の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物の使用。
［１３］サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を投与することを特徴とする、肥満症を予防又は治療する方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現を増強させて、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞の数や働きを高めることによる、全く新しい肥満症の予防又は治療剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】Ｕｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現量が高い６６化合物の遺伝子発現プロファイルの確認の結果を示す。
【図2】クロルマジノン酢酸エステル（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、ラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）及びロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）のＵｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図3】クロルマジノン酢酸エステル（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、ラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）及びロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）のＮｆｉａ ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図4】クロルマジノン酢酸エステル（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、ラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）及びロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）のＰｇｃ１α ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図5】クロルマジノン酢酸エステル（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、ラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）及びロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）のＣｉｄｅａ ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図6】クロルマジノン酢酸エステル（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、ラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）及びロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）のＣｏｘ８ｂ ｍＲＮＡ発現量を示す。
【図7】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス作成のためのＤＮＡコンストラクトを示す。
【図8】Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの各臓器におけるＮｆｉａ遺伝子発現（Ａ）及びＮＦＩＡタンパク質の検出（Ｂ）結果を示す。
【図9】普通食下におけるＮｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の体重（Ａ）及び摂餌量（Ｂ）を示す。
【図10】高脂肪食下におけるＮｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の体重（Ａ）及び摂餌量（Ｂ）を示す。
【図11】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の普通食下（ＮＣＤ）及び高脂肪食下（ＨＦＤ）における体重（Ａ）、肝臓重量（Ｂ）、脂肪組織重量（Ｃ）を示す。
【図12】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の高脂肪食下（ＨＦＤ）における褐色脂肪組織のＨＥ染色（Ａ）及び脂肪滴サイズ（Ｂ）を示す。
【図13】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の高脂肪食下（ＨＦＤ）における鼠径部皮下白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）のＨＥ染色（Ａ）及び脂肪滴サイズ（Ｂ）を示す。
【図14】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の高脂肪食下（ＨＦＤ）における褐色脂肪組織（Ａ）鼠径部皮下白色脂肪組織（Ｂ）、生殖器周囲脂肪組織（Ｃ）における褐色脂肪関連遺伝子群のｍＲＮＡ発現変化を示す。
【図15】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の高脂肪食下（ＨＦＤ）における褐色脂肪組織（Ａ）鼠径部皮下白色脂肪組織（Ｂ）、生殖器周囲脂肪組織（Ｃ）におけるミトコンドリア関連遺伝子群のｍＲＮＡ発現変化を示す。
【図16】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の室温（ＲＴ）及び寒冷条件（４℃、Ｃｏｌｄ）における体温の変化を示す。
【図17】Ｎｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）の高脂肪食下（ＨＦＤ）における酸素消費量（Ａ）と呼吸商（Ｂ）の変化を示す。
【図18】高脂肪食下におけるＮｆｉａトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と野生型マウス（ＷＴ）のブドウ糖負荷試験（Ａ）及びインスリン負荷試験（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の肥満症を予防又は治療するための医薬組成物の有効成分は、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物である。
【0010】
サルフイソキサゾールは、次の式（１）で表される４－アミノ－Ｎ－３，４－ジメチル－５－イソオキサゾリル）ベンゼンスルホンアミドであり、スルホンアミド系抗菌薬、いわゆるサルファ剤の１種であり、主として結膜炎、眼瞼炎、角膜炎などの治療薬として用いられている。
【0011】
【化1】
【0012】
しかし、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡに対する作用、並びに肥満症に対する作用は知られていない。
【0013】
クロルマジノンは、６－クロロ－３，２０－ジオキソプレグナ－４，６－ジエン－１７－オールであり、その酢酸エステルであるクロルマジノン酢酸エステルは、次の式（２）で表される６－クロロ－３，２０－ジオキソプレグナ－４，６－ジエン－１７－イル アセテートであり、プロゲステロン受容体作動薬、アンドロゲン受容体拮抗薬としての作用を有し、前立腺肥大症、前立腺癌などの治療薬として用いられている。
【0014】
【化2】
【0015】
しかし、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡに対する作用、並びに肥満症に対する作用は知られていない。
【0016】
ラマトロバンは、次の式（３）で表される（＋）－（３Ｒ）－３－（４－フルオロベンゼンスルホンアミド）－１，２，３，４－テトラヒドロカルバゾール－９－プロピオン酸であり、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤であり、アレルギー性鼻炎治療薬として用いられている。
【0017】
【化3】
【0018】
しかし、ＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡに対する作用、並びに肥満症に対する作用は知られていない。
【0019】
サルフイソキサゾール、クロルマジノン、ラマトロバンの塩としては、化合物の性状に応じて、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、酢酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。また、エステルとしては酢酸エステルなどの脂肪酸エステルが挙げられる。また、これらの化合物は、水和物、溶媒和物として用いてもよい。
【0020】
サルフイソキサゾール、クロルマジノン、ラマトロバン又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物は、後記実施例に示すように、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現増加を促進する作用を有し、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞から脂肪前駆細胞への脱分化を阻害し及び／又は脂肪前駆細胞からベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞への分化を促進し、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の数や働きを高めることによって、肥満症の予防又は治療作用を発揮する。
従って、本発明の医薬組成物は、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低いことに起因する肥満症、さらにベージュ細胞又は褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現が低いことに起因して、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低くなっている肥満症に対して有効である。
従って、本発明の医薬組成物は、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低いことに起因する肥満症、さらにベージュ細胞又は褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの発現が低いことに起因して、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低くなっている肥満症に対して有効である。
【0021】
なお、ベージュ脂肪細胞又は褐色脂肪細胞の白色脂肪細胞に対する数的比率又は質量的比率が健常状態よりも相対的に低いことに起因する肥満症については、当該技術分野において公知の方法で調べることができる。例えば、上記肥満症は、寒冷刺激をかけた上でＦＤＧ－ＰＥＴと呼ばれるグルコースの取り込みを定量する検査を用いて褐色脂肪細胞の活性を定量することにより、調べることができる。
この検査において、ＦＤＧとしては、１８Ｆ－ｆｌｕｏｒｏ－２－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（例えば、日本メジフィジックス株式会社から入手可能）を用いることができ、ＰＥＴ／ＣＴ ｓｙｓｔｅｍについては、「Ａｑｕｉｄｕｏ； Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｏｔａｗａｒａ， Ｔｏｃｈｉｇｉ， Ｊａｐａｎ」を用いることができる。
「寒冷刺激」の条件としては、６－１２時間の絶食後、１時間に渡って軽装で１９℃過ごしてもらい、その間、脚は５分ごとに４分間ずつ氷で冷やすことにより行うことができる。
「褐色脂肪細胞の活性」は、ＣＴ値において脂肪組織として矛盾しない領域のうち、ＦＤＧ－ＰＥＴにおいて閾値以上のグルコース取り込みを認める領域を褐色脂肪細胞、残りを白色脂肪細胞と判定することにより、定量することができる。
この検査において、ＦＤＧとしては、１８Ｆ－ｆｌｕｏｒｏ－２－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（例えば、日本メジフィジックス株式会社から入手可能）を用いることができ、ＰＥＴ／ＣＴ ｓｙｓｔｅｍについては、「Ａｑｕｉｄｕｏ； Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｏｔａｗａｒａ， Ｔｏｃｈｉｇｉ， Ｊａｐａｎ」を用いることができる。
「寒冷刺激」の条件としては、６－１２時間の絶食後、１時間に渡って軽装で１９℃過ごしてもらい、その間、脚は５分ごとに４分間ずつ氷で冷やすことにより行うことができる。
「褐色脂肪細胞の活性」は、ＣＴ値において脂肪組織として矛盾しない領域のうち、ＦＤＧ－ＰＥＴにおいて閾値以上のグルコース取り込みを認める領域を褐色脂肪細胞、残りを白色脂肪細胞と判定することにより、定量することができる。
【0022】
さらには、本発明の医薬組成物は、褐色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に特異的な遺伝子プログラムに関連する遺伝子であるＵＣＰ－１、ＮＦＩＡ、ＰＧＣ１α、ＣＩＤＥＡ、及びＣＯＸ８Ｂからなる群から選択される少なくとも１種、特にＵＣＰ－１及び／又はＮＦＩＡの働きを高めることによって、エネルギー摂取の抑制ではなく、エネルギー消費の促進に基づく肥満症、メタボリックシンドローム、及び／又は肥満２型糖尿病の治療薬として有用である。
従って、本発明の予防及び／又は治療の対象となる疾患又は症状は、肥満症、メタボリックシンドローム、及び肥満２型糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種であり、好ましくは肥満症である。
従って、本発明の予防及び／又は治療の対象となる疾患又は症状は、肥満症、メタボリックシンドローム、及び肥満２型糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種であり、好ましくは肥満症である。
【0023】
本発明の医薬組成物は、前記サルフイソキサゾール、クロルマジノン、ラマトロバン又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含有すればよいが、これに薬学的に許容される担体を配合して種々の投与形態の医薬組成物とするのが好ましい。
このような医薬組成物の投与形態としては、注射剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤）、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。このうち、注射剤、経口剤が特に好ましい。
このような医薬組成物の投与形態としては、注射剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤）、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。このうち、注射剤、経口剤が特に好ましい。
【0024】
これらの医薬組成物の形態とするために用いられる薬学的に許容される担体としては、例えば、溶解補助剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤、防腐剤、界面活性剤などが挙げられる。
より具体的には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、乳糖、ブドウ糖、Ｄ－マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、非イオン界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸－水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム、カルメロース、ヒプロメロース等が挙げられる。
経口剤とする場合には、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などが用いられ、常法によって製造できる。経口剤としては、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが好ましい。
注射剤とする場合には、水、溶解補助剤などが用いられる。注射剤としては、静脈内投与剤、皮下注射剤、筋肉内投与剤が好ましく、凍結乾燥製剤、粉末充填剤の形態が挙げられる。
より具体的には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、乳糖、ブドウ糖、Ｄ－マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、非イオン界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸－水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム、カルメロース、ヒプロメロース等が挙げられる。
経口剤とする場合には、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などが用いられ、常法によって製造できる。経口剤としては、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが好ましい。
注射剤とする場合には、水、溶解補助剤などが用いられる。注射剤としては、静脈内投与剤、皮下注射剤、筋肉内投与剤が好ましく、凍結乾燥製剤、粉末充填剤の形態が挙げられる。
【0025】
本発明のクロルマジノン又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含有する医薬組成物としては、既存薬の組成を好ましく使用することができ、例えば、クロルマジノン酢酸エステル（好ましくは２５ｍｇ）に加えて、アルファー化デンプン、カルメロースカルシウム、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、及び乳糖水和物を含有することができる。
【0026】
本発明のラマトロバン又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を含有する医薬組成物としては、既存薬の組成を好ましく使用することができ、例えば、ラマトロバン（好ましくは５０ｍｇ又は７５ｍｇ）に加えて、乳糖水和物、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース、マクロゴール（好ましくはマクロゴール６０００）、及び酸化チタンを含有することができる。
【0027】
本発明の医薬組成物には、他の肥満症治療剤、メタボリックシンドローム治療剤、２型糖尿病治療剤などを配合してもよく、これらの薬剤と併用してもよい。
併用可能な薬剤としては、公知の２型糖尿病治療剤がより好ましく、例えば、本発明に係る化合物と同じく脂肪細胞を標的とするピオグリタゾンが更に好ましい。
併用可能な薬剤としては、公知の２型糖尿病治療剤がより好ましく、例えば、本発明に係る化合物と同じく脂肪細胞を標的とするピオグリタゾンが更に好ましい。
【0028】
本発明の医薬組成物中における本発明の有効成分の含有量は、有効成分、投与形態によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して０．０１～１００質量％、好ましくは１～１００質量％である。
有効成分は、経口剤の場合には、通常一投与単位当たり、５質量％～７０質量％程度含有するのが好ましい。
有効成分は、経口剤の場合には、通常一投与単位当たり、５質量％～７０質量％程度含有するのが好ましい。
【0029】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、前記有効成分量として、成人に対して１日あたり１．０μｇ～５００ｍｇであるのが好ましい。またこの投与量は１日に１～４回に分けて投与することもできる。
クロルマジノン酢酸エステルの場合には、通常成人に対し１回２５ｍｇ～５０ｍｇを１日１～３回投与するのが好ましい。また、ラマトロバンの場合には、通常成人に対し１回７５ｍｇ～１００ｍｇを１日１～３回投与するのが好ましい。スルフイソキサゾールの場合には、通常成人に対し、１回２００ｍｇ～８００ｍｇを１日１～３回投与するのが好ましい。
クロルマジノン酢酸エステルの場合には、通常成人に対し１回２５ｍｇ～５０ｍｇを１日１～３回投与するのが好ましい。また、ラマトロバンの場合には、通常成人に対し１回７５ｍｇ～１００ｍｇを１日１～３回投与するのが好ましい。スルフイソキサゾールの場合には、通常成人に対し、１回２００ｍｇ～８００ｍｇを１日１～３回投与するのが好ましい。
【0030】
本発明の好ましい別の実施態様は、肥満症を予防又は治療するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物である。
本発明の好ましい別の実施態様は、肥満症の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物の使用である。
本発明の好ましい別の実施態様は、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を投与することを特徴とする、肥満症を予防又は治療する方法である。
本発明の好ましい別の実施態様は、肥満症の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物の使用である。
本発明の好ましい別の実施態様は、サルフイソキサゾール（Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ）、クロルマジノン（Ｃｈｌｏｒｍａｄｉｎｏｎｅ）、若しくはラマトロバン（Ｒａｍａｔｒｏｂａｎ）、又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物若しくは水和物を投与することを特徴とする、肥満症を予防又は治療する方法である。
【実施例0031】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0032】
試験例１（クロルマジノン酢酸エステル）、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンの抗肥満作用）
ＵＣＰ－１発現の増加は、脂肪細胞における熱産生増加による基礎代謝の増加を誘導し、抗肥満効果に寄与すると考えられている。そこで、抗肥満効果に寄与する化合物を探索するため、白色脂肪細胞前駆細胞およびベージュ脂肪細胞前駆細胞の混合物であるマウス鼠径部間質血管細胞由来不死化細胞を脂肪細胞へと分化誘導する細胞実験系において種々の化合物を添加し、ＵＣＰ－１ ｍＲＮＡ発現を増加させる化合物のスクリーニングを行った。
ＵＣＰ－１発現の増加は、脂肪細胞における熱産生増加による基礎代謝の増加を誘導し、抗肥満効果に寄与すると考えられている。そこで、抗肥満効果に寄与する化合物を探索するため、白色脂肪細胞前駆細胞およびベージュ脂肪細胞前駆細胞の混合物であるマウス鼠径部間質血管細胞由来不死化細胞を脂肪細胞へと分化誘導する細胞実験系において種々の化合物を添加し、ＵＣＰ－１ ｍＲＮＡ発現を増加させる化合物のスクリーニングを行った。
【0033】
（方法）
１．１ｓｔスクリーニング
１）分化誘導
マウス鼠径部間質血管細胞由来不死化細胞を基本培地（１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ， ＧＩＢＣＯ）を用いてゼラチンコートをしたｐｌａｔｅに播種し、コンフルエント（ｄａｙ０）になるまで培養を行った。培地を分化培地１（基本培地に１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ， ０．５ｍＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ， ５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ， １ｎＭ Ｔ３， １２５μＭ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎを含む）に置換し、終濃度１０μＭとなるようにスクリーニング化合物を添加した。Ｄａｙ２に分化培地１を分化培地２（基本培地に５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ， １ｎＭ Ｔ３を含む）に置換し、終濃度１０μＭとなるようにスクリーニング化合物を添加した。Ｄａｙ４に分化培地２を新しい分化培地２に置換し、終濃度１０μＭとなるようにスクリーニング化合物を添加した。ポジティブコントロールとして１μＭ Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅをスクリーニング化合物と同様に培地交換を行いながらｄａｙ０―ｄａｙ７まで添加した。
１．１ｓｔスクリーニング
１）分化誘導
マウス鼠径部間質血管細胞由来不死化細胞を基本培地（１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ， ＧＩＢＣＯ）を用いてゼラチンコートをしたｐｌａｔｅに播種し、コンフルエント（ｄａｙ０）になるまで培養を行った。培地を分化培地１（基本培地に１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ， ０．５ｍＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ， ５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ， １ｎＭ Ｔ３， １２５μＭ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎを含む）に置換し、終濃度１０μＭとなるようにスクリーニング化合物を添加した。Ｄａｙ２に分化培地１を分化培地２（基本培地に５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ， １ｎＭ Ｔ３を含む）に置換し、終濃度１０μＭとなるようにスクリーニング化合物を添加した。Ｄａｙ４に分化培地２を新しい分化培地２に置換し、終濃度１０μＭとなるようにスクリーニング化合物を添加した。ポジティブコントロールとして１μＭ Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅをスクリーニング化合物と同様に培地交換を行いながらｄａｙ０―ｄａｙ７まで添加した。
【0034】
２）ＲＮＡ抽出、逆転写反応
Ｄａｙ７の細胞からＳｕｐｅｒＰｒｅｐＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＆ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＲＮＡ ｌｙｓａｔｅを作製し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを作製した。
Ｄａｙ７の細胞からＳｕｐｅｒＰｒｅｐＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＆ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＲＮＡ ｌｙｓａｔｅを作製し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを作製した。
【0035】
３）ｑＰＣＲ
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲを行い、ＵＣＰ－１ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールにはＲｐｌｐ０を用いた。用いたプライマーを表１に示す。
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲを行い、ＵＣＰ－１ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールにはＲｐｌｐ０を用いた。用いたプライマーを表１に示す。
【0036】
【表1】
【0037】
２．遺伝子発現プロファイルの確認
１）分化誘導
前記１．１ｓｔスクリーニング に同じ。
２）ＲＮＡ抽出、逆転写反応
Ｄａｙ７の細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを作製した。
３）ｑＰＣＲ
ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＶｉｉＡ７ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲを行い、Ｕｃｐ－１、Ｎｆｉａ、Ｐｇｃ１α、Ｃｉｄｅａ、 Ｃｏｘ８ｂ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールにはＲｐｌｐ０を用いた。プライマーは表１。
１）分化誘導
前記１．１ｓｔスクリーニング に同じ。
２）ＲＮＡ抽出、逆転写反応
Ｄａｙ７の細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを作製した。
３）ｑＰＣＲ
ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＶｉｉＡ７ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲを行い、Ｕｃｐ－１、Ｎｆｉａ、Ｐｇｃ１α、Ｃｉｄｅａ、 Ｃｏｘ８ｂ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールにはＲｐｌｐ０を用いた。プライマーは表１。
【0038】
（結果）
１．１ｓｔスクリーニング
結果は図１に示す。Ｕｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現量が高い６６化合物を用いて再度分化誘導実験を行い、遺伝子発現プロファイルの確認を行った。
２．遺伝子発現プロファイルの確認
クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンを添加した細胞において、Ｕｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現量が対照群に比べて増加することが明らかとなった（図２）。なお、Ｎｆｉａ、Ｐｇｃ１α、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ８ｂ ｍＲＮＡ発現量も同様にｑＰＣＲで測定を行い、各化合物の遺伝子発現プロファイルを明らかにした（図３－図６）。
１．１ｓｔスクリーニング
結果は図１に示す。Ｕｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現量が高い６６化合物を用いて再度分化誘導実験を行い、遺伝子発現プロファイルの確認を行った。
２．遺伝子発現プロファイルの確認
クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンを添加した細胞において、Ｕｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現量が対照群に比べて増加することが明らかとなった（図２）。なお、Ｎｆｉａ、Ｐｇｃ１α、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ８ｂ ｍＲＮＡ発現量も同様にｑＰＣＲで測定を行い、各化合物の遺伝子発現プロファイルを明らかにした（図３－図６）。
【0039】
（解釈）
クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンは、それぞれの化合物を添加した細胞においてＵｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現の増加を示したことから（図２）、ＵＣＰ－１の熱産生効果による抗肥満効果をもつと考えられる。
また、クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールはＮｆｉａ ｍＲＮＡ発現を増加した（図３）。ＮＦＩＡは脂肪細胞分化のマスター転写因子ＰＰＡＲγの褐色脂肪細胞特異的遺伝子エンハンサーへ結合を促進することでこれら遺伝子の転写を促進し、体重減少作用を誘導することから（試験例２を参照）、クロルマジノン酢酸エステルおよびサルフイソキサゾールはＮＦＩＡの誘導またＵＣＰ－１発現の誘導を介して、抗肥満効果を持つ可能性がある。なお、Ｎｆｉａ ｍＲＮＡ増加作用は肥満に伴う糖尿病治療薬であるロシグリタゾンおよびラマトロバンには認められなかったことから、少なくともクロルマジノン酢酸エステルとサルフイソキサゾールはロシグリタゾンとは異なる経路で抗肥満作用を有している可能性がある。
また、クロルマジノン酢酸塩、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンはＰｇｃ１α、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ８ｂの発現も増加した。ＰＧＣ１αはＰＰＡＲγの転写共役因子として褐色脂肪細胞特異的遺伝子発現を誘導し、ＣＩＤＥＡは褐色脂肪細胞の脂肪滴の維持に関与する。また、ＣＯＸ８Ｂはミトコンドリアのシトクロームｃオキシダーゼ酵素複合体の構成要素であることから、各化合物は白色脂肪細胞のベージュ化誘導に寄与することが示唆される。
以上のことから、クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンはそれぞれ異なる褐色脂肪細胞及び／又はベージュ脂肪細胞関連遺伝子の発現増加プロファイルを持つ抗肥満薬として利用できる可能性がある。
クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンは、それぞれの化合物を添加した細胞においてＵｃｐ－１ ｍＲＮＡ発現の増加を示したことから（図２）、ＵＣＰ－１の熱産生効果による抗肥満効果をもつと考えられる。
また、クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールはＮｆｉａ ｍＲＮＡ発現を増加した（図３）。ＮＦＩＡは脂肪細胞分化のマスター転写因子ＰＰＡＲγの褐色脂肪細胞特異的遺伝子エンハンサーへ結合を促進することでこれら遺伝子の転写を促進し、体重減少作用を誘導することから（試験例２を参照）、クロルマジノン酢酸エステルおよびサルフイソキサゾールはＮＦＩＡの誘導またＵＣＰ－１発現の誘導を介して、抗肥満効果を持つ可能性がある。なお、Ｎｆｉａ ｍＲＮＡ増加作用は肥満に伴う糖尿病治療薬であるロシグリタゾンおよびラマトロバンには認められなかったことから、少なくともクロルマジノン酢酸エステルとサルフイソキサゾールはロシグリタゾンとは異なる経路で抗肥満作用を有している可能性がある。
また、クロルマジノン酢酸塩、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンはＰｇｃ１α、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ８ｂの発現も増加した。ＰＧＣ１αはＰＰＡＲγの転写共役因子として褐色脂肪細胞特異的遺伝子発現を誘導し、ＣＩＤＥＡは褐色脂肪細胞の脂肪滴の維持に関与する。また、ＣＯＸ８Ｂはミトコンドリアのシトクロームｃオキシダーゼ酵素複合体の構成要素であることから、各化合物は白色脂肪細胞のベージュ化誘導に寄与することが示唆される。
以上のことから、クロルマジノン酢酸エステル、サルフイソキサゾールおよびラマトロバンはそれぞれ異なる褐色脂肪細胞及び／又はベージュ脂肪細胞関連遺伝子の発現増加プロファイルを持つ抗肥満薬として利用できる可能性がある。
【0040】
試験例２（脂肪細胞のＮＦＩＡ遺伝子の発現制御による体重および全身代謝に与える作用の検討）
【0041】
（概要）
褐色脂肪細胞はミトコンドリアに富み、エネルギー消費が高く、ヒト成人において鎖骨上窩や深部頸部などに存在することが知られている。本発明者らはマウスの褐色脂肪組織のオープンクロマチン解析により転写因子ＮＦＩＡが褐色脂肪細胞特異的な転写プログラムの重要な制御因子であることを明らかにし報告した（非特許文献４．）。ＮＦＩＡは褐色脂肪特異的な遺伝子群の転写を制御することから、脂肪組織におけるＮＦＩＡの発現を増加させることにより、全身のエネルギー代謝を亢進させ、肥満もしくは肥満症の治療戦略となる可能性が期待される。このことを検討するために、遺伝子改変技術で、マウスの脂肪組織のＮＦＩＡ発現を増加させるもしくは減少させるモデルマウスを作製し、全身の体重および代謝に与える影響を検討した。
褐色脂肪細胞はミトコンドリアに富み、エネルギー消費が高く、ヒト成人において鎖骨上窩や深部頸部などに存在することが知られている。本発明者らはマウスの褐色脂肪組織のオープンクロマチン解析により転写因子ＮＦＩＡが褐色脂肪細胞特異的な転写プログラムの重要な制御因子であることを明らかにし報告した（非特許文献４．）。ＮＦＩＡは褐色脂肪特異的な遺伝子群の転写を制御することから、脂肪組織におけるＮＦＩＡの発現を増加させることにより、全身のエネルギー代謝を亢進させ、肥満もしくは肥満症の治療戦略となる可能性が期待される。このことを検討するために、遺伝子改変技術で、マウスの脂肪組織のＮＦＩＡ発現を増加させるもしくは減少させるモデルマウスを作製し、全身の体重および代謝に与える影響を検討した。
【0042】
（方法）
１．Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの開発
１）ＤＮＡコンストラクトの作成（図７）
脂肪組織に選択的に発現するＦａｂｐ４遺伝子のプロモーター（－５．４ｋｂ）の下流に、マウスＮｆｉａ遺伝子をコードするデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を挿入した。
１．Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの開発
１）ＤＮＡコンストラクトの作成（図７）
脂肪組織に選択的に発現するＦａｂｐ４遺伝子のプロモーター（－５．４ｋｂ）の下流に、マウスＮｆｉａ遺伝子をコードするデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を挿入した。
【0043】
２）マウスの作成
Ｃ５７ＢＬ／６の受精卵に、上記ＤＮＡコンストラクトをマイクロインジェクションにより注入し、ゲノムＤＮＡにランダムインテグレーションされたマウス仔を得た。脂肪組織に選択的なＮｆｉａ遺伝子の過剰発現は、トラスジェニックマウスの各種臓器からＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（コスモバイオ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、Ｎｆｉａ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールにはＲｐｌｐ０遺伝子を用いた。ＮＦＩＡタンパクの検出にはＮＦＩＡ抗体（Ａｂｃａｍ社ａｂ４１８５１）を用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングを施行した。
Ｃ５７ＢＬ／６の受精卵に、上記ＤＮＡコンストラクトをマイクロインジェクションにより注入し、ゲノムＤＮＡにランダムインテグレーションされたマウス仔を得た。脂肪組織に選択的なＮｆｉａ遺伝子の過剰発現は、トラスジェニックマウスの各種臓器からＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（コスモバイオ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、Ｎｆｉａ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールにはＲｐｌｐ０遺伝子を用いた。ＮＦＩＡタンパクの検出にはＮＦＩＡ抗体（Ａｂｃａｍ社ａｂ４１８５１）を用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングを施行した。
【0044】
２．体重や摂餌量の影響の検討
マウスは東京大学医学部動物実験委員会の承認された実験計画のもと、温度、湿度、照明、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）が制御された動物舎で飼育し、通常の普通食、もしくは図に記載された週数、高脂肪食（Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２、日本クレア）を与え、体重および摂餌量を測定した。
マウスは東京大学医学部動物実験委員会の承認された実験計画のもと、温度、湿度、照明、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）が制御された動物舎で飼育し、通常の普通食、もしくは図に記載された週数、高脂肪食（Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２、日本クレア）を与え、体重および摂餌量を測定した。
【0045】
３．脂肪組織および他の臓器の解析
マウスは頸椎脱臼による安楽死を行い、解剖の後、各種臓器重量を測定した。特に脂肪組織はホルマリン固定を行い、組織切片のＨＥ染色を施行した。脂肪細胞のサイズは、組織切片の脂肪滴もしくは脂肪細胞の画像をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で解析した。
マウスは頸椎脱臼による安楽死を行い、解剖の後、各種臓器重量を測定した。特に脂肪組織はホルマリン固定を行い、組織切片のＨＥ染色を施行した。脂肪細胞のサイズは、組織切片の脂肪滴もしくは脂肪細胞の画像をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で解析した。
【0046】
４．脂肪組織および他の臓器のＲＮＡ解析
臓器サンプルは、ビーズ式細胞破砕装置（トミー精工）でホモジナイズし、ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（コスモバイオ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを作製した。さらにＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、各種遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。用いたプライマーを表２～表４に示す。
臓器サンプルは、ビーズ式細胞破砕装置（トミー精工）でホモジナイズし、ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（コスモバイオ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを作製した。さらにＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、各種遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。用いたプライマーを表２～表４に示す。
【0047】
【表2】
【0048】
【表3】
【0049】
【表4】
【0050】
５．寒冷耐性の検討
マウスを小動物用温度調節機能付チャンバー（シンファクトリー、ＨＣ－１０）で４oＣの寒冷環境でモニターしながら、記載された時間間隔で直腸温をマイクロプローブ・サーモメータ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ ＢＡＴ－１２Ｒ）で測定した。
マウスを小動物用温度調節機能付チャンバー（シンファクトリー、ＨＣ－１０）で４oＣの寒冷環境でモニターしながら、記載された時間間隔で直腸温をマイクロプローブ・サーモメータ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ ＢＡＴ－１２Ｒ）で測定した。
【0051】
６．酸素消費量および呼吸商の測定
マウスを代謝ケージ（小動物用代謝計測システム、室町機械株式会社 Ｍｏｄｅｌ ＭＫ－５０００）内で飼育し、酸素消費量と二酸化炭素排出量を測定した。
マウスを代謝ケージ（小動物用代謝計測システム、室町機械株式会社 Ｍｏｄｅｌ ＭＫ－５０００）内で飼育し、酸素消費量と二酸化炭素排出量を測定した。
【0052】
７．ブドウ糖負荷試験とインスリン負荷試験
尾静脈から少量の血液を採取し、血糖はグルテストセンサー（三和化学株式会社）を用いて測定した。ブドウ糖水溶液をゾンデ用いて規定量（２ｇ／ｋｇ）経口摂取させ、記載された時間後に尾静脈から得た少量の血液で測定した。インスリン水溶液は０．７５Ｕ／ｋｇの用量で腹腔内投与を行い、ブドウ糖負荷試験と同様に、記載された時間後に尾静脈から得た少量の血液で測定した。
尾静脈から少量の血液を採取し、血糖はグルテストセンサー（三和化学株式会社）を用いて測定した。ブドウ糖水溶液をゾンデ用いて規定量（２ｇ／ｋｇ）経口摂取させ、記載された時間後に尾静脈から得た少量の血液で測定した。インスリン水溶液は０．７５Ｕ／ｋｇの用量で腹腔内投与を行い、ブドウ糖負荷試験と同様に、記載された時間後に尾静脈から得た少量の血液で測定した。
【0053】
（結果）
１．Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの解析結果
Ｎｆｉａトランスジェニックマウスにおいては、ｍＲＮＡの解析結果から、脂肪組織において選択的にＮｆｉａ遺伝子のｍＲＮＡおよび蛋白の発現量が増加していることを確認した（図８）。普通食下においては、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスと野生型に体重と摂餌量には差が認められなかったが（図９）、高脂肪食を負荷すると、摂餌量には差がないにもかかわらず、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスにおいて体重の増加が有意に抑制された（図１０）。解剖時の組織重量の検討では、高脂肪食下ではＮｆｉａトランスジェニックマウスは野生型と比較して、白色脂肪組織で有意な臓器重量の減少が認められた（図１１）。脂肪組織のＨＥ染色では、褐色脂肪組織では変化はないものの、鼠径部皮下白色脂肪では高脂肪食による脂肪細胞の肥大化が抑制されていた（図１２、１３）。遺伝子レベルにおいても、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの白色脂肪組織（鼠径部皮下および生殖器周囲）では、野生型マウスと比較して、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ８ｂ、Ｄｉｏ２、Ｓ１００ｂなどの褐色脂肪関連遺伝子群や（図１４）、ミトコンドリア関連遺伝子群（図１５）が誘導されていることが分かった。更に、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、寒冷環境下における体温低下が有意に抑制されていること（図１６）、また代謝ケージによる酸素消費量の測定で、酸素消費量が有意に高いことから（図１７）、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスは、熱産生によるエネルギー消費が増加していることが示唆された。更に、ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験の結果から、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスは野生型と比較して、耐糖能ならびにインスリン感受性が高く、高脂肪食による糖尿病の悪化が抑制されていた（図１８）。
１．Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの解析結果
Ｎｆｉａトランスジェニックマウスにおいては、ｍＲＮＡの解析結果から、脂肪組織において選択的にＮｆｉａ遺伝子のｍＲＮＡおよび蛋白の発現量が増加していることを確認した（図８）。普通食下においては、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスと野生型に体重と摂餌量には差が認められなかったが（図９）、高脂肪食を負荷すると、摂餌量には差がないにもかかわらず、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスにおいて体重の増加が有意に抑制された（図１０）。解剖時の組織重量の検討では、高脂肪食下ではＮｆｉａトランスジェニックマウスは野生型と比較して、白色脂肪組織で有意な臓器重量の減少が認められた（図１１）。脂肪組織のＨＥ染色では、褐色脂肪組織では変化はないものの、鼠径部皮下白色脂肪では高脂肪食による脂肪細胞の肥大化が抑制されていた（図１２、１３）。遺伝子レベルにおいても、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスの白色脂肪組織（鼠径部皮下および生殖器周囲）では、野生型マウスと比較して、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ８ｂ、Ｄｉｏ２、Ｓ１００ｂなどの褐色脂肪関連遺伝子群や（図１４）、ミトコンドリア関連遺伝子群（図１５）が誘導されていることが分かった。更に、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、寒冷環境下における体温低下が有意に抑制されていること（図１６）、また代謝ケージによる酸素消費量の測定で、酸素消費量が有意に高いことから（図１７）、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスは、熱産生によるエネルギー消費が増加していることが示唆された。更に、ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験の結果から、Ｎｆｉａトランスジェニックマウスは野生型と比較して、耐糖能ならびにインスリン感受性が高く、高脂肪食による糖尿病の悪化が抑制されていた（図１８）。
【0054】
（解釈）
遺伝子改変技術で、マウスの脂肪細胞のＮｆｉａ発現を増加させるモデルマウスを作製した。脂肪細胞におけるＮｆｉａ遺伝子の発現が増加すると、酸素消費量が増大し、高脂肪食下の体重増加や糖代謝の異常を緩和することが明らかとなった。このことから、脂肪組織のＮｆｉａ遺伝子の発現量を増加させることで、高脂肪食により悪化する肥満や２型糖尿病を改善することが示唆された。
従って、本発明の医薬組成物を高脂肪食による肥満患者や２型糖尿病患者に投与することにより、当該患者における脂肪組織のＮＦＩＡ遺伝子の発現量を増加させ、当該肥満や２型糖尿病を予防及び／又は治療できることが示唆された。
遺伝子改変技術で、マウスの脂肪細胞のＮｆｉａ発現を増加させるモデルマウスを作製した。脂肪細胞におけるＮｆｉａ遺伝子の発現が増加すると、酸素消費量が増大し、高脂肪食下の体重増加や糖代謝の異常を緩和することが明らかとなった。このことから、脂肪組織のＮｆｉａ遺伝子の発現量を増加させることで、高脂肪食により悪化する肥満や２型糖尿病を改善することが示唆された。
従って、本発明の医薬組成物を高脂肪食による肥満患者や２型糖尿病患者に投与することにより、当該患者における脂肪組織のＮＦＩＡ遺伝子の発現量を増加させ、当該肥満や２型糖尿病を予防及び／又は治療できることが示唆された。
【0055】
（新規スクリーニングによる新しいＮｆｉａ増加化合物の探索）
（１）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、３Ｔ３－Ｆ４４２Ａ細胞もしくはその他の細胞を使用して、Ｎｆｉａをターゲットとしたスクリーニングを行う。
（２）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、３Ｔ３－Ｆ４４２Ａ細胞もしくはその他の細胞にルシフェラーゼもしくはその他の酵素の遺伝子を付与したＮｆｉａ発現ベクターを導入し、発光シグナルもしくはその他の酵素反応を利用したスクリーニングを行う。
（３）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、サルフイソキサゾールやクロルマジノンがＮｆｉａ ｍＲＮＡ発現を誘導する作用機序を解析し、その作用機序に基づいたスクリーニングを行う。
（４）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、Ｎｆｉａ ｍＲＮＡもしくはＮｆｉａタンパク発現の作用機序を解析し、その作用機序に基づいたスクリーニングを行う。
（１）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、３Ｔ３－Ｆ４４２Ａ細胞もしくはその他の細胞を使用して、Ｎｆｉａをターゲットとしたスクリーニングを行う。
（２）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、３Ｔ３－Ｆ４４２Ａ細胞もしくはその他の細胞にルシフェラーゼもしくはその他の酵素の遺伝子を付与したＮｆｉａ発現ベクターを導入し、発光シグナルもしくはその他の酵素反応を利用したスクリーニングを行う。
（３）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、サルフイソキサゾールやクロルマジノンがＮｆｉａ ｍＲＮＡ発現を誘導する作用機序を解析し、その作用機序に基づいたスクリーニングを行う。
（４）Ｎｆｉａ増加化合物を探索するため、Ｎｆｉａ ｍＲＮＡもしくはＮｆｉａタンパク発現の作用機序を解析し、その作用機序に基づいたスクリーニングを行う。
【0056】
（Ｎｆｉａ増加化合物の動物における評価）
（１）Ｎｆｉａ増加化合物の作用を動物において評価するため、高脂肪食摂取マウスにＮｆｉａ増加化合物を投与し、体重測定を行う。
（２）Ｎｆｉａ増加化合物の作用を動物において評価するため、動物にＮｆｉａ
増加化合物を投与し、酸素消費量の測定を行う。
（３）Ｎｆｉａ増加化合物の作用を動物において評価するため、動物にＮｆｉａ増加化合物を投与し、耐糖能および糖代謝の測定を行う。
（１）Ｎｆｉａ増加化合物の作用を動物において評価するため、高脂肪食摂取マウスにＮｆｉａ増加化合物を投与し、体重測定を行う。
（２）Ｎｆｉａ増加化合物の作用を動物において評価するため、動物にＮｆｉａ
増加化合物を投与し、酸素消費量の測定を行う。
（３）Ｎｆｉａ増加化合物の作用を動物において評価するため、動物にＮｆｉａ増加化合物を投与し、耐糖能および糖代謝の測定を行う。
【0057】
（Ｎｆｉａ増加化合物のＵｃｐ－１依存性／非依存性の確認）
（１）Ｎｆｉａ誘導性抗肥満作用のＵｃｐ－１依存性を評価するため、Ｎｆｉａ遺伝子ノックダウン動物もしくは細胞またはノックアウト動物もしくは細胞に対して、Ｎｆｉａ増加化合物を処置し、Ｕｃｐ－１発現を評価する。
（１）Ｎｆｉａ誘導性抗肥満作用のＵｃｐ－１依存性を評価するため、Ｎｆｉａ遺伝子ノックダウン動物もしくは細胞またはノックアウト動物もしくは細胞に対して、Ｎｆｉａ増加化合物を処置し、Ｕｃｐ－１発現を評価する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】