(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023159758
(43)【公開日】2023-11-01
(54)【発明の名称】遺伝子組換え大腸菌を用いたタンパク質の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20231025BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20231025BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231025BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C ZNA
C07K14/47
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022069666
(22)【出願日】2022-04-20
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】栗原 桃
(72)【発明者】
【氏名】大江 正剛
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD11
4B064DA01
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた前記タンパク質の製造において、前記大腸菌の培養に用いる培地を最適化し、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供すること。
【解決手段】 遺伝子組換え大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定し、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養することで、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【解決手段】 遺伝子組換え大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定し、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養することで、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養工程と、得られた培養物中に含まれる前記大腸菌が発現した組換えタンパク質の回収工程とを含む、組換えタンパク質の製造方法であって、
前記培養工程を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定する工程と、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養する工程とを少なくとも含む方法で行なう、前記製造方法。
前記培養工程を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定する工程と、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養する工程とを少なくとも含む方法で行なう、前記製造方法。
【請求項2】
培養工程が、遺伝子組換え大腸菌の菌体濃度が一定濃度に達した時点で誘導剤を添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
一定濃度が６００ｎｍの吸光度で７０以上１２０以下であり、誘導剤が添加後の終濃度で０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ以上４ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
遺伝子組換え大腸菌を培養する工程を、炭素源および窒素源を含む流加液を培養途中に流加する、流加培養で実施し、かつ培養開始時の培地ならびに前記流加液に含まれる炭素源および窒素源が、それぞれ以下に示す態様である、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法；
［培養開始時の培地］炭素源：２０ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：８０ｇ／Ｌ以下の酵母エキス
［流加液］炭素源：３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下の酵母エキス。
［培養開始時の培地］炭素源：２０ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：８０ｇ／Ｌ以下の酵母エキス
［流加液］炭素源：３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下の酵母エキス。
【請求項5】
組換えタンパク質がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質である、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項6】
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項５に記載の製造方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【請求項7】
組換えタンパク質がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項8】
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項７に記載の製造方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた前記タンパク質の製造方法に関する。特に本発明は、前記大腸菌の培養に用いる培地を最適化することで、前記タンパク質を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え大腸菌を利用した組換えタンパク質の製造は、特許文献１をはじめとし、これまでにも多くの例が報告されている。大腸菌には炭素、窒素の他に、多種の無機元素を含むことが知られている。そのため遺伝子組換え大腸菌から組換えタンパク質を効率的に発現させるには、前記大腸菌の培養に用いる培地に、炭素源や窒素源のみならず、無機塩などの無機元素も添加する必要がある。さらに前記培地の組成も遺伝子組換え大腸菌に適合した組成にすることが重要である。
【0003】
培地への無機元素の添加を最適化した例として、特許文献２には、組換えタンパク質を発現可能な大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）を、マグネシウムイオンとして２．８×１０-2ｍｏｌ／Ｌ（培地当たりの終濃度）以上添加した培地で培養することで、前記組換えタンパク質を大量発現させた例を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２０００－５０１９３６号公報
【特許文献2】特開２０１３－０８５５３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた前記タンパク質の製造において、前記大腸菌の培養に用いる培地を最適化し、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、組換えタンパク質を発現可能な大腸菌に含まれる特定の無機元素濃度に基づき、当該特定の無機元素の培地への添加濃度を決定することで、前記組換えタンパク質を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0007】
すなわち本発明の第一の態様は、
組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養工程と、得られた培養物中に含まれる前記大腸菌が発現した組換えタンパク質の回収工程とを含む、組換えタンパク質の製造方法であって、
前記培養工程を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定する工程と、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養する工程とを少なくとも含む方法で行なう、前記製造方法である。
組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養工程と、得られた培養物中に含まれる前記大腸菌が発現した組換えタンパク質の回収工程とを含む、組換えタンパク質の製造方法であって、
前記培養工程を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定する工程と、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養する工程とを少なくとも含む方法で行なう、前記製造方法である。
【0008】
また本発明の第二の態様は、培養工程が、遺伝子組換え大腸菌の菌体濃度が一定濃度に達した時点で誘導剤を添加する工程をさらに含む、前記第一の態様に記載の製造方法である。
【0009】
また本発明の第三の態様は、一定濃度が６００ｎｍの吸光度で７０以上１２０以下であり、誘導剤が添加後の終濃度で０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ以上４ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドである、前記第二の態様に記載の製造方法である。
【0010】
また本発明の第四の態様は、
遺伝子組換え大腸菌を培養する工程を、炭素源および窒素源を含む流加液を培養途中に流加する、流加培養で実施し、かつ培養開始時の培地ならびに前記流加液に含まれる炭素源および窒素源が、それぞれ以下に示す態様である、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の製造方法である；
［培養開始時の培地］炭素源：２０ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：８０ｇ／Ｌ以下の酵母エキス
［流加液］炭素源：３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下の酵母エキス。
遺伝子組換え大腸菌を培養する工程を、炭素源および窒素源を含む流加液を培養途中に流加する、流加培養で実施し、かつ培養開始時の培地ならびに前記流加液に含まれる炭素源および窒素源が、それぞれ以下に示す態様である、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の製造方法である；
［培養開始時の培地］炭素源：２０ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：８０ｇ／Ｌ以下の酵母エキス
［流加液］炭素源：３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下の酵母エキス。
【0011】
また本発明の第五の態様は、組換えタンパク質がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の製造方法である。
【0012】
また本発明の第六の態様は、ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記第五の態様に記載の製造方法である；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、組換えタンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養工程と、得られた培養物中に含まれる前記大腸菌が発現した組換えタンパク質の回収工程とを含む、組換えタンパク質の製造方法において、前記培養工程を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度を測定する工程と、前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるようナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養する工程とを少なくとも含む方法で行なうことを特徴としている。本発明の製造方法は、他の方法と比較して培養液当たりの組換えタンパク質の生産量が大幅に増大している。したがって本発明は、組換えタンパク質の工業的製造に有用といえる。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の製造方法では、組換えタンパク質を発現可能な、遺伝子組換え大腸菌を培養して製造する。前記組換え大腸菌を得るには、例えば、組換えタンパク質をコードする遺伝子（以下、単に「組換えタンパク質遺伝子」とも表記する）を適切な発現ベクターに挿入し、当該挿入したベクターを用いて大腸菌を形質転換して得ればよい。
本発明の製造方法では、組換えタンパク質を発現可能な、遺伝子組換え大腸菌を培養して製造する。前記組換え大腸菌を得るには、例えば、組換えタンパク質をコードする遺伝子（以下、単に「組換えタンパク質遺伝子」とも表記する）を適切な発現ベクターに挿入し、当該挿入したベクターを用いて大腸菌を形質転換して得ればよい。
【0015】
組換えタンパク質遺伝子の発現ベクターへの挿入は、挿入するベクターの適切な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定してよい。また発現ベクターに挿入する場合、例えばプロモーター機能を有するオリゴヌクレオチドを付加してもよい。大腸菌で機能するプロモーターとして、例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターまたはＴ７プロモーターが例示できる。挿入する発現ベクターは、形質転換する大腸菌内で安定に存在し、複製できるものであれば特に制限はない。発現ベクターの具体例として、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られている、ｐＴｒｃ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系、広宿主域（Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクターがあげられる。
【0016】
形質転換に用いる大腸菌の好ましい態様として、大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ ５３３２３）、大腸菌ＭＶ１１８４株（ＡＴＣＣ ４７１０８）、大腸菌ＧＭ３１株（ＮＢＲＰ ＭＥ７７４１）、大腸菌ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）、大腸菌ＪＭ１０１株（ＮＢＲＰ ＭＥ９０４３）、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）、および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＮＢＲＣ １０８８９６）があげられる。中でも、より好ましくは大腸菌Ｗ３１１０株である。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。
【0017】
前記発現ベクターを用いた大腸菌の形質転換は、公知の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法）で行なえばよい。
【0018】
本発明は、前述した方法で得られた、組換えタンパク質を発現可能な形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を、以下の＜１＞および＜２＞に示す工程を少なくとも含む方法で培養することを特徴としている；
＜１＞前記形質転換体に含まれるナトリウム濃度を測定する工程
＜２＞前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるよう、ナトリウムを添加した培地で前記形質転換体を培養する工程。
＜１＞前記形質転換体に含まれるナトリウム濃度を測定する工程
＜２＞前記測定したナトリウム濃度と同等な濃度となるよう、ナトリウムを添加した培地で前記形質転換体を培養する工程。
【0019】
前記＜１＞の工程における、形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）に含まれるナトリウム濃度の測定は、公知の無機元素分析方法を用いて行なえばよく、例えばＩＣＰ発光分光分析法、ＩＣＰ質量分析法、原子吸光分析法、蛍光Ｘ線分析法、イオンクロマトグラフィー法、キャピラリー電気泳動法、滴定法、比色分析法、電極法、沈殿重量分析法があげられる。ナトリウム濃度測定に供する形質転換体の調製方法については特に限定はなく、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２ＹＴ培地などの大腸菌が増殖し得る培地を用いて、大腸菌が増殖し得る温度や通気撹拌等の条件で適宜培養を行ない、実施するナトリウム濃度分析方法に適した方法で菌体の回収／洗浄や乾燥・抽出操作等の前処理を実施すればよい。なお前記形質転換体の調製を、発現させる組換えタンパク質の生産性が高い、効率的な培養方法を用いて実施すると、より効率的な組換えタンパク質の製造が本発明で期待できる点で好ましい。
【0020】
前記＜２＞の工程では、前記＜１＞の工程で測定した、遺伝子組換え大腸菌に含まれるナトリウム濃度と同等な濃度となるよう、ナトリウムを添加した培地で前記大腸菌を培養することで、組換えタンパク質を発現させる。なおナトリウム添加量の基準に用いる前記＜１＞の工程での測定値として、例えば、前記＜２＞の工程（本培養）の直前に実施した培養（前培養）で得られた遺伝子組換え大腸菌に含まれるナトリウム濃度の測定値を用いてもよいし、あらかじめ前記前培養および前記本培養とは異なる時期に培養した前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度の測定値を流用してもよい。
【0021】
前記＜２＞の工程は、例えば、下式（１）で定義される余剰度（「Ｓ」と表記）を指標とすると、定量的に判断できる点で好ましい（特開２００７－１４３４９２号公報）。
【0022】
余剰度Ｓ＝（Ｍm－Ｍx）／Ｍx （１）
式（１）中、
余剰度Ｓは培地中のナトリウムの余剰度を、
Ｍmは培地中のナトリウムの含有量（単位はｍｇ／Ｌ（培地））を、
Ｍxは培地中の遺伝子組換え大腸菌密度がＸ（単位はｇ／Ｌ（培地））の場合に当該大腸菌内に存在するナトリウムの培地当たりの含有量（単位はｍｇ／Ｌ（培地））を、
それぞれ示す。なおＭxは、前記大腸菌中のナトリウムの含有量Ｍc（単位はｍｇ／ｇ（菌体））から、ＭcＸで算出してもよい。遺伝子組換え大腸菌密度Ｘは任意の値を設定してもよいし、実際に培養を行ない回収された前記大腸菌量に基づいて設定してもよい。無機元素の前記大腸菌への取り込み効率や前記大腸菌内での利用効率を踏まえて、回収される湿菌体量の７０％から３００％の範囲で遺伝子組換え大腸菌密度Ｘを設定すると好ましい。
式（１）中、
余剰度Ｓは培地中のナトリウムの余剰度を、
Ｍmは培地中のナトリウムの含有量（単位はｍｇ／Ｌ（培地））を、
Ｍxは培地中の遺伝子組換え大腸菌密度がＸ（単位はｇ／Ｌ（培地））の場合に当該大腸菌内に存在するナトリウムの培地当たりの含有量（単位はｍｇ／Ｌ（培地））を、
それぞれ示す。なおＭxは、前記大腸菌中のナトリウムの含有量Ｍc（単位はｍｇ／ｇ（菌体））から、ＭcＸで算出してもよい。遺伝子組換え大腸菌密度Ｘは任意の値を設定してもよいし、実際に培養を行ない回収された前記大腸菌量に基づいて設定してもよい。無機元素の前記大腸菌への取り込み効率や前記大腸菌内での利用効率を踏まえて、回収される湿菌体量の７０％から３００％の範囲で遺伝子組換え大腸菌密度Ｘを設定すると好ましい。
【0023】
本発明では、式（１）で示される余剰度の絶対値が低いほど、前記大腸菌と培地のナトリウム濃度の乖離が小さい点で好ましい。しかしながら、例えば、後述するペプトン類やエキス類など、複数の無機元素を含有する成分を培地に添加する場合もあるため、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度と培地に添加するナトリウム濃度とを厳密に一致させる必要はなく、同等な濃度とすればよい。本明細書における「同等な濃度」として、余剰度Ｓiの絶対値が１．０未満、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．２未満を例示できる。
【0024】
本発明において、遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地は、ナトリウム濃度が遺伝子組換え大腸菌中のナトリウム濃度と同等な濃度となる限り、前記大腸菌が増殖し、かつ組換えタンパク質が発現し得るものであればよい。炭素源の一例として、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、粗糖、糖蜜が挙げられ、中でもグルコースが好ましい。窒素源は酵母エキス（例えば、ＣＡＳ番号：８０１３－０１－２）が好ましいが、ポリペプトン、カゼインおよびその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキス等を窒素源として用いても良い。無機塩の一例としては、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、硫酸マンガン（ＩＩ）、塩化マンガン（ＩＩ）があげられる。ビタミン類の一例としては、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンがあげられる。
【0025】
本発明において、遺伝子組換え大腸菌の培養方法に特に限定はなく、回分培養、半回分培養（流加培養ともいう）、および潅流培養のいずれかで培養してもよく、それらを組み合せて培養してもよい。ただし培養開始時に炭素源や窒素源といった栄養源を一度に培地に投入すると、大腸菌の増殖および前記大腸菌による組換えタンパク質の発現が阻害され、かつ有機酸などの副生成物も生産されるため、前記タンパク質の発現効率および得られた前記タンパク質の品質に悪影響を与える可能性がある。そのため、培養開始時に投入する栄養源は最小限とし、培養中に栄養源を適宜供給（流加）しながら培養する流加培養で遺伝子組換え大腸菌を培養すると好ましい。
【0026】
本発明において、遺伝子組換え大腸菌の培養を流加培養で行なう際、培養開始時に投入する炭素源および窒素源の濃度は、炭素源がグルコースの場合は２０ｇ／Ｌ以下に、窒素源が酵母エキスの場合は８０ｇ／Ｌ以下に、それぞれすると好ましい。流加する炭素源と窒素源は高濃度の溶液とすると培養液の液量増加を抑えられるため好ましい。具体的には、炭素源がグルコースの場合は３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下に、窒素源が酵母エキスの場合は１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下に、それぞれすると好ましい。なお前記大腸菌中のナトリウム濃度と培地のナトリウム濃度とが同等な濃度となる条件で、前述した無機塩をさらに加えても良い。
【0027】
流加培養で遺伝子組換え大腸菌を培養する際、炭素源および窒素源の流加は、培地中における当該炭素源および窒素源の濃度を所定の低濃度を維持しながら行なう必要がある。なお本明細書において「所定の低濃度」とは、炭素源が枯渇せず有機酸等の副生成物が生産しない濃度のことをいう。具体例として、グルコースを炭素源とした場合、炭素源濃度が５ｇ／Ｌを超えた状態で培養を行なうと、副生成物である有機酸の蓄積により大腸菌の増殖や組換えタンパク質の発現を抑制する可能性があることから、少なくとも５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下である。炭素源の枯渇をモニターする方法に特に限定はなく、一例として呼吸活性の低下によりモニターできる。呼吸活性の低下は、例えば培養液の溶存酸素濃度（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ、以下、ＤＯ）の上昇、排ガス中の酸素濃度の上昇、炭酸ガス濃度の低下、ｐＨの上昇として現れる。特に、ＤＯは炭素源が枯渇すると微生物の呼吸活性が低下し急激に上昇することから、応答が速い点で、炭素源の枯渇をモニターするのに好ましい指標である。
【0028】
本発明における、遺伝子組換え大腸菌の培養条件は、大腸菌が増殖し、かつＡＡＶ結合性タンパク質を発現し得るものであれば特に限定は無いが、培養温度は１５℃以上５０℃以下が好ましく、特に好ましい温度は２０℃以上３３℃以下である。ｐＨは６以上８以下が好ましい。培養時間は任意に設定できるが、通常は数時間以上１００時間以下に設定される。
【0029】
遺伝子組換え大腸菌が、誘導性のプロモーターおよび組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（組換えタンパク質遺伝子）を挿入した発現ベクターを含んでいる場合、本発明における培養工程に、前記大腸菌の菌体濃度が一定濃度に達した時点で誘導剤を添加する工程をさらに含ませると、前記大腸菌当たりの組換えタンパク質発現量が向上するため、好ましい。本発明において、誘導剤とは、発現ベクターに挿入された遺伝子の発現を誘導する遺伝子発現誘導剤を指す。このような誘導剤として、例えばイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が挙げられる。特に、誘導剤を添加するときの菌体濃度が６００ｎｍの吸光度（ＯＤ600）で７０以上１２０以下、および／または前記誘導剤が終濃度で０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ以上４ｍｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは終濃度で０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．４ｍｍｏｌ／Ｌ以下）のイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とすると、前記大腸菌当たりの組換えタンパク質発現量が特に向上するため、さらに好ましい。
【0030】
前述した方法で発現した組換えタンパク質を回収するには、遺伝子組換え大腸菌における前記タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して前記タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から組換えタンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することで菌体を破砕し、組換えタンパク質を抽出後、精製すればよい。
【0031】
回収した組換えタンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、前記タンパク質を高純度に調製できる。
【0032】
本発明の方法で製造可能な組換えタンパク質に特に限定はなく、一例として、インシュ
リン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、
およびそれらの受容体のタンパク質や、細菌やウイルスに対する受容体や、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）といった遺
伝子工学の領域で用いられる酵素があげられる。以降、本発明の方法で製造する組換えタ
ンパク質の好ましい例である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質について詳細に説明する。
リン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、
およびそれらの受容体のタンパク質や、細菌やウイルスに対する受容体や、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）といった遺
伝子工学の領域で用いられる酵素があげられる。以降、本発明の方法で製造する組換えタ
ンパク質の好ましい例である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質について詳細に説明する。
【0033】
ＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶと結合可能なポリペプチドであれば特に制限はなく、インテグリンなどのラミニン受容体、抗ＡＡＶ抗体やＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）が例示できる。
【0034】
ＡＡＶ結合性タンパク質がＡＡＶＲである場合の好ましい態様として、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドがあげられる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0035】
なお配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＡＡＶＲの一態様であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（公式データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ、アクセッションナンバー：Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である。
【0036】
前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１およびＰＫＤ２に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、
ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
【0037】
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドや、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のＡＡＶ結合性タンパク質、があげられる。また前記（ｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換があげられる。
【0038】
前記（ｉｉ）における、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶＲの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、ＡＡＶ結合活性を有する限り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。
【0039】
なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶＲの由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0040】
前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0041】
本発明の方法で製造する組換えタンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質が存在する溶液からの分析・精製の迅速化やタンパク質の安定化等に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、Ｃ－ｍｙｃタグ等があげられる。
【0042】
さらに本発明の方法で製造する組換えタンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよく、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ，ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。
【実施例0043】
以下、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を組換えタンパク質としたときの実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0044】
比較例１ 遺伝子組換え大腸菌からのＡＡＶ結合性タンパク質製造（その１、無機元素非制御の通常培地）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）および誘導性のプロモーターを挿入した発現ベクターで大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を、２×ＹＴ培地（トリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス（ＣＡＳ番号：８０１３－０１－２）：１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩：５０ｍｇ／Ｌ）に植菌し、３０℃で１６時間、前培養を行なった。なおＡＶＲ１０ｓ（配列番号２）は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＩＺＡ０、配列番号１）の細胞外ドメイン１および２（ＰＫＤ１およびＰＫＤ２）に相当する、３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基（以下、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質とも表記）において、以下の（ｉ）から（ｘ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質と比較し、アルカリへの安定性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質である（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）。
（ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号２では６番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ｉｉ）配列番号１の３４２番目（配列番号２では３１番目）のチロシンがセリンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３６２番目（配列番号２では５１番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ｉｖ）配列番号１の３７１番目（配列番号２では６０番目）のリジンがアスパラギンに置換
（ｖ）配列番号１の３８１番目（配列番号２では７０番目）のバリンがアラニンに置換
（ｖｉ）配列番号１の３８２番目（配列番号２では７１番目）のイソロイシンがバリンに置換
（ｖｉｉ）配列番号１の３９０番目（配列番号２では７９番目）のグリシンがセリンに置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の３９９番目（配列番号２では８８番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ｉｘ）配列番号１の４７６番目（配列番号２では１６５番目）のセリンがアルギニンに置換
（ｘ）配列番号１の４８７番目（配列番号２では１７６番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２）表１に示す組成からなる通常培地１．２Ｌを調製後、（１）の前培養液３６ｍＬを添加して、本培養を行なった。培養装置はエイブル社製ＢＭＳ－０３ＰＩを使用し、撹拌速度４００から７００ｒｐｍ、空気の通気量１．５Ｌ／分、培養温度３０℃、ｐＨ６．８から７．２とした。なお培養中におけるｐＨの変動は、１４％（ｗ／ｖ）アンモニア水または５０％（ｗ／ｖ）リン酸の添加により前記範囲に制御した。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）および誘導性のプロモーターを挿入した発現ベクターで大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を、２×ＹＴ培地（トリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス（ＣＡＳ番号：８０１３－０１－２）：１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩：５０ｍｇ／Ｌ）に植菌し、３０℃で１６時間、前培養を行なった。なおＡＶＲ１０ｓ（配列番号２）は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＩＺＡ０、配列番号１）の細胞外ドメイン１および２（ＰＫＤ１およびＰＫＤ２）に相当する、３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基（以下、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質とも表記）において、以下の（ｉ）から（ｘ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質と比較し、アルカリへの安定性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質である（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）。
（ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号２では６番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ｉｉ）配列番号１の３４２番目（配列番号２では３１番目）のチロシンがセリンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３６２番目（配列番号２では５１番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ｉｖ）配列番号１の３７１番目（配列番号２では６０番目）のリジンがアスパラギンに置換
（ｖ）配列番号１の３８１番目（配列番号２では７０番目）のバリンがアラニンに置換
（ｖｉ）配列番号１の３８２番目（配列番号２では７１番目）のイソロイシンがバリンに置換
（ｖｉｉ）配列番号１の３９０番目（配列番号２では７９番目）のグリシンがセリンに置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の３９９番目（配列番号２では８８番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ｉｘ）配列番号１の４７６番目（配列番号２では１６５番目）のセリンがアルギニンに置換
（ｘ）配列番号１の４８７番目（配列番号２では１７６番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２）表１に示す組成からなる通常培地１．２Ｌを調製後、（１）の前培養液３６ｍＬを添加して、本培養を行なった。培養装置はエイブル社製ＢＭＳ－０３ＰＩを使用し、撹拌速度４００から７００ｒｐｍ、空気の通気量１．５Ｌ／分、培養温度３０℃、ｐＨ６．８から７．２とした。なお培養中におけるｐＨの変動は、１４％（ｗ／ｖ）アンモニア水または５０％（ｗ／ｖ）リン酸の添加により前記範囲に制御した。
【0045】
【表1】
【0046】
【表2】
（５）培養開始から４８時間後、培養を終了し、培地の遠心分離により、培養湿菌体を回収した。
（６）得られた湿菌体を、市販の抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、メルク社製）を用いて、試薬に添付の標準プロトコルに従い抽出し、遠心分離操作により上清（無細胞抽出液）を得た。
（７）得られた無細胞抽出液を、濃度既知のＡＡＶ結合性タンパク質標準品と並べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド電気泳動）に供した。
（８）画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ １０．０、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてＡＡＶ結合性タンパク質に相当するバンドの濃度を定量し、前記標準品における前記バンド濃度との比較から、無細胞抽出液中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を定量し、培養液当たりの生産量を算出した。
【0047】
培養およびＡＡＶ結合性タンパク質生産の結果を表３に示す。培養液当たりのＡＡＶ結合性タンパク質量は３．８ｇ／Ｌ（培養液）であった。
【0048】
【表3】
【0049】
比較例２ 元素分析
（１）比較例１（５）の遠心分離で回収した培養湿菌体約１０ｇを純水３００ｍＬに懸濁し、再度遠心分離によって菌体を回収する操作を２回実施することで菌体を洗浄後、乾熱乾燥機で２日間菌体を乾燥させた。
（２）乾燥させた菌体を乳鉢で粉砕後、ＩＣＰ発光分光分析装置（装置名：Ｖｉｓｔａ－ＰＲＯ［セイコーインスツルメンツ］）で分析することで、遺伝子組換え大腸菌中の無機元素（具体的には、カルシウム（Ｃａ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、ナトリウム（Ｎａ）、ニッケル（Ｎｉ）および亜鉛（Ｚｎ））濃度を測定した。
（３）培地に添加する酵母エキスについても、（２）に記載のＩＣＰ発光分光分析装置で同様に測定した。
（１）比較例１（５）の遠心分離で回収した培養湿菌体約１０ｇを純水３００ｍＬに懸濁し、再度遠心分離によって菌体を回収する操作を２回実施することで菌体を洗浄後、乾熱乾燥機で２日間菌体を乾燥させた。
（２）乾燥させた菌体を乳鉢で粉砕後、ＩＣＰ発光分光分析装置（装置名：Ｖｉｓｔａ－ＰＲＯ［セイコーインスツルメンツ］）で分析することで、遺伝子組換え大腸菌中の無機元素（具体的には、カルシウム（Ｃａ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、ナトリウム（Ｎａ）、ニッケル（Ｎｉ）および亜鉛（Ｚｎ））濃度を測定した。
（３）培地に添加する酵母エキスについても、（２）に記載のＩＣＰ発光分光分析装置で同様に測定した。
【0050】
酵母エキスに含まれる無機元素濃度の測定結果を表４に示す。また培養菌体および培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度、ならびにこれら測定結果より算出した各無機元素の余剰度を表５に示す。なお培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度は、表１に示す組成からなる培地に含まれる無機元素濃度、表２に示す組成からなる流加培地に含まれる無機元素濃度、および表４に示す酵母エキスに含まれる無機元素濃度から計算した値である。また濃度１ｍｇ／Ｌ未満の無機元素（具体的には、コバルト、銅、モリブデンおよびニッケル）は余剰度の計算から外している。
【0051】
【表4】
【0052】
【表5】
【0053】
表４より通常培地に含まれるカルシウム、鉄、マグネシウム、マンガンおよび亜鉛は、培養菌体に含まれる濃度と同等な濃度（余剰度の絶対値が１．０未満）であることから、これら無機元素については表１および表２に記載の組成からなる培地で問題ないことがわかる。一方、カリウムおよびナトリウムは余剰度が１０以上あり、表１および表２に記載の組成からなる通常培地では、培養菌体に含まれる濃度に対し、カリウムおよびナトリウムが大過剰であることがわかる。
【0054】
実施例１ 遺伝子組換え大腸菌からのＡＡＶ結合性タンパク質生産（その１、ナトリウム濃度制御）
表４より、表１および表２に記載の組成からなる培地ではカリウムおよびナトリウムが大過剰であることが判明したため、このうち培地に含まれるナトリウムを培養菌体に含まれる濃度と同等な濃度とすべく、ナトリウム濃度を制御した培地で遺伝子組換え大腸菌を培養した。具体的には、比較例１（２）の本培養で用いる培地を表５に記載のナトリウム制御培地Ａに変更した他は比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。また表５に示す組成からなるナトリウム制御培地Ａに含まれる無機元素濃度、表２に示す組成からなる流加培地に含まれる無機元素濃度、および表４に示す酵母エキスに含まれる無機元素濃度から培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度を計算した。
表４より、表１および表２に記載の組成からなる培地ではカリウムおよびナトリウムが大過剰であることが判明したため、このうち培地に含まれるナトリウムを培養菌体に含まれる濃度と同等な濃度とすべく、ナトリウム濃度を制御した培地で遺伝子組換え大腸菌を培養した。具体的には、比較例１（２）の本培養で用いる培地を表５に記載のナトリウム制御培地Ａに変更した他は比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。また表５に示す組成からなるナトリウム制御培地Ａに含まれる無機元素濃度、表２に示す組成からなる流加培地に含まれる無機元素濃度、および表４に示す酵母エキスに含まれる無機元素濃度から培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度を計算した。
【0055】
【表6】
【0056】
比較例３ 遺伝子組換え大腸菌からのＡＡＶ結合性タンパク質生産（その１、カリウム濃度制御）
表４より、表１および表２に記載の組成からなる培地ではカリウムおよびナトリウムが大過剰であることが判明したため、このうち培地に含まれるカリウムを培養菌体に含まれる濃度と同等な濃度とすべく、カリウム濃度を制御した培地で遺伝子組換え大腸菌を培養した。具体的には、比較例１（２）の本培養で用いる培地を表５に記載のカリウム制御培地に、比較例１（３）の流加に用いた培地を表７に記載のカリウム制御培地に、それぞれ変更した他は比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。また表６に示す組成からなるカリウム制御培地に含まれる無機元素濃度、表７に示す組成からなる流加培地（カリウム制御培地）に含まれる無機元素濃度、および表４に示す酵母エキスに含まれる無機元素濃度から培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度を計算した。
表４より、表１および表２に記載の組成からなる培地ではカリウムおよびナトリウムが大過剰であることが判明したため、このうち培地に含まれるカリウムを培養菌体に含まれる濃度と同等な濃度とすべく、カリウム濃度を制御した培地で遺伝子組換え大腸菌を培養した。具体的には、比較例１（２）の本培養で用いる培地を表５に記載のカリウム制御培地に、比較例１（３）の流加に用いた培地を表７に記載のカリウム制御培地に、それぞれ変更した他は比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。また表６に示す組成からなるカリウム制御培地に含まれる無機元素濃度、表７に示す組成からなる流加培地（カリウム制御培地）に含まれる無機元素濃度、および表４に示す酵母エキスに含まれる無機元素濃度から培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度を計算した。
【0057】
【表7】
【0058】
実施例１および比較例３での培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度を表８に示す（比較のため、表４に示した、培養菌体に含まれる無機元素濃度を再掲している）。また培養終了時の培地および培養菌体に含まれる無機元素濃度とから算出した、各無機元素の余剰度を表９に示す（濃度１ｍｇ／Ｌ未満の無機元素（コバルト、銅、モリブデンおよびニッケル）は余剰度計算の対象外）。
【0059】
【表8】
【0060】
【表9】
【0061】
表９より、ナトリウム制御培地（実施例１）でのナトリウムの余剰度は－０．０１と、培地に含まれるナトリウム濃度が培養菌体に含まれるナトリウム濃度と同等なナトリウム濃度であることから、実施例１でのＡＡＶ結合性タンパク質生産がナトリウムを制御した培養での生産であることを確認した。またカリウム制御培地（比較例３）でのカリウムの余剰度も１．０３と、培地に含まれるカリウム濃度が培養菌体に含まれるカリウム濃度とほぼ同等なカリウム濃度であることから、比較例３でのＡＡＶ結合性タンパク質生産もカリウムを制御した培養での生産であることを確認した。
【0062】
実施例１および比較例３における培養およびＡＡＶ結合性タンパク質生産の結果を表１０に示す。遺伝子組換え大腸菌をナトリウムを制御した培地で培養（実施例１）すると、ナトリウムおよびカリウムを制御しなかった培地で培養（比較例１、表３）したときと比較し、培養液当たりのＡＡＶ結合性タンパク質生産量が向上した（実施例１：８．８ｇ／Ｌ（培養液）、比較例１：３．８ｇ／Ｌ（培養液））。以上の結果から、組換えタンパク質の製造を目的とした、遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地に含まれるナトリウム濃度を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度と同等な濃度とすることで、前記タンパク質を効率的に製造できることがわかる。
【0063】
一方、遺伝子組換え大腸菌をカリウムを制御した培地で培養（比較例３）すると、ナトリウムおよびカリウムを制御しなかった培地で培養（比較例１、表３）したときと比較し、培養後の菌体密度が大きく減少（比較例３：１４６ｇ／Ｌ（培養液）、比較例１：３０２ｇ／Ｌ（培養液））し、培養液当たりのＡＡＶ結合性タンパク質生産量も減少（比較例３：２．８ｇ／Ｌ（培養液）、比較例１：３．８ｇ／Ｌ（培養液））した。以上の結果から、組換えタンパク質の製造を目的とした、遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地に含まれるカリウム濃度を、前記大腸菌に含まれるカリウム濃度と同等な濃度としても、前記タンパク質の効率的な製造にはつながらないことがわかる。
【0064】
【表10】
【0065】
比較例４ 遺伝子組換え大腸菌からのＡＡＶ結合性タンパク質製造（その２、無機元素非制御の通常培地）
発現ベクターに挿入するＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）に変更した他は、比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。なおＡＶＲ１１ａ（配列番号４）は、ＡＶＲ１０ｓ（配列番号２）のアミノ酸残基において、さらに以下の（ｘｉ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質やＡＶＲ１０ｓと比較し、アルカリへの安定性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質である。
（ｘｉ）配列番号１の３３０番目（配列番号２では１９番目）のアラニンがバリンに置換
発現ベクターに挿入するＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）に変更した他は、比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。なおＡＶＲ１１ａ（配列番号４）は、ＡＶＲ１０ｓ（配列番号２）のアミノ酸残基において、さらに以下の（ｘｉ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質やＡＶＲ１０ｓと比較し、アルカリへの安定性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質である。
（ｘｉ）配列番号１の３３０番目（配列番号２では１９番目）のアラニンがバリンに置換
【0066】
実施例２ 遺伝子組換え大腸菌からのＡＡＶ結合性タンパク質生産（その２、ナトリウム濃度制御）
発現ベクターに挿入するＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、前述したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）に変更し、比較例１（２）の本培養で用いる培地を表５に記載の組成からなるナトリウム制御培地Ｂに変更した他は、比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。
発現ベクターに挿入するＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、前述したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）に変更し、比較例１（２）の本培養で用いる培地を表５に記載の組成からなるナトリウム制御培地Ｂに変更した他は、比較例１と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を生産した。
【0067】
表１に示す組成からなる通常培地（比較例４）または表５に示す組成からなるナトリウム制御培地Ｂ（実施例２）に含まれる無機元素濃度、表２に示す組成からなる流加培地に含まれる無機元素濃度、および表４に示す酵母エキスに含まれる無機元素濃度から計算した、比較例２および実施例２における培養終了時の培地に含まれる無機元素濃度を表１１に示す。（比較のため、表４に示した、培養菌体に含まれる無機元素濃度を再掲している）。また培養終了時の培地および培養菌体に含まれる無機元素濃度とから算出した、各無機元素の余剰度を表１２に示す（濃度１ｍｇ／Ｌ未満の無機元素（コバルト、銅、モリブデンおよびニッケル）は余剰度計算の対象外）。
【0068】
【表11】
【0069】
【表12】
【0070】
表１２より、ナトリウム制御培地Ｂ（実施例２）でのナトリウムの余剰度は－０．８２と、余剰度の絶対値が１未満であるため、培地に含まれるナトリウム濃度が培養菌体に含まれるナトリウム濃度と同等と言えることから、実施例２でのＡＡＶ結合性タンパク質生産がナトリウムを制御した培養での生産であることを確認した。比較例４および実施例２における培養およびＡＡＶ結合性タンパク質生産の結果を表１３に示す。遺伝子組換え大腸菌をナトリウム制御培地Ｂで培養（実施例２）すると、ナトリウムおよびカリウムを制御しなかった培地で培養（比較例４）したときと比較し、培養液当たりのＡＡＶ結合性タンパク質生産量が向上した（実施例２：６．９ｇ／Ｌ（培養液）、比較例４：３．２ｇ／Ｌ（培養液））。以上の結果から、製造する組換えタンパク質をＡＶＲ１０ｓ（配列番号２）からＡＶＲ１１ａ（配列番号４）に変更しても、当該タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地に含まれるナトリウム濃度を、前記大腸菌に含まれるナトリウム濃度と同等な濃度とすることで、前記タンパク質を効率的に製造できることがわかる。
【0071】
【表13】
【配列表】