特開 2023-160632 植物クロマチンの試験管内再構築法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023160632

(43)【公開日】2023-11-02

(54)【発明の名称】植物クロマチンの試験管内再構築法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20231026BHJP

   C12N 15/00 20060101ALI20231026BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68 100Z

C12Q1/68 ZNA

C12N15/00 100Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022071114

(22)【出願日】2022-04-22

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】高須賀 太一

(72)【発明者】

【氏名】沖宗 慶一

(72)【発明者】

【氏名】バンコ，ペトラ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ42

4B063QQ53

4B063QR48

4B063QR49

(57)【要約】

【課題】一般的な構造のクロマチンおよび／または変種ヒストンからなるクロマチンを生理的条件下で、クロマチン再構成因子を用いることなく、イン・ビトロで再構築する方法を開発すること。
【解決手段】小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物をインキュベートすることを含む、または小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすることを含む、植物クロマチンの再構築方法等が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物をインキュベートすることを含む、または小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすることを含む、植物クロマチンの再構築方法。

【請求項2】

４種のコアヒストンが少なくとも１種の変種ヒストンを含む、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記混合物がさらにクロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを含むか、または前記混合物をクロマチン再構成因子と共にさらにインキュベートすることを含む、請求項２記載の方法。

【請求項4】

小麦胚芽無細胞抽出液中で発現された植物由来の４種のコアヒストンと、鋳型ＤＮＡとからなる、再構築された植物クロマチン。

【請求項5】

４種のコアヒストンが少なくとも１種の変種ヒストンを含む、請求項４記載の再構築された植物クロマチン。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項記載の方法によって再構築された、植物クロマチン。

【請求項7】

クロマチンの構築を促進または阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、
（１）
（ａ）小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートすること、
（ｂ）小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすること、または
（ｃ）小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共に候補物質の存在下でインキュベートすること、および
（２）クロマチンが再構築されたか否かを評価すること
を含む、方法。

【請求項8】

前記（ａ）または（ｂ）において、前記候補物質が小麦胚芽無細胞抽出液中で共発現されている、請求項７記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試験管内で植物クロマチンの再構築を行う方法、および該方法によって構築されたクロマチンに関する。

【背景技術】

【0002】

真核生物において、ゲノム情報（ＤＮＡ）はクロマチン高次構造によってコンパクトに収納されていることが知られている。クロマチンの最少機能性単位はヌクレオソームであり、ヌクレオソームは、各２コピーの４種のヒストンからなるヒストン八量体と、該ヒストンの周囲に巻き付いた約１５０ｂｐのＤＮＡとから構成される。クロマチンの生化学的解析によって、これまでに、クロマチン立体構造や真核生物細胞核内におけるクロマチン構成因子などの機能の同定が進んでいる。また、クロマチンは一般的な構造に加え、セントロメアなどに特徴的に見られる変種ヒストンから構成される特殊な構造をとることが知られている。

【0003】

試験管内においてクロマチンを再構築する方法として、二本鎖ＤＮＡと大腸菌異種発現したヒストン（組換えヒストン）を塩透析する方法や、二本鎖ＤＮＡと大腸菌異種発現したヒストンにクロマチン再構成因子を作用させる方法が報告されている。しかしながら、これらの技術では、１）大腸菌異種発現したヒストンは構造が壊れ不溶化するため、非生理的条件下で可溶化する必要があること；２）塩透析法によるクロマチン再構築は、塩濃度依存的に（すなわち、非生理的条件下で）クロマチンを再構築することなど、天然に近い状態で再構成されたクロマチンを提供できないという問題があった。これらの問題を打破するため、最近、発明者らのグループは、小麦胚芽無細胞抽出液を用いて、ヒトおよびショウジョウバエ由来の可溶化ヒストンとクロマチン再構成因子の共発現反応によりクロマチン再構築を行える技術を開発した（非特許文献１および２）。

【0004】

しかしながら、クロマチン再構成因子を用いずに生理的条件下でクロマチンを再構築する方法は、発明者らの知る限りまだ存在しない。さらに、変種ヒストンから成るクロマチンの再構築については、塩透析による方法しか報告されていない。染色体のクロマチン構造については不明な点が多く、ゲノム編集や組換え体作製における基礎的知見を得るためには、天然に近い状態での評価用クロマチン構造が必要とされる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｏｋｉｍｕｎｅら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０，， ６２（２０２０）

【非特許文献2】Ｅｎｄｏら、ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ， １１（２０２１）， １５５２－１５６４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記のような情況下において、本発明は、一般的な構造のクロマチンおよび／または変種ヒストンからなるクロマチンを生理的条件下で、クロマチン再構成因子を用いることなく、イン・ビトロで再構築する方法を開発することを目的とした。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明者らは鋭意研究の結果、驚くべきことに、小麦胚芽無細胞抽出液、４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡの混合物をアミノ酸混合物等のタンパク質翻訳のための反応基質の存在下でインキュベートすることにより、植物クロマチンが再構築されることを見出した。さらに、用いるヒストンの種類によりクロマチン再構築が困難な場合は、クロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを加えて共発現させることにより、植物クロマチンを再構築できることを見出した。かくして、本発明を完成させた。

【0008】

したがって、本発明は以下の態様を提供する。
［１］小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物をインキュベートすることを含む、または小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすることを含む、植物クロマチンの再構築方法、
［２］４種のコアヒストンが少なくとも１種の変種ヒストンを含む、［１］記載の方法、
［３］前記混合物がさらにクロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを含むか、または前記混合物をクロマチン再構成因子と共にさらにインキュベートすることを含む、［２］記載の方法、
［４］小麦胚芽無細胞抽出液中で発現された植物由来の４種のコアヒストンと、鋳型ＤＮＡとからなる、再構築された植物クロマチン、
［５］４種のコアヒストンが少なくとも１種の変種ヒストンを含む、［４］記載の再構築された植物クロマチン、
［６］［１］～［３］のいずれか１項記載の方法によって再構築された、植物クロマチン、
［７］クロマチンの構築を促進または阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、
（１）
（ａ）小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートすること、
（ｂ）小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすること、または
（ｃ）小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共に候補物質の存在下でインキュベートすること、および
（２）クロマチンが再構築されたか否かを評価すること
を含む、方法、
［８］前記（ａ）または（ｂ）において、前記候補物質が小麦胚芽無細胞抽出液中で共発現されている、［７］記載の方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、これまでに報告のない生理的条件下において植物クロマチンを試験管内で簡便に再構築することができる。具体的には、本発明は、小麦胚芽無細胞抽出液を用いることで、クロマチン再構成因子を用いずに、かつ、生理的条件下で、変種ヒストンを含むヒストンおよび鋳型ＤＮＡから植物クロマチンを再構築できる技術を提供する。クロマチンを再構築し難いヒストンの組み合わせについては、さらにクロマチン再構成因子を用いることにより再構築を可能にした。さらに、本発明のクロマチン再構築過程は、クロマチン再構築機能を促進あるいは阻害する新規因子をスクリーニングする方法に利用できる。本発明によれば、生理的条件下で再構成された植物クロマチンが提供されるので、本発明は、エピジェネティクスの研究を行う上で重要な評価系を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、小麦胚芽無細胞抽出液によって発現された各ヒストンタンパク質を示す。

【図2】図２は、小麦胚芽無細胞抽出液によるクロマチン再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。

【図3】図３は、小麦胚芽無細胞抽出液によるクロマチン再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。

【図4】図４は、小麦胚芽無細胞抽出液によるクロマチン再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。

【図5】図５は、推定クロマチン再構成因子を用いた小麦胚芽無細胞抽出液によるクロマチン再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。

【図6】図６は、推定クロマチン再構成因子を用いた小麦胚芽無細胞抽出液によるクロマチン再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

小麦胚芽無細胞抽出液は、無細胞タンパク質合成系として知られている。小麦胚芽より抽出した溶液にはタンパク質合成を行うために必要なリボソームやｔＲＮＡ等の装置が含まれるため、所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびタンパク質翻訳のための反応基質（各種アミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー源等）を加えることにより、所望のタンパク質が合成される。該無細胞タンパク質合成系は、複数のタンパク質を同時に発現させることもできる。このような小麦胚芽無細胞抽出液は、当該分野で既知の方法によって調製することができる。小麦胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系はよく確立されており、また、様々な試薬およびキットが市販されている。本発明において使用される小麦胚芽無細胞抽出液は、当該分野で既知の方法によって調製してもよく、または市販の小麦胚芽無細胞抽出液を用いてもよい。

【0012】

小麦胚芽無細胞抽出液は、内因性ＤＮＡが混入している場合があるため、該内因性ＤＮＡを排除するために非特異的エンドヌクレアーゼによって前処理されていてもよい。非特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、限定するものではないが、マイクロコッカルヌクレアーゼが挙げられる。

【0013】

コアヒストンには、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の４種がある。コアヒストンにはそれぞれ、変種ヒストンと称される複数のサブタイプが存在するが、Ｈ４の変種はこれまでに報告されていない。本発明において、４種のコアヒストンは、コアヒストンまたはその変種ヒストンのいずれであってもよく、コアヒストンと変種ヒストンの組み合わせであってもよい。

【0014】

本発明において、コアヒストンは、いずれの植物由来であってもよい。例えば、限定するものではないが、モデル植物として汎用されているシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のコアヒストンが用いられる。シロイヌナズナは多くの変種ヒストンを持つことが知られており、例えば、表１に示される変種ヒストンが挙げられる。

【0015】

【表1】

【0016】

コアヒストンをコードするｍＲＮＡは、当該分野で既知の方法によって調製すればよく、また、市販のキットや試薬を用いて調製することもできる。コアヒストンをコードするｍＲＮＡは、例えば、植物細胞から抽出された全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリを作製し、該ライブラリから所望の遺伝子をクローニングして試験管内転写することによって調製してもよく、あるいは既知の遺伝子情報に基づいて化学合成したｃＤＮＡを試験管内転写することによって調製してもよい。例えば、コアヒストンをコードするｍＲＮＡとして、ｃＤＮＡからの転写溶液をそのまま（未精製の状態で）用いてもよく、または転写溶液からｍＲＮＡを単離・精製して用いてもよい。シロイヌナズナのコアヒストンをコードするｍＲＮＡの例として、限定するものではないが、Ｈ２ＡをコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ５１０６０）、Ｈ２Ａ．ＸをコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ５４６９０）、Ｈ２Ａ．ＷをコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ５Ｇ５９８７０）、Ｈ２Ａ．ＺをコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ２Ｇ３８８１０）、Ｈ２Ｂ．９をコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ３Ｇ４５９８０）、Ｈ２Ｂ．７をコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ３Ｇ０９４８０）、Ｈ３．１をコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ０９２００）、Ｈ３．３をコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ４Ｇ４００３０）、ＣＥＮＨ３をコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ０１３７０）、およびＨ４をコードするｍＲＮＡ（遺伝子座番号ＡＴ２Ｇ２８７４０）が挙げられる。シロイヌナズナのゲノム情報は、例えば、ＴＡＩＲ（The Arabidopsis Information Resource）などの公共のデータベースから得ることができる。

【0017】

４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡの使用量は特に限定されないが、好ましくは、各ｍＲＮＡが等量の重量で用いられる。

【0018】

本明細書において、鋳型ＤＮＡとは、小麦胚芽無細胞抽出液中で発現されたヒストン分子の周囲に巻き付いて、ヒストンと共にクロマチンを再構築するＤＮＡをいう。鋳型ＤＮＡは、小麦胚芽抽出液に含まれない外来性ＤＮＡである。鋳型ＤＮＡの配列は限定されず、いずれの配列を有していてもよい。鋳型ＤＮＡは、好ましくは非翻訳配列を有する。鋳型ＤＮＡは、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。鋳型ＤＮＡは、環状であってもよく、または線状であってもよい。鋳型ＤＮＡの長さは、１５０ｂｐ以上であれば特に限定されないが、好ましくは１６０ｂｐ以上、例えば２０００ｂｐ～１０，０００ｂｐであってもよい。

【0019】

本発明では、コアヒストンをコードするｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系である小麦胚芽無細胞抽出液中でインキュベートすることによって、コアヒストンタンパク質を発現させ、発現されたコアヒストンと鋳型ＤＮＡによってクロマチンが再構築される。本発明の一の態様では、小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物をインキュベートすることを含む、一段階の植物クロマチンの再構築方法（共発現構築法）が提供される。また、本発明の別の態様では、小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすることを含む、二段階の植物クロマチンの再構築方法（翻訳後構築法）が提供される。

【0020】

上記のように、本発明では小麦胚芽無細胞抽出液中でコアヒストンをコードするｍＲＮＡからヒストンタンパク質を発現させるため、上記混合物のインキュベートはタンパク質翻訳のための反応基質溶液の共存下で行われる。タンパク質翻訳のための反応基質溶液は、アミノ酸混合物、エネルギー源としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を産生するためのクレアチンキナーゼ等を含む。アミノ酸混合物は、好ましくは、全てのコドンに対応している少なくとも２０種のＬ型アミノ酸を含む。アミノ酸混合物は、目的に応じて、アミノ酸アナログや異性体、または同位体元素等で標識されたアミノ酸を含んでいてもよい。タンパク質翻訳のための反応基質溶液は、好ましくは、アミノ酸混合物およびＡＴＰを含む。タンパク質翻訳のための反応基質溶液は、さらに、各種イオン（例えば、カリウムイオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン等）、核酸分解酵素阻害剤（例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤等）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール等）、抗菌剤（例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリン等）、緩衝剤、ポリエチレングリコール、葉酸塩等を含んでいてもよい。上記の成分の使用量は、無細胞タンパク質合成において通常使用される範囲に基づき当業者が適宜決定することができる。タンパク質翻訳のための反応基質溶液として様々な試薬が市販されている。本発明においては、これらの市販の試薬を用いてもよい。

【0021】

上記混合物のインキュベートは、重層法、透析法、バッチ法等の既知の様式で行うことができる。重層法は、反応基質溶液の上層の下に上記混合物を注入するか、または上記混合物の上に反応基質溶液を載せることによって二層を形成させてインキュベートする方法である。透析法は、透析膜内に上記混合物を入れ、外側に反応基質溶液を入れてインキュベートする方法である。

【0022】

上記混合物のインキュベートの時間および温度は、タンパク質の翻訳反応に適した時間および温度であれば特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。例えば、限定するものではないが、約１７～２６℃で約２～２４時間であってもよい。さらに、翻訳後構築法において、鋳型ＤＮＡとのインキュベートの時間および温度もまた当業者が適宜決定すればよく、例えば、約１７～２６℃で約２～２４時間であってもよい。

【0023】

翻訳後構築法では、小麦胚芽無細胞抽出液中で発現させたヒストンタンパク質を単離した後に鋳型ＤＮＡとインキュベートしてもよく、または小麦胚芽無細胞抽出液中で発現させたヒストンタンパク質を含む翻訳反応液を用いて鋳型ＤＮＡとインキュベートしてもよい。

【0024】

かくして、本発明の方法によれば、クロマチン再構成因子を用いることなく（特に、外因性のクロマチン再構成因子を用いることなく）、生理的条件下で植物クロマチンがイン・ビトロで再構築される。本発明の方法によれば、４種のコアヒストンの組み合わせだけでなく、変種ヒストンを含む組み合わせを含むクロマチンを再構築することもできる。後述する実施例では、シロイヌナズナの４種のコアヒストンに加え、変種ヒストン６種を用いて、全２４通りの組み合わせ（４種のヒストンＨ２Ａ、２種のヒストンＨ２Ｂ、３種のヒストンＨ３、および１個のヒストンＨ４）のうち７通りの組み合せで、外因性のクロマチン再構成因子を用いることなく、生理的条件下でクロマチンが再構築できることを証明した。

【0025】

本明細書において「生理的条件下」とは、生体内と同様の塩濃度やｐＨ等をいう。したがって、本発明の方法によって再構築された植物クロマチンは、植物の生体内と同様の条件下で構築されており、植物の生体内で生じる天然の植物クロマチンと同様の構造を有すると考えられる。

【0026】

本発明の方法においては、さらに、クロマチン再構成因子を用いてもよい。用いられる４種のヒストンをコードするｍＲＮＡの組み合わせが変種ヒストンをコードするｍＲＮＡを含む場合、ヒストンの組み合わせによってはクロマチン再構築の効率が低いか、またはクロマチン再構築が困難な場合がある。このような場合は、クロマチン再構成因子を用いることが好ましい。クロマチン再構成因子としては、植物クロマチンの再構成因子を用いてもよく、あるいは、ヒストンの由来とは異なる動物や真菌などのクロマチン再構成因子を用いてもよい。クロマチン再構成因子としては、例えば、限定するものではないが、Ｎａｐ１、Ａｃｆ１、ＩＳＷＩ、ＮＲＰ１、ＮＰＲ２等が挙げられる。植物クロマチンの再構成因子としては、ヒストンの由来と同じ植物または異なる植物のクロマチン再構成因子を用いてもよい。例えば、シロイヌナズナのクロマチンの再構成因子であるＡｔＮＲＰ１またＮＲＰ２を用いることができる。２種以上のクロマチン再構成因子を用いてもよい。

【0027】

クロマチン再構成因子の使用は、クロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを上記混合物に加えることによって行ってもよく、または上記混合物をクロマチン再構成因子と共にインキュベートすることによって行ってもよい。すなわち、小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、クロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物、または小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡおよびクロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを含む混合物を上記のようにインキュベートして、クロマチン再構成因子をコアヒストンと共発現させてもよく、あるいは、小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡおよび鋳型ＤＮＡを含む混合物をクロマチン再構成因子の存在下でインキュベートするか、または小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートしてコアヒストンを発現させた後、鋳型ＤＮＡおよびクロマチン再構成因子と共にインキュベートしてもよい。クロマチン再構成因子の使用量は、特に限定されず、当業者が適宜決定すればよい。

【0028】

本発明の方法によって再構築された植物クロマチンは、その反応液より単離・精製してもよい。単離・精製は、当該分野で既知の方法によって行えばよく、例えば多価陽イオンを用いた沈殿法や、ショ糖濃度勾配超遠心法等が挙げられる。

【0029】

本発明のさらなる態様において、小麦胚芽無細胞抽出液中で発現された植物由来の４種のコアヒストンと、鋳型ＤＮＡとからなる、再構築された植物クロマチンが提供される。４種のコアヒストンは、上記したように、変種ヒストンを含んでいてもよい。該再構成された植物クロマチンは、本発明の方法によって再構築された植物クロマチンである。

【0030】

かくしてイン・ビトロで再構築された植物クロマチンは、例えば、エピジェネティクス研究において有用である。例えば、イン・ビトロで再構築された植物クロマチンは、ヌクレオソーム修飾酵素の探索に利用することができる。例えば、本発明の方法によりイン・ビトロで再構築した未修飾クロマチンに種々のヌクレオソーム修飾酵素を添加して反応させ、ヌクレオソーム内ヒストン上の修飾アミノ酸残基を同定することができる。修飾アミノ酸残基の同定は、既知の方法で行えばよく、例えば、液体クロマトグラフ質量計等を用いることができる。

【0031】

本発明のさらなる態様において、クロマチンの構築を促進または阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、上記の本発明の植物クロマチンの再構築方法において、クロマチン再構築のための反応液を候補物質と共にインキュベートすることを含む方法を提供する。したがって、該スクリーニング方法は、（１）（ａ）小麦胚芽無細胞抽出液、植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートすること、（ｂ）小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすること、または（ｃ）小麦胚芽無細胞抽出液および植物由来の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に鋳型ＤＮＡと共に候補物質の存在下でインキュベートすること、および（２）クロマチンが再構築されたか否かを評価すること、を含む。

【0032】

候補物質としては、クロマチン再構築機能があること、クロマチン再構築を促進すること、またはクロマチン再構築を抑制することが既知または推定されるいずれの物質であってもよい。例えば、限定するものではないが、他の種でクロマチン再構成因子として知られている物質、ＮＡＰ１やヌクレオプラスミン等が挙げられる。例えば、シロイヌナズナのＮＡＰ１（ＡｔＮＡＰ１）が挙げられる。ＮＡＰ１は、シロイヌナズナ以外の他の種でクロマチン構築を改善することが知られているが、シロイヌナズナのＮＡＰ１のクロマチン再構築機能はまだ証明されておらず、推定されるに過ぎない。

【0033】

候補物質は、単離されたタンパク質としてクロマチン再構築のための反応液に加えられてもよく、または候補物質をコードするｍＲＮＡとして、小麦胚芽無細胞抽出液を含む混合物中に含まれて４種のコアヒストンと共に発現されてもよい。

【0034】

クロマチンが再構築されたか否かの評価は、当該分野で既知の方法によって行えばよい。例えば、スーパーコイリング法（supercoiling assay）、マイクロコッカルヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）による限定消化法、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）またはＣｒｙｏ電子顕微鏡等による観察等によって、インキュベート後の反応液中におけるクロマチン形成の有無およびレベルを評価することができる。スーパーコイリング法は、クロマチン形成が引き起こすＤＮＡトポロジー変化を分析することによってスーパーコイル化効率を評価する方法であり、再構築されたクロマチンからヒストン分子を除去することによって生じた、スーパーコイル化した鋳型ＤＮＡを電気泳動において検出することによって、クロマチン形成の有無およびそのレベルを測定することができる。クロマチンが正常に形成している場合は、ヒストンを分解することによってスーパーコイル化したＤＮＡが生じる。一方、ヌクレオソームの取込が不完全な場合など、不完全なクロマチンが形成している場合やクロマチン自体が形成していない場合は、ヒストンを分解するとスーパーコイル化していない緩い（リラックス型）ＤＮＡや線状ＤＮＡが生じる。電気泳動において、スーパーコイル化ＤＮＡは、リラックス型ＤＮＡや線状ＤＮＡよりも早く移動する。スーパーコイリング法は、特に環状の鋳型ＤＮＡを用いる場合に好適である。

【0035】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、実施例では、モデル植物であるシロイヌナズナのクロマチンの再構築実験を行った。

【実施例0036】

［材料］
実施例において、特記しない限り、以下の試薬を用いた。タンパク質発現には、小麦胚芽無細胞抽出液（CellFree Sciences社製）、ＳＵＢ－ＡＭＩＸ翻訳バッファー（CellFree Sciences社製）、クレアチンキナーゼ（Roche Dignostics, GmbH）を用いた。クロマチン構築（assembly）反応には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫプラスミドＤＮＡ（Addgene社製）（以下、「ｐＢＳＫプラスミド」と表記する）、ＳＵＢ－ＡＭＩＸ溶液（CellFree Sciences社製）、クレアチンキナーゼ（Roche Dignostics, GmbH）、トポイソメラーゼＩ（Takara Bio Inc.）を用いた。ゲル分析には、１ｋｂｐ ＤＮＡ分子量マーカー（Toyobo）およびタンパク質サイズマーカー（Bio-Rad Laboratories）を用いた。

【0037】

実施例１：ヒストンｍＲＮＡおよびクロマチン再構成因子ｍＲＮＡの調製
実施例で使用したシロイヌナズナタンパク質をコードした遺伝子は全て、発明者らが独自に作製したシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリから小麦胚芽無細胞タンパク質発現用ベクター（ｐＥＵベクター、CellFree Sciences社）にクローニングすることによって調製した。簡単に言うと、シロイヌナズナの全ＲＮＡを常法により抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡライブラリを合成した。シロイヌナズナの４種のコアヒストンおよび６種の変種ヒストンとシロイヌナズナクロマチン再構成因子）をコードする遺伝子をそれぞれ、ｃＤＮＡライブラリから増幅し、ｐＥＵベクターに挿入した。なお、４種のコアヒストンとして、Ｈ２Ａ（遺伝子ＨＴＡ１０；遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ５１０６０；配列番号１）、Ｈ２Ｂ クラスＩ（本明細書において「Ｈ２Ｂ．９」と称する）（遺伝子ＨＴＢ９；遺伝子座番号ＡＴ３Ｇ４５９８０；配列番号２）、Ｈ３．１（遺伝子ＨＴＲ２；遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ０９２００；配列番号３）、およびＨ４（遺伝子ＨＦＯ１；遺伝子座番号ＡＴ２Ｇ２８７４０；配列番号４）を用いた。６種の変種ヒストンとして、Ｈ２Ａ．Ｘ（遺伝子ＨＴＡ３；遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ５４６９０；配列番号５）、Ｈ２Ａ．Ｗ（遺伝子ＨＴＡ６；遺伝子座番号ＡＴ５Ｇ５９８７０；配列番号６）、Ｈ２Ａ．Ｚ（遺伝子ＨＴＡ８；遺伝子座番号ＡＴ２Ｇ３８８１０；配列番号７）、Ｈ２Ｂ クラスＩＩ（本明細書において「Ｈ２Ｂ．７」と称する）（遺伝子ＨＴＢ７；遺伝子座番号ＡＴ３Ｇ０９４８０；配列番号８）、Ｈ３．３（遺伝子ＨＴＲ４；遺伝子座番号ＡＴ４Ｇ４００３０；配列番号９）、ＣＥＮＨ３（遺伝子ＨＴＲ１２；遺伝子座番号ＡＴ１Ｇ０１３７０；配列番号１０）を用いた。シロイヌナズナ再構成因子として、ＡｔＮＡＰ１（遺伝子座番号ＡＴ５Ｇ５６９５０；配列番号１１）を用いた。

【0038】

上記プラスミド構築物（転写鋳型ＤＮＡ）を、ＷＥＰＲＯ７２４０タンパク質合成キット（CellFree Sciences社）中の転写キットを用いて、製造者のプロトコールにしたがって３７℃で４時間の試験管内転写反応に付してｍＲＮＡ合成液を得た。該ｍＲＮＡ合成液に、ＤＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ、Nippon Gene社製）を容量４０μＬ当たり１μＬ加え、３７℃で３０分間保温することによって、転写鋳型ＤＮＡを実質的に完全に消化した。ｐＨ５．５に合わせたフェノール（５０容）／クロロホルム（５０容）／イソアミルアルコール（１容）で２回抽出を繰り返した後、水層に１／１０容量の３Ｍ ＮａＯＡｃを加え、２．５容量のエタノールでｍＲＮＡを沈殿回収した。該沈殿を７０％エタノールで１回洗浄することによって遊離ヌクレオチドを除去した後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水（Nippon Gene社製）に溶解し、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Thermofisher Scientific社製）でＲＮＡ濃度を測定した。ｍＲＮＡ濃度を１μｇ／μＬに調整して以下の実施例に用いた。

【0039】

実施例２：小麦胚芽無細胞タンパク質合成重層法によるヒストンの合成
ＷＥＰＲＯ７２４０タンパク質合成キットを用い、製造者のプロトコールにしたがって、反応容器として９６穴プレートを用いて翻訳反応を行った。キットに含まれる翻訳反応基質溶液（１ｘ ＳＵＢ－ＡＭＩＸｘＳＧＣ）２０６μＬを入れたウェルに、キットに含まれる小麦胚芽無細胞抽出液（ＷＥＰＲＯ７２４０）１０μＬ、クレアチンキナーゼ０．８μｇ、および実施例１で調製した各種ヒストンをコードするｍＲＮＡの混合物８μｇを前記翻訳反応基質溶液の下層になるよう注入し、２６℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、反応液中で合成されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、小麦胚芽無細胞タンパク質合成法を用いたシロイヌナズナヒストンおよび変種ヒストンの合成と可溶化の有無を検証した。

【0040】

可溶化の有無は、合成産物を１０分間程遠心分離（１２，０００ ｘｇ）し、得られた上清において合成産物を検出することによって評価した。可溶化した合成産物は上清に含まれ、不溶化形態の合成産物は沈殿物する。その結果、いずれの合成産物も可溶性であることが分かった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、１８％ＳＤＳ－アクリルアミドゲル電気泳動を用いた。タンパク質バンドは、ＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）染色によって検出した。結果を図１に示す。図１中、標的タンパク質を矢印で示す。すべての生成物が予測されたサイズで観察された。

【0041】

実施例３：小麦胚芽無細胞タンパク質合成によるクロマチンの再構築
小麦胚芽無細胞抽出液を用いたシロイヌナズナクロマチン（変異ヒストンを含まない一般的なクロマチン）の再構築を重層法により行い、スーパーコイリング法によって確認した。簡単に言うと、実施例１で調製したＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ．９、Ｈ３．１、およびＨ４の４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡの等量混合物１．０μＬ（各ｍＲＮＡを～２．５μｇ含む）、０．２５μｇのｐＢＳＫプラスミド（鋳型ＤＮＡ）、２ＵのトポイソメラーゼＩ、５．０μＬの小麦胚芽無細胞抽出液（ＷＥＰＲＯ７２４０）、および０．４μｇのクレアチンキナーゼを混合し、１ｘＳＵＢ－ＡＭＩＸ溶液を用いて最終容量１０．４μＬに調整した。該混合物を、９６穴プレートの各ウェルにおいて、１０３．０μＬ／ウェルの１ｘＳＵＢ－ＡＭＩＸ溶液の下層になるように静かに置いて二層を形成させた。２６℃で４時間反応させて、クロマチンを構築させた。コントロール実験として、クロマチン鋳型として用いたｐＢＳＫプラスミド、およびヒストンＨ３．１とＨ４のみを共発現させる反応を行った。

【0042】

上記で得られたクロマチン構築反応液５５．０μＬをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，ｖ／ｖ）抽出（ｐＨ８．０）、次いでエタノール沈殿によって精製し、精製されたＤＮＡを微量のリボヌクレアーゼＡ（Macherey-Nagel GmbH & Co.）を含有するＨＤバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ ＤＴＴ，ｐＨ７．６）中に再懸濁した。スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを０．５ｘＴＢＥバッファー中の０．８％ＴＢＥアガロースゲルによって分離し、エチジウムブロマイド（Nippon Gene）で可視化し、ゲル・ドキュメンテーション・システム（Bio-Rad Laboratories）によって分析した。結果を図２（レーン３）に示す。

【0043】

図２に示されるように、小麦胚芽無細胞抽出液、４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡの混合物をインキュベートすることによってクロマチンが再構築された（レーン３）。一方、２種のコアヒストンのみを共発現させた場合はクロマチンが再構築されなかった（レーン２）。本実施例においてクロマチン再構成因子は添加していないことから、外因性のクロマチン再構成因子を用いることなく、小麦胚芽無細胞抽出液を用いて植物クロマチンを再構築できることを初めて見出した。

【0044】

実施例４：変種ヒストンを含むクロマチンの再構築
４種のコアヒストンをコードするｍＲＮＡのいずれかを実施例１で調製した６種の変種ヒストンをコードするｍＲＮＡのいずれかに置き換えた、２３通りのヒストンｍＲＮＡの組み合わせを用いて実施例３と同様にクロマチン構築反応を行い、スーパーコイリング法によって確認した。

【0045】

その結果、４種のヒストンのうちＨ２ＡをＨ２Ａ．ＸまたはＨ２Ａ．Ｗに置き換えた組み合わせ(図２）、４種のヒストンのうちＨ３．１をＨ３．３に置き換えた組み合わせ（図３）、４種のヒストンのうちＨ３．１をＨ３．３に置き換え、かつ、Ｈ２ＡをＨ２Ａ．ＸまたはＨ２Ａ．Ｗに置き換えた組み合わせ（図３）、４種のヒストンのうちＨ３．１をＣＥＮＨ３に置き換えた組み合わせ（図４）、４種のヒストンのうちＨ３．１をＣＥＮＨ３に置き換え、かつ、Ｈ２ＡをＨ２Ａ．Ｘに置き換えた組み合わせ（図４）の、合計７通りの組み合わせでクロマチンを再構築できた。

【0046】

実施例５：推定ヒストン再構成因子を用いるクロマチンの再構築
実施例４でクロマチンが再構築しなかった、または再構築効率が低かった組み合わせについて、推定のクロマチン再構成因子であるＡｔＮＡＰ１を用いてクロマチンを再構築できるか実験した。４種のコアヒストンの組み合わせとして、４種のヒストンのうちＨ２ＡをＨ２Ａ．Ｚに置き換えた組み合わせ、４種のヒストンのうちＨ２ＡをＨ２Ａ．Ｗに置き換え、かつ、Ｈ３．１をＨ３．３に置き換えた組み合わせ、および４種のヒストンのうちＨ２ＡをＨ２Ａ．Ｚに置き換え、かつ、Ｈ３．１をＨ３．３に置き換えた組み合わせを用いた。上記のｍＲＮＡの各組み合わせ、実施例１で調製したＡｔＮＡＰ１をコードするｍＲＮＡ、ｐＢＳＫプラスミド（鋳型ＤＮＡ）、および小麦胚芽無細胞抽出液を含む混合物を用いて実施例３と同様にクロマチン構築反応を行い、スーパーコイリング法によって確認した。

【0047】

その結果、シロイヌナズナの推定クロマチン再構成因子ＡｔＮＡＰ１を共発現することで、上記の変種ヒストンを含む組み合わせにおいてクロマチンの再構築が改善された（図５、および図６のレーン４および６）。したがって、ＡｔＮＡＰ１がクロマチン再構成因子であることが証明され、かつ、小麦胚芽無細胞抽出液中でクロマチン再構築が困難な場合は、外因性クロマチン再構成因子を加えることにより植物クロマチンを再構築できることが分かった。また、推定のクロマチン再構成因子であったＡｔＮＡＰ１のクロマチン再構築機能が証明されたことから、本発明のクロマチン再構築のための系が、クロマチン再構築の促進または抑制候補物質のスクリーニングに利用できることが分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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