(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023163455
(43)【公開日】2023-11-10
(54)【発明の名称】反応性官能基を有するポリマー
(51)【国際特許分類】
C08G 69/44 20060101AFI20231102BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20231102BHJP
C07K 5/02 20060101ALI20231102BHJP
C07K 7/02 20060101ALI20231102BHJP
【ＦＩ】
C08G69/44
C07K14/00 ZNA
C07K5/02
C07K7/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022074390
(22)【出願日】2022-04-28
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100211018
【弁理士】
【氏名又は名称】財部 俊正
(74)【代理人】
【識別番号】100176773
【弁理士】
【氏名又は名称】坂西 俊明
(72)【発明者】
【氏名】金 栄鎮
【テーマコード（参考）】
4H045
4J001
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045BA10
4H045BA17
4H045BA50
4H045FA10
4J001DA03
4J001DC03
4J001EB03
4J001EB24
4J001EC54
4J001EC84
4J001EE43A
4J001FB03
4J001FC03
4J001GD06
4J001JA20
(57)【要約】 （修正有）
【課題】反応性官能基の導入量が増大したポリマーを提供すること。
【解決手段】分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマー。
［式中、複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基である。］
【選択図】なし
【解決手段】分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマー。
［式中、複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基である。］
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマー。
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、前記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は前記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
前記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
【化1】
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
【化2】
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、前記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
【化3】
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は前記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
前記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
【請求項2】
Ｒ３がヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種を有する、請求項１に記載のポリマー。
【請求項3】
Ｒ３に活性化官能基が修飾された請求項２に記載のポリマー。
【請求項4】
前記活性化官能基がマレイミド基である、請求項３に記載のポリマー。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリマーと、ペプチド、抗体、抗原、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１種との複合体である、バイオコンジュゲーション生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、反応性官能基を有するポリマーに関する。より具体的には、本発明は、反応性官能基を有する、ポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンに関する。
【背景技術】
【0002】
従来、ポリエーテルエステルアミド、ポリエーテルエステルウレタンといったポリマーの中には、ゲル、ミセル、ファイバー、フィルム等に成形して、例えばナノバイオ分野、バイオマテリアル分野に適用可能なポリマーがあることが知られている。例えば特許文献１には、ポリエーテルエステルアミド型医療用粘着剤が例示されている。特許文献２には、ドラッグデリバリ－に用いられることのあるＰＥＧ（ポリエチレングリコ－ル）の活性化に関する例が示されている。特許文献３には、薬剤等の運搬に用いることが可能な、ポリエステルエーテルアミド骨格を有するポリマーが記載されている。特許文献４には、ポリエステルアミド骨格を有し、薬剤等を運搬可能な化合物が記載されている。
【0003】
また、ポリマーがアミノ酸残基を含有する例も報告されている。例えば、非特許文献１には、アミノ酸の一種であるフェニルアラニンを有するモノマーを用いて合成されるポリエステルアミドが例示されている。非特許文献２では、フェニルアラニンを用いて合成されるポリエステルアミドが報告されている。非特許文献３には、フェニルアラニンを有するモノマー及びアリルグリシンを有するモノマー等の重縮合により得られたポリエステルアミドが例示されている。非特許文献４では、アルギニンを用いて合成されるポリエステルアミドが報告されている。
【0004】
さらに、ポリエステルアミド系化合物に反応性の官能基を付与した例も非特許文献５及び非特許文献６で報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第３６４２９１２号公報
【特許文献2】米国特許第７１２５５５８号明細書
【特許文献3】米国特許出願公開第２０１１／００２７３７９号公報
【特許文献4】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２７７２１号明細書
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｇｕｏ，Ｋ．， Ｃｈｕ，Ｃ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．（２００５）， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ ａｍｉｄｅ）ｓ． Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ａ Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ．，４３：１４６３．
【非特許文献2】Ｃｈｅｎ Ｘ．， Ｚｈａｏ Ｌ．， ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ ａｍｉｄｅ） Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ． Ｆｒｏｎｔ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ，９：１１８．
【非特許文献3】Ｐａｎｇ，Ｘ．， Ｃｈｕ，Ｃ．Ｃ．，（２０１０）， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ ａｍｉｄｅ）ｓ ｂａｓｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ． Ｐｏｌｙｍｅｒ，５１：４２００．
【非特許文献4】Ｇｕ Ｚ．， Ｗｕ Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２０１８）Ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ ａｍｉｄｅ）－ｂａｓｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ６：６７２３．
【非特許文献5】Ｗｉｔ， Ｍ．Ａ．， Ｗａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． （２００８）． Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ ａｍｉｄｅ）ｓ ｗｉｔｈ ｐｅｎｄａｎｔ ａｍｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ． Ｊ． ｏｆ Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｐａｒｔ Ａ， ４６：６３７６．
【非特許文献6】Ｊｉ， Ｙ．， Ｓｈａｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２０１７）Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｓｅｕｄｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌａｒ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．Ｓｍａｌｌ １３：１６０１４９１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、特許文献１～４及び非特許文献１～４に記載されるようなポリマーをナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等に適用する場合、適用範囲に限りがあった。
【0008】
また、非特許文献５及び非特許文献６に記載されるようなポリマーは、そのポリマー側鎖に反応性官能基を有するが、反応性官能基の導入量増大の余地があった。
【0009】
本発明は、反応性官能基の導入量が増大したポリマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は次に示す［１］～［５］に関する。
［１］分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマー。
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は上記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
上記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
［２］Ｒ３がヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種を有する、［１］に記載のポリマー。
［３］Ｒ３に活性化官能基が修飾された［１］又は［２］に記載のポリマー。
［４］上記活性化官能基がマレイミド基である、［３］に記載のポリマー。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリマーと、ペプチド、抗体、抗原、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１種との複合体である、バイオコンジュゲーション生成物。
［１］分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマー。
【化1】
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
【化2】
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
【化3】
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は上記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
上記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
［２］Ｒ３がヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種を有する、［１］に記載のポリマー。
［３］Ｒ３に活性化官能基が修飾された［１］又は［２］に記載のポリマー。
［４］上記活性化官能基がマレイミド基である、［３］に記載のポリマー。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリマーと、ペプチド、抗体、抗原、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１種との複合体である、バイオコンジュゲーション生成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、反応性官能基の導入量が増大したポリマーを提供することができる。
【0012】
アミノ酸側鎖の反応性官能基を用いることで、反応点が豊富であり種々の反応が可能な生分解性ポリマーマトリクス材を提供することができる。本発明のポリマーを用いることで、種々のバイオ分子、リンカー、ポリマー、第２の反応性官能基等の導入が簡便になり新たな特性を持たせたポリマー材料の提供ができると考えられる。本発明のポリマーを用いることで、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等の広い範囲において、新たな用途展開ができると考えられる。
【0013】
本発明のポリマーが有する反応性官能基の有機化学反応を介して、ポリマーの側鎖に新たな官能基の導入及び特性付与が簡便に可能である。特に、バイオ分子等との複合体を形成する、バイオコンジュゲーションへの応用が可能であると考えられる。バイオ分子としては、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が考えられる。本発明のポリマーの用途として考えられるのは、例えば、細胞培養足場、ドラッグデリバリーシステム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、イムノアッセイ（ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）、創薬探索試薬、バイオセンサ媒体、病原診断試薬等への応用である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図10】図１０（Ａ）はペプチドリンカーを架橋剤とする１５ｗ／ｖ％のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルである（左からポリマー：ペプチドリンカー比は、１：１、２：１、３：１、４：１）。図１０（Ｂ）はペプチドリンカーを架橋剤とする２０ｗ／ｖ％のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルである（左からポリマー：ペプチドリンカー比は、１：１、２：１、３：１、４：１）。図１０（Ｃ）はペプチドリンカーを架橋剤とする２５ｗ／ｖ％のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルである（左からポリマー：ペプチドリンカー比は、１：１、２：１、３：１、４：１）。
【図11】図１１（Ａ）は２０ｗ／ｖ％のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルのＳＥＭ観察画像（５００倍）である（ポリマー：ペプチドリンカー比＝３：１）。図１１（Ｂ）は２５ｗ／ｖ％のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルのＳＥＭ観察画像（５００倍）である（ポリマー：ペプチドリンカー比＝３：１）。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【0016】
本発明の一実施形態は、分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマーである。
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は上記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
上記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
【化4】
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
【化5】
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
【化6】
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は上記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
上記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
【0017】
本実施形態に係るポリマーの分子量は、５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、７０００～２００００ｇ／ｍｏｌであってよく、１００００～１５０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。本実施形態に係るポリマーは、上記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有し、５～１２個有していてよく、７～１０個有していてもよい。
【0018】
Ｒ１は炭素数２～１２のアルキレン基であってよく、炭素数４～１０のアルキレン基であってよく、炭素数６～９のアルキレン基であってもよい。炭素数２～１２のアルキレン基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基等が挙げられ、これらは直鎖状又は分岐鎖状であってよい。
【0019】
Ｒ１及び／又はＲ２は、上記式（２）で表される基である。上記式（２）において、Ｒ４の分子量は２００～５０００ｇ／ｍｏｌであり、５００～４５００ｇ／ｍｏｌであってよく、１０００～４０００ｇ／ｍｏｌであってよい。ポリオキシエチレン基におけるオキシエチレン基の重合度は４～１１５であってよく、１０～１００であってよく、２０～８０であってよい。
【0020】
Ｒ２は、上記式（３）で表される基であってよい。上記式（３）において、Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であってよく、炭素数４～１０のアルキレン基であってよく、炭素数６～９のアルキレン基であってもよい。炭素数２～１２のアルキレン基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基等が挙げられ、これらは直鎖状又は分岐鎖状であってよい。
【0021】
Ｒ３は、アミノ酸の反応性側鎖である。本明細書において、「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」とは、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸両者を示す。アミノ酸は立体配置によってＤ体又はＬ体に大別されるが、本明細書におけるポリマーを構成するアミノ酸残基はＬ体であることが好ましい。「反応性側鎖」とは、反応性官能基を有する側鎖である。反応性官能基としては、例えば、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、アミノ基等が挙げられる。Ｒ３がヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種を有していてよい。反応性側鎖を有するアミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）等が例示される。
【0022】
Ｒ３は、活性化官能基により修飾されていてよい。活性化官能基は、アミノ基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシ基等と反応し、生成された共有結合を介して架橋又はリンカーを形成することができる官能基を意味する。活性化官能基としては、アミン反応性基、ヒドロキシ反応性基、チオール反応性基、アルデヒド又はケトン反応性基、カルボキシ反応性基等が挙げられる。活性化官能基としては、より具体的には、アミン、エポキシ、イソチオシアネ－ト、イソシアネ－ト、スクシンイミジルエステル、ハロゲン化スルホニル、アリ－ルハライド、アルデヒド、グルタルアルデヒド、無水物、イミダゾールカルバメート等のアミン基と反応可能な官能基；アルキレンハライド、アリ－ルハライド、マレイミド、過酸化物、ビニ－ルスルホン、ジスルフィド等のチオール基と反応可能な官能基；アミン、ヒドロキシ等のカルボン酸基と反応可能な官能基；エポキシ、アジド等のヒドロキシ基と反応可能な官能基が例示される。活性化官能基は、マレイミド基であることが好ましい。活性化官能基がマレイミド基である場合、チオール基等との反応時に余計な触媒を必要とせず、また、人体及び環境に悪影響のある副生成物が産生されないため、生体への適合性がより向上する。加えて、生体内でマレイミド基とチオール基等との結合が分解されたとしても生体に影響が少ないという利点もある。活性化官能基がマレイミド基である場合、本実施形態に係るポリマーは生分解性及び生体適合性により優れることから、ナノバイオ分野及びバイオマテリアル分野においてより好適に用いることができる。
【0023】
上記式（１）で表される繰り返し単位中のＲ３の含有量は、１．５～２当量であり、１．６～１．９当量であってよく、１．７～１．８当量であってもよい。本明細書において、「当量」とは、１モルの上記式（１）で表される繰り返し単位に含まれるＲ３のモル数を意味する。
【0024】
ｘ及びｙは、それぞれ、０．１及び０．９、０．２及び０．８、０．３及び０．７、０．４及び０．６、０．４５及び０．５５、０．５及び０．５、０．５５及び０．４５、０．６及び０．４、０．７及び０．３、０．８及び０．２、又は、０．９及び０．１であってよい。ｘ及びｙは、それぞれ０．４５及び０．５５、又は、０．６５及び０．４５であることが好ましく、０．５及び０．５であることがより好ましい。
【0025】
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、少なくとも２種のモノマーの重縮合によって得られるポリマーである。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、下記式（４）で表されるモノマー（モノマー（Ａ））及び下記式（５）で表されるモノマー（モノマー（Ｂ））を含む原料を用いた重縮合によって製造することができる。重縮合の方法は後述する。
【化7】
【化8】
【0026】
上記式（４）において、Ｒ１としては、上記式（１）が有するＲ１として例示された基と同じ基が例示される。Ｒ１が炭素数２～１２のアルキレン基であった場合、モノマー（Ａ）はジカルボン酸の活性化形態の疎水性モノマーである。Ｒ１が上記式（２）で表される基である場合、モノマー（Ａ）は、ジカルボン酸の活性化形態の親水性モノマーである。
【0027】
上記式（４）において、複数存在するＬＧ１は、独立して、脱離性を有する電子吸引性置換基である。脱離性を有する電子吸引性置換基としては、例えば、ｐ－フルオロフェノール、ｐ－クロロフェノール、ｐ－ブロモフェノール、ｐ－ニトロフェノール、ｐ－シアノフェノール、ｐ－フルオロチオフェノール、ｐ－クロロチオフェノール、ｐ－ブロモチオフェノール、ｐ－ニトロチオフェノール、ｐ－シアノチオフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－トリメチルシリルイミダゾ－ル等に由来する基が挙げられる。
【0028】
モノマー（Ａ）は、一般的な有機合成法における公知のエステル化反応により製造することができる。モノマー（Ａ）の製造方法を、ＬＧ１がいずれもｐ－ニトロフェノールに由来する基である場合を例にとって説明する。溶媒中で、縮合剤及び触媒の存在下で飽和ジカルボン酸の二塩化物（ジクロリド）とｐ－ニトロフェノールとのエステル化反応を進行させる。エステル化反応における溶媒は、有機塩基試薬（例えばピリジン）を含んでいてよい。得られたエステル化合物を再結晶化して精製することで、モノマー（Ａ）を得ることができる。
【0029】
飽和ジカルボン酸としては、ブタン二酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、トリデカン二酸、テトラデカン二酸等が挙げられ、好適な飽和ジカルボン酸ジクロリドとしては、ブタン二酸ジクロリド、グルタル酸ジクロリド、アジピン酸ジクロリド、ピメリン酸ジクロリド、スベリン酸ジクロリド、アゼライン酸ジクロリド、セバシン酸ジクロリド、ウンデカン二酸ジクロリド、ドデカン二酸ジクロリド、トリデカン二酸ジクロリド、テトラデカン二酸ジクロリド等が挙げられる。
【0030】
上記式（５）において、Ｒ２としては、上記式（１）が有するＲ２として例示された基と同じ基が例示される。Ｒ２が上記式（２）で表される基である場合、モノマー（Ｂ）は親水性モノマーである。Ｒ２が上記式（３）で表される基である場合、モノマー（Ｂ）は疎水性モノマーである。
【0031】
上記式（５）において、Ｒ６は上記式（１）が有するＲ３であってもよく、反応性官能基が保護基によって保護されたＲ３であってもよい。
【0032】
上記式（５）において、複数存在するＬＧ２は、独立して、アミノ酸残基のＮ末端と塩化合物を形成可能な酸類である。アミノ酸残基のＮ末端と塩化合物を形成可能な酸としては、例えば、スルホン酸類、トリフルオロ酢酸、塩酸等が挙げられる。
【0033】
モノマー（Ｂ）は、例えば後述する第１工程及び第２工程によって合成することができる。第１工程及び第２工程を、ＬＧ２がｐ－トルエンスルホン酸である場合を例にとって説明する。第１工程では、アミノ酸と、飽和炭化水素ジオール又はポリオキシエチレン化合物とを溶媒に溶解させ、縮合剤及び触媒の存在下でエステル化反応を進行させる。これにより、アミノ酸のＣ末端のカルボキシ基と飽和炭化水素ジオール又はポリオキシエチレン化合物の水酸基とのエステル化反応が進み、モノマー（Ｂ）の中間体が生成される。エステル化反応に用いるアミノ酸のＮ末端と、側鎖に存在する反応性官能基とは、そのいずれか又は両方が保護基で保護されていてよい。
【0034】
第２工程では、中間体のアミノ酸残基のＮ末端と、ｐ－トルエンスルホン酸とを塩化反応させることで、Ｂｏｃ基の脱保護が生じ、モノマー（Ｂ）が得られる。反応性側鎖に保護基が結合している場合、常法に従って保護基を除去してもよい。
【0035】
飽和炭化水素ジオールとしては、１，２－エタンジオール、プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，４－ブタンジオール、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，７－ヘプタンジオール、１，８－オクタンジオール、１，９－ノナンジオール、１，１０－デカンジオール、１，１１－ウンデカンジオール、１，１２－ドデカンジオール等が挙げられる。
【0036】
アミノ酸の保護基としては、例えばｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジル基（Ｂｚｌ基）、メチル基（Ｍｅ基）、トリチル基（Ｔｒｔ基）、アセトアミドメチル基（Ａｃｍ基）、スルホキシド基（ＳＯ基）、メチルエステル基（ＯＭｅ基）、ベンジルエステル基（ＯＢｚｌ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、４－メチルトリチル基（Ｍｔｔ基）、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ基）、メタンチオスルフォネ－ト基（Ｍｔｓ基）、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル基（Ｐｂｆ基）、キサンチル基（Ｘａｎ基）等が挙げられる。
【0037】
例えば、アミノ酸のＮ末端がＢｏｃ基で保護され、且つ、側鎖に存在する反応性官能基がＢｚｌ基で保護された状態はＢｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨと表記される。Ｎ末端と側鎖に存在する反応性官能基とが保護基で保護されたアミノ酸としては、例えば、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｈｒ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ（ＳＯ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＭｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｍｔｒ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｍｔｓ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｃｂｚ）２－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ，Ｂｏｃ－Ａｓｎ（Ｘａｎ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）－ＯＨ等が挙げられる。本実施形態で原料として用いるアミノ酸は、Ｎ末端がＢｏｃ基で保護され、側鎖が有する反応性官能基がＣｂｚ基で保護されたリジン（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ）であることが好ましい。
【0038】
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、上記式（４）で表されるモノマー及び上記式（５）で表されるモノマーのみを構成単位として含んでいてよく、上記式（４）及び（５）で表されるモノマー以外の第３のモノマーを構成単位として含んでいてもよい。第３のモノマーの両末端は、それぞれ、上記式（４）及び（５）で表されるモノマーのいずれかの末端と同じであってよい。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンの質量を基準として、反応性官能基を有するアミノ酸残基を有するモノマー（モノマー（Ｂ））の含有量が、５０質量％以上を占めるのが好ましく、６０質量％以上であるのがより好ましく、７０質量％以上であるのが更に好ましい。
【0039】
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、下記式（６）で表される繰り返し構造を有するポリマーであってよい。ｎは２～１５であり、５～１２であってよく、７～１０であってもよい。
【化9】
【0040】
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンを製造するための重縮合は、例えば次のように行うことができる。まず、モノマー（Ａ）及びモノマー（Ｂ）と、必要に応じて第３のモノマーとを、溶媒に分散させて、６０℃で完全に溶解させる。溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等が挙げられる。次に、得られたモノマー溶液に有機塩基試薬を加えて７０℃で４８時間重縮合反応を行う。有機塩基試薬としては、例えば、ジアザビシクロノネン、ジアザビシクロウンデセン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、ピリジン等が挙げられる。得られた反応液から、透析及び／又は凍結乾燥により、下記式（７）で表される繰り返し単位を有するポリマーを得ることができる。
【化10】
【0041】
上記式（７）で表される繰り返し単位において、Ｒ６がＲ３である場合は、上記モノマー同士の重縮合反応で得られたポリマーが、本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンである。上記式（７）で表される繰り返し単位において、Ｒ６が、反応性官能基が保護基で保護されているＲ３である場合は、当該保護基を除去して脱保護することにより、本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンを得ることができる。脱保護反応は、保護基の種類により適切な公知の脱保護法にて行うことができる。例えば、Ｃｂｚ基、Ｂｚｌ基等で保護された側鎖は、トリフルオロ酢酸系カクテル試薬、メタンスルホン酸系カクテル試薬、臭化水素酸系カクテル試薬、パラジウム／炭素－水素還元剤等を用いて脱保護することができる。メチルエステル基で保護された側鎖は、塩基性試薬カクテル処理により脱保護することができる。Ｔｒｔ基、Ｐｂｆ基等で保護された側鎖はトリフルオロ酢酸系カクテル試薬処理により脱保護することができる。
【0042】
モノマー（Ａ）及びモノマー（Ｂ）の少なくとも一方が親水性モノマーであれば、得られたポリマーに親水性を持たせることができる。モノマー（Ａ）が疎水性モノマーであり、モノマー（Ｂ）が親水性モノマーである場合に得られるポリマーをポリエーテルエステルアミドと呼称する。モノマー（Ａ）が親水性モノマーであり、モノマー（Ｂ）が疎水性モノマーである場合に得られるポリマーをポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）と呼称する。モノマー（Ａ）及びモノマー（Ｂ）がいずれも親水性モノマーである場合に得られるポリマーをポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）と呼称する。
【0043】
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ））によれば、反応性官能基及び／又は活性化反応基を有するポリマーを簡便に提供することができる。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）は、バイオ分子等のコンジュゲーション（バイオコンジュゲーション）に好適に用いることができる。バイオコンジュゲーションとは、複数のバイオ分子を安定した共有結合で結合させる化学的手段である。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）は、直接的に又は低分子リンカーを介して間接的に、様々なバイオ分子に結合することができる。
【0044】
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）は、原料としてアミノ酸を用いているため、生体親和性及び生分解性が高い。また、主鎖にポリオキシエチレン基を有するために、親水性に優れている。これらのことから、上述したようなバイオマテリアルの分野で好適に用いることができる。加えて、原料のモノマー１モル中に１当量以上の反応性側鎖を有するアミノ酸残基が導入されることにより、反応性官能基の導入量及び／又は種類が増える。これにより、本実施例に係るポリマーは、種々の化合物と反応しやすくなり、展開できる用途が増えると考えられる。
【0045】
バイオ分子としては、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、脂質等が挙げられる。これらのバイオ分子と、本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）との複合体を「バイオコンジュゲーション生成物」という。バイオコンジュゲーション生成物は、バイオ分子と、本実施形態に係るポリマーと、それ以外の分子との複合体であってもよい。それ以外の分子としては、低分子リンカーが例示され、より具体的には、ペプチドリンカーが例示される。バイオコンジュゲーション生成物は、例えば、細胞培養足場、ドラッグデリバリ－システム、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、イムノアッセイ、抗体－薬物複合体、創薬探索試薬、バイオセンサ媒体、病原診断試薬等へ応用することができる。
【0046】
ペプチドリンカーとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａｃ－ＧＣＲＧＧＰＡＧＭＲＧＫＧＲＣＧ－ＮＨ２：配列番号１）を用いることができる。配列番号１において、Ｎ末端のＡｃ－はＮ末端がアセチル化されていることを意味し、Ｃ末端の－ＮＨ２は、Ｃ末端がアミド化されていることを意味する。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、種々のプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）によって開裂可能なアミノ酸配列であり、次のようにして製造することができる。
【0047】
＜反応溶液、緩衝液等の組成＞
・脱保護液：ピペリジン（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ジメチルホルムアミド；ＤＭＦ（富士フィルム和光純薬（株）、７５ｖｏｌ％）
・アミノ酸カクテル：Ｎ末Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨはメルク（株）製、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨはシグマ・アルドリッチ社製、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨはＣｈｅｍｓｃｅｎｅ社製を使用、反応点に対して６当量）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル；Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ（商標）（メルク（株）製、反応点に対して６当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（富士フィルム和光純薬（株）、反応点に対して６当量）、２，４，６－トリメチルピリジン（東京化成工業（株）、反応点に対して１２当量）、ＤＭＦ（溶媒量）
・不活性化液：無水酢酸（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ＤＭＦ（７５ｖｏｌ％）
・脱樹脂液：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡ（東京化成工業（株）、９５ｍａｓｓ％）、トリイソプロピルシラン（富士フィルム和光純薬（株）、２．５ｍａｓｓ％）、蒸留水（２．５ｍａｓｓ％）
・溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／蒸留水
・溶離液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、富士フィルム和光純薬（株））
・脱保護液：ピペリジン（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ジメチルホルムアミド；ＤＭＦ（富士フィルム和光純薬（株）、７５ｖｏｌ％）
・アミノ酸カクテル：Ｎ末Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨはメルク（株）製、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨはシグマ・アルドリッチ社製、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨはＣｈｅｍｓｃｅｎｅ社製を使用、反応点に対して６当量）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル；Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ（商標）（メルク（株）製、反応点に対して６当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（富士フィルム和光純薬（株）、反応点に対して６当量）、２，４，６－トリメチルピリジン（東京化成工業（株）、反応点に対して１２当量）、ＤＭＦ（溶媒量）
・不活性化液：無水酢酸（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ＤＭＦ（７５ｖｏｌ％）
・脱樹脂液：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡ（東京化成工業（株）、９５ｍａｓｓ％）、トリイソプロピルシラン（富士フィルム和光純薬（株）、２．５ｍａｓｓ％）、蒸留水（２．５ｍａｓｓ％）
・溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／蒸留水
・溶離液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、富士フィルム和光純薬（株））
【0048】
＜Ｆｍｏｃペプチド固相合成＞
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、Ｆｍｏｃ固相合成法で合成する。マルチ固相合成器（ＫＭＳ－３、国産化学（株））にエコノパックカラム（２０ｍＬ、ＢＩＯ ＲＡＤ製）をセットし、Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡＭ ｒｅｓｉｎ（１００－２００ｍｅｓｈ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、メルク（株））を０．０５ｍｍｏｌスケールとなるように秤量した後、ジクロロメタン；ＤＣＭ（ペプチド合成用グレード、富士フィルム和光純薬（株））２ｍＬを添加し過流攪拌下で１２～２４時間膨潤させる。膨潤液を除液後、脱保護液を２ｍＬ添加し樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護する（２ｍＬ×２回、各１０分処理）。脱保護液を除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した後にアミノ酸カクテルを添加し、過流攪拌下で２～３時間反応させることで樹脂担体上にアミノ酸をカップリングさせる。反応液の除液後、不活性化液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３０分間処理することで未反応点をキャッピングする。不活性化液の除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄してＦｍｏｃアミノ酸導入樹脂担体を得る。以降、上記脱保護、カップリング反応、未反応点の不活性化を繰り返し実施することで配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成する。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、Ｆｍｏｃ固相合成法で合成する。マルチ固相合成器（ＫＭＳ－３、国産化学（株））にエコノパックカラム（２０ｍＬ、ＢＩＯ ＲＡＤ製）をセットし、Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡＭ ｒｅｓｉｎ（１００－２００ｍｅｓｈ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、メルク（株））を０．０５ｍｍｏｌスケールとなるように秤量した後、ジクロロメタン；ＤＣＭ（ペプチド合成用グレード、富士フィルム和光純薬（株））２ｍＬを添加し過流攪拌下で１２～２４時間膨潤させる。膨潤液を除液後、脱保護液を２ｍＬ添加し樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護する（２ｍＬ×２回、各１０分処理）。脱保護液を除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した後にアミノ酸カクテルを添加し、過流攪拌下で２～３時間反応させることで樹脂担体上にアミノ酸をカップリングさせる。反応液の除液後、不活性化液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３０分間処理することで未反応点をキャッピングする。不活性化液の除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄してＦｍｏｃアミノ酸導入樹脂担体を得る。以降、上記脱保護、カップリング反応、未反応点の不活性化を繰り返し実施することで配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成する。
【0049】
＜粗精製、ＬＣ分離精製＞
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した後、Ｎ末に存在するＦｍｏｃ基を脱保護し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びメタノールで洗浄し、デシケータ内で２４時間静置することで乾燥樹脂担体を得る。上記乾燥樹脂担体に冷やした脱樹脂液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３～４時間処理することで脱樹脂及び側鎖保護基の脱保護を達成する。ペプチドを含む上澄み液を回収後、さらに上記脱樹脂液を２ｍＬ添加して樹脂担体を洗浄する。上記上澄み液及び洗浄液（計４ｍＬ）に冷ジエチルエーテルを１０倍量添加した後、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して沈殿物を回収する。沈殿物は再度冷ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥して粗ポリペプチドを得る。得られた粗ポリペプチドを溶離液Ａに溶解した後、溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用いて中圧液体クロマトグラフ（型式：ＥＰＣＬＣ－ＡＩ－５８０Ｓ、山善（株））によって目的成分を分画し、アセトニトリルを減圧留去した後、凍結乾燥して精製ペプチドを得る。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した後、Ｎ末に存在するＦｍｏｃ基を脱保護し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びメタノールで洗浄し、デシケータ内で２４時間静置することで乾燥樹脂担体を得る。上記乾燥樹脂担体に冷やした脱樹脂液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３～４時間処理することで脱樹脂及び側鎖保護基の脱保護を達成する。ペプチドを含む上澄み液を回収後、さらに上記脱樹脂液を２ｍＬ添加して樹脂担体を洗浄する。上記上澄み液及び洗浄液（計４ｍＬ）に冷ジエチルエーテルを１０倍量添加した後、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して沈殿物を回収する。沈殿物は再度冷ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥して粗ポリペプチドを得る。得られた粗ポリペプチドを溶離液Ａに溶解した後、溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用いて中圧液体クロマトグラフ（型式：ＥＰＣＬＣ－ＡＩ－５８０Ｓ、山善（株））によって目的成分を分画し、アセトニトリルを減圧留去した後、凍結乾燥して精製ペプチドを得る。
【実施例0050】
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また、下記例示は本発明の範囲内で適宜変更して実施することができる。なお、断りのない限り試薬としては市販品を用いた。「ＮＭＲ測定結果」は、核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ／ＬＩ、４００ＭＨｚ）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析の結果である。「収率」（％）は、１００×目的物（疎水性モノマーＩ若しくはＩＩ又は親水性モノマーＩ並びにＩＩ）の収量（ｍｏｌ）／原料（アゼライン酸クロリド、ポリエチレングリコ－ル（ＰＥＧ）又は１，９－ノナンジオール）の使用量（ｍｏｌ）によって算出された値である。
【0051】
＜疎水性モノマーＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、３当量のｐ－ニトロフェノール（原料）及び４当量のピリジンをアセトン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに１当量のアゼライン酸クロリドを滴下し、室温にて５時間撹拌してｐ－ニトロフェノール及びアゼライン酸を反応させた。得られた粗生成物を塩酸水溶液及び塩水で洗浄し、再結晶化により精製した。これらの操作により、白色粉末状の疎水性モノマーＩが収率９５％で得られた。疎水性モノマーＩは下記式（８）で表される化合物である。図１にＮＭＲ測定結果を示す。図１の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図１から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、３当量のｐ－ニトロフェノール（原料）及び４当量のピリジンをアセトン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに１当量のアゼライン酸クロリドを滴下し、室温にて５時間撹拌してｐ－ニトロフェノール及びアゼライン酸を反応させた。得られた粗生成物を塩酸水溶液及び塩水で洗浄し、再結晶化により精製した。これらの操作により、白色粉末状の疎水性モノマーＩが収率９５％で得られた。疎水性モノマーＩは下記式（８）で表される化合物である。図１にＮＭＲ測定結果を示す。図１の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図１から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
【化11】
【0052】
＜親水性モノマーＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量のＰＥＧ（分子量：２，０００ｇ／ｍｏｌ、重合度ａ（定数））及び４当量のピリジンをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに４当量のクロロぎ酸４－ニトロフェニルを滴下し、室温にて１８時間撹拌してＰＥＧ及びクロロぎ酸４－ニトロフェニルを反応させた。得られた粗生成物を塩酸水溶液で洗浄し、ジエチルエーテルによって沈殿させることで精製した。これらの操作により、白色ワックス状の親水性モノマーＩが収率９０％で得られた。親水性モノマーＩは下記式（９）で表される化合物である。図２にＮＭＲ測定結果を示す。図２の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図２から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量のＰＥＧ（分子量：２，０００ｇ／ｍｏｌ、重合度ａ（定数））及び４当量のピリジンをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに４当量のクロロぎ酸４－ニトロフェニルを滴下し、室温にて１８時間撹拌してＰＥＧ及びクロロぎ酸４－ニトロフェニルを反応させた。得られた粗生成物を塩酸水溶液で洗浄し、ジエチルエーテルによって沈殿させることで精製した。これらの操作により、白色ワックス状の親水性モノマーＩが収率９０％で得られた。親水性モノマーＩは下記式（９）で表される化合物である。図２にＮＭＲ測定結果を示す。図２の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図２から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
【化12】
【0053】
＜疎水性モノマーＩＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量の１，９－ノナンジオール及び２．２当量のＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに縮合剤及び触媒を加え、１８時間室温で反応を進行させた。得られた粗中間生成物を酸性水溶液、塩基性水溶液及び塩水で洗浄し、中間体を得た。得られた中間体の両末端保護基であるＢｏｃ基を２．１当量のｐ－トルエンスルホン酸を用いてトルエン下で置換することにより、Ｂｏｃ基を脱離させ、ｐ－トルエンスルホン酸塩化合物を合成した。得られた粗生成物を再結晶化により生成した。これらの操作により、白色粉末状の疎水性モノマーＩＩが収率８５％で得られた。疎水性モノマーＩＩは下記式（１０）で表される化合物である。図３にＮＭＲ測定結果を示す。図３の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図３から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量の１，９－ノナンジオール及び２．２当量のＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに縮合剤及び触媒を加え、１８時間室温で反応を進行させた。得られた粗中間生成物を酸性水溶液、塩基性水溶液及び塩水で洗浄し、中間体を得た。得られた中間体の両末端保護基であるＢｏｃ基を２．１当量のｐ－トルエンスルホン酸を用いてトルエン下で置換することにより、Ｂｏｃ基を脱離させ、ｐ－トルエンスルホン酸塩化合物を合成した。得られた粗生成物を再結晶化により生成した。これらの操作により、白色粉末状の疎水性モノマーＩＩが収率８５％で得られた。疎水性モノマーＩＩは下記式（１０）で表される化合物である。図３にＮＭＲ測定結果を示す。図３の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図３から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
【化13】
【0054】
＜親水性モノマーＩＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量のＰＥＧ（分子量：２，０００ｇ／ｍｏｌ、重合度ａ（定数））及び２．２当量のＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに縮合剤及び触媒を加え、１８時間室温で反応させた。得られた粗中間生成物を酸性水溶液、塩基性水溶液及び塩水で洗浄し、中間体を得た。中間体の両末端保護基であるＢｏｃ基を２．１当量のｐ－トルエンスルホン酸を用いてトルエン下で置換することにより、Ｂｏｃ基を脱離させ、ｐ－トルエンスルホン酸塩化合物を合成した。得られた粗生成物を－、ジエチルエーテルによって沈殿させることで精製した。これらの操作により、白色～黄色のワックス状の親水性モノマーＩＩが収率８５％で得られた。親水性モノマーＩＩは下記式（１１）で表される化合物である。図４にＮＭＲ測定結果を示す。図４の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図４から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量のＰＥＧ（分子量：２，０００ｇ／ｍｏｌ、重合度ａ（定数））及び２．２当量のＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに縮合剤及び触媒を加え、１８時間室温で反応させた。得られた粗中間生成物を酸性水溶液、塩基性水溶液及び塩水で洗浄し、中間体を得た。中間体の両末端保護基であるＢｏｃ基を２．１当量のｐ－トルエンスルホン酸を用いてトルエン下で置換することにより、Ｂｏｃ基を脱離させ、ｐ－トルエンスルホン酸塩化合物を合成した。得られた粗生成物を－、ジエチルエーテルによって沈殿させることで精製した。これらの操作により、白色～黄色のワックス状の親水性モノマーＩＩが収率８５％で得られた。親水性モノマーＩＩは下記式（１１）で表される化合物である。図４にＮＭＲ測定結果を示す。図４の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図４から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
【0055】
【化14】
【0056】
＜ポリマー重縮合＞
下記一般式（１２）で表される化合物に含まれる、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ））、ポリエーテルエステルアミド（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミド）及びポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ））は、上述の疎水性モノマーＩ又は親水性モノマーＩと、疎水性モノマーＩＩ又は親水性モノマーＩＩとを重縮合させて得られた。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミドは疎水性モノマーＩ及び親水性モノマーＩＩの重縮合により得られ、下記一般式（１２）におけるｘはｂ（定数）、ｙはｃ（定数）、ｎはｄ（定数）であった。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）は親水性モノマーＩ及び疎水性モノマーＩＩの重縮合により得られ、下記一般式（１２）におけるｘはｅ（定数）、ｙはｆ（定数）、ｎはｇ（定数）であった。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）は親水性モノマーＩ及び親水性モノマーＩＩの重縮合により得られた。下記一般式（１２）で表される化合物には、疎水性モノマーＩ及び疎水性モノマーＩＩの重縮合により得られた化合物であるポリエステルアミド（Ｃｂｚ－ポリエステルアミド）は含まれない。重縮合は、１当量の疎水性モノマーＩ又は親水性モノマーＩと、１当量の疎水性モノマーＩＩ又は親水性モノマーＩＩとを６０℃のＤＭＳＯ及びＤＭＡｃに溶解させた後、ＴＥＡを加えることで行われた。７０℃で４８時間重縮合反応を行い、透析法で精製して黄色ワックス状のポリマーを得た。
下記一般式（１２）で表される化合物に含まれる、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ））、ポリエーテルエステルアミド（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミド）及びポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ））は、上述の疎水性モノマーＩ又は親水性モノマーＩと、疎水性モノマーＩＩ又は親水性モノマーＩＩとを重縮合させて得られた。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミドは疎水性モノマーＩ及び親水性モノマーＩＩの重縮合により得られ、下記一般式（１２）におけるｘはｂ（定数）、ｙはｃ（定数）、ｎはｄ（定数）であった。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）は親水性モノマーＩ及び疎水性モノマーＩＩの重縮合により得られ、下記一般式（１２）におけるｘはｅ（定数）、ｙはｆ（定数）、ｎはｇ（定数）であった。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）は親水性モノマーＩ及び親水性モノマーＩＩの重縮合により得られた。下記一般式（１２）で表される化合物には、疎水性モノマーＩ及び疎水性モノマーＩＩの重縮合により得られた化合物であるポリエステルアミド（Ｃｂｚ－ポリエステルアミド）は含まれない。重縮合は、１当量の疎水性モノマーＩ又は親水性モノマーＩと、１当量の疎水性モノマーＩＩ又は親水性モノマーＩＩとを６０℃のＤＭＳＯ及びＤＭＡｃに溶解させた後、ＴＥＡを加えることで行われた。７０℃で４８時間重縮合反応を行い、透析法で精製して黄色ワックス状のポリマーを得た。
【化15】
【0057】
＜ポリマー側鎖脱保護＞
Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミド、Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）及びＣｂｚ－ポリエステルアミドのＣｂｚ基を酸処理により除去し、各ポリマーを脱保護した。得られた粗生成物を透析法で精製することで黄色ワックス状のポリマーを得た。これらの操作により得られたポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、は実施例であり、下記一般式（１３）で表される繰り返し単位を有する。これらの操作により得られたポリエステルアミドは比較例であり、下記一般式（１３）で表される繰り返し単位を有さない。
Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミド、Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）及びＣｂｚ－ポリエステルアミドのＣｂｚ基を酸処理により除去し、各ポリマーを脱保護した。得られた粗生成物を透析法で精製することで黄色ワックス状のポリマーを得た。これらの操作により得られたポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、は実施例であり、下記一般式（１３）で表される繰り返し単位を有する。これらの操作により得られたポリエステルアミドは比較例であり、下記一般式（１３）で表される繰り返し単位を有さない。
【化16】
【0058】
＜コンジュゲーション：マレイミド基＞
マレイミド基は、チオール基を有する分子とマイケル反応が可能であり、副生成物が生成されないことと細胞毒性がないこととから、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等において広く使用されている。本実施例では、マレイミド基を有するポリマーを製造した。「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ポリエーテルエステルアミド、ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）及びポリエステルアミドが有するリジン側鎖のフリーのアミンにマレイミド基を導入した。
マレイミド基は、チオール基を有する分子とマイケル反応が可能であり、副生成物が生成されないことと細胞毒性がないこととから、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等において広く使用されている。本実施例では、マレイミド基を有するポリマーを製造した。「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ポリエーテルエステルアミド、ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）及びポリエステルアミドが有するリジン側鎖のフリーのアミンにマレイミド基を導入した。
【0059】
親水性であるポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）にマレイミド基を導入する場合は、まず、これらのポリマーをｐＨ４．５～５のＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）バッファーに溶解させた。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び６－マレイミドヘキサン酸を加え、２４時間撹拌することでマレイミド基の付加反応を行った。反応後、酸水溶液（ｐＨ４．５～５）で透析後、凍結乾燥により白色～黄色のスポンジ状のポリマーを得た。
【0060】
疎水性であるポリエステルアミドの場合、まず、ポリエステルアミド及びＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）をＤＭＦ及びＤＭＳＯに溶解させた。これらの化合物を２４時間反応させ、透析法により精製させることで、黄色ワックス状のポリマーを得た。
【0061】
図５に、マレイミド基を導入したポリエーテルエステルアミド（Ｍａｌ－ポリエーテルエステルアミド、ｘ＝ｂ（定数）、ｙ＝ｃ（定数）、ｎ＝ｄ（定数）、疎水性）のＮＭＲ測定結果を示す。図５の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図５に示された各ピークから、目的のポリマーが得られたことが分かった。
【0062】
図６にＧＰＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）による分子量測定結果を示す。図６の縦軸は検出信号強度であり、横軸は溶出時間（分）である。図６の結果及びポリスチレンスタンダードサンプルの検量線を用いて算出した結果から、「＜ポリマー重縮合＞」により得られたＣｂｚ－ポリエーテルエステルアミドの分子量（Ｍｗ）は約３３０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．７５）であり、「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルアミドの分子量（Ｍｗ）は約２１０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．３９）であり、Ｍａｌ－ポリエーテルエステルアミドの分子量（Ｍｗ）は約２２０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．３７）であることが分かった。
【0063】
図７にマレイミド基を導入したポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）（Ｍａｌ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ｘ＝ｅ（定数）、ｙ＝ｆ（定数）、ｎ＝ｇ（定数）、親水性）のＮＭＲ測定結果を示す。図７の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図７に示された各ピークから、目的のポリマーが得られたことが分かった。
【0064】
図８にＧＰＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）による分子量測定結果を示す。図８の縦軸は検出信号強度であり、横軸は溶出時間（分）である。図８の結果及びポリスチレンスタンダードサンプルの検量線を用いて算出した結果から、「＜ポリマー重縮合＞」により得られたＣｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の分子量（Ｍｗ）は約４５０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．９０）であり、「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の分子量（Ｍｗ）は約３００００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．４９）であり、Ｍａｌ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の分子量（Ｍｗ）は約４００００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．４２）であることが分かった。
【0065】
＜マレイミド基の反応性確認：チオールを用いたゲル化反応＞
マレイミド基は、チオール基を有する分子とマイケル反応が可能であり、副生成物も生成されないことと細胞毒性がないことから、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等において広く使用されている。本発明の用途の一例として、マレイミド基を有するポリマー及びジチオール基を両末端に有するペプチドを用いたゲル化検証による反応性を実施した。ゲル化の概念図を図９に示す。
マレイミド基は、チオール基を有する分子とマイケル反応が可能であり、副生成物も生成されないことと細胞毒性がないことから、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等において広く使用されている。本発明の用途の一例として、マレイミド基を有するポリマー及びジチオール基を両末端に有するペプチドを用いたゲル化検証による反応性を実施した。ゲル化の概念図を図９に示す。
【0066】
マレイミド基が修飾されたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を１５、２０又は２５質量／体積％（ｗ／ｖ％）の濃度になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に溶解させ、ｐＨを７～８に調整した。得られた溶液をポリマー溶液とする。ジチオールペプチドは２０ｎＭの濃度になるようにＰＢＳに溶解させ、ｐＨを７～８に調整した。得られた溶液をジチオールペプチド溶液という。本実施形態に使用されたジチオールペプチド配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａｃ－ＧＣＲＧＧＰＡＧＭＲＧＫＧＲＣＧ－ＮＨ２：配列番号１）である。
【0067】
ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）溶液（ポリマー溶液）、ジチオールペプチド溶液及び溶媒を、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１又は４：１になるように混合してゲル前駆体水溶液を得た。室温で、マレイミド基及びチオール基の共有結合を介してゲルを形成させた。図１０にゲルの例の写真を示す。図１０（Ａ）は１５ｗ／ｖ％のポリマー溶液を用いたゲルであり（左からポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１及び４：１）、図１０（Ｂ）は２０ｗ／ｖ％のポリマー溶液を用いたゲルであり（左からポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１及び４：１）、図１０（Ｃ）は２５ｗ／ｖ％のポリマー溶液を用いたゲルである（左からポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１及び４：１）。本実施例では、ポリマー溶液濃度が高いほど、又はゲル前駆体水溶液中のポリマー溶液の体積割合が高いほどゲルの粘度が高くなった。ポリマー溶液濃度が２０ｗ／ｖ％以上の条件並びにポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１又は４：１の条件で、遊動性のないより良好なゲルの形成が可能であった。
【0068】
＜ゲルの内部構造画像化＞
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルの画像を取得した。図１１に、凍結乾燥されたゲルの構造を示す。図１１（Ａ）はポリマー溶液濃度が２０ｗ／ｖ％の条件、並びに、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１の条件で作成したゲル、図１１（Ｂ）はポリマー溶液濃度が２５ｗ／ｖ％の条件、並びに、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１の条件で作成したゲルを５００倍で撮影した画像であり、ゲルはファイバー及び多数の孔隙で構成され、多数の孔隙はつながった構造であった。
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルの画像を取得した。図１１に、凍結乾燥されたゲルの構造を示す。図１１（Ａ）はポリマー溶液濃度が２０ｗ／ｖ％の条件、並びに、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１の条件で作成したゲル、図１１（Ｂ）はポリマー溶液濃度が２５ｗ／ｖ％の条件、並びに、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１の条件で作成したゲルを５００倍で撮影した画像であり、ゲルはファイバー及び多数の孔隙で構成され、多数の孔隙はつながった構造であった。
【0069】
＜細胞培養評価－ゲルの形成無し＞
２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）に、１ウェルあたり約１００００細胞となるようにＭＳＣを播種した。ウェルには、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を０．１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ、１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ又は１０ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌで含有するＭＳＣ専用培養培地、又は、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）のいずれも含有しないＭＳＣ専用培養培地が事前に入れられていた。通常の細胞増殖培養法にて、７日間又は１４日間継続的に培養した後、ＷＳＴ－１細胞生存度アッセイ及び細胞数計測によりポリマーの細胞毒性が評価された。培養開始から７日目又は１４日目に、ＭＳＣのアクチンファイバーをファロイジン－アクチンで、核をダーピー（ＤＡＰＩ）試薬で染色した後、画像を取得した。取得した画像を図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）に示す。図１２（Ａ）及び（Ｂ）は、ＤＡＰＩで染色された細胞核及びアクチンファイバーであり、得られた画像について、専用セルカウントソフトにより細胞数を計測した。この細胞数測定の結果を、図１２（Ｃ）のグラフに黒三角印で示す。また、培養開始から７日目（Ｄａｙ－７）又は１４日目（Ｄａｙ－１４）に、ウェルにＷＳＴ－１試薬を添加し、プレートの吸光度を観察波長４３８ｎｍで測定した。測定した結果を図１２（Ｃ）に棒グラフとして示す。図１２（Ｂ）の縦軸（左側）は吸光度を示し、縦軸（右側）は細胞数を示す。図１２（Ｃ）の横軸は、培地中のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の含有量を示す。図１２（Ｃ）より、培養開始から１４日目では、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の含有量が０．１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ及び１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌの場合に、吸光度が高くなることが分かった。これは、本実施例に係るゲルが細胞を好適に捕捉できたためと考えられる。
２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）に、１ウェルあたり約１００００細胞となるようにＭＳＣを播種した。ウェルには、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を０．１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ、１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ又は１０ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌで含有するＭＳＣ専用培養培地、又は、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）のいずれも含有しないＭＳＣ専用培養培地が事前に入れられていた。通常の細胞増殖培養法にて、７日間又は１４日間継続的に培養した後、ＷＳＴ－１細胞生存度アッセイ及び細胞数計測によりポリマーの細胞毒性が評価された。培養開始から７日目又は１４日目に、ＭＳＣのアクチンファイバーをファロイジン－アクチンで、核をダーピー（ＤＡＰＩ）試薬で染色した後、画像を取得した。取得した画像を図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）に示す。図１２（Ａ）及び（Ｂ）は、ＤＡＰＩで染色された細胞核及びアクチンファイバーであり、得られた画像について、専用セルカウントソフトにより細胞数を計測した。この細胞数測定の結果を、図１２（Ｃ）のグラフに黒三角印で示す。また、培養開始から７日目（Ｄａｙ－７）又は１４日目（Ｄａｙ－１４）に、ウェルにＷＳＴ－１試薬を添加し、プレートの吸光度を観察波長４３８ｎｍで測定した。測定した結果を図１２（Ｃ）に棒グラフとして示す。図１２（Ｂ）の縦軸（左側）は吸光度を示し、縦軸（右側）は細胞数を示す。図１２（Ｃ）の横軸は、培地中のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の含有量を示す。図１２（Ｃ）より、培養開始から１４日目では、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の含有量が０．１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ及び１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌの場合に、吸光度が高くなることが分かった。これは、本実施例に係るゲルが細胞を好適に捕捉できたためと考えられる。
【0070】
＜細胞培養評価－ゲルの形成有り＞
ＭＳＣ、上述したポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）溶液（ポリマー溶液）及びＭＳＣ専用培養培地をジチオールペプチド（２０ｎＭ）と混合した後（ポリマー溶液濃度＝２５ｗ／ｖ％、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比＝３：１）、低接着性２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）にゲルを形成させた。１ウェル当たりの細胞数が３０００細胞となるように、最初に混合するＭＳＣの細胞濃度を調整した。ゲル内において３日間ＭＳＣを培養した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により細胞生存性を評価した。その結果を図１３（Ａ）に示す。本発明のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を用いた場合、死細胞がほとんど観察されないことが図１３（Ａ）より分かった。
ＭＳＣ、上述したポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）溶液（ポリマー溶液）及びＭＳＣ専用培養培地をジチオールペプチド（２０ｎＭ）と混合した後（ポリマー溶液濃度＝２５ｗ／ｖ％、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比＝３：１）、低接着性２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）にゲルを形成させた。１ウェル当たりの細胞数が３０００細胞となるように、最初に混合するＭＳＣの細胞濃度を調整した。ゲル内において３日間ＭＳＣを培養した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により細胞生存性を評価した。その結果を図１３（Ａ）に示す。本発明のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を用いた場合、死細胞がほとんど観察されないことが図１３（Ａ）より分かった。
【0071】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】