特開 2023-16445 Ｂ型肝炎ウイルスＰＯＬタンパク質の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023016445

(43)【公開日】2023-02-02

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスＰＯＬタンパク質の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230126BHJP

   A61K 31/122 20060101ALI20230126BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230126BHJP

   C07K 14/02 20060101ALI20230126BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20230126BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20230126BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61K31/122

A61P31/12

C07K14/02

C12Q1/48 Z

C12N9/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021120759

(22)【出願日】2021-07-21

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、肝炎等克服緊急対策研究事業「Ｂ型肝炎ウイルス全長ＰＯＬの大量発現系の開発とその新規薬剤開発への応用」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】510192802

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立国際医療研究センター

(71)【出願人】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】杉山 真也

(72)【発明者】

【氏名】金井 雅武

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

4C084

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD01

4B050LL03

4B063QA18

4B063QQ27

4B063QQ28

4B063QR07

4B063QR08

4B063QS36

4B063QX01

4C084AA17

4C084NA05

4C084ZB331

4C206AA01

4C206AA02

4C206CB28

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA05

4C206ZB33

4H045AA20

4H045BA10

4H045CA02

4H045DA89

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】逆転写酵素活性を持つ状態でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）－ＰＯＬタンパク質の全長を大量発現する技術を提供する。
【解決手段】ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の製造方法であって、Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ｌ／Ｒ（ＰＫＬＲ）タンパク質、Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｍ１／２（ＰＫＭ）タンパク質又はｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ（ＰＫＲ）タンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程を含む、製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）－ＰＯＬタンパク質の製造方法であって、Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ｌ／Ｒ（ＰＫＬＲ）タンパク質、Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｍ１／２（ＰＫＭ）タンパク質又はｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ（ＰＫＲ）タンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程を含む、製造方法。

【請求項2】

ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の製造方法であって、請求項１に記載の製造方法で製造したＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を、結晶形成条件下でインキュベートする工程を含む、製造方法。

【請求項3】

ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の活性を測定する工程を含み、
前記活性が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す、方法。

【請求項4】

ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質、及び、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程と、
前記ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写酵素活性を測定する工程と、を含み、
前記逆転写酵素活性が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す、方法。

【請求項5】

ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質と、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質との結合を測定する工程を含み、
前記結合が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す、方法。

【請求項6】

ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤を有効成分とする、ＨＢＶ感染症の治療剤。

【請求項7】

前記阻害剤が、シコニン又はＰＫＲ－ＩＮ－Ｃ１６である、請求項６に記載のＨＢＶ感染症の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）－ＰＯＬタンパク質の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の製造方法、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の製造方法、ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法、及び、ＨＢＶ感染症の治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ＨＢＶは、全世界で約３億５，０００万人以上が感染しているといわれ、そのうち日本では約１３０～１５０万人（約１００人に１人）が感染していると推定されている。Ｂ型肝炎が持続すると、慢性肝炎から肝硬変、さらには肝臓がん（肝細胞がん）へと進展する可能性があり、全世界で毎年８８万人が肝がんや肝硬変といった合併症で死亡しているとの報告がある。

【0003】

Ｂ型肝炎の治療薬として、ＨＢＶが持つＰＯＬタンパク質（ＨＢＶ－ＰＯＬ）が有する逆転写酵素活性の阻害薬が利用されている。しかしながら、当該阻害薬は治療効果が限定的であり、ウイルス複製を完全に抑えることができない。このため、患者は治療に際し当該阻害薬を一生服用する必要がある。これは、当該阻害薬が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）治療薬からの転用であるためである可能性が考えられる。

【0004】

Ｂ型肝炎の治療薬にＨＩＶ治療薬が転用されている理由としては、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶構造が解明されていないことが挙げられ、それが新薬開発の障害となっている。結晶構造解析には、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の大量発現と精製が必要であるが、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質は分解されやすい性質があるため、まだ実現には至っていない。

【0005】

例えば、非特許文献１～３には、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させたことが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Voros J., et al., Large-Scale Production and Structural and Biophysical Characterizations of the Human Hepatitis B Virus Polymerase, Journal of Virology, 88 (5), 2584-2599, 2014.

【非特許文献2】Favre, D., Reverse Transcriptase Activity of Hepatitis B Virus Polymerase in Eukaryotic Cell Extracts In Vitro, ALTEX, 25 (3), 197-211, 2008.

【非特許文献3】Jones S.A., and Hu J., Protein-Primed Terminal Transferase Activity of Hepatitis B Virus Polymerase, Journal of Virology, 87 (5), 2563-2576, 2013.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、非特許文献１～３では、逆転写酵素活性を持つ状態でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の全長を発現することは実現できていない。本発明は、逆転写酵素活性を持つ状態でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の全長を大量発現する技術を提供することを目的とする。また、別の側面において、本発明は、ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法、及び、ＨＢＶ感染症の治療剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）－ＰＯＬタンパク質の製造方法であって、Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ｌ／Ｒ（ＰＫＬＲ）タンパク質、Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｍ１／２（ＰＫＭ）タンパク質又はｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ（ＰＫＲ）タンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程を含む、製造方法。
［２］ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の製造方法であって、［１］に記載の製造方法で製造したＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を、結晶形成条件下でインキュベートする工程を含む、製造方法。
［３］ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の活性を測定する工程を含み、前記活性が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す、方法。
［４］ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質、及び、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程と、前記ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写酵素活性を測定する工程と、を含み、前記逆転写酵素活性が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す、方法。
［５］ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質と、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質との結合を測定する工程を含み、前記結合が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す、方法。
［６］ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤を有効成分とする、ＨＢＶ感染症の治療剤。
［７］前記阻害剤が、シコニン又はＰＫＲ－ＩＮ－Ｃ１６である、［６］に記載のＨＢＶ感染症の治療剤。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、逆転写酵素活性を持つ状態でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の全長を大量発現する技術を提供することができる。また、ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法、及び、ＨＢＶ感染症の治療剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、実験例２の結果を示すグラフである。

【図2】図２は、実験例２の結果を示すグラフである。

【図3】図３（ａ）～（ｄ）は、実験例３において、ＰＫＬＲタンパク質及びＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を共発現させた後、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した結果を示すグラフである。

【図4】図４（ａ）～（ｄ）は、実験例３において、ＰＫＭ２タンパク質及びＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を共発現させた後、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した結果を示すグラフである。

【図5】図５（ａ）～（ｄ）は、実験例３において、ＰＫＲタンパク質及びＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を共発現させた後、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した結果を示すグラフである。

【図6】図６は、実験例４におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。

【図7】図７は、実験例４におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。

【図8】図８（ａ）は、実験例５におけるＨＢｓＡｇの測定結果を示すグラフである。図８（ｂ）は、実験例５におけるＨＢｃｒＡｇの測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の製造方法］
１実施形態において、本発明は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の製造方法であって、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程を含む、製造方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、逆転写酵素活性を持つ状態でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の全長を大量発現することができる。

【0012】

ここで、「逆転写酵素活性を持つ」とは、例えば、市販のキットを使用して逆転写酵素活性を測定した場合に、ネガティブコントロールと比較して高い逆転写酵素活性を示すことを意味する。また、「ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の全長を大量発現することができる」とは、例えば、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の分解を抑制し、全長の形態で、タンパク質結晶を調製できる程度の量発現することができることを意味する。あるいは、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質、ＰＫＲタンパク質の非存在下でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させた場合と比較して、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の発現量が有意に高くなることを意味する。

【0013】

本実施形態の製造方法により、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を大量に調製し、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶構造解析の実現へとつながり、ひいてはＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質に特異的に結合する阻害薬の開発へとつながることが期待できる。

【0014】

ＨＢＶには、Ａ型からＪ型まで少なくとも１０種類の遺伝子型が存在する。本実施形態の製造方法により製造することができるＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質としては、これらのいずれの遺伝子型のＨＢＶのＰＯＬタンパク質であってもよい。

【0015】

例えば、ＨＢＶ遺伝子型Ａ型のＰＯＬタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＡＢ２４６３３６．１、ＡＢ２４６３３８．１、ＡＢ２４６３３７．１等が挙げられる。ＨＢＶ遺伝子型Ｂ型のＰＯＬタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＡＢ２４６３３９．１、ＡＢ２４６３４１．１、ＡＢ２４６３４３．１等が挙げられる。ＨＢＶ遺伝子型Ｃ型のＰＯＬタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＡＢ２４６３４４．１、ＡＢ２４６３４６．１、ＡＢ２４６３４５．１等が挙げられる。ＨＢＶ遺伝子型Ｄ型のＰＯＬタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＡＢ２４６３４７．１、ＡＢ２４６３４８．１、ＫＣ０１２６５２．１等が挙げられる。

【0016】

ＰＫＬＲタンパク質は、解糖系において、ホスホエノールピルビン酸からＡＤＰへのホスホリル基の転移を触媒し、ＡＴＰとピルビン酸を生成するピルビン酸キナーゼの１種である。ＰＫＬＲタンパク質としては、ヒトＰＫＬＲタンパク質を用いることが好ましい。ＰＫＬＲタンパク質には複数のバリアントが存在するが、本実施形態の製造方法においてはいずれのバリアントであっても使用することができる。ヒトＰＫＬＲタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿０００２８９．１、ＮＰ＿８７０９８６．１等が挙げられる。

【0017】

ＰＫＭタンパク質は、解糖系において、ホスホエノールピルビン酸からＡＤＰへのホスホリル基の転移を触媒し、ＡＴＰとピルビン酸を生成するピルビン酸キナーゼの１種である。ＰＫＭタンパク質としては、ヒトＰＫＭタンパク質を用いることが好ましい。ＰＫＭタンパク質には複数のバリアントが存在するが、本実施形態の製造方法においてはいずれのバリアントであっても使用することができる。ヒトＰＫＭタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１１９３７２５．１、ＮＰ＿００１１９３７２６．１、ＮＰ＿００１１９３７２７．１、ＮＰ＿００１１９３７２８．１、ＮＰ＿００１３０３２４７．１、ＮＰ＿００２６４５．３、ＮＰ＿８７２２７０．１、ＮＰ＿８７２２７１．１等が挙げられる。

【0018】

ＰＫＲタンパク質は、二本鎖ＲＮＡに結合した後に自己リン酸化によって活性化される、セリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＰＫＲタンパク質としては、ヒトＰＫＲタンパク質を用いることが好ましい。ＰＫＲタンパク質には複数のバリアントが存在するが、本実施形態の製造方法においてはいずれのバリアントであっても使用することができる。ヒトＰＫＲタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１１２９１２３．１、ＮＰ＿００１１２９１２４．１、ＮＰ＿００２７５０．１等が挙げられる。

【0019】

本実施形態の製造方法において、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の発現は、無細胞翻訳系中で行ってもよいし、細胞中で行ってもよい。

【0020】

無細胞翻訳系としては、原核生物由来の無細胞翻訳系、昆虫細胞由来の無細胞翻訳系、非ヒト動物細胞由来の無細胞翻訳系、ヒト細胞由来の無細胞翻訳系、コムギ胚芽由来の無細胞系等が挙げられ、これらのいずれであってもよい。なかでも、非ヒト動物細胞由来の無細胞翻訳系、ヒト細胞由来の無細胞翻訳系が好ましく、ヒト細胞由来の無細胞翻訳系がより好ましい。

【0021】

ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を細胞中で発現させる場合、細胞としては、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞等を適宜利用することができる。

【0022】

無細胞翻訳系に発現対象タンパク質のｍＲＮＡを添加することにより翻訳を行うことができる。あるいは、無細胞翻訳系に無細胞転写系を組み合わせた無細胞転写翻訳系を用いて、１つの反応容器内で転写及び翻訳を行うと、より簡便である。この場合には、無細胞転写翻訳系に発現対象タンパク質をコードするＤＮＡベクター、又はＤＮＡ断片を添加することにより、転写及び翻訳を行うことができる。

【0023】

また、細胞に、発現対象タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ、ＤＮＡベクター又はＤＮＡ断片を導入することにより、細胞中でタンパク質の発現を行うことができる。

【0024】

本実施形態の製造方法において、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質にはタグが付加されていてもよい。タグを利用することにより、発現させたＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を簡便に精製することができる。具体的なタグとしては、特に限定されないが、特異的抗体により認識されるタグであることが好ましく、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ等が挙げられる。

【0025】

本実施形態の製造方法において、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質、ＰＫＲタンパク質は、いずれか１種を単独で使用してもよいし、２種又は３種を混合して使用してもよい。

【0026】

また、無細胞翻訳系中に、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質を、タンパク質の形態で添加してもよいし、ｍＲＮＡの形態で添加してもよい。あるいは、無細胞翻訳系が、無細胞転写系を組み合わせた無細胞転写翻訳系である場合には、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質をコードするＤＮＡベクター、又はＤＮＡ断片の形態で添加してもよい。

【0027】

また、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を細胞中で発現させる場合、細胞に、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質を、タンパク質の形態で導入してもよいし、ｍＲＮＡの形態で導入してもよい。あるいは、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質をコードするＤＮＡベクター、又はＤＮＡ断片の形態で導入してもよい。

【0028】

［ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の製造方法］
１実施形態において、本発明は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の製造方法であって、上述した製造方法で製造したＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を、結晶形成条件下でインキュベートする工程を含む、製造方法を提供する。

【0029】

すなわち、本実施形態の製造方法は、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程と、発現したＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を、結晶形成条件下でインキュベートする工程とを含む、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の製造方法であるということができる。

【0030】

大量発現したＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を、クロマトグラフィー等で精製し、夾雑物を除く。タグを利用したアフィニティクロマトグラフィー等でも精製することができる。続いて、精製したＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を、結晶形成条件下でインキュベートする。結晶形成条件は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を溶解するバッファー組成、ｐＨ、沈殿剤の種類等の組み合わせを検討して設定する必要がある。結晶形成条件の検討には、市販の専用ロボットで条件を無数に検討することができる。結晶形成条件はタンパク質の性質によって変化するため、各タンパク質にあわせて設定する必要がある。

【0031】

本実施形態の製造方法により得られた、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結晶の構造解析を行うことにより、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質に特異的に結合する阻害薬の開発を行うことが可能になる。

【0032】

［ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法］
本発明は、ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。

【0033】

（第１実施形態）
第１実施形態に係るＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の活性を測定する工程を含み、前記活性が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す方法である。

【0034】

実施例において後述するように、発明者らは、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤が、ＨＢＶの複製効率を顕著に低下させることを明らかにした。したがって、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質は、ＨＢＶ感染症の新規の治療標的となり得る。

【0035】

ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤は、新しいタイプのＨＢＶ感染症の治療剤へとつながり、従来薬との併用が可能で、よりよい治療手法となりうる可能性がある。

【0036】

被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。

【0037】

ＰＫＬＲタンパク質及びＰＫＭタンパク質の活性の評価は、これらのタンパク質のピルビン酸キナーゼ活性を測定することにより行うことができる。ピルビン酸キナーゼ活性の測定には、市販のキット等を使用することができる。

【0038】

ＰＫＲタンパク質の活性の評価は、ＰＫＲタンパク質のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性を測定することにより行うことができる。セリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性の測定には、市販のキット等を使用することができる。

【0039】

（第２実施形態）
第２実施形態に係るＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法は、被験物質、及び、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程と、前記ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写酵素活性を測定する工程と、を含み、前記逆転写酵素活性が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す方法である。

【0040】

本実施形態のスクリーニング方法において、「被験物質、及び、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程」は、「被験物質及びＰＫＬＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程」であってもよいし、「被験物質及びＰＫＭタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程」であってもよいし、「被験物質及びＰＫＲタンパク質の存在下で、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させる工程」であってもよい。

【0041】

実施例において後述するように、発明者らは、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質が、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写酵素活性の発現にも必要な因子であることを明らかにした。

【0042】

したがって、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質による、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写酵素活性の発現を抑制する被験物質は、ＨＢＶ感染症の治療剤となり得る。

【0043】

被験物質については上述したものと同様である。また、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の発現は、上述したものと同様であり、無細胞翻訳系中で行ってもよいし、細胞中で行ってもよい。また、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写酵素活性の測定には、市販のキット等を使用することができる。

【0044】

（第３実施形態）
第３実施形態に係るＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質と、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質との結合を測定する工程を含み、前記結合が前記被験物質の非存在下と比較して低下することが、前記被験物質がＨＢＶ感染症の治療剤であることを示す方法である。

【0045】

実施例において後述するように、発明者らは、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質が、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質に結合し、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を安定化させていることを明らかにした。

【0046】

したがって、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質と、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質との結合を抑制する被験物質は、ＨＢＶ感染症の治療剤となり得る。

【0047】

本実施形態のスクリーニング方法において、「結合を測定する」は、「結合量を測定する」、「結合力を測定する」等といいかえることができる。

【0048】

被験物質については上述したものと同様である。また、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質と、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質との結合の測定は、ｎａｎｏＢＲＥＴアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定する方法、免疫沈降－ウエスタンブロッティング法等により行うことができる。

【0049】

［ＨＢＶ感染症の治療剤］
１実施形態において、本発明は、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤を有効成分とする、ＨＢＶ感染症の治療剤を提供する。

【0050】

実施例において後述するように、発明者らは、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤が、ＨＢＶの複製効率を顕著に低下させることを明らかにした。具体的なＰＫＬＲ／ＰＫＭ２阻害剤としては、シコニン（ＣＡＳ番号：５１７－８９－５）等が挙げられる。また、具体的なＰＫＲ阻害剤としては、ＰＫＲ－ＩＮ－Ｃ１６（ＣＡＳ番号：６０８５１２－９７－６）等が挙げられる。

【0051】

ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭタンパク質又はＰＫＲタンパク質の阻害剤は、新しいタイプのＨＢＶ感染症の治療剤へとつながり、従来薬との併用が可能で、よりよい治療手法となりうる可能性がある。

【実施例0052】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0053】

［実験例１］
（ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質に結合するヒトタンパク質の探索１）
発明者らは、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の活性を助けるヒト因子が存在していると仮定し、ＨＢＶ－ＰＯＬに結合しているヒトタンパク質を質量分析で探索した。

【0054】

具体的には、ヒト細胞由来の無細胞転写翻訳系で、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを融合させたＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質（ＦＬＡＧ－ＰＯＬ）、及び、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを融合させた緑色蛍光タンパク質（ＦＬＡＧ－ＧＦＰ）をそれぞれ発現させた。続いて、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降により、ＦＬＡＧ－ＰＯＬ及びＦＬＡＧ－ＧＦＰをそれぞれ精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行った。

【0055】

続いて、得られたゲルを銀染色し、ＦＬＡＧ－ＧＦＰをアプライしたレーンには存在せず、ＦＬＡＧ－ＰＯＬをアプライしたレーンに存在するバンドを切り抜き、オービトラップ型ＬＳ－ＭＳ／ＭＳで解析した。

【0056】

その結果、複数の候補タンパク質を特定した。表１に、ＨＢＶ－ＰＯＬに結合していたヒトタンパク質を示す。表１中、スコアが大きいほど信憑性が高いことを示す。また、「ｅｍＰＡＩ」は、修飾タンパク質の存在量指数を示す。

【0057】

【表1】

【0058】

［実験例２］
（ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質に結合するヒトタンパク質の探索２）
実験例１で特定された候補タンパク質及びその類似タンパク質について、市販のキット（製品名「ｎａｎｏＢＲＥＴ」、プロメガ）を用いたアッセイにより、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質への結合を確認した。

【0059】

ｎａｎｏＢＲＥＴアッセイとは、（ｉ）被験タンパク質の一方とＮａｎｏＬｕｃ蛍光タンパク質との融合タンパク質と、（ｉｉ）被験タンパク質の他方とＨａｌｏＴａｇ（登録商標）との融合タンパク質に低分子蛍光リガンド（６１８リガンド）が結合した融合タンパク質と、が近接すると、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）により蛍光波長が遷移し、波長の変化した蛍光を発することを利用して、被験タンパク質同士の結合を評価する方法である。

【0060】

ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２と、ヒト胎児腎由来細胞株であるＨＥＫ２９３の２種類の細胞株に、被験タンパク質の融合タンパク質の発現ベクターと、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の融合タンパク質の発現ベクターをそれぞれ導入し、検討を行った。ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質のＣ末端にＮａｎｏＬｕｃ蛍光タンパク質を結合させた。

【0061】

図１は、ＨｅｐＧ２を用いてＢＲＥＴシグナルを検出した結果を示すグラフである。また、図２は、ＨＥＫ２９３を用いてＢＲＥＴシグナルを検出した結果を示すグラフである。図１及び図２中、縦軸は検出されたＢＲＥＴシグナルの強度（相対値）を示す。また、Ｃ０１～Ｃ１４は、各タンパク質のＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）及び低分子蛍光リガンド（６１８リガンド）を結合させた結果を示す。また、Ｎ０１～Ｎ１４は、各タンパク質のＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）及び低分子蛍光リガンド（６１８リガンド）を結合させた結果を示す。また、「Ｖ１」、「Ｖ２」、「Ｖ３」は、バリアントを示す。また、「ＮＣ」は空のベクターを導入したネガティブコントロールの結果であることを示し、「ＰＣ」はＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質と結合することが知られているＤＤＸ３を導入したポジティブコントロールの結果であることを示す。

【0062】

その結果、いずれの細胞株においてもＰｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ｌ／Ｒ（ＰＫＬＲ）がＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質との高い結合性を示した。そこで、ＰＫＬＲ、及び、ＰＫＬＲに類似するＰＫＭ２及びＰＫＲを、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の結合タンパク質の候補として選択し、以下の実験を行った。

【0063】

［実験例３］
（ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性の検討）
ヒト細胞由来の無細胞転写翻訳系を用いて、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭ２タンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させた。続いて、市販のキット（製品名「Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ａｓｓａｙ」、ロシュ社）を使用して、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した。

【0064】

図３（ａ）～（ｄ）は、ＰＫＬＲタンパク質及びＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を共発現させた後、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した結果を示すグラフである。図３（ａ）～（ｄ）中、縦軸はＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を単独で発現した場合の逆転写活性を１００％とした場合の相対的な逆転写活性を示す。また、「Ｎ－Ｈａｌｏ ＰＫＬＲ ｖ１」はＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＬＲバリアント１を共発現させた結果であることを示し、「Ｎ－Ｈａｌｏ ＰＫＬＲ ｖ２」はＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＬＲバリアント２を共発現させた結果であることを示し、「Ｃ－Ｈａｌｏ ＰＫＬＲ ｖ１」はＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＬＲバリアント１を共発現させた結果であることを示し、「Ｃ－Ｈａｌｏ ＰＫＬＲ ｖ２」はＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＬＲバリアント２を共発現させた結果であることを示す。また、「ＰＯＬ－Ａｅ」はＨＢＶ遺伝子型Ａ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－Ｂａ５１」はＨＢＶ遺伝子型Ｂ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－ＣＡＴ」はＨＢＶ遺伝子型Ｃ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－Ｄ６０」はＨＢＶ遺伝子型Ｄ型のＰＯＬタンパク質であることを示す。

【0065】

その結果、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質とＰＫＬＲタンパク質を共発現させることにより、ＨＢＶの遺伝子型に関係なく逆転写活性が増加することが明らかとなった。また、ＰＫＬＲの添加量依存的に逆転写活性が増加した。また、ＰＫＬＲのバリアント２種類、更にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）の位置に関係なく同じ結果が得られた。

【0066】

図４（ａ）～（ｄ）は、ＰＫＭ２タンパク質及びＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を共発現させた後、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した結果を示すグラフである。図４（ａ）～（ｄ）中、縦軸はＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を単独で発現した場合の逆転写活性を１００％とした場合の相対的な逆転写活性を示す。また、「Ｎ－Ｈａｌｏ ＰＫＭ２ ｖ１」はＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＭ２バリアント１を共発現させた結果であることを示し、「Ｎ－Ｈａｌｏ ＰＫＭ２ ｖ２」はＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＭ２バリアント２を共発現させた結果であることを示し、「Ｃ－Ｈａｌｏ ＰＫＭ２ ｖ１」はＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＭ２バリアント１を共発現させた結果であることを示し、「Ｃ－Ｈａｌｏ ＰＫＭ２ ｖ２」はＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＭ２バリアント２を共発現させた結果であることを示す。また、「ＰＯＬ－Ａｅ」はＨＢＶ遺伝子型Ａ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－Ｂａ５１」はＨＢＶ遺伝子型Ｂ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－ＣＡＴ」はＨＢＶ遺伝子型Ｃ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－Ｄ６０」はＨＢＶ遺伝子型Ｄ型のＰＯＬタンパク質であることを示す。

【0067】

その結果、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質とＰＫＭ２タンパク質を共発現させることにより、ＨＢＶの遺伝子型に関係なく逆転写活性が増加することが明らかとなった。また、ＰＫＭ２の添加量依存的に逆転写活性が増加した。また、ＰＫＭ２のバリアント２種類、更にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）の位置に関係なく同じ結果が得られた。

【0068】

図５（ａ）～（ｄ）は、ＰＫＲタンパク質及びＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を共発現させた後、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の逆転写活性を測定した結果を示すグラフである。図５（ａ）～（ｄ）中、縦軸はＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を単独で発現した場合の逆転写活性を１００％とした場合の相対的な逆転写活性を示す。また、「Ｎ－Ｈａｌｏ ＰＫＲ ｖ１」はＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＲバリアント１を共発現させた結果であることを示し、「Ｎ－Ｈａｌｏ ＰＫＲ ｖ２」はＮ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＲバリアント２を共発現させた結果であることを示し、「Ｃ－Ｈａｌｏ ＰＫＲ ｖ１」はＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＲバリアント１を共発現させた結果であることを示し、「Ｃ－Ｈａｌｏ ＰＫＲ ｖ２」はＣ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＲバリアント２を共発現させた結果であることを示す。また、「ＰＯＬ－Ａｅ」はＨＢＶ遺伝子型Ａ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－Ｂａ５１」はＨＢＶ遺伝子型Ｂ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－ＣＡＴ」はＨＢＶ遺伝子型Ｃ型のＰＯＬタンパク質であることを示し、「ＰＯＬ－Ｄ６０」はＨＢＶ遺伝子型Ｄ型のＰＯＬタンパク質であることを示す。

【0069】

その結果、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質とＰＫＲタンパク質を共発現させることにより、ＨＢＶの遺伝子型に関係なく逆転写活性が増加することが明らかとなった。また、ＰＫＲの添加量依存的に逆転写活性が増加した。また、ＰＫＲのバリアント２種類、更にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）の位置に関係なく同じ結果が得られた。

【0070】

以上の結果は、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭ２タンパク質又はＰＫＲタンパク質とＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質が共存することにより、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の安定性が向上したことを示す。

【0071】

［実験例４］
（ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の安定性の検討）
ヒト細胞由来の無細胞転写翻訳系を用いて、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭ２タンパク質又はＰＫＲタンパク質の存在下でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を発現させ、その発現量を検討した。

【0072】

具体的には、ヒト細胞由来の無細胞転写翻訳系で、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを融合させたＨＢＶ遺伝子型Ａ型のＰＯＬタンパク質（ＦＬＡＧ－ＰＯＬ－Ａｅ）を、Ｎ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＬＲタンパク質バリアント１「Ｎ－Ｈａｌｏ ｔａｇ ＰＫＬＲ ｖ１」、バリアント２「Ｎ－Ｈａｌｏ ｔａｇ ＰＫＬＲ ｖ２」、Ｎ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＭ２タンパク質バリアント１「Ｎ－Ｈａｌｏ ｔａｇ ＰＫＭ２ ｖ１」、バリアント２「Ｎ－Ｈａｌｏ ｔａｇ ＰＫＭ２ ｖ２」、Ｎ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を結合したＰＫＲタンパク質バリアント１「Ｎ－Ｈａｌｏ ｔａｇ ＰＫＲ ｖ１」、及び、バリアント２「Ｎ－Ｈａｌｏ ｔａｇ ＰＫＲ ｖ２」と共発現させた。

【0073】

続いて、共発現させたサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）した後、メンブレンに転写した。続いて、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質を染色した。

【0074】

図６及び図７は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図６は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質とＰＫＬＲタンパク質又はＰＫＭ２タンパク質を共発現させた結果を示し、図７は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質とＰＫＲタンパク質を共発現させた結果を示す。図６及び図７中、「ＦＬＡＧ－ＰＯＬ－Ａｅ ｗ／ｏ ａｄｄｉｔｉｖｅ」は、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質のみを発現させた結果であることを示し、「Ｎｅｇ ｃｔｒｌ」はネガティブコントロールの結果であることを示す。

【0075】

その結果、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質とＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭ２タンパク質又はＰＫＲタンパク質を共発現させることにより、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭ２タンパク質又はＰＫＲタンパク質の量依存的に、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の発現量が増加することが明らかとなった。

【0076】

ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質のみを発現させても早期に分解されてしまうことから、ＰＫＬＲタンパク質、ＰＫＭ２タンパク質又はＰＫＲタンパク質とＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質が共存することにより、ＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の安定性が向上したと考えられた。

【0077】

［実験例５］
（ＨＢＶの複製効率の検討）
ヒト肝癌由来細胞株であるＨｕｈ７を用い、ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２阻害剤、ＰＫＲ阻害剤、ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２活性化剤又はＰＫＲ活性化剤の存在下でＨＢＶを複製させ、複製効率を測定した。ＨＢＶとしては、ＨＢＶ遺伝子型Ａ型であるＨＢＶ－Ａｅ－ＵＳ株、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ型であるＨＢＶ－Ｂｊ５６株、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ型であるＨＢＶ－Ｃ－ＡＴ株を使用した。

【0078】

ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２阻害剤としては、シコニン（ＣＡＳ番号：５１７－８９－５）、ＰＫＭ２－ＩＮ－１（ＣＡＳ番号：９４１６４－８８－２）を使用した。ＰＫＲ阻害剤としては、ＰＫＲ－ＩＮ－Ｃ１６（ＣＡＳ番号：６０８５１２－９７－６）を使用した。ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２活性化剤としては、ＤＡＳＡ－５８（ＣＡＳ番号：１２０３４９４－４９－８）、ＴＥＰＰ－４６（ＣＡＳ番号：１２２１１８６－５３－３）を使用した。ＰＫＬＲ活性化剤としては、ＰＫＲ－ＩＮ－２（ＣＡＳ番号：１６２８４２８－０１－２）を使用した。

【0079】

ＨＢＶの複製効率は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）及びＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原（ＨＢｃｒＡｇ）を測定することにより測定した。特に、ＨＢｃｒＡｇはウイルス量と強く相関するものである。

【0080】

図８（ａ）及び（ｂ）は、測定結果を示すグラフである。図８（ａ）はＨＢｓＡｇの測定結果を示し、図８（ｂ）はＨＢｃｒＡｇの測定結果を示す。図８（ａ）及び（ｂ）中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は薬物を添加していないコントロールの結果であることを示し、グラフの縦軸はコントロールを１００％とした場合の相対値を示す。

【0081】

その結果、ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２阻害剤であるシコニンを添加すると、ＨＢＶの複製効率が顕著に低下することが明らかとなった。また、ＰＫＭ２－ＩＮ－１を投与した場合には、ＨＢｃｒＡｇの検出において、ＨＢＶの複製効率の低下が確認された。また、ＰＫＲ阻害剤であるＰＫＲ－ＩＮ－Ｃ１６を添加すると、ＨＢＶの複製効率が顕著に低下することが明らかとなった。

【0082】

これらの結果は、ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２阻害剤又はＰＫＲ阻害剤の添加により、ＨＢＶの複製効率が低下することを示す。

【0083】

一方、ＰＫＬＲ／ＰＫＭ２活性化剤、ＰＫＲ活性化剤を添加した場合には顕著な影響は認められなかった。

【産業上の利用可能性】

【0084】

本発明によれば、逆転写酵素活性を持つ状態でＨＢＶ－ＰＯＬタンパク質の全長を大量発現する技術を提供することができる。また、ＨＢＶ感染症の治療剤のスクリーニング方法、及び、ＨＢＶ感染症の治療剤を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】