特開2023-166088トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを用いた前記酵素の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023166088
(43)【公開日】2023-11-21
(54)【発明の名称】トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを用いた前記酵素の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231114BHJP
C12N 15/48 20060101ALI20231114BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20231114BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231114BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231114BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231114BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231114BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/48
C12N9/10
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022076862
(22)【出願日】2022-05-09
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】野口 惇
(72)【発明者】
【氏名】服部 将人
(72)【発明者】
【氏名】大熊 里佳
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD01
4B050LL10
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA29
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】 遺伝子組換え宿主を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なポリヌクレオチドを提供すること。
【解決の手段】 ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端側１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量を４５％未満とすることで、前記課題を解決する。
【選択図】 図３
【解決の手段】 ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端側１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量を４５％未満とすることで、前記課題を解決する。
【選択図】 図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドであって、当該５’末端側の１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量が４５％未満である、前記ポリヌクレオチド。
【請求項2】
ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側６残基が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであり、かつ以下の（１）および（２）のコドンを少なくとも含み、かつ以下の（３）から（５）のコドンを少なくとも１つ含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド；
（１）配列番号１の１番目のスレオニンがＡＣＴまたはＡＣＡ
（２）配列番号１の２番目のバリンがＧＴＴまたはＧＴＡ
（３）配列番号１の３番目のアラニンがＧＣＴまたはＧＣＡ
（４）配列番号１の４番目および６番目のロイシンがＴＴＡ
（５）配列番号１の５番目のヒスチジンがＣＡＴ。
（１）配列番号１の１番目のスレオニンがＡＣＴまたはＡＣＡ
（２）配列番号１の２番目のバリンがＧＴＴまたはＧＴＡ
（３）配列番号１の３番目のアラニンがＧＣＴまたはＧＣＡ
（４）配列番号１の４番目および６番目のロイシンがＴＴＡ
（５）配列番号１の５番目のヒスチジンがＣＡＴ。
【請求項3】
ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側６残基をコードするオリゴヌクレオチドが、配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
ＡＭＶ逆転写酵素が以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）より選択されるいずれかである、請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有したポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有したポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
【請求項5】
ＡＭＶ逆転写酵素が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）より選択されるいずれかである、請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
【請求項6】
請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドベクター。
【請求項7】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドベクター。
【請求項8】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドベクター。
【請求項9】
請求項６に記載のプラスミドベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項10】
請求項７に記載のプラスミドベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項11】
請求項８に記載のプラスミドベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項12】
宿主が大腸菌である、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項13】
宿主が大腸菌である、請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項14】
宿主が大腸菌である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項15】
請求項９に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【請求項16】
請求項１０に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【請求項17】
請求項１１に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を宿主で発現させるためのポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを用いた前記酵素の製造方法に関する。特に本発明は、前記酵素を宿主で大量発現可能なポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを用いた前記酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成等の用途で、遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬などに利用されている。
【0003】
ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、古くから、ニワトリを用いてＡＭＶを増殖させ、得られたＡＭＶから前記酵素を抽出・精製し、製造する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら生産性に課題があった。
【0004】
ＡＭＶを用いないＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、タンパク質を安定的に大量生産可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた製造方法が知られている。一例として、特許文献２には、ＡＭＶから取得したＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（ＡＭＶ逆転写酵素本来のポリヌクレオチド配列）を含むベクターで形質転換し得られた遺伝子組換え大腸菌を用いて発現させる方法が、特許文献３には、大腸菌型コドンに変換したＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換し得られた遺伝子組換え大腸菌を用いて発現させる方法が、それぞれ記載されている。
【0005】
しかしながら、工業的にＡＭＶ逆転写酵素を大量生産するためには、さらなる発現量の向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開昭６０－０９１９８１号公報
【特許文献2】特開２００２－３１５５８４号公報
【特許文献3】特開２０１３－１４６２３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、遺伝子組換え宿主を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なポリヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端側のＧＣ含量を最適化することで、前記酵素を大量に発現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0009】
すなわち本発明は以下＜１＞から＜１７＞に記載の態様を包含する。
【0010】
＜１＞トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドであって、当該５’末端側の１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量が４５％未満である、前記ポリヌクレオチド。
【0011】
＜２＞ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側６残基が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであり、かつ以下の（１）および（２）のコドンを少なくとも含み、かつ以下の（３）から（５）のコドンを少なくとも１つ含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチド；
（１）配列番号１の１番目のスレオニンがＡＣＴまたはＡＣＡ
（２）配列番号１の２番目のバリンがＧＴＴまたはＧＴＡ
（３）配列番号１の３番目のアラニンがＧＣＴまたはＧＣＡ
（４）配列番号１の４番目および６番目のロイシンがＴＴＡ
（５）配列番号１の５番目のヒスチジンがＣＡＴ。
（１）配列番号１の１番目のスレオニンがＡＣＴまたはＡＣＡ
（２）配列番号１の２番目のバリンがＧＴＴまたはＧＴＡ
（３）配列番号１の３番目のアラニンがＧＣＴまたはＧＣＡ
（４）配列番号１の４番目および６番目のロイシンがＴＴＡ
（５）配列番号１の５番目のヒスチジンがＣＡＴ。
【0012】
＜３＞ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側６残基をコードするオリゴヌクレオチドが、配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
【0013】
＜４＞ＡＭＶ逆転写酵素が以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）より選択されるいずれかである、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（Ｉ）配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有したポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
（Ｉ）配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有したポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
【0014】
＜５＞ＡＭＶ逆転写酵素が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）より選択されるいずれかである、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド。
【0015】
＜６＞＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドベクター。
【0016】
＜７＞＜４＞に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドベクター。
【0017】
＜８＞＜５＞に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドベクター。
【0018】
＜９＞＜６＞に記載のプラスミドベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【0019】
＜１０＞＜７＞に記載のプラスミドベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【0020】
＜１１＞＜８＞に記載のプラスミドベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【0021】
＜１２＞宿主が大腸菌である、＜９＞に記載の形質転換体。
【0022】
＜１３＞宿主が大腸菌である、＜１０＞に記載の形質転換体。
【0023】
＜１４＞宿主が大腸菌である、＜１１＞に記載の形質転換体。
【0024】
＜１５＞＜９＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【0025】
＜１６＞＜１０＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【0026】
＜１７＞＜１１＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【発明の効果】
【0027】
本発明のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドは、当該５’末端側の1塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量が４５％未満であることを特徴としている。前記ポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターで形質転換して得られる形質転換体は、前記ＧＣ含量が４５％以上である前記ポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターで形質転換して得られる形質転換体と比較し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量が増大している。したがって本発明は、前記酵素の工業的製造に有用といえる。
【発明を実施するための形態】
【0028】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0029】
本発明においてＡＭＶ逆転写酵素とは、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ、トリ骨髄芽球症ウイルス等とも呼称される）が有する逆転写酵素のことである。ＡＭＶ逆転写酵素の一例として、
（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有したポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、があげられる。
（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有したポリペプチド、
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、があげられる。
【0030】
前記（ＩＩ）の一例として、配列番号３に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基からなり、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基において、以下に示す３箇所のアミノ酸残基の置換が生じたポリペプチドである；
配列番号２の２８０番目（配列番号３では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号２の３１１番目（配列番号３では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号２の４０２番目（配列番号３では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。
配列番号２の２８０番目（配列番号３では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号２の３１１番目（配列番号３では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号２の４０２番目（配列番号３では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。
【0031】
前記（ＩＩＩ）において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸残基の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。相同性は７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していてもよい。
【0032】
なお前述したＡＭＶ逆転写酵素はβ鎖と呼ばれるポリペプチドである。一方、ＡＭＶ逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のポリペプチドであるα鎖も存在する。ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の一例として、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、があげられる。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該残基のうち、１４番目のアラニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有したポリペプチド、があげられる。
【0033】
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端側５７２残基からなるポリペプチドである、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
【0034】
ＡＭＶ逆転写酵素は、前述したβ鎖のモノマーやホモダイマー、前述したα鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（以下、「αβ体」とも表記する）などを構成することが知られているが、後述する本発明のプラスミドベクターを用いて宿主で発現させるＡＭＶ逆転写酵素はこれらのいずれの形態を有していてもよい。
【0035】
またＡＭＶ逆転写酵素は、その機能を損ねない範囲で、当該酵素のＮ末端および／またはＣ末端にタグペプチドがさらに付加されていてもよい。前記タグペプチドの一例として、分析・精製を容易にするためのタグペプチド（ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグなど）、宿主での分泌発現を促すためのシグナルペプチド（宿主が大腸菌の場合、ＯｍｐＡシグナルペプチド、ＰｅｌＢシグナルペプチドなど）、ベクターの開始コドン（メチオニン）やマルチクローニングサイト（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）由来のペプチドがあげられる。タグペプチドを付加したＡＭＶ逆転写酵素の一態様として、配列番号３に記載の配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖のＮ末端にマルチクローニングサイト（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）および開始コドン（メチオニン）を付加したポリペプチドである、配列番号８に記載の配列からなるポリペプチドがあげられる。
【0036】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とも表記する）は、当該５’末端側の１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量（グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）塩基の割合）が４５％未満であることを特徴としている。特に５’末端に近い領域のＧＣ含量が少ないと好ましく、例えば、前記ｎが１１以上２４以下の整数でのＧＣ含量が４０％未満であると、より好ましい。ＧＣ含量を前述した値にするには、例えばＡＭＶ逆転写酵素のアミノ酸配列を変えることなく、当該アミノ酸のコドンをＡ（アデニン）またはＴ（チミン）塩基が多くなるコドンに変換すればよい。
【0037】
前記より好ましい態様の具体例として、ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側６残基が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであり、かつ以下の（１）および（２）のコドンを少なくとも含み、かつ以下の（３）から（５）のコドンを少なくとも１つ含む、＜１＞に記載のポリヌクレオチドがあげられる；
（１）配列番号１の１番目のスレオニンがＡＣＴまたはＡＣＡ
（２）配列番号１の２番目のバリンがＧＴＴまたはＧＴＡ
（３）配列番号１の３番目のアラニンがＧＣＴまたはＧＣＡ
（４）配列番号１の４番目および６番目のロイシンがＴＴＡ
（５）配列番号１の５番目のヒスチジンがＣＡＴ。
（１）配列番号１の１番目のスレオニンがＡＣＴまたはＡＣＡ
（２）配列番号１の２番目のバリンがＧＴＴまたはＧＴＡ
（３）配列番号１の３番目のアラニンがＧＣＴまたはＧＣＡ
（４）配列番号１の４番目および６番目のロイシンがＴＴＡ
（５）配列番号１の５番目のヒスチジンがＣＡＴ。
【0038】
前記態様では、前記（１）および（２）のコドンを少なくとも含んだ上で、さらに（３）から（５）のコドンのうち、いずれか１つ、いずれか２つ、または３つ全てを含んでいればよい。ＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側６残基（配列番号１）をコードするオリゴヌクレオチドの好ましい態様として、前記（１）から（５）のコドンを全て含む、配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【0039】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のうち、前述した５’末端側の１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）まで以外の領域については、ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質が発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチドと実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。ここで「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの酵素活性（逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性）のうち少なくとも１つが、天然型ＡＭＶ逆転写酵素と同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。例えば、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％以上（好ましくは８０％以上、９０％以上、または９５％以上）の相同性を有したヌクレオチド配列を含む遺伝子の転写および翻訳により合成されたタンパク質であってよい。またここで「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、具体的には、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、または７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムが共存する条件が例示できる。
【0040】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一例として、
配列番号３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、配列番号６に記載の配列からなるポリヌクレオチドや、
配列番号４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。なお配列番号６および７のうち、５’末端側１８塩基のヌクレオチド配列は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列である。
配列番号３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、配列番号６に記載の配列からなるポリヌクレオチドや、
配列番号４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。なお配列番号６および７のうち、５’末端側１８塩基のヌクレオチド配列は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列である。
【0041】
なおＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端および／またはＣ末端に前述したタグペプチドが付加されている場合、当該前記タグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドについても、ＧＣ含量が少なくなる（ＡおよびＴ残基が多くなる）コドンを選択すると好ましい。一例として、タグペプチド（マルチクローニングサイトおよび開始コドン）をＡＭＶ逆転写酵素β鎖（配列番号３）のＮ末端に付加したポリペプチドである、配列番号８に記載の配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの好ましい態様として、配列番号９に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。なお配列番号９に記載の配列からなるポリヌクレオチドにおいて、マルチクローニングサイトのフェニルアラニン（配列番号８では３番目の残基）のコドン（配列番号９では７番目から９番目までの塩基）はＴＴＴであり、ＡＭＶ逆転写酵素Ｎ末端側６残基（配列番号８では５番目から１０番目の残基）をコードするオリゴヌクレオチド（配列番号９では１３番目から３０番目までの塩基）の配列は配列番号５に記載のヌクレオチド配列と同一である。
【0042】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を、適切なプラスミドベクターに挿入することで、宿主で前記酵素を発現可能なプラスミドベクター（以下単に、本発明のプラスミドベクターとも表記する）を作製できる。本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入するプラスミドベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し、複製できるものであれば特に制限はない。宿主が大腸菌である場合のプラスミドベクターの具体例として、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られている、ｐＴｒｃ系プラスミドベクター、ｐＵＣ系プラスミドベクター、ｐＢＲ系プラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター、広宿主域（Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクターがあげられる。その中でもｐＴｒｃ系プラスミドベクターであるｐＴｒｃ９９Ａは、形質転換した大腸菌内で安定に存在できるため、好ましい。本発明のプラスミドベクターにおけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の位置は、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で適宜設定してよい。
【0043】
本発明のプラスミドベクターを用いて宿主を形質転換することで、本発明の形質転換体を作製できる。前記宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。大腸菌の好ましい態様として、大腸菌ＭＶ１１８４株（ＡＴＣＣ ４７１０８）、大腸菌ＧＭ３１株（ＮＢＲＰ ＭＥ７７４１）、大腸菌ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ ３３６９４）、大腸菌ＪＭ１０１株（ＮＢＲＰ ＭＥ９０４３）および大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）があげられる。なお前述した宿主に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した宿主変異株を使用してもよい。本発明のプラスミドベクターを用いて宿主を形質転換するには、公知の方法（例えば宿主が大腸菌の場合、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法）で行なえばよい。
【0044】
前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養は、公知の方法を利用すればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２ＹＴ培地を用いる方法があげられる。なお本発明のプラスミドベクターに薬剤耐性遺伝子を有している場合、当該遺伝子に対応した薬剤を選抜剤として培地に添加すると、本発明の形質転換体を選択して培養できる点で好ましい。例えば、本発明のプラスミドベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩や、適当な栄養源を添加してもよい。培養温度は、例えば宿主が大腸菌の場合、１０℃以上４０℃以下の範囲であればよく、好ましくは２５℃以上３７℃以下の範囲、より好ましくは３７℃付近である。ｐＨは例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＨ５．９以上８．１以下の範囲であればよく、好ましくはｐＨ６．０付近である。培養時間は、例えば３時間以上であればよく、好ましくは１６時間以上、より好ましくは５０時間以上、さらに好ましくは７２時間以上である。
【0045】
本発明のプラスミドベクターがｔｒｃプロモーターなど誘導性のプロモーターを有している場合、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）などの誘導剤を培地に添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導してもよい。この場合、培養開始時に誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで菌体を増殖させた後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよい。好ましくは宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）が概ね０．１以上２０．０以下を示す増殖期間、より好ましくは濁度が０．５以上１０．０以下を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は宿主が大腸菌の場合、一例として終濃度で概ね０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲、より好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ付近である。なお、誘導操作後（誘導剤添加後）の培養温度を宿主の至適培養温度よりも低い温度まで下げると好ましく、具体的には宿主が大腸菌の場合、１０℃以上３０℃以下の範囲、より好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲、さらに好ましくは２５℃付近である。具体的には宿主が大腸菌の場合、特開２０１４－１１３１０６号公報に記載の方法を用いると、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産できる点で好ましい。
【0046】
前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出するには、当該形質転換体による発現の形態によって、適宜抽出方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が宿主内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出すればよい。なお前記抽出段階では核酸など種々の夾雑物が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリエチレンイミン（商品名：ポリミンＰ）などの除核酸剤を添加し、前記核酸と共沈させることで、効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収できる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製できる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖と、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖と、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素とを、分離精製できる。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】実施例で作製したプラスミドベクターのうち、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端側５４塩基のヌクレオチド配列を比較した図である。図中、白抜きで示した箇所が、プラスミドベクターｐＡＭＶｂ（配列番号１０）に対し、コドン変換した箇所である。
【図2】実施例で作製したプラスミドベクターのうち、ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの５’末端側のＧＣ含量を示す図である。
【図3】ＡＭＶ逆転写酵素の発現量をウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。なお発現量はプラスミドベクターｐＡＭＶｂ（配列番号１０）で大腸菌を形質転換して得られた形質転換体での発現量を１とした相対値で示している。
【実施例0048】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0049】
実施例１ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターの作製
（１）配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
（１）配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
【0050】
（２）あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターに、（１）で合成したポリヌクレオチドを挿入し、プラスミドベクターｐＡＭＶｂ（以下、ｐＡＭＶｂと表記する）を作製した。なおｐＡＭＶｂは、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の上流にｔｒｃプロモーターを、下流にアンピシリン耐性遺伝子を、それぞれ含んでいる。配列番号１２に記載のポリヌクレオチドの５’末端側に、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター由来のマルチクローニングサイトと開始コドンを含む１２塩基を付加したポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に示す。なお配列番号１０のうち、５’末端側９塩基（ＡＴｇｇＡＡＴＴＣ）が、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター由来のマルチクローニングサイトである。
【0051】
（３）ｐＡＭＶｂのうち、配列番号１０の５’末端側３０塩基（以下、５’末端側領域とも表記する）に対し、Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いてコドン置換し、５’末端側領域のＧＣ含量を低下または増大させた。 配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を含むポリヌクレオチドに対し、５’末端側領域のＧＣ含量を低下させたポリヌクレオチドを配列番号９に、５’末端側領域のＧＣ含量を増加させたポリヌクレオチドを配列番号１１に、それぞれ示す。また配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を含むプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－ＡＴと、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を含むプラスミドベクターをｐＡＭＶｂ－ＧＣと、それぞれ命名する。なお配列番号１０、９および１１に記載のポリヌクレオチドの転写および翻訳により宿主内で合成されるポリペプチドは、いずれも配列番号８に記載の配列からなるポリペプチドである。
【0052】
配列番号１０、９および１１の５’末端側領域におけるヌクレオチド配列を比較した図を図１に示す。配列番号９は、配列番号１０に対し、ベクター由来のフェニルアラニンのコドンがＴＴＴに、ＡＭＶ逆転写酵素Ｎ末端のスレオニンのコドンがＡＣＴに、同酵素Ｎ末端側２番目のバリンのコドンがＧＴＴに、３番目のアラニンのコドンがＧＣＡに、５番目のヒスチジンのコドンがＣＡＴに、６番目のロイシンのコドンがＴＴＡに、それぞれ置換されている。配列番号１１は、配列番号１０に対し、ＡＭＶ逆転写酵素Ｎ末端側２番目のバリンのコドンがＧＴＣに、３番目のアラニンのコドンがＧＣＣに、４番目および６番目のロイシンのコドンがＣＴＣに、それぞれ置換されている。
【0053】
配列番号１０、９および１１のうち、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子５’末端側の１塩基目からｎ塩基目までにおけるＧＣ含量をプロットした図を図２に示す（ｎは２から５４までの整数）。配列番号９は、配列番号１０に対し、ｎ＝３以降ＧＣ含量が低下しており、ｎ＝９からｎ＝５０までＧＣ含量４５％未満を維持している。配列番号１１は、配列番号１０に対し、ｎ＝１０以降ＧＣ含量が増大している。
【0054】
実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素の発現
（１）実施例１で作製した、ｐＡＭＶｂ（配列番号１０）ならびにｐＡＭＶｂ－ＡＴ（配列番号９）およびｐＡＭＶ－ＧＣ（配列番号１１）それぞれで、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、形質転換体（ＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌）を作製した。
（１）実施例１で作製した、ｐＡＭＶｂ（配列番号１０）ならびにｐＡＭＶｂ－ＡＴ（配列番号９）およびｐＡＭＶ－ＧＣ（配列番号１１）それぞれで、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、形質転換体（ＡＭＶ逆転写酵素発現大腸菌）を作製した。
【0055】
（２）（１）で作製した形質転換体を、適量のカルベニシリンを含む２ＹＴ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）３ｍＬにそれぞれ植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍで一晩前培養した。
【0056】
（３）（２）の前培養液０．２ｍＬを、適量のカルベニシリンを含む２ＹＴ－ＰＮａ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム・二水和物 １４．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物 ２．５ｇ／Ｌ）２０ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで３時間培養した。
【0057】
（４）ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう、各培養液に添加し、２５℃、１５０ｒｐｍでさらに３日間培養した。
【0058】
（５）各培養液を遠心分離し、ＡＭＶ逆転写酵素を発現した大腸菌を回収した。
【0059】
実施例３ ＡＭＶ逆転写酵素発現量の評価
（１）実施例２で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（グリセロール １０％（ｗ／ｖ）、リン酸カリウム ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ジチオトレイトール ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）２ｍＬに懸濁し、超音波破砕機ＵＤ－１００（トミー精工）で破砕した。
（１）実施例２で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（グリセロール １０％（ｗ／ｖ）、リン酸カリウム ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ジチオトレイトール ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）２ｍＬに懸濁し、超音波破砕機ＵＤ－１００（トミー精工）で破砕した。
【0060】
（２）（１）で得られた各菌体破砕液を、ジチオトレイトールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液に添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％（ｗ／ｖ）から２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。
【0061】
（３）電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。
【0062】
（４）（３）のメンブレンに対して、１次抗体として抗ＡＭＶ逆転写酵素ラビットポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ラビットＩｇＧ抗体－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）を、発色試薬としてＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、ウェスタンブロッティング解析を実施した。
【0063】
（５）（４）で染色したメンブレンを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ８００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて各バンドの輝度を定量解析した。
【0064】
配列番号１０、９および１１のいずれかの記載の配列からなるポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター（配列番号１０：ｐＡＭＶｂ、配列番号９：ｐＡＭＶｂ－ＡＴ、配列番号１１：ｐＡＭＶ－ＧＣ）で形質転換して得られた形質転換体を用いて発現させた際のＡＭＶ逆転写酵素発現量を比較した結果を図３に示す。なお図３において発現量は、ｐＡＭＶｂ（配列番号１０）で形質転換して得られた形質転換体での発現量（バンドの輝度に相当）を１とした相対値で表している。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の５’末端側の１塩基目からｎ塩基目（ただし、ｎは９以上５０以下の整数）までのＧＣ含量を４５％未満となるコドン置換（配列番号９、ｐＡＭＶｂ－ＡＴ）を行なうことで、当該置換前（配列番号１０、ｐＡＭＶｂ）よりも発現量が約３倍に向上していることがわかる。一方、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の５’末端領域のＧＣ含量を増大させるコドン置換（配列番号１１、ｐＡＭＶｂ－ＧＣ）を行なうと、当該置換前（配列番号１０、ｐＡＭＶｂ）と比べて、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量は著しく低下した。
【産業上の利用可能性】
【0065】
本発明のポリヌクレオチドにより、遺伝子組換え宿主を用いたトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の大量発現が可能となるため、工業規模でのＡＭＶ逆転写酵素の製造を効率的に行なえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】