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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023166262
(43)【公開日】2023-11-21
(54)【発明の名称】サルモネラ属菌の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20231114BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
C12Q1/689 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022077187
(22)【出願日】2022-05-09
(71)【出願人】
【識別番号】000227009
【氏名又は名称】日清オイリオグループ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100137338
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100196313
【弁理士】
【氏名又は名称】村松 大輔
(72)【発明者】
【氏名】上薗 あずさ
(72)【発明者】
【氏名】篠原 久実
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】
サルモネラ属菌の生菌を死菌と区別して特異的に検出できる新規な検出技術を提供すること。
【解決手段】
サルモネラ属菌の生菌の検出方法であって、
被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程と、
前記曝露工程を経た菌体に光を照射する、光照射工程と、
前記光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程と、
前記洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【選択図】 なし
サルモネラ属菌の生菌を死菌と区別して特異的に検出できる新規な検出技術を提供すること。
【解決手段】
サルモネラ属菌の生菌の検出方法であって、
被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程と、
前記曝露工程を経た菌体に光を照射する、光照射工程と、
前記光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程と、
前記洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サルモネラ属菌の生菌の検出方法であって、
被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程と、
前記曝露工程を経た菌体に光を照射する、光照射工程と、
前記光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程と、
前記洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の生菌の検出方法。
被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程と、
前記曝露工程を経た菌体に光を照射する、光照射工程と、
前記光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程と、
前記洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【請求項2】
前記光反応性クロスリンク剤が、プロピジウムモノアジド若しくはその誘導体又はこれらのモノ若しくはビスハライド塩である、請求項１に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【請求項3】
前記光反応性クロスリンク剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはそのモノもしくはビスハライド塩である、請求項２に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
（式１中、
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。）
【化1】
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。）
【請求項4】
前記曝露工程における曝露時間は３分以上であり、
前記光照射工程における光照射時間は５分以上である、請求項１に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
前記光照射工程における光照射時間は５分以上である、請求項１に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【請求項5】
前記被験試料が、油粕である、請求項１に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【請求項6】
前記ライゼート液調製工程において、加熱処理を行う、請求項１に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
【請求項7】
請求項１～６の何れか一項に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法により、サルモネラ属菌の有無を試験する工程を含む、飼料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サルモネラ属菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
サルモネラ属菌は、グラム陰性桿菌の一種であり、食中毒やチフスの原因となることが知られている。そのため、食品や家畜の飼料の製造においては、サルモネラ属菌を感度よく検出することが必要とされている。
【0003】
このような状況の中、サルモネラ菌を選択的に検出する方法が種々開発されてきている。
例えば特許文献１には、（ａ）マンニトール、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上、（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ－ガラクトシダーゼ基質、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ－グルコシダーゼ基質、（ｅ）胆汁酸又はその塩、（ｆ）ニュートラルレッドを検出時の濃度として０．００１～０．００８ｇ／Ｌ、（ｇ）ノボビオシン又はその塩、並びに（ｈ）イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）サルモネラ検出用培地及びこれを用いたサルモネラ属菌の検出方法が記載されている。
例えば特許文献１には、（ａ）マンニトール、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上、（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ－ガラクトシダーゼ基質、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ－グルコシダーゼ基質、（ｅ）胆汁酸又はその塩、（ｆ）ニュートラルレッドを検出時の濃度として０．００１～０．００８ｇ／Ｌ、（ｇ）ノボビオシン又はその塩、並びに（ｈ）イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）サルモネラ検出用培地及びこれを用いたサルモネラ属菌の検出方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１３－０３９０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
標準試験法としては、サルモネラ属菌標準試験法が存在する。この試験法に基づいた試験では、生菌か死菌かを区別し、陽性／陰性を精度よく検出することができるが、最終的な判断に５日以上を要するため、迅速な検出が求められる食品や家畜の飼料の品質管理の場面には適さなかった。
【0006】
ところで迅速かつ特異性の高い検出方法としてＰＣＲ法が知られている。ＰＣＲ法によれば、プライマーを適切に設定することで、特定の種類の菌のみを特異的に検出することが可能である。しかし、ＰＣＲ法では生菌と死菌を区別して検出することができない。
【0007】
上記状況に鑑み、本発明は、サルモネラ属菌の生菌を死菌と区別して特異的に検出できる新規な検出技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決する本発明は、以下の通りである。
［１］ サルモネラ属菌の生菌の検出方法であって、被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程と、前記曝露工程を経た菌体に光を照射する、光照射工程と、前記光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程と、前記洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［２］ 前記クロスリンク剤が、プロピジウムモノアジド又はその誘導体である、［１］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［３］ 前記光反応性クロスリンク剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはそのモノもしくはビスハライド塩である、［２］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
（式１中、
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。）
［４］ 前記曝露工程における曝露時間は３分以上であり、前記光照射工程における光照射時間は５分以上である、［１］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［５］ 前記被験試料が、油粕である、［１］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［６］ 前記ライゼート液調製工程において、加熱処理を行う、［１］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［７］ ［１］～［６］の何れか一項に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法により、サルモネラ属菌の有無を試験する工程を含む、飼料の製造方法。
［１］ サルモネラ属菌の生菌の検出方法であって、被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程と、前記曝露工程を経た菌体に光を照射する、光照射工程と、前記光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程と、前記洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［２］ 前記クロスリンク剤が、プロピジウムモノアジド又はその誘導体である、［１］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［３］ 前記光反応性クロスリンク剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはそのモノもしくはビスハライド塩である、［２］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
【化1】
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。）
［４］ 前記曝露工程における曝露時間は３分以上であり、前記光照射工程における光照射時間は５分以上である、［１］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［５］ 前記被験試料が、油粕である、［１］に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法。
［６］ 前記ライゼート液調製工程において、加熱処理を行う、［１］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［７］ ［１］～［６］の何れか一項に記載のサルモネラ属菌の生菌の検出方法により、サルモネラ属菌の有無を試験する工程を含む、飼料の製造方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の検出方法によれば、被験試料中にサルモネラ属菌の生菌を死菌と区別して迅速に検出することができる。
本発明の製造方法によれば、サルモネラ属菌の生菌の存否が判定された飼料を提供することができる。
本発明の製造方法によれば、サルモネラ属菌の生菌の存否が判定された飼料を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明に係るサルモネラ属菌の検出方法は、曝露工程、光照射工程、洗浄工程、ライゼート液調製工程、核酸抽出工程、及び核酸検出工程を含む。
曝露工程は、被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する工程である。光照射工程は、曝露工程を経た菌体に光を照射する工程である。洗浄工程は光照射工程を経た菌体を洗浄する工程である。ライゼート液調製工程は洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する工程である。核酸抽出工程は調製したライゼート液から核酸を抽出する工程である。核酸検出工程はサルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する工程である。
曝露工程は、被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する工程である。光照射工程は、曝露工程を経た菌体に光を照射する工程である。洗浄工程は光照射工程を経た菌体を洗浄する工程である。ライゼート液調製工程は洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する工程である。核酸抽出工程は調製したライゼート液から核酸を抽出する工程である。核酸検出工程はサルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する工程である。
【0011】
本発明で使用するクロスリンク剤は、細胞膜非透過性であるため、生菌の細胞膜を透過しない。一方、細胞膜を損傷している死菌においては細胞膜を透過して菌体内に入り込み、内部のＤＮＡと非特異的に結合する。さらに、本発明で使用するクロスリンク剤は光反応性であるため、光照射によってＤＮＡとクロスリンクすることで不可逆的な結合を形成することができる。クロスリンク剤による不可逆的な修飾を受けたＤＮＡにおいては、ＬＡＭＰ法における鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応が物理的に阻害され、進行しない。
【0012】
以上の原理により、本発明を適用した場合、死菌ＤＮＡはＬＡＭＰ法による核酸増幅が生じず、一方、生菌ＤＮＡはＬＡＭＰ法による核酸増幅が生じ、ＡＴＰ検出法によって検出することができる。
したがって、本発明によればサルモネラ菌の生菌を死菌と区別して特異的に検出することができる。
したがって、本発明によればサルモネラ菌の生菌を死菌と区別して特異的に検出することができる。
【0013】
以下、本発明の実施形態について詳しく説明する。なお、本発明は以下に説明する実施形態に限定されないことは言うまでもない。
【0014】
本発明において「被験試料」は、サルモネラ属菌の生菌の有無を検査したい試料であれば、特に制限されないが、食品、飼料、食品原料、飼料原料であることが好ましく、飼料又は飼料原料を被験試料とすることが好ましい。
本発明において「飼料」とは、家禽などが栄養目的で経口的に摂取するもの全てを意味する。具体的には養分含量の面から分類すると、粗飼料、濃厚飼料、無機物飼料、特殊飼料の全てを包含し、また公的規格の面から分類すると、配合飼料、混合飼料、単体飼料の全てを包含する。また、給餌方法の面から分類すると、直接給餌する飼料、他の飼料と混合して給餌する飼料、あるいは飲料水に添加し栄養分を補給するための飼料の全てを包含する。
本発明の好ましい形態では、被験試料が油粕である。油粕は、食品原料又は飼料原料として用いられる。ここで、本発明において「油粕」とは、農作物から油を搾り取った残渣であり、例えば菜種粕、綿実粕、茶実粕、大豆粕が含まれるが、これらに限定されない。本発明のより好ましい形態では、被験試料は、菜種粕及び／又は大豆粕である。
本発明において「飼料」とは、家禽などが栄養目的で経口的に摂取するもの全てを意味する。具体的には養分含量の面から分類すると、粗飼料、濃厚飼料、無機物飼料、特殊飼料の全てを包含し、また公的規格の面から分類すると、配合飼料、混合飼料、単体飼料の全てを包含する。また、給餌方法の面から分類すると、直接給餌する飼料、他の飼料と混合して給餌する飼料、あるいは飲料水に添加し栄養分を補給するための飼料の全てを包含する。
本発明の好ましい形態では、被験試料が油粕である。油粕は、食品原料又は飼料原料として用いられる。ここで、本発明において「油粕」とは、農作物から油を搾り取った残渣であり、例えば菜種粕、綿実粕、茶実粕、大豆粕が含まれるが、これらに限定されない。本発明のより好ましい形態では、被験試料は、菜種粕及び／又は大豆粕である。
【0015】
本発明において「サルモネラ属菌」とは、グラム陰性通性嫌気性桿菌の腸内細菌科の一属であるサルモネラ属に属する細菌のことであり、主にヒトや動物の消化管に生息する腸内細菌の一種である。サルモネラ属に属する細菌の一部は、ヒトや動物に経口感染して食中毒を引き起こす。サルモネラ属菌による食中毒は人獣共通の感染症である。以下、「サルモネラ属菌」を単に「サルモネラ」又は「サルモネラ菌」と記載する場合もある。
【0016】
本発明は、被験試料中に含まれる菌体を、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤に曝露する曝露工程を含む。以下、本発明で用いる「細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤」のことを単に「クロスリンク剤」と記載する場合がある。
【0017】
死菌は細胞膜が損傷している。そのため、曝露工程において死菌ＤＮＡはクロスリンク剤に曝露することとなる。一方、生菌においてはＤＮＡが細胞膜により外界と隔絶されている。そのため、曝露工程を経ても生菌ＤＮＡは、細胞膜非透過性のクロスリンク剤に曝露することは無い。
この死菌及び生菌に対するクロスリンク剤の選択性が、サルモネラ属菌の生菌を特異的に検出することを可能にする。
この死菌及び生菌に対するクロスリンク剤の選択性が、サルモネラ属菌の生菌を特異的に検出することを可能にする。
【0018】
本発明で用いるクロスリンク剤は、細胞膜非透過性であり、かつ、光反応性である。クロスリンク剤は、光反応性官能基としてアジド基を有する化合物であることが好ましい。より具体的には、芳香環にアジド基が結合した構造を有する化合物が例示でき、さらに好ましくは芳香性を有する六員環にアジド基が結合した構造を有する化合物が例示できる。
【0019】
クロスリンク剤は、正電荷数として２以上の電荷を有していることが好ましい。正電荷数が２以上であることにより、細胞膜非透過性が向上し、死菌と生菌への浸透選択性を向上させることができる。これにより、検出の生菌特異性を向上させることができる。
【0020】
本発明の好ましい形態では、クロスリンク剤は、式（Ｉ）で表される化合物またはそのモノもしくはビスハライド塩である。
【化1】
【0021】
式（Ｉ）中、
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。
【0022】
より好ましい実施形態では、クロスリンク剤は式（ＩＩ）で表される化合物またはそのモノもしくはビスハライド塩である。
【0023】
【化2】
【0024】
式（ＩＩ）中、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。
【0025】
さらに好ましい実施形態では、クロスリンク剤は式（ＩＩＩ）で表される化合物またはそのモノもしくはビスハライド塩である。
【0026】
【化3】
【0027】
式（ＩＩＩ）中、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、水素または１から６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ－アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、水素または１から６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ－アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される。
【0028】
具体的には、クロスリンク剤として、３－アミノ－８－アジド－５－エチル－６－フェニルフェナントリジウムヨウ化物、３－アミノ－８－アジド－５－エチル－６－フェニルフェナントリジウム臭化物、３－アミノ－８－アジド－５－エチル－６－フェニルフェナントリジウム塩化物、３－アミノ－８－アジド－５－（３－（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）－６－フェニルフェナントリジウム二ヨウ化物、３－アミノ－８－アジド－５－（３－（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）－６－フェニルフェナントリジウム二臭化物、および３－アミノ－８－アジド－５－（３－（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）－６－フェニルフェナントリジウム二塩化物などを好適に例示することができる。
【0029】
また、クロスリンク剤としては、プロピジウムモノアジド（３－アミノ－８－アジド－５－（３－（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）－６－フェニルフェナントリジウム）若しくはその誘導体又はこれらのモノ若しくはビスハライド塩を好適に例示できる。
【0030】
クロスリンク剤としてＰＭＡＴＭやＰＭＡｘｘＴＭ（ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用することができるが、これに限定されない。
【0031】
曝露工程は暗所にて行うことが好ましい。
また、クロスリンク剤と菌体との曝露時間は、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上である。また、曝露時間は、好ましくは２０分以下、より好ましくは１５分以下、さらに好ましくは１０分以下とすることができる。
曝露工程は、クロスリンク剤に菌体を曝露させた状態で静置して行うことが好ましい。
また、クロスリンク剤と菌体との曝露時間は、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上である。また、曝露時間は、好ましくは２０分以下、より好ましくは１５分以下、さらに好ましくは１０分以下とすることができる。
曝露工程は、クロスリンク剤に菌体を曝露させた状態で静置して行うことが好ましい。
【0032】
また、後述する核酸検出工程での検出効率の観点から、曝露工程の前に、被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程を行ってもよい。
インキュベート工程におけるサルモネラ属菌の培養条件は特に制限されず、本分野において公知の条件を、被験試料にあわせて適宜採用、調整することができるが、例えば３５℃で一晩震盪培養することで、サルモネラ属菌を培養することができる。
インキュベート工程におけるサルモネラ属菌の培養条件は特に制限されず、本分野において公知の条件を、被験試料にあわせて適宜採用、調整することができるが、例えば３５℃で一晩震盪培養することで、サルモネラ属菌を培養することができる。
【0033】
インキュベート工程において使用する培地は、サルモネラ属菌を培養することができれば特に制限されず、本分野において公知の非選択的又は軽度に選択的な一般的細菌用増殖培地を適宜採用することができる。例えば、ＭＰ培地、ＢＰＷ、ＥＥＭブイヨン、ＢＬＢ培地又はこれと同様なタイプの培地が含まれる。本培地は、潜在的に損傷を受けたサルモネラの迅速な回復と増殖を可能にする非選択培地及び／又は軽度に選択的な培地のいずれでもよく、さらに、十分なサルモネラの増殖を可能にし、その結果、サルモネラが最初のサンプルに存在している場合には、少なくとも１個の生存力のあるサルモネラを含むことが可能となるように調製できる培地が含まれる。
適切な非選択増殖培地の例としては、ＭＰ培地（ＭＰ Ｍｅｄｉａ、ＭＰ）、緩衝ペプトン水（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｗａｔｅｒ、ＢＰＷ）、ＥＥＭブイヨン（ＥＥＭ Ｂｒｏｔｈ、ＥＥＭ）、ＢＴＢ加乳糖ブイヨン（Ｌａｃｔｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ ＢＴＢ、ＢＬＢ）及び当業者に既知の他の非選択的培地及び／又は軽度に選択的培地が挙げられる。以上の培地は、デュポン株式会社（ＭＰ培地）、関東化学株式会社（ＢＰＷ）、メルク社（ＥＥＭ培地、ＬＢ培地）から入手可能である。この中で特に本発明で使用される好ましい培地は、ＭＰ培地である。
適切な非選択増殖培地の例としては、ＭＰ培地（ＭＰ Ｍｅｄｉａ、ＭＰ）、緩衝ペプトン水（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｗａｔｅｒ、ＢＰＷ）、ＥＥＭブイヨン（ＥＥＭ Ｂｒｏｔｈ、ＥＥＭ）、ＢＴＢ加乳糖ブイヨン（Ｌａｃｔｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ ＢＴＢ、ＢＬＢ）及び当業者に既知の他の非選択的培地及び／又は軽度に選択的培地が挙げられる。以上の培地は、デュポン株式会社（ＭＰ培地）、関東化学株式会社（ＢＰＷ）、メルク社（ＥＥＭ培地、ＬＢ培地）から入手可能である。この中で特に本発明で使用される好ましい培地は、ＭＰ培地である。
【0034】
増菌用の培地成分としては、サルモネラの生育に適したものが選択される。例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス等の栄養成分、乳糖、ブドウ糖等の糖類、及びサルモネラ以外の細菌の生育を抑制するための選択剤や抗生物質を含有する培地成分が用いられる。
糖類としては、被検体試料中に混在している可能性が高い大腸菌群が特に資化する乳糖を用いるのが、サルモネラに対する選択性を向上させる上で好ましい。選択剤としては、マラカイトグリーンや塩化マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、胆汁酸塩類等が好ましく、さらに抗生物質としては、プロテウス属に有効なノボビオシンの添加が有効である。ノボビオシン又はそのナトリウム塩は１～５０μｇ／ｍｌの濃度で添加できる。好ましくはノボビオシンの濃度は２０～４０μｇ／ｍｌで、より好ましい濃度は約２５μｇ／ｍｌである。また、他の抗生物質（例えばバンコマイシン、ペニシリン、アンピシリン及びアミカシン）を適切な濃度で培地に添加することもできる。
糖類としては、被検体試料中に混在している可能性が高い大腸菌群が特に資化する乳糖を用いるのが、サルモネラに対する選択性を向上させる上で好ましい。選択剤としては、マラカイトグリーンや塩化マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、胆汁酸塩類等が好ましく、さらに抗生物質としては、プロテウス属に有効なノボビオシンの添加が有効である。ノボビオシン又はそのナトリウム塩は１～５０μｇ／ｍｌの濃度で添加できる。好ましくはノボビオシンの濃度は２０～４０μｇ／ｍｌで、より好ましい濃度は約２５μｇ／ｍｌである。また、他の抗生物質（例えばバンコマイシン、ペニシリン、アンピシリン及びアミカシン）を適切な濃度で培地に添加することもできる。
【0035】
曝露工程は、被験試料にクロスリンク剤を直接添加して行っても良いが、被験試料を遠心分離することで集菌し、これを任意の液体（ＰＢＳなど）に再分散させ、ここにクロスリンク剤を添加して行ってもよい。
またインキュベート工程を行う場合には、培地にクロスリンク剤を直接添加して行っても良いが、遠心分離することで集菌し、これを任意の液体（ＰＢＳなど）に再分散させ、ここにクロスリンク剤を添加して行ってもよい。
またインキュベート工程を行う場合には、培地にクロスリンク剤を直接添加して行っても良いが、遠心分離することで集菌し、これを任意の液体（ＰＢＳなど）に再分散させ、ここにクロスリンク剤を添加して行ってもよい。
【0036】
本発明は曝露工程の後に光照射工程を備える。光照射工程は、曝露工程を経た菌体に光を照射する工程である。
曝露工程を経たサルモネラ属菌の死菌に対して光を照射すると、クロスリンク剤と死菌ＤＮＡが不可逆的に結合する。そのため、後述のＬＡＭＰ法において核酸増幅反応が物理的に阻害される。
一方、生菌ＤＮＡは曝露工程を経てもクロスリンク剤の影響を受けないため、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応が問題無く進行する。
曝露工程を経たサルモネラ属菌の死菌に対して光を照射すると、クロスリンク剤と死菌ＤＮＡが不可逆的に結合する。そのため、後述のＬＡＭＰ法において核酸増幅反応が物理的に阻害される。
一方、生菌ＤＮＡは曝露工程を経てもクロスリンク剤の影響を受けないため、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応が問題無く進行する。
【0037】
光照射工程において照射する光の波長は特に限定されず、クロスリンク剤に特有の励起波長に合わせて適宜選択することができる。好ましくは２００ｎｍ～４８０ｎｍ、より好ましくは２５０～４７０ｎｍの波長の光が好ましく例示できる。
光照射工程において用いる光源は特に限定されず、例えば光源としては、ハロゲンランプや青色ＬＥＤ（波長４７０ｎｍ）や短波長ＵＶランプ（波長２５４ｎｍ）などが例示できる。
光照射工程において用いる光源は特に限定されず、例えば光源としては、ハロゲンランプや青色ＬＥＤ（波長４７０ｎｍ）や短波長ＵＶランプ（波長２５４ｎｍ）などが例示できる。
【0038】
光照射工程における光照射時間は、特に制限されないが、好ましくは５分以上、より７分以上、さらに好ましくは１０分以上である。また、光照射時間は、好ましくは３０分以下、より好ましくは２０分以下、さらに好ましくは１５分以下とすることができる。
【0039】
また、曝露工程における曝露時間（ｘ分）と、光照射工程における光照射時間（ｙ分）は、以下の関係を満たすことが好ましい。
ｙ≧ｘ＋ｂ
ｂ＞０
上記式においてｂは、好ましくは１であり、より好ましくは２であり、さらに好ましくは３であり、さらに好ましくは４であり、さらに好ましくは４．５であり、さらに好ましくは５である。
ｙ≧ｘ＋ｂ
ｂ＞０
上記式においてｂは、好ましくは１であり、より好ましくは２であり、さらに好ましくは３であり、さらに好ましくは４であり、さらに好ましくは４．５であり、さらに好ましくは５である。
【0040】
上記式を満たすように曝露工程における暗所静置時間と、光照射工程における光照射時間を調整することで、検出精度を向上させることができる。
【0041】
本発明は、光照射工程の後に洗浄工程を備える。洗浄工程は、光照射工程を経た菌体を洗浄する工程である。
光照射工程の後に洗浄をせずに菌体をライゼート液調製工程に供すると、生菌ＤＮＡは、曝露工程においては細胞膜の存在によりクロスリンク剤から保護されていたにも関わらず、ライゼート液調製工程において残存するクロスリンク剤に曝露することとなる。そのため、後述の核酸検出工程において、生菌ＤＮＡの核酸増幅も死菌ＤＮＡと同様にクロスリンク剤の影響によって阻害され、偽陰性を示してしまうという問題が生じる。
洗浄工程によって残存したクロスリンク剤を除去し、生菌ＤＮＡとクロスリンク剤の意図しない相互作用を防ぐことで、後述する核酸検出工程において偽陰性の結果が生じる問題を解消することができる。
光照射工程の後に洗浄をせずに菌体をライゼート液調製工程に供すると、生菌ＤＮＡは、曝露工程においては細胞膜の存在によりクロスリンク剤から保護されていたにも関わらず、ライゼート液調製工程において残存するクロスリンク剤に曝露することとなる。そのため、後述の核酸検出工程において、生菌ＤＮＡの核酸増幅も死菌ＤＮＡと同様にクロスリンク剤の影響によって阻害され、偽陰性を示してしまうという問題が生じる。
洗浄工程によって残存したクロスリンク剤を除去し、生菌ＤＮＡとクロスリンク剤の意図しない相互作用を防ぐことで、後述する核酸検出工程において偽陰性の結果が生じる問題を解消することができる。
【0042】
洗浄は、細胞洗浄溶液として使用されているものであればよく、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用することができる。
【0043】
洗浄工程は、遠心分離による集菌と洗浄液への再懸濁を１回ないし２回以上行うことで実施することができる。
【0044】
本発明は、洗浄工程を経た菌体からライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程を備える。
ライゼート液の調製は、本分野で公知の方法やキットを使用して、調製することができる。例えば、上記洗浄工程の後に、上清を除去し、一般的に入手可能なキットに含まれる溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）と混合することで、ライゼート液を調製することができる。
ライゼート液の調製は、本分野で公知の方法やキットを使用して、調製することができる。例えば、上記洗浄工程の後に、上清を除去し、一般的に入手可能なキットに含まれる溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）と混合することで、ライゼート液を調製することができる。
【0045】
抽出効率を向上させる観点から、溶解バッファーに菌体を分散させた後に加熱処理することが好ましい。加熱処理は、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、さらに好ましくは９５℃以上で行うことができる。
また、加熱処理の時間は、特に限定されないが、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上とすることができる。上限も限定されず、好ましくは３０分以下、より好ましくは２０分以下とすることができる。
また、加熱処理の時間は、特に限定されないが、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上とすることができる。上限も限定されず、好ましくは３０分以下、より好ましくは２０分以下とすることができる。
【0046】
本発明は、調製したライゼート液から核酸を抽出する核酸抽出工程を備える。
菌体から核酸を抽出する方法は特に制限されず、一般的に入手可能な核酸抽出キットを使用して、抽出することができる。
菌体から核酸を抽出する方法は特に制限されず、一般的に入手可能な核酸抽出キットを使用して、抽出することができる。
【0047】
本発明において「核酸」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味し、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは修飾されたり、又は修飾された塩基を含むことができる。
オリゴヌクレオチドは、２～６０のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。
ポリヌクレオチドは、２以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。またポリヌクレオチドは、第２鎖が第１オリゴヌクレオチドの逆相補的配列のオリゴヌクレオチドとアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖ＤＮＡ、単一鎖ＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスを含む単一鎖核酸重合体でありうる。
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、切片化された核酸を含むが、これらに限定されるものではない。
オリゴヌクレオチドは、２～６０のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。
ポリヌクレオチドは、２以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。またポリヌクレオチドは、第２鎖が第１オリゴヌクレオチドの逆相補的配列のオリゴヌクレオチドとアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖ＤＮＡ、単一鎖ＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスを含む単一鎖核酸重合体でありうる。
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、切片化された核酸を含むが、これらに限定されるものではない。
【0048】
最後に、サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程を行う。
後述するように、ＬＡＭＰ法及びＡＴＰ法は、その他の核酸増幅方法及び核酸検出方法と比較して、簡便な装置又は方法でサルモネラ属菌の核酸を増幅し、検出することができる。
したがって本発明によれば、被験試料中のサルモネラ属菌を簡便に検出することができる。
後述するように、ＬＡＭＰ法及びＡＴＰ法は、その他の核酸増幅方法及び核酸検出方法と比較して、簡便な装置又は方法でサルモネラ属菌の核酸を増幅し、検出することができる。
したがって本発明によれば、被験試料中のサルモネラ属菌を簡便に検出することができる。
【0049】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、標的遺伝子の６か所の領域に対して４種類のプライマーを設計し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることを特徴とする、核酸増幅方法である。
核酸増幅方法として、ＬＡＭＰ法を採用することで、ＰＣＲのように特別な機器を使用しなくとも、一定時間等温状態を維持することができれば、上記核酸抽出工程で抽出した核酸を増幅することができる。
なおＬＡＭＰ法は、国際公開２００１－３４７９０号公報に記載の方法で行うことができる。また、一般的に入手可能な、ＬＡＭＰ法を実行するためのキットを使用することでも、実行することができる。
核酸増幅方法として、ＬＡＭＰ法を採用することで、ＰＣＲのように特別な機器を使用しなくとも、一定時間等温状態を維持することができれば、上記核酸抽出工程で抽出した核酸を増幅することができる。
なおＬＡＭＰ法は、国際公開２００１－３４７９０号公報に記載の方法で行うことができる。また、一般的に入手可能な、ＬＡＭＰ法を実行するためのキットを使用することでも、実行することができる。
【0050】
ＡＴＰ検出法は、遺伝子増幅された際に出現するピロリン酸塩及び３′ホスフォアデノシン５′ホスフォ硫酸をＡＴＰスルフリラーゼでの付加反応によりＡＴＰを産生させ，これをルシフェラーゼにより発光検出することにより，特定遺伝子の検出を行う方法である。
ＡＴＰ検出法は発光検出のため、励起光源が不要となる。またＡＴＰ検出法による検出は、蛍光検出よりも高感度で核酸を検出することができる。
ＡＴＰ検出法は、一般的に入手可能な試薬を用いることで、実行することができる。
ＡＴＰ検出法は発光検出のため、励起光源が不要となる。またＡＴＰ検出法による検出は、蛍光検出よりも高感度で核酸を検出することができる。
ＡＴＰ検出法は、一般的に入手可能な試薬を用いることで、実行することができる。
【0051】
本発明においては、ＬＡＭＰ法による核酸増幅と、ＡＴＰ検出法による核酸検出とを、同一の機器を用いて実行することができる。
例えば、スリーエムヘルスケア株式会社より発売されている３ＭＴＭ病原菌自動検出システム（以下、ＭＤＳともいう）を用いることで、ＬＡＭＰ法による核酸増幅の後、引き続いてＡＴＰ検出法による核酸検出を行うことができる。
例えば、スリーエムヘルスケア株式会社より発売されている３ＭＴＭ病原菌自動検出システム（以下、ＭＤＳともいう）を用いることで、ＬＡＭＰ法による核酸増幅の後、引き続いてＡＴＰ検出法による核酸検出を行うことができる。
【0052】
ＬＡＭＰ法で用いるプライマーセットは、サルモネラ属菌の核酸配列に基づいて、適宜設計することができる。サルモネラ属菌の例示的な核酸配列は、例えば下記文献に記載されている。
ＬｉｕＷＱ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｃ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９；４（２）：ｅ４５１０；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＮＲ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＰＴ４ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ２８７／９１ ｐｒｏｖｉｄｅｓｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｈｏｓｔ ａｄａｐａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ，“Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８ Ｏｃｔ；１８（１０）：１６２４－３７；ＥｎｃｈｅｖａＶ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ Ｐｕｌｌｏｒｕｍ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓＩ”，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５ Ｊｕｌ １８；５：４２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ａｎｄ Ｔｙｐｈｉ，ｈｕｍａｎ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｔｙｐｈｏｉｄ”，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００４ Ｄｅｃ；３６（１２）：１２６８－７４；Ｃｈｉｕ ＣＨ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，“Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２００４ Ａｐｒ；１７（２）：３１１－２２；Ｄｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ｓｔｒａｉｎｓ Ｔｙ２ ａｎｄ ＣＴ１８，”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３ Ａｐｒ；１８５（７）：２３３０－７；Ｐａｒｋｈｉｌ ｌＪ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ Ｃ Ｔ１８”，Ｎａｔｕｒｅ，２００ １Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８４８－５２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２，“Ｎａｔｕｒｅ，２００１ Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８５２－６．
ＬｉｕＷＱ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｃ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９；４（２）：ｅ４５１０；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＮＲ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＰＴ４ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ２８７／９１ ｐｒｏｖｉｄｅｓｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｈｏｓｔ ａｄａｐａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ，“Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８ Ｏｃｔ；１８（１０）：１６２４－３７；ＥｎｃｈｅｖａＶ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ Ｐｕｌｌｏｒｕｍ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓＩ”，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５ Ｊｕｌ １８；５：４２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ａｎｄ Ｔｙｐｈｉ，ｈｕｍａｎ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｔｙｐｈｏｉｄ”，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００４ Ｄｅｃ；３６（１２）：１２６８－７４；Ｃｈｉｕ ＣＨ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，“Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２００４ Ａｐｒ；１７（２）：３１１－２２；Ｄｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ｓｔｒａｉｎｓ Ｔｙ２ ａｎｄ ＣＴ１８，”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３ Ａｐｒ；１８５（７）：２３３０－７；Ｐａｒｋｈｉｌ ｌＪ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ Ｃ Ｔ１８”，Ｎａｔｕｒｅ，２００ １Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８４８－５２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２，“Ｎａｔｕｒｅ，２００１ Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８５２－６．
【0053】
またプライマーセットは、本分野において公知の方法及び機器によって、合成することができる。
【0054】
また本発明は、飼料の製造方法にも関する。
すなわち、本発明は、上記したサルモネラ属菌の生菌の検出方法により、サルモネラ属菌の有無を試験する工程を含む、飼料の製造方法である。
本発明の飼料の製造方法は、被験試料に対して、上記したサルモネラ属菌の検出方法によるサルモネラ属菌の有無を試験し、当該被験試料についてサルモネラ属菌の生菌陰性であるという試験結果が得られた場合に、当該被験試料を飼料とし、又は当該被験試料を用いて飼料を作製する。
本発明によれば、サルモネラ属菌の生菌陰性が精度よく判定された飼料を提供することができる。
なお本発明の飼料の製造方法は、上記サルモネラ属菌の有無を試験する工程以外の工程を含んでいてもよい。
すなわち、本発明は、上記したサルモネラ属菌の生菌の検出方法により、サルモネラ属菌の有無を試験する工程を含む、飼料の製造方法である。
本発明の飼料の製造方法は、被験試料に対して、上記したサルモネラ属菌の検出方法によるサルモネラ属菌の有無を試験し、当該被験試料についてサルモネラ属菌の生菌陰性であるという試験結果が得られた場合に、当該被験試料を飼料とし、又は当該被験試料を用いて飼料を作製する。
本発明によれば、サルモネラ属菌の生菌陰性が精度よく判定された飼料を提供することができる。
なお本発明の飼料の製造方法は、上記サルモネラ属菌の有無を試験する工程以外の工程を含んでいてもよい。
【実施例0055】
以下、実施例を参照して具体的に本発明を説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されない。
【0056】
＜試験例１＞ 洗浄工程の要否の検討
本試験例では、光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程の要否について検討した。
本試験例では、光照射工程を経た菌体を洗浄する洗浄工程の要否について検討した。
【0057】
＜試験方法＞
（１）３５℃で一晩培養したサルモネラ属菌の生菌を含む培養液４００μＬに対し、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤であるＰＭＡＴＭ又はＰＭＡｘｘＴＭを、最終濃度５０μＭとなるようにそれぞれの試料に添加し、暗所室温で１０分間静置した（曝露工程）。コントロールとして、上記クロスリンク剤を添加しない試料も同様に準備し、暗所室温で１０分間静置した。
（２）青色ＬＥＤ（４７０ｎｍ）を上記（１）で暗所静置した菌体に対して１５分間照射した（光照射工程）。
（３―１）洗浄工程を行う試料の場合、上記（２）で青色ＬＥＤを照射した後、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、得られた沈殿物にＰＢＳを１ｍＬ添加して懸濁した（洗浄工程）。その後、再度１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。
（３－２）洗浄工程を行わない試料の場合、上記（２）で青色ＬＥＤを照射した後、１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。
（４）上記（３－１）及び（３－２）で得られた沈殿物全量に、ＭＤＳのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し（ライゼート液調製工程）、得られたライゼート液を１００℃で１５分間加熱した（加熱処理）後、ＭＤＳの製造元提供のプロトコルに従って核酸を抽出し、検出した（核酸抽出工程、核酸検出工程）。プライマーは市販のプライマーセットを用いた。
（１）３５℃で一晩培養したサルモネラ属菌の生菌を含む培養液４００μＬに対し、細胞膜非透過性の光反応性クロスリンク剤であるＰＭＡＴＭ又はＰＭＡｘｘＴＭを、最終濃度５０μＭとなるようにそれぞれの試料に添加し、暗所室温で１０分間静置した（曝露工程）。コントロールとして、上記クロスリンク剤を添加しない試料も同様に準備し、暗所室温で１０分間静置した。
（２）青色ＬＥＤ（４７０ｎｍ）を上記（１）で暗所静置した菌体に対して１５分間照射した（光照射工程）。
（３―１）洗浄工程を行う試料の場合、上記（２）で青色ＬＥＤを照射した後、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、得られた沈殿物にＰＢＳを１ｍＬ添加して懸濁した（洗浄工程）。その後、再度１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。
（３－２）洗浄工程を行わない試料の場合、上記（２）で青色ＬＥＤを照射した後、１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。
（４）上記（３－１）及び（３－２）で得られた沈殿物全量に、ＭＤＳのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し（ライゼート液調製工程）、得られたライゼート液を１００℃で１５分間加熱した（加熱処理）後、ＭＤＳの製造元提供のプロトコルに従って核酸を抽出し、検出した（核酸抽出工程、核酸検出工程）。プライマーは市販のプライマーセットを用いた。
【0058】
検出結果を下記表１に示す。
表１中、（＋）はサルモネラ属菌が検出されたことを表し、（－）はサルモネラ属菌が検出されなかったことを表す。以下、表２及び表３でも同様である。
表１中、（＋）はサルモネラ属菌が検出されたことを表し、（－）はサルモネラ属菌が検出されなかったことを表す。以下、表２及び表３でも同様である。
【0059】
【表1】
【0060】
表１に記載された通り、洗浄工程無しの試料は、検出結果が（－）、すなわち、サルモネラ属菌の生菌が存在するにもかかわらず、これを検出することができなかった。これは、生菌ＤＮＡが、ライゼート液調製工程において残存していたＰＭＡＴＭ又はＰＭＡｘｘＴＭに曝露した影響により、ＭＤＳによる生菌ＤＮＡの核酸増幅が阻害されたためであると考えられる。
一方、洗浄工程有りの試料は、検出結果が（＋）、すなわち、サルモネラ属菌の生菌を検出することができていた。これは、ライゼート液調製工程においてＰＭＡＴＭ又はＰＭＡｘｘＴＭが除去されていたため、生菌ＤＮＡのクロスリンク剤との意図しない相互作用が防がれたためであると考えられる。
以上より、本発明は洗浄工程を含むことで、サルモネラ属菌の生菌を精度よく検出することができることが明らかになった。
一方、洗浄工程有りの試料は、検出結果が（＋）、すなわち、サルモネラ属菌の生菌を検出することができていた。これは、ライゼート液調製工程においてＰＭＡＴＭ又はＰＭＡｘｘＴＭが除去されていたため、生菌ＤＮＡのクロスリンク剤との意図しない相互作用が防がれたためであると考えられる。
以上より、本発明は洗浄工程を含むことで、サルモネラ属菌の生菌を精度よく検出することができることが明らかになった。
【0061】
＜試験例２＞ 曝露時間及び光照射時間の検討
本試験例では、曝露時間及び光照射時間を検討した。
本試験例では、曝露時間及び光照射時間を検討した。
【0062】
＜死菌の調製＞
サルモネラ属菌を、ハートインフュージョンブロス（ＨＩＢ：ベクトンデッキンソン社製）４ｍＬに１白金耳量植菌し、３５℃で一晩培養した。その後、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、死菌を調製した。
サルモネラ属菌を、ハートインフュージョンブロス（ＨＩＢ：ベクトンデッキンソン社製）４ｍＬに１白金耳量植菌し、３５℃で一晩培養した。その後、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、死菌を調製した。
【0063】
＜試験方法＞
被験試料として、上記試験例１と同様にして得た生菌入りの被験試料１（４００μＬ）と、上記＜死菌の調製＞で得た死菌を被験試料１と同じ培地に分散させた被験試料２（４００μＬ）を用いて、試験例１と同様の試験を行った。
クロスリンク剤としてはＰＭＡｘｘＴＭを用い、曝露時間及び光照射時間を下記表２に記載された通りにした。
結果を下記表２に示す。
被験試料として、上記試験例１と同様にして得た生菌入りの被験試料１（４００μＬ）と、上記＜死菌の調製＞で得た死菌を被験試料１と同じ培地に分散させた被験試料２（４００μＬ）を用いて、試験例１と同様の試験を行った。
クロスリンク剤としてはＰＭＡｘｘＴＭを用い、曝露時間及び光照射時間を下記表２に記載された通りにした。
結果を下記表２に示す。
【0064】
【表2】
【0065】
表２の結果より、クロスリンク剤への曝露時間は３分以上、また、光照射時間は５分以上で、死菌における核酸増幅を防止し、生菌を特異的に検出できるものといえる。
【0066】
なお、実施例１～３の曝露時間（ｘ分）と光照射時間（ｙ分）とは、以下の関係を満たす。
ｙ≧ｘ＋ｂ
ｂ＞０
ｙ≧ｘ＋ｂ
ｂ＞０
【0067】
＜試験例３＞ 油粕検体におけるサルモネラ属菌の生菌を選択的に検出する方法の検討
本試験例では、被験試料として油粕を用いた場合に、サルモネラ属菌の生菌を選択的に検出する方法を検討した。
本試験例では、被験試料として油粕を用いた場合に、サルモネラ属菌の生菌を選択的に検出する方法を検討した。
【0068】
（１）下記表３に示す油粕２５ｇにそれぞれに対し、死菌を分散させた液体培地２５０ｇ又は、生菌と死菌を含む培養液２５０ｇをそれぞれ添加し、４２℃で一晩培養した（インキュベート工程）。
（２）上記（１）で得た培養液５００μＬを３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上清４００μＬを得た。
（３）上記（２）で得た上清４００μＬをさらに１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、沈殿物を得た。
（４）上記（３）で得られた沈殿物にＰＢＳを１ｍＬ添加し、ＰＭＡｘｘＹＭを最終濃度１００μＭとなるよう添加し、暗所室温で１０分間静置した（曝露工程）。
（５）上記（４）の後、青色ＬＥＤ（４７０ｎｍ）を１５分間照射した（光照射工程）。
（６）上記（５）で得た試料を、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、沈殿物を得た。
（７）上記（６）で得た沈殿物にＰＢＳを１ｍＬ添加し、再度１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した（洗浄工程）。
（８）得られた沈殿物全量をＭＤＳのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに添加し、ライゼート液を１００℃で１５分間加熱した後、ＭＤＳにて分析を実施した（ライゼート液調製工程、核酸抽出工程、核酸検出工程）。
なお、死菌では増殖しないことを確認するため、食品衛生検査指針準拠の公定法も実施した。
また、コントロールとして、曝露工程及び光照射工程を経ない試料も調製した。
結果を表３に示す。なお表３中、ＬＰは低たんぱく大豆粕を、ＨＰは高たんぱく大豆粕をそれぞれ表す。
（２）上記（１）で得た培養液５００μＬを３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上清４００μＬを得た。
（３）上記（２）で得た上清４００μＬをさらに１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、沈殿物を得た。
（４）上記（３）で得られた沈殿物にＰＢＳを１ｍＬ添加し、ＰＭＡｘｘＹＭを最終濃度１００μＭとなるよう添加し、暗所室温で１０分間静置した（曝露工程）。
（５）上記（４）の後、青色ＬＥＤ（４７０ｎｍ）を１５分間照射した（光照射工程）。
（６）上記（５）で得た試料を、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、沈殿物を得た。
（７）上記（６）で得た沈殿物にＰＢＳを１ｍＬ添加し、再度１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した（洗浄工程）。
（８）得られた沈殿物全量をＭＤＳのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに添加し、ライゼート液を１００℃で１５分間加熱した後、ＭＤＳにて分析を実施した（ライゼート液調製工程、核酸抽出工程、核酸検出工程）。
なお、死菌では増殖しないことを確認するため、食品衛生検査指針準拠の公定法も実施した。
また、コントロールとして、曝露工程及び光照射工程を経ない試料も調製した。
結果を表３に示す。なお表３中、ＬＰは低たんぱく大豆粕を、ＨＰは高たんぱく大豆粕をそれぞれ表す。
【0069】
【表3】
【0070】
表３に示す通り、曝露工程及び光照射工程を有しない方法で検出を試みた場合、死菌のみを含むにもかかわらず、サルモネラ属菌が陽性であるとの検出結果が得られた。
これに対し本発明の検出方法（曝露工程・光照射工程あり）は、死菌のみを含む場合にはサルモネラ属菌を検出せず、死菌と生菌を含む場合には、サルモネラ属菌を検出していた。これらの結果をあわせると、本発明の検出方法は、生菌のみを選択的に検出できることが明らかになった。
また、ＭＤＳ法（ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ法で核酸検出する方法）を用いたことにより、迅速にサルモネラ属菌を検出することができた。
さらにまた、本発明と公知の飼料の製造方法とを組み合わせた飼料の製造方法は、サルモネラ属菌の存否が精度よく判定された飼料を作成することができることが示唆された。
これに対し本発明の検出方法（曝露工程・光照射工程あり）は、死菌のみを含む場合にはサルモネラ属菌を検出せず、死菌と生菌を含む場合には、サルモネラ属菌を検出していた。これらの結果をあわせると、本発明の検出方法は、生菌のみを選択的に検出できることが明らかになった。
また、ＭＤＳ法（ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ法で核酸検出する方法）を用いたことにより、迅速にサルモネラ属菌を検出することができた。
さらにまた、本発明と公知の飼料の製造方法とを組み合わせた飼料の製造方法は、サルモネラ属菌の存否が精度よく判定された飼料を作成することができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0071】
本発明によれば、被験試料中にサルモネラ属菌の生菌が存在するか否か、迅速に精度よく検出することができる。また、サルモネラ属菌の存否が精度よく判定された飼料の作成方法を提供することができる。