特開2023-171086化合物、ポリヌクレオチド、リンカー、及び架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023171086
(43)【公開日】2023-12-01
(54)【発明の名称】化合物、ポリヌクレオチド、リンカー、及び架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 19/04 20060101AFI20231124BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231124BHJP
C07K 1/107 20060101ALI20231124BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20231124BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20231124BHJP
【ＦＩ】
C07H19/04
C12N15/11 Z ZNA
C07K1/107
C07H21/04
C07H21/02
C07H21/04 A
C07H21/04 B
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022083316
(22)【出願日】2022-05-20
(71)【出願人】
【識別番号】000003182
【氏名又は名称】株式会社トクヤマ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】三宅 由花
(72)【発明者】
【氏名】菊池 重俊
(72)【発明者】
【氏名】安齋 宏紀
【テーマコード（参考）】
4C057
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C057AA17
4C057AA18
4C057AA20
4C057CC03
4C057DD03
4C057LL03
4C057LL19
4C057MM02
4C057MM04
4C057MM09
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA54
(57)【要約】 （修正有）
【課題】光応答性塩基を有する新規の化合物、及びその関連技術を提供する。
【解決手段】本発明の一態様に係る化合物は、下記式（１）で示される。
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基である。）
【選択図】なし
【解決手段】本発明の一態様に係る化合物は、下記式（１）で示される。
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基である。）
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）
（式（１）中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基であり、
ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子であり、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合しており、
Ｒ５は、メチル基、トリチル基、２－トリメチルシリルエチル基、メトキシフェニルジフェニルメチル基、又はジメトキシトリチル基であり、
ｎは、１以上４以下の整数である）
で示される、化合物。
【化1】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基であり、
ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子であり、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合しており、
Ｒ５は、メチル基、トリチル基、２－トリメチルシリルエチル基、メトキシフェニルジフェニルメチル基、又はジメトキシトリチル基であり、
ｎは、１以上４以下の整数である）
で示される、化合物。
【請求項2】
Ｒ１は、シアノ基であり、
Ｒ２及びＲ３は、水素原子であり、
ｎは、１であり、
Ｒ４は、塩素原子、臭素原子又はメチル基であり、カルバゾール構造の６位に結合している、
請求項１に記載の化合物。
Ｒ２及びＲ３は、水素原子であり、
ｎは、１であり、
Ｒ４は、塩素原子、臭素原子又はメチル基であり、カルバゾール構造の６位に結合している、
請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
下記式（２）
（式（２）中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基であり、
ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子であり、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合しており、
Ｘ及びＹにおいて、それぞれ他のヌクレオチドと結合しており、
ｎは、１以上４以下の整数である）
で示される構造を含む、ポリヌクレオチド。
【化2】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基であり、
ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子であり、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合しており、
Ｘ及びＹにおいて、それぞれ他のヌクレオチドと結合しており、
ｎは、１以上４以下の整数である）
で示される構造を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項4】
ＲＮＡを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
タンパク質又はペプチドと、他のポリヌクレオチドとを結合するためのリンカーであって、
請求項３に記載のポリヌクレオチドを備える、リンカー。
請求項３に記載のポリヌクレオチドを備える、リンカー。
【請求項6】
請求項１若しくは２に記載の化合物、又は請求項３に記載のポリヌクレオチドを用いて、ポリヌクレオチドの一本鎖領域同士を架橋させる、架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化合物、ポリヌクレオチド、リンカー、及びポリヌクレオチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
新規機能性ポリペプチドの探索等の分子生物学の分野において、核酸構築物の安定化及び遺伝子発現の阻害等のために、ポリヌクレオチド同士の架橋技術が用いられることがある。中でも、光照射によって架橋反応を生じる光架橋技術は、反応条件に関する制限が少ないこと、及び反応系に含まれる成分の損傷が小さいことから、有用な技術として用いられている。
【0003】
このようなポリヌクレオチドの光架橋技術として、例えば特許文献１には、光架橋可能な光反応性架橋剤として、３位において、置換していてもよいビニル基により置換された、カルバゾリル基と糖類基、多糖類基等とが、カルバゾリル基の１位において結合してなる化合物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１２－１２１８９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
新規機能性ポリペプチドの探索等の分子生物学の分野において利用可能な、光応答性塩基を有する化合物への需要は高く、光応答性塩基を有する新規の化合物が求められている。
【0006】
本発明の一態様は、上述した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、光応答性塩基を有する新規の化合物、及びその関連技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者等は、特定の式で示される新規化合物は、その構造中に有する塩基が光応答性であることを見出し、本発明を完成させた。
【0008】
すなわち、本発明の態様（１）に係る化合物は、下記式（１）（式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基であり、ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子であり、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合しており、Ｒ５は、メチル基、トリチル基、２－トリメチルシリルエチル基、メトキシフェニルジフェニルメチル基、又はジメトキシトリチル基であり、ｎは、１以上４以下の整数である）で示される。
【0009】
【化1】
【0010】
本発明の態様（２）に係る化合物は、態様（１）において、Ｒ１は、シアノ基であり、Ｒ２及びＲ３は、水素原子であり、ｎは、１であり、Ｒ４は、塩素原子、臭素原子又はメチル基であり、カルバゾール構造の６位に結合している。
【0011】
本発明の態様（３）に係るポリヌクレオチドは、下記式（２）（式（２）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、シアノ基、アミド基、又はカルボキシル基であり、ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子であり、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合しており、Ｘ及びＹにおいて、それぞれ他のヌクレオチドと結合しており、ｎは、１以上４以下の整数である）で示される構造を含む。
【0012】
【化2】
【0013】
本発明の態様（４）に係るポリヌクレオチドは、態様（３）において、ＲＮＡを含む。
【0014】
本発明の態様（５）に係るリンカーは、タンパク質又はペプチドと、他のポリヌクレオチドとを結合するためのリンカーであって、態様（３）又は（４）に係るポリヌクレオチドを備える。
【0015】
本発明の態様（６）に係る架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法は、態様（１）若しくは態様（２）に係る化合物、態様（３）若しくは態様（４）に係るポリヌクレオチド、又は態様（５）に係るリンカーを用いて、ポリヌクレオチドの一本鎖領域同士を架橋させる。
【発明の効果】
【0016】
本発明の一態様によれば、光応答性塩基を有する新規の化合物、及びその関連技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明の実施例、比較例又は参考例のポリヌクレオチドと、モデルｍＲＮＡとしてＢＤＡをコードするｍＲＮＡとを含む混合溶液の、光架橋反応後（ＲＯ）及び光開裂反応（ＣＬ）後のゲル電気泳動写真である。
【図2】本発明の実施例、比較例又は参考例のポリヌクレオチドと、モデルｍＲＮＡとしてＣ１４ライブラリとを含む混合溶液の、光架橋反応後（ＲＯ）及び光開裂反応後（ＣＬ）のゲル電気泳動写真である。
【図5】同一サンプルにおける、１０分間の光開裂反応後の開裂構造を示すバンド強度に対する、光架橋反応後の架橋構造を示すバンド強度の比率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
〔定義〕
本発明の一態様について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書において「Ａ～Ｂ」とは、特に指定しない限りＡ以上Ｂ以下であることを示している。
本発明の一態様について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書において「Ａ～Ｂ」とは、特に指定しない限りＡ以上Ｂ以下であることを示している。
【0019】
本明細書において、「光開裂反応速度が低い」とは、架橋構造にある化合物に対して光開裂反応を意図して光照射したときに、架橋構造が維持される割合が、比較対象と比べて高いことを意味する。また、「光開裂反応速度が低い」とは、同様に光照射したときに、架橋構造が維持される割合の、比較対象との差が２０％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下であることを意味する。
【0020】
〔化合物〕
本発明の一態様に係る化合物は、下記式（１）で示される。
本発明の一態様に係る化合物は、下記式（１）で示される。
【0021】
【化3】
【0022】
式（１）中、カルバゾール構造の３位に結合しているアルケン系官能基－Ｃ（Ｒ３）＝Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）は、光照射により、特定の官能基との光架橋反応を生じる官能基である。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の種類は、光架橋反応速度に寄与し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３それぞれが上述した好ましい官能基であることによって、光架橋反応速度を向上させることができる。
【0023】
式（１）中、ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子である。
【0024】
炭素数１～６のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、及びヘキシル基が挙げられる。炭素数１～６のアルキル基が有してもよい置換基の例としては、炭素数１～３のアルキル基、及びハロゲン原子が挙げられる。また、ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。製造の容易性及び価格低減の観点から、ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、塩素原子、臭素原子、メチル基又はエチル基であることが好ましく、塩素原子、臭素原子又はメチル基であることがより好ましく、塩素原子又はメチル基であることがさらに好ましく、塩素原子であることがよりさらに好ましい。
【0025】
式（１）中、ｎは、１以上４以下の整数である。ｎは、１以上２以下の整数であることが好ましく、１であることがより好ましい。
【0026】
式（１）中、ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、カルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に結合している。架橋反応の効率及び製造の容易性の観点から、ｎ個のＲ４のうち１個は、カルバゾール構造の６位に結合していることが好ましい。
【0027】
式（１）中、ｎ個のＲ４はそれぞれ独立して、光架橋反応速度及び光開裂反応速度を変化させる官能基である。ｎ個のＲ４それぞれが上述した好ましい官能基であることによって、光架橋反応速度を向上させるか又は維持しつつ、光開裂反応速度をより低下させるか又は同程度に維持することができる。
【0028】
特許文献１に記載の化合物は、同一の波長の光照射によって、光架橋反応及び光開裂反応の両方を生じるという性質を有している。本発明者等は、研究の中で、この性質によって、光架橋反応を意図した実験操作においても化合物が光開裂反応を生じ、したがって架橋構造が不安定化される、という問題点を見出した。本発明の一態様に係る化合物は、ｎ個のＲ４それぞれが上述した構成を有するとき、中でもＲ４が塩素原子又はメチル基であるとき（好ましくはｎ＝１であり、６位に結合しているとき）に、光架橋反応速度を向上させるか又は維持しつつ、光開裂反応速度をより低下させるか又は同程度に維持することができる。したがって、本発明の一態様に係る化合物は、架橋構造が安定化されており、新規機能性ポリペプチドの探索等の分子生物学の分野において好適に利用することができる。
【0029】
式（１）中、Ｒ５は、メチル基、トリチル基、２－トリメチルシリルエチル基、メトキシフェニルジフェニルメチル基、又はジメトキシトリチル基である。Ｒ５は、トリチル基、メトキシフェニルジフェニルメチル基、又はジメトキシトリチル基であることが好ましく、ジメトキシトリチル基であることがより好ましい。
【0030】
式（１）中、Ｒ５は、式（１）で示される化合物を原料として用いる合成反応において、保護基として機能する官能基である。Ｒ５が上述した好ましい官能基であることによって、保護基としてより効果的に機能させることができる。
【0031】
式（１）中、カルバゾール構造は、ヌクレオチド類化合物の塩基部分との間に相補性を有する構造である。カルバゾール構造が相補性によって塩基部分とハイブリダイズすることによって、カルバゾール構造と塩基部分との位置関係が安定化されるため、カルバゾール構造の３位に結合しているアルケン系官能基－Ｃ（Ｒ３）＝Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）がより効果的に光架橋反応を生じることができる。換言すれば、式（１）中、カルバゾール構造及び３位に結合しているアルケン系官能基は、光応答性塩基である。
【0032】
式（１）中、ホスホロアミダイト構造は、式（１）で示される化合物を原料として用いる合成反応において、求核性を示し、カップリング反応を生じる構造である。したがって、式（１）で示される化合物は、ホスホロアミダイト法等のポリヌクレオチド合成法において好適に用いることができる。
【0033】
〔化合物の製造方法〕
式（１）で示される化合物は、例えば、本発明の一態様に係る化合物の製造方法によって、製造され得る。本発明の一態様に係る化合物の製造方法は、原料化合物が有するカルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に対して、ｎ個のＲ４を導入する第１の反応工程を含み得る。また、本発明の一態様に係る化合物の製造方法は、後述する第２の反応工程、第３の反応工程、第４の反応工程、及び第５の反応工程をさらに含み得る。
式（１）で示される化合物は、例えば、本発明の一態様に係る化合物の製造方法によって、製造され得る。本発明の一態様に係る化合物の製造方法は、原料化合物が有するカルバゾール構造の５位、６位、７位又は８位に対して、ｎ個のＲ４を導入する第１の反応工程を含み得る。また、本発明の一態様に係る化合物の製造方法は、後述する第２の反応工程、第３の反応工程、第４の反応工程、及び第５の反応工程をさらに含み得る。
【0034】
以下、説明の簡単のため、式（１）中、Ｒ１がシアノ基であり、Ｒ２及びＲ３が水素原子であり、ｎが１であり、Ｒ４が塩素原子、臭素原子又はメチル基であり、カルバゾール構造の６位に結合しており、Ｒ５がジメトキシトリチル基である化合物（以下、「化合物６」という。）の製造方法について説明する。しかしながら、本発明の一態様に係る化合物の製造方法は、以下で説明する形態に限定されるものではなく、式（１）で示される化合物について所望される具体的な構造に応じて、当業者が種々の変更を行うことができる。なお、種々の変更の例は、Org. Lett. 2015, 17, 1874-1877; Tetrahedron Lett. 2012, 53, 4012-4014; Org. Lett. 2008, 10, 3227-3230に記載されている。
【0035】
本実施形態において、化合物６の製造方法は、下記スキームで示されるように、第１の反応工程（Ｒｅａｃｔｉｏｎ １）、第２の反応工程（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ２）、第３の反応工程（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ３）、第４の反応工程（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ４）、及び第５の反応工程（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ５）を含む。化合物６の製造方法は、原料化合物として化合物１を用い、最終生成物として化合物６を得る。
【0036】
【化4】
【0037】
〔第１の反応工程〕
第１の反応工程は、化合物１のカルバゾール構造の６位に対して、Ｒ４を導入し、中間体化合物２を得る工程である。第１の反応工程において、ＮＸＳはＲ４の供給源である。例えば、Ｒ４が塩素原子であるならば、ＮＸＳはＮＣＳ（Ｎ－クロロスクシンイミド）である。Ｒ４が臭素原子であるならば、ＮＸＳはＮＢＳ（Ｎ－ブロモスクシンイミド）である。Ｒ４が炭素数１～６のアルキル基であるならば、ＮＸＳは、ＮＩＳ（Ｎ－ヨードスクシンイミド）と、炭素数１～６のアルキルカルボン酸との組み合わせである。例えば、Ｒ４がメチル基であるならば、ＮＸＳは、ＮＩＳ（Ｎ－ヨードスクシンイミド）と酢酸との組み合わせである。
第１の反応工程は、化合物１のカルバゾール構造の６位に対して、Ｒ４を導入し、中間体化合物２を得る工程である。第１の反応工程において、ＮＸＳはＲ４の供給源である。例えば、Ｒ４が塩素原子であるならば、ＮＸＳはＮＣＳ（Ｎ－クロロスクシンイミド）である。Ｒ４が臭素原子であるならば、ＮＸＳはＮＢＳ（Ｎ－ブロモスクシンイミド）である。Ｒ４が炭素数１～６のアルキル基であるならば、ＮＸＳは、ＮＩＳ（Ｎ－ヨードスクシンイミド）と、炭素数１～６のアルキルカルボン酸との組み合わせである。例えば、Ｒ４がメチル基であるならば、ＮＸＳは、ＮＩＳ（Ｎ－ヨードスクシンイミド）と酢酸との組み合わせである。
【0038】
第１の反応工程において、ＮＸＳの量は、化合物１に対して１当量～２当量であってもよい。第１の反応工程において、溶媒を使用してもよいし、使用しなくてもよい。第１の反応工程で使用され得る溶媒の例としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等が挙げられる。溶媒は、ＤＭＦであることが好ましい。
【0039】
〔第２の反応工程〕
第２の反応工程は、中間体化合物２のカルバゾール構造の３位に結合しているヨウ素原子をビニルシアノ基で置換し、中間体化合物３を得る工程である。本実施形態において、ビニルシアノ基の供給源として、中間体化合物２に対して３．０当量のアクリロニトリルが用いられ、反応溶媒としてＤＭＦと水との混合溶媒が用いられる。また、酸成分として、中間体化合物２に対して１．０当量～３．０当量のトリプロピルアミン（ＴＰＡ）が用いられる。
第２の反応工程は、中間体化合物２のカルバゾール構造の３位に結合しているヨウ素原子をビニルシアノ基で置換し、中間体化合物３を得る工程である。本実施形態において、ビニルシアノ基の供給源として、中間体化合物２に対して３．０当量のアクリロニトリルが用いられ、反応溶媒としてＤＭＦと水との混合溶媒が用いられる。また、酸成分として、中間体化合物２に対して１．０当量～３．０当量のトリプロピルアミン（ＴＰＡ）が用いられる。
【0040】
第２の反応工程において、反応系にマイクロウェーブ（ＭＷ）を照射することが好ましい。反応系にＭＷを照射することによって、カルバゾール構造の３位に導入されるビニルシアノ基の幾何異性選択性（Ｅ／Ｚ値）を向上させ、したがって収率を向上させることができる。
【0041】
〔第３の反応工程〕
第３の反応工程は、中間体化合物３のカルバゾール構造の９位に対してデオキシリボフラノース構造を導入し、中間体化合物４を得る工程である。第３の反応工程において、デオキシリボフラノース構造の供給源として、下記式で示されるＨｏｆｆｅｒ’ｓ ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒが用いられる。
第３の反応工程は、中間体化合物３のカルバゾール構造の９位に対してデオキシリボフラノース構造を導入し、中間体化合物４を得る工程である。第３の反応工程において、デオキシリボフラノース構造の供給源として、下記式で示されるＨｏｆｆｅｒ’ｓ ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒが用いられる。
【0042】
【化5】
【0043】
〔第４の反応工程〕
第４の反応工程は、中間体化合物４のデオキシリボフラノース構造の５位に対して、４，４－ジメトキシトリチル基を導入し、中間体化合物５を得る工程である。本実施形態において、４，４－ジメトキシトリチル基の供給源として、４，４－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）が用いられる。溶媒としては、ジクロロメタン（ＤＣＭ）が用いられる。
第４の反応工程は、中間体化合物４のデオキシリボフラノース構造の５位に対して、４，４－ジメトキシトリチル基を導入し、中間体化合物５を得る工程である。本実施形態において、４，４－ジメトキシトリチル基の供給源として、４，４－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）が用いられる。溶媒としては、ジクロロメタン（ＤＣＭ）が用いられる。
【0044】
第４の反応工程において、脱ハロゲン化剤としてジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）が用いられる。なお、脱ハロゲン化剤としては、ＤＢＵの代わりにジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）を用いてもよい。
【0045】
〔第５の反応工程〕
第５の反応工程は、中間体化合物５のデオキシリボフラノース構造の３位に対して、ホスホロアミダイト構造を導入し、最終生成物として化合物６を得る工程である。本実施形態において、ホスホロアミダイト構造の供給源として、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトが用いられる。
第５の反応工程は、中間体化合物５のデオキシリボフラノース構造の３位に対して、ホスホロアミダイト構造を導入し、最終生成物として化合物６を得る工程である。本実施形態において、ホスホロアミダイト構造の供給源として、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトが用いられる。
【0046】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明の一態様は、ポリヌクレオチドに関する。本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、下記式（２）で示される構造を含む。本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、例えば、主鎖を構成する構成単位のうち少なくとも一部に、式（２）で示される構造を含む、ポリヌクレオチドであり得る。ここで、当該構造は、式（１）で示される化合物に由来する構造であり得る。
本発明の一態様は、ポリヌクレオチドに関する。本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、下記式（２）で示される構造を含む。本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、例えば、主鎖を構成する構成単位のうち少なくとも一部に、式（２）で示される構造を含む、ポリヌクレオチドであり得る。ここで、当該構造は、式（１）で示される化合物に由来する構造であり得る。
【0047】
【化6】
【0048】
なお、本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを構成単位として含む重合体を意味する。ヌクレオチドにおいて、塩基それぞれは、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）及びＵ（ウラシル）などの天然塩基であってもよく、天然塩基に由来する誘導体塩基であってもよく、人工的に合成された合成塩基であってもよい。ポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドそれぞれは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及びこれらの誘導体から独立して選択される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド以外に由来する構成単位を含んでもよい。ヌクレオチド以外に由来する構成単位としては、例えば、合成アミノ酸等が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの総質量に対して、ヌクレオチドを構成単位とする部分を、５０質量％以上含むことが好ましく、７０質量％以上含むことがより好ましく、９０質量％以上含むことがさらに好ましい。
【0049】
式（２）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びｎはそれぞれ、上述した式（１）に含まれるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びｎと同一の構成を備えるため、その説明を繰り返さない。
【0050】
式（２）で示される構造は、Ｘ及びＹそれぞれにおいて、ポリヌクレオチド主鎖に構成単位として含まれる、それぞれ他のヌクレオチドと結合している。例えば、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、リン酸エステル結合、及び当該結合を介して式（２）で示される構造に結合している他のヌクレオチドの組み合わせを表す。
【0051】
本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、式（２）で示される構造を含むポリヌクレオチド主鎖に加えて、他の部材をさらに含んでもよい。説明の簡単のため、以下、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドに含まれる：（Ｘ）式（２）で示される構造を含むポリヌクレオチド主鎖；及び（Ｙ）存在する場合には他の部材；のうち、（Ｘ）を「第１のセグメント」と記載することがある。
【0052】
本発明の一態様において、第１のセグメントは、式（２）で示される構造を含めばよく、塩基配列は特に制限されない。式（２）で示される構造は、例えば、第１のセグメントにおける中間領域に位置していることが好ましい。限定するものではないが、式（２）で示される構造は、第１のセグメントの３’末端及び５’末端それぞれから２塩基以上離れていることが好ましい。このような構成によれば、式（２）で示される構造による光架橋反応速度がより向上する。
【0053】
本発明の一態様において、第１のセグメントの長さは、５ヌクレオチド長以上であることが好ましく、１０ヌクレオチド長以上であることがより好ましく、１５ヌクレオチド長以上であることがさらに好ましい。第１のセグメントの長さがこのような数値範囲内であることによって、第１のセグメントと、他のポリヌクレオチドとの二本鎖領域の形成効率が向上する。また、第１のセグメントの長さは、９０ヌクレオチド長以下であることが好ましく、６０ヌクレオチド長以下であることがより好ましく、４０ヌクレオチド長以下であることがさらに好ましい。第１のセグメントの長さがこのような数値範囲内であることによって、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドを安価に製造することができる。
【0054】
本発明の一態様において、第１のセグメントのＧ／Ｃ含有量は、２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましく、４０％以上であることがさらに好ましく、５０％以上であることがよりさらに好ましい。Ｇ／Ｃ含有量がこのような数値範囲内であることによって、第１のセグメントと、他のポリヌクレオチドとの二本鎖領域の形成効率が向上する。また、第１のセグメントのＧ／Ｃ含有量は、９９％以下であることが好ましく、９８％以下であることがより好ましく、９０％以下であることがさらに好ましく、８０％以下であることがよりさらに好ましい。Ｇ／Ｃ含有量がこのような数値範囲内であることによって、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドによる非特異的な吸着が減少する。なお、本明細書において、「Ｇ／Ｃ含有量」とは、ポリヌクレオチドに含まれるすべての塩基の合計数に対する、ポリヌクレオチドに含まれるＧ（グアニン）塩基、Ｃ（シトシン）塩基及びこれらに由来する誘導体塩基の合計数の割合を意味する。
【0055】
本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、他の部材として、ＲＮＡを含んでもよい。また、ＲＮＡは、第１のセグメントとハイブリダイゼーションすることによって二本鎖領域を形成していてもよい。換言すれば、第１のセグメントと、ＲＮＡとが二本鎖領域を形成してなる複合体もまた、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドの一実施形態である。本発明の一態様において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡであることが好ましい。
【0056】
本発明の一態様において、ＲＮＡは、第１のセグメントとハイブリダイゼーションすることによって二本鎖領域を形成していることが好ましい。このような構成において、ＲＮＡは、第１のセグメントに含まれる式（２）で示される構造と相補的な塩基として、Ａ／Ｇプリン環塩基を含むことが好ましい。このような構成によれば、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドにおいて、第１のセグメントとＲＮＡとが高い効率で光架橋を形成し、ポリヌクレオチドの構造が安定化される。また、ＲＮＡは、第１のセグメントに含まれる式（２）で示される構造と相補的な塩基の３’末端側で隣接している塩基として、Ｔ／Ｃ／Ｕピリミジン環塩基を含むことが好ましい。このような構成によれば、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドにおいて、第１のセグメントとＲＮＡとがさらに高い効率で光架橋を形成し、ポリヌクレオチドの構造が安定化される。
【0057】
また、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、他の部材として、第１のセグメントに共有結合している部材を含んでもよい。ここで、他の部材は、第１のセグメントの主鎖上に存在してもよいし、第１のセグメントに側鎖として結合していてもよい。他の部材としては、例えば：蛍光標識部位；スペーサー部位；等が挙げられる。
【0058】
〔リンカー〕
本発明の一態様は、リンカーに関する。本発明の一態様に係るリンカーは、タンパク質又はペプチドと、他のポリヌクレオチドとを結合するためのリンカーであって、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドを備える。本発明の一態様に係るリンカーは、例えば、式（２）で示される構造を含むポリヌクレオチド主鎖である第１のセグメントを備えており、タンパク質又はペプチドと、第１のセグメントとは別のポリヌクレオチド（他のポリヌクレオチド）とを結合するためのリンカーである。
本発明の一態様は、リンカーに関する。本発明の一態様に係るリンカーは、タンパク質又はペプチドと、他のポリヌクレオチドとを結合するためのリンカーであって、本発明の一態様に係るポリヌクレオチドを備える。本発明の一態様に係るリンカーは、例えば、式（２）で示される構造を含むポリヌクレオチド主鎖である第１のセグメントを備えており、タンパク質又はペプチドと、第１のセグメントとは別のポリヌクレオチド（他のポリヌクレオチド）とを結合するためのリンカーである。
【0059】
本発明の一態様に係るリンカーは、結合部位を含み得る。結合部位は、リンカーにおいて、当該リンカーとタンパク質又はペプチドとの間の結合を形成する性質を有する部位である。結合部位は、第１のセグメントの主鎖中に含まれてもよいし、第１のセグメントの側鎖としてリンカーに含まれてもよい。
【0060】
結合部位は、タンパク質又はペプチドと結合する性質を有する限りにおいて、任意の構造を有し得る。結合部位としては、例えば、ピューロマイシン、３’－Ｎ－アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ－アミノ酸）、３’－Ｎ－アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ－アミノ酸）、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）及びデオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などのアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログ等が挙げられる。
【0061】
ＰＡＮＳ－アミノ酸としては、例えば、アミノ酸部分がグリシンであるＰＡＮＳ－Ｇｌｙ、アミノ酸部分がバリンであるＰＡＮＳ－Ｖａｌ、アミノ酸部分がアラニンであるＰＡＮＳ－Ａｌａ、及び、アミノ酸部分がすべてのアミノ酸それぞれに対応するＰＡＮＳ－アミノ酸混合物、が挙げられる。ＡＡＮＳ－アミノ酸としては、例えば、アミノ酸部分がグリシンであるＡＡＮＳ－Ｇｌｙ、アミノ酸部分がバリンであるＡＡＮＳ－Ｖａｌ、アミノ酸部分がアラニンであるＡＡＮＳ－Ａｌａ、及び、アミノ酸部分がすべてのアミノ酸それぞれに対応するＡＡＮＳ－アミノ酸混合物、が挙げられる。
【0062】
結合部位は、ピューロマイシン、３’－Ｎ－アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ－アミノ酸）及び３’－Ｎ－アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ－アミノ酸）からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。このような構成を有する結合部位は、タンパク質及びペプチドに対して高い結合能を有し、したがってリンカーが高い効率で所望の複合体を形成することができる。
【0063】
〔架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法〕
本発明の一態様に係る化合物、本発明の一態様に係るポリヌクレオチド、及び本発明の一態様に係るリンカーを用いて、架橋部位を有するポリヌクレオチドを製造できる。かかる架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法も本発明の一態様である。
本発明の一態様に係る化合物、本発明の一態様に係るポリヌクレオチド、及び本発明の一態様に係るリンカーを用いて、架橋部位を有するポリヌクレオチドを製造できる。かかる架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法も本発明の一態様である。
【0064】
本発明の一態様に係る架橋部位を有するポリヌクレオチドの製造方法は、本発明の一態様に係る、化合物、ポリヌクレオチド、又はリンカーを用いて、ポリヌクレオチドの一本鎖領域同士を架橋させる工程を含む。当該工程は、任意のポリヌクレオチド（以下、「対象ポリヌクレオチド」と略記する）と、本発明の一態様に係る、化合物、ポリヌクレオチド又はリンカーとを架橋させる工程である。ポリヌクレオチドの一本鎖領域同士を架橋させる工程は、アニーリング工程と、光照射工程とを含んでもよい。
【0065】
アニーリング工程は、本発明の一態様に係る、化合物、ポリヌクレオチド又はリンカーと、対象ポリヌクレオチドとをアニーリング処理に供する工程である。アニーリング処理は、ポリヌクレオチドをアニーリングするための当業者に公知の方法によって、実施することができる。アニーリング処理は、例えば、本発明の一態様に係る、化合物、ポリヌクレオチド又はリンカーと、対象ポリヌクレオチドとを含む溶液を、６０℃～１００℃にて２分間～６０分間、ヒートブロック、アルミブロックまたはウォーターバスなどの加温用器具にて温めた後、室温にて２分間～６０分間静置して液温を穏やかに低下させ、さらに－５℃～１０℃まで冷却することによって、実施することができる。アニーリング処理は、例えば、本発明の一態様に係る、化合物、ポリヌクレオチド又はリンカーと、対象ポリヌクレオチドとを含む溶液を、９０℃にて５分間アルミブロック上にて温め、次いで７０℃にて５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温にて１０分間静置した後、氷上に置いて冷却することによって、実施することが好ましい。
【0066】
光照射工程は、アニーリング工程の後に、本発明の一態様に係る、化合物、ポリヌクレオチド又はリンカーと、対象ポリヌクレオチドとに光照射し、光架橋反応させ、架橋部位を形成する工程である。照射される光の波長は、適宜に選択され得、３５０ｎｍ～３７０ｎｍの範囲内であることが好ましく、３６０ｎｍ～３６６ｎｍの範囲内であることがより好ましい。光強度は、適宜に選択され得、４００ｍＪ～４２０ｍＪの範囲内であることが好ましく、４００ｍＪ～４０５ｍＪの範囲内であることがより好ましい。
【実施例0067】
以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。
【0068】
〔実施例１〕化合物６－１の合成（Ｒ４＝Ｃｌ）
以下のスキーム（合成例１－１～５－１）に従って、化合物６－１を合成した。なお、化合物６－１において、Ｒ４は塩素原子（Ｃｌ）である。
以下のスキーム（合成例１－１～５－１）に従って、化合物６－１を合成した。なお、化合物６－１において、Ｒ４は塩素原子（Ｃｌ）である。
【0069】
（合成例１－１）化合物２－１の合成（Ｒｅａｃｔｉｏｎ １）
化合物１－１（３．００ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）との混合物に、Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）（２．４６ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応混合物に水３０ｍＬを加え、析出した固体をろ取した。得られた粗生成物をエタノールにより再結晶し、化合物２－１（１．６０ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）を白色粉末状物として得た。
化合物１－１（３．００ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）との混合物に、Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）（２．４６ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応混合物に水３０ｍＬを加え、析出した固体をろ取した。得られた粗生成物をエタノールにより再結晶し、化合物２－１（１．６０ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）を白色粉末状物として得た。
【0070】
（合成例２－１）化合物３－１の合成（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ２）
化合物２－１（１．６０ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（２ｍＬ）と水（３ｍＬ）との混合物に、アクリロニトリル（０．５６７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）（０．６１２ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）及び酢酸パラジウム（０．０９６０ｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）を加え、マイクロウェーブを照射しながら１６０℃で１０分間撹拌した。反応混合物に酢酸エチル（１０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）を加え、有機相を減圧下、溶媒である酢酸エチル及びＤＭＦを留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、化合物３－１（０．６７６ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を黄色粉末状物として得た。
化合物２－１（１．６０ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（２ｍＬ）と水（３ｍＬ）との混合物に、アクリロニトリル（０．５６７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）（０．６１２ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）及び酢酸パラジウム（０．０９６０ｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）を加え、マイクロウェーブを照射しながら１６０℃で１０分間撹拌した。反応混合物に酢酸エチル（１０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）を加え、有機相を減圧下、溶媒である酢酸エチル及びＤＭＦを留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、化合物３－１（０．６７６ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を黄色粉末状物として得た。
【0071】
（合成例３－１）化合物４－１の合成（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ３）
化合物３－１（６７６ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）とアセトニトリル（５ｍＬ）との混合物に、３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルイル）－２－デオキシリボフラノシルクロリド（Ｈｏｆｆｅｒ’ｓ ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒ）（３８１ｍｇ、３．２１ｍｍｏｌ）、水素化ナトリウム（６６．１ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。その後、メタノール（５ｍＬ）と２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５１２ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、化合物４－１（０．６５０ｇ）を黄色オイル状物として得た。
化合物３－１（６７６ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）とアセトニトリル（５ｍＬ）との混合物に、３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルイル）－２－デオキシリボフラノシルクロリド（Ｈｏｆｆｅｒ’ｓ ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒ）（３８１ｍｇ、３．２１ｍｍｏｌ）、水素化ナトリウム（６６．１ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。その後、メタノール（５ｍＬ）と２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５１２ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、化合物４－１（０．６５０ｇ）を黄色オイル状物として得た。
【0072】
【化7】
【0073】
（合成例４－１）化合物５－１の合成（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ４）
化合物４－１（６５０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）との混合物に、４，４－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）（５９７ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）（０．７９１ｍＬ、５．２９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、化合物５－１（１００ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）を黄色オイル状物として得た。
化合物４－１（６５０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）との混合物に、４，４－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）（５９７ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）（０．７９１ｍＬ、５．２９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、化合物５－１（１００ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）を黄色オイル状物として得た。
【0074】
【化8】
【0075】
化合物５－１の１Ｈ ＮＭＲの結果を以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.02 (d, 2H, J = 12.4 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.61 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.45-7.52 (m, 4H), 7.25-7.37 (m, 8H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.81 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.57 (dd, 1H, J = 8.2, 6.3 Hz), 5.76 (d, 1H, J = 16.8 Hz), 4.82 (s, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.22-2.25 (m, 1H)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.02 (d, 2H, J = 12.4 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.61 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.45-7.52 (m, 4H), 7.25-7.37 (m, 8H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.81 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.57 (dd, 1H, J = 8.2, 6.3 Hz), 5.76 (d, 1H, J = 16.8 Hz), 4.82 (s, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.22-2.25 (m, 1H)。
【0076】
（合成例５－１）化合物６－１の合成（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ５）
化合物５－１（１００ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）に無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、減圧下、溶媒を留去した。この操作を３回繰り返し、化合物５－１に含まれる水を除去した。窒素雰囲気下、化合物５－１と無水アセトニトリル（１ｍＬ）との混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイド（０．０４５ｍＬ、０．１４９ｍｍｏｌ）及び１Ｈ－テトラゾール（１０．４ｍｇ、０．１４９ｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去した。残渣に無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、減圧下、溶媒を留去の操作を３回繰り返して、化合物６－１（１０３ｍｇ、０．０１１８ｍｍｏｌ）を黄色結晶状物として得た。
化合物５－１（１００ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）に無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、減圧下、溶媒を留去した。この操作を３回繰り返し、化合物５－１に含まれる水を除去した。窒素雰囲気下、化合物５－１と無水アセトニトリル（１ｍＬ）との混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイド（０．０４５ｍＬ、０．１４９ｍｍｏｌ）及び１Ｈ－テトラゾール（１０．４ｍｇ、０．１４９ｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去した。残渣に無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、減圧下、溶媒を留去の操作を３回繰り返して、化合物６－１（１０３ｍｇ、０．０１１８ｍｍｏｌ）を黄色結晶状物として得た。
【0077】
【化9】
【0078】
なお、合成例５－１において実施された第５の反応工程（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ５）の詳細は、Org. Lett. 2015, 17, 1874-1877; Tetrahedron Lett. 2012, 53, 4012-4014; Org. Lett. 2008, 10, 3227-3230に記載されている。合成例５－１において化合物６－１が得られたことは、これらの文献を参照すれば、当業者が容易に理解し得ることである。
【0079】
〔実施例２〕化合物６－２の合成（Ｒ４＝Ｂｒ）
合成例１－１においてＮ－クロロスクシンイミドの代わりにＮ－ブロモスクシンイミド（３．２８ｍｇ、１８４ｍｍｏｌ）を用いたことを除いて、実施例１と同一のスキームで、化合物６－２を合成した。なお、化合物６－２において、Ｒ４は臭素原子（Ｂｒ）である。
合成例１－１においてＮ－クロロスクシンイミドの代わりにＮ－ブロモスクシンイミド（３．２８ｍｇ、１８４ｍｍｏｌ）を用いたことを除いて、実施例１と同一のスキームで、化合物６－２を合成した。なお、化合物６－２において、Ｒ４は臭素原子（Ｂｒ）である。
【0080】
化合物５－２の１Ｈ ＮＭＲの結果を以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.07 (s,1H), 8.02-8.05 (m, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.45-7.52 (m, 4H), 7.25-7.37 (m, 8H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.83 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.56 (dd, 1H, J = 8.2, 6.3 Hz), 5.76 (d, 1H, J = 16.7 Hz), 4.82 (s, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.22-2.25 (m, 1H)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.07 (s,1H), 8.02-8.05 (m, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.45-7.52 (m, 4H), 7.25-7.37 (m, 8H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.83 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.56 (dd, 1H, J = 8.2, 6.3 Hz), 5.76 (d, 1H, J = 16.7 Hz), 4.82 (s, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.22-2.25 (m, 1H)。
【0081】
〔実施例３〕化合物６－３の合成（Ｒ４＝Ｍｅ）
合成例１－１において、化合物１－１の代わりに化合物１－３（２．４０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－クロロスクシンイミドの代わりにＮ－ヨードスクシンイミド（５．３６ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）と酢酸（１０ｍＬ、１７５ｍｍｏｌ）との混合物を用いたことを除いて、実施例１と同一のスキームで、化合物６－３を合成した。なお、化合物６－３において、Ｒ４はメチル基（Ｍｅ）である。
合成例１－１において、化合物１－１の代わりに化合物１－３（２．４０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－クロロスクシンイミドの代わりにＮ－ヨードスクシンイミド（５．３６ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）と酢酸（１０ｍＬ、１７５ｍｍｏｌ）との混合物を用いたことを除いて、実施例１と同一のスキームで、化合物６－３を合成した。なお、化合物６－３において、Ｒ４はメチル基（Ｍｅ）である。
【0082】
化合物５－３の１Ｈ ＮＭＲの結果を以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ 8.04 (s,1H), 7.82 (s, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.45-7.52 (m, 4H), 7.25-7.37 (m, 8H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.83 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.58 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 5.74 (d, 1H, J = 16.4 Hz), 4.79 (s, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.47 (s, 3H), 2.22-2.25 (m, 1H)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ 8.04 (s,1H), 7.82 (s, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.45-7.52 (m, 4H), 7.25-7.37 (m, 8H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.83 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.58 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 5.74 (d, 1H, J = 16.4 Hz), 4.79 (s, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.47 (s, 3H), 2.22-2.25 (m, 1H)。
【0083】
実施例１～３のスキームそれぞれにおける収率、収量及び生成物のＥ／Ｚ値を下記表に示す。
【0084】
【表1】
【0085】
〔比較例１〕化合物６－Ｃ１の合成（Ｒ４＝Ｈ）
合成例１－１を実施せず、合成例２－１において化合物２－１の代わりに化合物１－１（５００ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を用いたことを除いて、実施例１と同一のスキームで化合物６－Ｃ１を合成した。なお、化合物６－Ｃ１において、Ｒ４は水素原子（Ｈ）である。
合成例１－１を実施せず、合成例２－１において化合物２－１の代わりに化合物１－１（５００ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を用いたことを除いて、実施例１と同一のスキームで化合物６－Ｃ１を合成した。なお、化合物６－Ｃ１において、Ｒ４は水素原子（Ｈ）である。
【0086】
〔評価例〕モデルポリヌクレオチドを用いた光架橋反応及び光開裂反応における反応速度の分析
【0087】
合成した化合物を用いてモデルポリヌクレオチドを合成し、モデルポリヌクレオチドとモデルｍＲＮＡとの光架橋反応及び光開裂反応の反応速度を、ゲル電気泳動によって得られるバンド強度に基づいて、分析した。
【0088】
（モデルポリヌクレオチドの合成）
モデルポリヌクレオチドとして、実施例１で合成された化合物６－１を原料として用いて、ポリヌクレオチド１を合成した。合成は、つくばオリゴサービス株式会社に委託され、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って実施した。ポリヌクレオチド１は、下記の塩基配列を有する。
モデルポリヌクレオチドとして、実施例１で合成された化合物６－１を原料として用いて、ポリヌクレオチド１を合成した。合成は、つくばオリゴサービス株式会社に委託され、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って実施した。ポリヌクレオチド１は、下記の塩基配列を有する。
【0089】
３’－ＴＣＣ（ＦＴ＊）ＧＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＫ’ＡＣＣＴＴＴＡＡ－５’（配列番号１、２４ｍｅｒ）
ここで、ＦＴ＊はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）－ｄＴを表す。Ｋ’は化合物６－１に由来する塩基を表す。
ここで、ＦＴ＊はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）－ｄＴを表す。Ｋ’は化合物６－１に由来する塩基を表す。
【0090】
ポリヌクレオチド１と同様に、ポリヌクレオチド２、３及びＣ１を合成した。ポリヌクレオチド２は化合物６－２に由来する構造を含み、ポリヌクレオチド３は化合物６－３に由来する構造を含み、ポリヌクレオチドＣ１は化合物６－Ｃ１に由来する構造を含んだ。
【0091】
さらに、参考例１として、国際公開第２０１６／１５９２１１号の実施例１に記載の方法に従って、リンカー（Ｐｕｒｏｍｙｓｉｎｅ－ｌｉｎｋｅｒ（ｐｏｌｙＡ＋ｃｎｖＫ））を合成し、ポリヌクレオチドＲ１とした。
【0092】
（光架橋反応及び光開裂反応）
モデルｍＲＮＡとしては、（１）ＢＤＡ（Ｂ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）をコードするｍＲＮＡ、又は（２）Ｃ１４ライブラリを用いた。２種類のモデルｍＲＮＡの両方はそれぞれ、その一部に、モデルポリヌクレオチドに相補的な下記の塩基配列を含む。
モデルｍＲＮＡとしては、（１）ＢＤＡ（Ｂ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）をコードするｍＲＮＡ、又は（２）Ｃ１４ライブラリを用いた。２種類のモデルｍＲＮＡの両方はそれぞれ、その一部に、モデルポリヌクレオチドに相補的な下記の塩基配列を含む。
【0093】
５’－ＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＵＧＧＡＡＡ－３’（配列番号２、２２ｍｅｒ）
【0094】
ポリヌクレオチド１（最終濃度１００μＭ）とｍＲＮＡ（最終濃度１００μＭ）との混合溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））を調製した。混合溶液を９０℃で１分間インキュベートし、次いで７０℃で１分間インキュベートし、０．０８℃／秒の速度で２５℃まで降温させることによって、アニーリング処理を行い、ポリヌクレオチド１とモデルｍＲＮＡとをハイブリダイズさせた。
【0095】
混合溶液に波長３６６ｎｍの紫外光を４０５ｍＪ照射し、ポリヌクレオチド１とモデルｍＲＮＡとを光架橋反応させた。
【0096】
混合溶液５μＬを分取し、ＵＶトランスイルミネータ（ＭＢＰ－ＵＶ３１２ＪＰ）を用いて、分取した混合溶液に波長３１２ｎｍの紫外光（４８Ｗ）を２分間照射し、ポリヌクレオチド１とモデルｍＲＮＡとを光開裂反応させた。
【0097】
８Ｍの尿素を含む４％スタッキングゲル－６％分離ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いた電気泳動により、光架橋反応後の混合溶液及び光開裂反応後の混合溶液を分析した。電気泳動の条件は、電圧２０Ｖ及び泳動時間２０分間であった。
【0098】
ポリヌクレオチド２、３、Ｃ１及びＲ１それぞれについても、ポリヌクレオチド１について上述した方法と同一の方法を用いて、分析した。
【0099】
電気泳動の結果を表すゲル電気泳動写真を図１及び２に示す。図１は、モデルｍＲＮＡとしてＢＤＡをコードするｍＲＮＡが用いられた結果である。図２は、モデルｍＲＮＡとしてＣ１４ライブラリが用いられた結果である。図１及び２において、ＣＬレーンは光架橋反応後の混合溶液のレーンであり、ＲＯレーンは光開裂反応後の混合溶液のレーンである。図１及び２において、鎖線で囲まれた領域内のバンドは、互いに架橋されていない、開裂構造にあるモデルポリヌクレオチド及びモデルｍＲＮＡを表すバンドである。また、鎖線で囲まれた領域よりも上側に存在するバンドは、互いに架橋されている、架橋構造にあるモデルポリヌクレオチド及びモデルｍＲＮＡの複合体を表すバンドである。図１及び２に示すように、式（２）で示され、式（１）で示される化合物に由来する構造を含むポリヌクレオチド１～３は、光照射によって、光架橋反応を生じた。
【0100】
（評価）
モデルポリヌクレオチドに含まれるＦＩＴＣの蛍光によるバンド強度の比率を算出した。バンド強度の比率は、架橋構造にある複合体の量と、開裂状態にあるモデルポリヌクレオチド及びモデルｍＲＮＡの量との比率を表すため、バンド強度の比率に基づいて、光架橋反応及び光開裂反応の反応速度を判断することができる。バンド強度の比率の算出結果を表すグラフを図３～５に示す。
モデルポリヌクレオチドに含まれるＦＩＴＣの蛍光によるバンド強度の比率を算出した。バンド強度の比率は、架橋構造にある複合体の量と、開裂状態にあるモデルポリヌクレオチド及びモデルｍＲＮＡの量との比率を表すため、バンド強度の比率に基づいて、光架橋反応及び光開裂反応の反応速度を判断することができる。バンド強度の比率の算出結果を表すグラフを図３～５に示す。
【0101】
図３は、同一レーンにおける、架橋構造を表すバンド強度（Ｘ）と、開裂構造を表すバンド強度（Ｙ）との比率（＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）×１００）を表すグラフである。グラフは、比率が高いほど光架橋反応速度が高いことを示す。図３に示すように、ポリヌクレオチド１～３は、従来技術に係るポリヌクレオチドＣ１と比較して、同程度の光架橋反応速度を示した。
【0102】
図４は、同一のモデルｍＲＮＡを用いた場合の、ＲＯレーンの架橋構造を表すバンド強度（Ｘ）と、ＣＬレーンの開裂構造を表すバンド強度（Ｙ）との比率（＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）×１００）を表すグラフである。グラフは、比率が高いほど光開裂反応速度が低いことを示す。図４に示すように、ポリヌクレオチド１～３は、従来技術に係るポリヌクレオチドＣ１と比較して、低いか又は同程度の光開裂反応速度を示した。
【0103】
【産業上の利用可能性】
【0104】
本発明は、例えば、新規機能性ポリペプチドの探索等の分子生物学の分野において、利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】