ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人北海道大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023174174
(43)【公開日】2023-12-07
(54)【発明の名称】炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/6409 20220101AFI20231130BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20231130BHJP
A23L 33/115 20160101ALI20231130BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20231130BHJP
A61K 8/36 20060101ALI20231130BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20231130BHJP
A01N 37/06 20060101ALI20231130BHJP
【ＦＩ】
C12P7/6409
C12N1/20 A
C12N1/20 E
A23L33/115
A23L33/135
A61K8/36
A01P3/00
A01N37/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022086879
(22)【出願日】2022-05-27
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度 国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業「アトピー性皮膚環境を改善するプロバイオティクスおよび皮膚・腸管環境の創生」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100205914
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 総明
(74)【代理人】
【識別番号】100162189
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 真弓
(72)【発明者】
【氏名】菊川 寛史
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 徹
【テーマコード（参考）】
4B018
4B064
4B065
4C083
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B018MD10
4B018MD87
4B018ME07
4B018MF01
4B064AD85
4B064CA02
4B064CD13
4B064CE08
4B064DA01
4B064DA08
4B064DA10
4B065AA21X
4B065BA21
4B065BB12
4B065BC03
4B065BC07
4B065CA13
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA50
4C083AC251
4C083AC252
4C083EE13
4C083FF01
4H011AA01
4H011AA03
4H011BB06
(57)【要約】
【課題】化学合成以外の方法によって、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類を生産する方法を提供する。
【解決手段】炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有している。
【選択図】なし
【解決手段】炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有している。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有することを特徴とする、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項2】
前記ビフィドバクテリウム属細菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株又はこれらの変異株であることを特徴とする請求項１に記載の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項3】
前記変異株が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＤ２株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６）であることを特徴とする請求項２に記載の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項4】
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項5】
前記液体培地が、ＭＲＳ培地に対し、さらに、Ｌ－システイン又はその塩が０．００１～１ｇ／Ｌ配合された液体培地であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項6】
前記培養は、前記液体培地に炭酸ガスを通気して行われることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項7】
前記培養は、３２～３５℃の温度条件下で行われることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項8】
炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有し、
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とする黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の製造方法。
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とする黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の製造方法。
【請求項9】
炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有し、
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とするアトピー性皮膚炎改善用飲食品の製造方法。
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とするアトピー性皮膚炎改善用飲食品の製造方法。
【請求項10】
炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有し、
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とするアトピー性皮膚炎改善用化粧料の製造方法。
前記炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることを特徴とするアトピー性皮膚炎改善用化粧料の製造方法。
【請求項11】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＡＤ２株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ビフィズス菌を用いて炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎は、増悪・寛解を繰り返す、痒みのある湿疹を主病変とする疾患である。アトピー性皮膚炎の多くは幼少期に発症し、一旦治癒した後に青年期に重篤な症状を伴って再発することが知られている。日本のアトピー性皮膚炎の患者数は２００８年に約３５万人、２０１７年には約５１万人と年々増加しており（２０１７年、厚生労働省）、社会的課題の一つに発展しつつある。
【0003】
近年、アトピー性皮膚炎の要因の一つに、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）による炎症の惹起があることが明らかとなった。また、この黄色ブドウ球菌による炎症の惹起は、アトピー性皮膚炎以外にも、慢性的な皮膚炎や肌荒れの要因でもあるとされている。そのため、この種の皮膚炎を治療、改善又は予防するため、黄色ブドウ球菌の増殖や活動を抑制することが求められる。黄色ブドウ球菌のような微生物の抑制には通常、抗生物質が用いられるが、抗生物質は抗菌活性が強力であるために、皮膚常在細菌等の有益な微生物も抑制されてしまうという問題があった。
【0004】
他方、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸であるサピエン酸（６－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）は、黄色ブドウ球菌に対する抗菌性をもつことが知られている。このサピエン酸は黄色ブドウ球菌には強い抗菌性を示す一方で、その近縁種でありながら肌の保湿に寄与する有益菌である、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に対しては抗菌性を示さないという、選択的抗菌活性を示すことが報告されている（非特許文献１）。また、非特許文献１では、同じく炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸である、パルミトレイン酸（９－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）及び７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）がサピエン酸同様の選択的抗菌活性を示すことが報告されている。それゆえ、皮膚の健全な微生物叢を維持しながらアトピー性皮膚炎等の皮膚炎を治療、改善又は予防するため、有害な黄色ブドウ球菌には抗菌性を示すが、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さない、選択的抗菌活性を示す炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類を用いることが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】永尾寿浩・宇山彩香・田中重光・杉野哲造、“皮膚細菌叢を制御する脂肪酸”、生物工学、公益社団法人日本生物工学会、２０２０年１０月、第９８巻、第１０号、ｐ．５２５－５２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類をアトピー性皮膚炎等の治療、改善又は予防に用いるにあたっては、この種の脂肪酸類を配合した乳液・クリーム等の皮膚外用剤による塗布又はこの種の脂肪酸類を配合した飲食品等による経口投与が考えられる。それゆえ、皮膚外用剤や飲食品へ利用し易い天然成分又は天然由来成分として炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類を得ることが望まれるが、この炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類は抽出源となる天然資源が限られており、天然成分又は天然由来成分として炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類を得ることが難しい。そのため、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類は化学合成によって生産された合成材料が一般的であり、皮膚外用剤や飲食品には利用し難いという問題があった。
【0007】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、化学合成以外の方法によって、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、微生物による発酵生産に着想を得て、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類を生産できる微生物の探索と特徴解析による効率的生産について鋭意検討を行った。その結果、ヨーグルト生産菌であり、プロバイオティクスとして一般に良く知られるビフィドバクテリウム属細菌、いわゆるビフィズス菌に炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸類の生産を見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【0009】
上記課題を解決するため、本発明の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有する。これにより、化学合成以外の方法によって炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸を生産することができる。具体的には、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養することにより、液体培地で効率的に増殖したビフィドバクテリウム属細菌の菌体内に目的の脂肪酸が蓄積される。
【0010】
また、本発明の生産方法におけるビフィドバクテリウム属細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株又はこれらの変異株であることも好ましい。これにより、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性が高く、目的の脂肪酸生産に好適なビフィドバクテリウム属細菌が選択される。
【0011】
また、本発明の生産方法におけるビフィドバクテリウム属細菌の変異株は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＤ２株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６）であることも好ましい。これにより、新規なビフィドバクテリウム属細菌であって、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性が特に高く、目的の脂肪酸生産に好適なビフィドバクテリウム属細菌が選択される。
【0012】
また、本発明の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸であることも好ましい。これにより、ビフィドバクテリウム属細菌で生産され、有害な黄色ブドウ球菌には抗菌性を示すが、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さない、選択的抗菌活性を示す炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が選択される。
【0013】
また、本発明の生産方法における液体培地は、ＭＲＳ培地に対し、さらに、Ｌ－システイン又はその塩が０．００１～１ｇ／Ｌ配合された液体培地であることも好ましい。これにより、ビフィドバクテリウム属細菌による炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性を向上させることができる。
【0014】
また、本発明の生産方法における培養は、液体培地に炭酸ガスを通気して行われることも好ましい。これにより、ビフィドバクテリウム属細菌による炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性を向上させることができ、さらに、ラージスケール培養条件下でも炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の効率的な生産を行うことができる。
【0015】
また、本発明の生産方法における培養は、３２～３５℃の温度条件下で行われることも好ましい。これにより、ビフィドバクテリウム属細菌による炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性を向上させることができる。
【0016】
また、本発明の黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の製造方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有し、この炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸である。ビフィドバクテリウム属細菌が７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産するため、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さないが、有害な黄色ブドウ球菌には抗菌性を示す黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤が得られる。この黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤は、培養工程後のビフィドバクテリウム属細菌の菌体から得られた総脂肪酸の粗抽出物はもちろん、総脂肪酸の粗抽出物から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を分離・精製したものも含まれる。
【0017】
また、本発明のアトピー性皮膚炎改善用飲食品の製造方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有し、この炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸である。これにより、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さないが、アトピー性皮膚炎の要因の一つである黄色ブドウ球菌には抗菌性を示す７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が、ビフィドバクテリウム属細菌により生産されるため、飲食品に利用し易い７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸含有材料が得られる。この７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸含有材料を配合した飲食品は、アトピー性皮膚炎改善用飲食品として活用され得る。
【0018】
また、本発明のアトピー性皮膚炎改善用化粧料の製造方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有し、この炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸である。これにより、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さないが、アトピー性皮膚炎の要因の一つである黄色ブドウ球菌には抗菌性を示す７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が、ビフィドバクテリウム属細菌により生産されるため、化粧料に利用し易い７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸含有材料が得られる。この７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸含有材料を配合した化粧料は、アトピー性皮膚炎改善用化粧料として活用され得る。
【0019】
さらに、本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＡＤ２株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６）である。この新規ビフィドバクテリウム属細菌のＡＤ２株を培養することにより、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を高効率に生産することができる。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有する炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法並びに黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤及びアトピー性皮膚炎改善用飲食品又は化粧料の製造方法を提供することができる。
（１）ビフィズス菌の培養によって炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産することができる。
（２）培地組成や培養温度、ガス通気等の培養条件について、好適な条件とすることにより、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産量を向上させることができる。
（３）発酵食品の生産やプロバイオティクス等に用いられているビフィズス菌による生産であるため、安全性が高く、生産物が飲食品や化粧品の分野において利用され易い。
（１）ビフィズス菌の培養によって炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産することができる。
（２）培地組成や培養温度、ガス通気等の培養条件について、好適な条件とすることにより、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産量を向上させることができる。
（３）発酵食品の生産やプロバイオティクス等に用いられているビフィズス菌による生産であるため、安全性が高く、生産物が飲食品や化粧品の分野において利用され易い。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】実施例２における、ビフィズス菌が生産する７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の菌体内における局在を示すグラフである。縦軸は培養液１Ｌ中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量を表す。
【図2】実施例３における、ビフィズス菌から抽出された脂肪酸抽出物の黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌に対する抗菌活性を示すグラフである。
【図3】実施例４における、ビフィズス菌をＭＲＳ液体培地、ＣＳＬ液体培地及びＴＯＳ液体培地で培養した際の各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量（ｍｇ／Ｌ）及び総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合（％）を示すグラフであって、図３（ａ）はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を培養した際のグラフ、図３（ｂ）は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ ＪＣＭ１２１１株を培養した際のグラフである。
【図4】実施例６における、ビフィズス菌をＭＲＳ液体培地及びＭＲＳ＋Ｌ－Ｃｙｓ液体培地で培養した際の各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量（ｍｇ／Ｌ）及び総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合（％）を示すグラフであって、図４（ａ）はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を培養した際のグラフ、図４（ｂ）は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ ＪＣＭ１２１１株を培養した際のグラフである。
【図5】実施例７における、ビフィズス菌を炭酸ガス又は窒素ガスの通気培養により、ＴＯＳ液体培地、ＭＲＳ液体培地及びＭＲＳ＋Ｌ－Ｃｙｓ液体培地でスケールアップ培養した際の各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量（ｍｇ／Ｌ）と培養時間（ｈ）を示すグラフである。
【図6】実施例８における、ＭＲＳ液体培地中に添加するＬ－システイン量を変化させた液体培地でビフィズス菌を培養した際の各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量（ｍｇ／Ｌ）を示すグラフである。
【図7】実施例９における、ビフィズス菌の培養温度を変化させた際の各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量（ｍｇ／Ｌ）を示すグラフである。
【図8】実施例９における、ビフィズス菌の培養温度を３４℃とし、炭酸ガスの通気培養によりスケールアップ培養した際の培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の量（ｍｇ／Ｌ）と培養時間（ｈ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、本発明の一実施形態に係る炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法及びアトピー性皮膚炎改善用飲食品・化粧料の製造方法について詳細に説明する。本実施形態に係る炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産方法は、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有する。
【0023】
（ビフィドバクテリウム属細菌）
まず、本実施形態において用いられるビフィドバクテリウム属細菌について説明する。本実施形態に係るビフィドバクテリウム属細菌とは、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌である。具体的には、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株、並びにこれらの変異株が好適に挙げられる。このうち、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性に優れる観点から、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株並びにこれらの変異株がより好ましく用いられる。
まず、本実施形態において用いられるビフィドバクテリウム属細菌について説明する。本実施形態に係るビフィドバクテリウム属細菌とは、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌である。具体的には、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株、並びにこれらの変異株が好適に挙げられる。このうち、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性に優れる観点から、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株並びにこれらの変異株がより好ましく用いられる。
【0024】
変異株としては、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するものであれば特に限定されないが、後述する実施例１０で示すように、本発明では、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性に優れる変異株として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を親株とする変異株ＡＤ１株及びＡＤ２株が得られている。これらは、親株であるＪＣＭ７０４２株よりも優れた炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産性を示す。このうち、特に優れた生産性を示すＡＤ２株、すなわち、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＤ２株は、以下のとおり特許微生物の寄託機関に国際寄託がなされている。
（１）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６
（２）原寄託日：２０２１年１２月２２日
（３）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）
（１）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６
（２）原寄託日：２０２１年１２月２２日
（３）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）
【0025】
（炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸）
本実施形態において、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸とは、有害な黄色ブドウ球菌には抗菌性を示すが、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さない、選択的抗菌活性を示す炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸である。具体的には、サピエン酸（６－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）、パルミトレイン酸（９－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）及び７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸が挙げられる。このうち、後述する実施例において、ビフィズス菌による生産及びその生産性向上が見出された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）であることが特に好ましい。７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）は、上述した選択的抗菌活性を有する脂肪酸であるため、皮膚の健全な微生物叢を維持しながらアトピー性皮膚炎等の皮膚炎の治療、改善又は予防のために使用され得る。
本実施形態において、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸とは、有害な黄色ブドウ球菌には抗菌性を示すが、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さない、選択的抗菌活性を示す炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸である。具体的には、サピエン酸（６－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）、パルミトレイン酸（９－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）及び７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸が挙げられる。このうち、後述する実施例において、ビフィズス菌による生産及びその生産性向上が見出された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）であることが特に好ましい。７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）は、上述した選択的抗菌活性を有する脂肪酸であるため、皮膚の健全な微生物叢を維持しながらアトピー性皮膚炎等の皮膚炎の治療、改善又は予防のために使用され得る。
【0026】
（液体培地）
本実施形態において、ビフィドバクテリウム属細菌を培養する際に用いられる液体培地としては、いわゆるビフィズス菌を培養し、増殖させることができる液体培地であれば、どのような液体培地も用いることができる。具体的には、特に限定されないが、一例として、ＭＲＳ培地、ＴＯＳ培地、ＴＯＳプロピオン酸培地、ＣＳＬ培地、ＢＬ培地及びＧＡＭブイヨン等が挙げられる。ＭＲＳ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、プロテオースペプトン１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、ポリソルベート８０ １ｇ、クエン酸水素二アンモニウム２ｇ、酢酸ナトリウム５ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．１ｇ、硫酸マンガン０．０５ｇ及びリン酸一水素二カリウム２ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＴＯＳ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、トリプトン１０ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸一水素二カリウム４．８ｇ、硫酸アンモニウム３ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．２ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．５ｇ、ガラクトオリゴ糖１０ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＴＯＳプロピオン酸液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸一水素二カリウム４．８ｇ、硫酸アンモニウム３ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．２ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．５ｇ、プロピオン酸ナトリウム１５ｇ、ガラクトオリゴ糖１０ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＣＳＬ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、コーンスティープリカー５５ｇ、グルコース１０ｇ、ポリソルベート８０ １ｍＬ、リン酸一水素二カリウム１ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＢＬ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、肉エキス２．４ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、ペプトン５ｇ、ダイズペプトン３ｇ、酵母エキス５ｇ、肝臓エキス３．２ｇ、ブドウ糖１０ｇ、溶性デンプン０．５ｇ、リン酸一水素二カリウム１ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水和物）、０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇ、硫酸マンガン０．００７ｇ、消泡剤（シリコン）０．２ｇ、ポリソルベート８０ １ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．５ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。さらに、ＧＡＭブイヨンの組成としては、液体培地１Ｌあたり、ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。
本実施形態において、ビフィドバクテリウム属細菌を培養する際に用いられる液体培地としては、いわゆるビフィズス菌を培養し、増殖させることができる液体培地であれば、どのような液体培地も用いることができる。具体的には、特に限定されないが、一例として、ＭＲＳ培地、ＴＯＳ培地、ＴＯＳプロピオン酸培地、ＣＳＬ培地、ＢＬ培地及びＧＡＭブイヨン等が挙げられる。ＭＲＳ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、プロテオースペプトン１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、ポリソルベート８０ １ｇ、クエン酸水素二アンモニウム２ｇ、酢酸ナトリウム５ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．１ｇ、硫酸マンガン０．０５ｇ及びリン酸一水素二カリウム２ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＴＯＳ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、トリプトン１０ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸一水素二カリウム４．８ｇ、硫酸アンモニウム３ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．２ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．５ｇ、ガラクトオリゴ糖１０ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＴＯＳプロピオン酸液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸一水素二カリウム４．８ｇ、硫酸アンモニウム３ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．２ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．５ｇ、プロピオン酸ナトリウム１５ｇ、ガラクトオリゴ糖１０ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＣＳＬ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、コーンスティープリカー５５ｇ、グルコース１０ｇ、ポリソルベート８０ １ｍＬ、リン酸一水素二カリウム１ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。また、ＢＬ液体培地の組成としては、液体培地１Ｌあたり、肉エキス２．４ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、ペプトン５ｇ、ダイズペプトン３ｇ、酵母エキス５ｇ、肝臓エキス３．２ｇ、ブドウ糖１０ｇ、溶性デンプン０．５ｇ、リン酸一水素二カリウム１ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム（７水和物）０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水和物）、０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇ、硫酸マンガン０．００７ｇ、消泡剤（シリコン）０．２ｇ、ポリソルベート８０ １ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．５ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。さらに、ＧＡＭブイヨンの組成としては、液体培地１Ｌあたり、ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇが挙げられるが、各成分の配合量が±２０％程度異なっていてもよいし、いくつかの成分が同様の機能を有する成分と代替されていてもよく、さらに他の成分が追加されていてもよい。
【0027】
上述した液体培地のうち、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産性を向上させる観点から、培養に用いられる液体培地は、ＭＲＳ液体培地であることが好ましい。ＭＲＳ液体培地で培養することにより、ＣＳＬ液体培地やＴＯＳ液体培地と比べて、培養液中における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の濃度を２～５倍に増量させることができる。また、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性をより向上できる観点から、ＭＲＳ液体培地に対し、Ｌ－システイン又はその塩を追加配合した培地とすることが特に好ましい。Ｌ－システイン類を追加配合したＭＲＳ液体培地で培養することにより、Ｌ－システイン類を配合していないＭＲＳ液体培地で培養したものと比べて、培養液中における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の濃度を２倍に増量させることができる。ＭＲＳ液体培地に追加配合する、Ｌ－システイン又はその塩の配合量としては、培養液中における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性の観点から、液体培地１Ｌあたり、０．００１～１．０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、０．０１～０．７ｇ／Ｌの範囲がより好ましく、０．１～０．６ｇ／Ｌの範囲が特に好ましい。
【0028】
（培養条件）
本実施形態において、ビフィズス菌の培養にあたっては、ビフィズス菌が増殖し易い微好気条件下又は嫌気的条件下で培養することが好ましく、具体的には、液体静置培養又は通気培養を行うことが好ましい。ここで、通気培養にあたっては、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産性を向上させる観点から、炭酸ガスを通気して培養することが特に好ましい。炭酸ガスを培養液に通気して培養することにより、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産速度及び生産量を顕著に向上させることができる。このうち、炭酸ガスを通気して培養する液体培地として、ＭＲＳ液体培地にＬ－システイン類を追加配合した培地を用いることにより、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性がさらに向上するため、スケールアップ培養において、効率的に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産を行うことができる。
本実施形態において、ビフィズス菌の培養にあたっては、ビフィズス菌が増殖し易い微好気条件下又は嫌気的条件下で培養することが好ましく、具体的には、液体静置培養又は通気培養を行うことが好ましい。ここで、通気培養にあたっては、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産性を向上させる観点から、炭酸ガスを通気して培養することが特に好ましい。炭酸ガスを培養液に通気して培養することにより、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産速度及び生産量を顕著に向上させることができる。このうち、炭酸ガスを通気して培養する液体培地として、ＭＲＳ液体培地にＬ－システイン類を追加配合した培地を用いることにより、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性がさらに向上するため、スケールアップ培養において、効率的に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産を行うことができる。
【0029】
本実施形態におけるビフィズス菌の培養温度としては、ビフィズス菌の増殖に好適な温度条件とすることが好ましいが、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産性、特に７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産性を向上させる観点から、後述する実施例に示されるように、培養温度は３０℃～３７℃の範囲とすることが好ましく、３２℃～３５℃の範囲とすることがより好ましく、３４℃とすることがさらに好ましい。
【0030】
また、本実施形態におけるビフィズス菌の培養時間は適宜設定でき、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸が所望の濃度となるまで培養することができる。一例として、一例として、１２時間～５日間程度とすることが好ましく、２４時間～７２時間程度とすることがより好ましい。
【0031】
（培養液の利用）
ビフィズス菌によって生産された、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）等の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸は、ビフィズス菌の菌体内に極性脂質として蓄積されている。そのため、培養工程によって得られた培養液を利用する際には、目的に応じて、培養液そのものを利用することもできるが、培養液から遠心分離処理等で菌体を回収し、菌体の状態で利用することも可能である。また、本発明の効果を失わない範囲において、回収菌体及び培養液に対し、洗浄処理、凍結乾燥やＬ－乾燥、スプレードライ等の乾燥処理又は加熱処理等の種々の追加処理を施すことも可能である。なお、回収菌体については、生菌として用いることも、死菌としても用いることも可能であり、生菌と死菌とが混合されたものを用いてもよい。さらに、回収菌体から、菌体内に蓄積された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸等の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸を含む総脂肪酸を抽出して用いたり、抽出された総脂肪酸から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸等の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸をさらに分離・精製して用いることも当然に行うことができる。
ビフィズス菌によって生産された、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）等の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸は、ビフィズス菌の菌体内に極性脂質として蓄積されている。そのため、培養工程によって得られた培養液を利用する際には、目的に応じて、培養液そのものを利用することもできるが、培養液から遠心分離処理等で菌体を回収し、菌体の状態で利用することも可能である。また、本発明の効果を失わない範囲において、回収菌体及び培養液に対し、洗浄処理、凍結乾燥やＬ－乾燥、スプレードライ等の乾燥処理又は加熱処理等の種々の追加処理を施すことも可能である。なお、回収菌体については、生菌として用いることも、死菌としても用いることも可能であり、生菌と死菌とが混合されたものを用いてもよい。さらに、回収菌体から、菌体内に蓄積された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸等の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸を含む総脂肪酸を抽出して用いたり、抽出された総脂肪酸から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸等の炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸をさらに分離・精製して用いることも当然に行うことができる。
【0032】
（黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の製造方法）
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の製造方法は、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有している。７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌、培養に用いる液体培地及び培養条件並びに培養液の利用態様については、上述した説明と同様であり、その作用効果も同様である。この黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤は、培養工程後のビフィドバクテリウム属細菌の菌体から得られた総脂肪酸の粗抽出物はもちろん、総脂肪酸の粗抽出物から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を分離・精製したものも含まれる。さらに、黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の具体的な製造方法としては、培養工程後のビフィドバクテリウム属細菌の菌体を回収する工程及び回収工程後の菌体から総脂肪酸の粗抽出物を得る抽出工程が挙げられるが、黄色ブドウ球菌選択性の抗菌活性を有するものを得られればよく、特に限定されない。なお、総脂肪酸は、菌体の総脂質から遊離型の脂肪酸として抽出されることが好ましい。また、抽出工程後に総脂肪酸の粗抽出物から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を分離・精製する精製工程を設けることも可能である。これにより、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さないが、黄色ブドウ球菌には抗菌性を示す黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤がビフィズス菌由来材料として得られる。
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の製造方法は、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有している。７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌、培養に用いる液体培地及び培養条件並びに培養液の利用態様については、上述した説明と同様であり、その作用効果も同様である。この黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤は、培養工程後のビフィドバクテリウム属細菌の菌体から得られた総脂肪酸の粗抽出物はもちろん、総脂肪酸の粗抽出物から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を分離・精製したものも含まれる。さらに、黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤の具体的な製造方法としては、培養工程後のビフィドバクテリウム属細菌の菌体を回収する工程及び回収工程後の菌体から総脂肪酸の粗抽出物を得る抽出工程が挙げられるが、黄色ブドウ球菌選択性の抗菌活性を有するものを得られればよく、特に限定されない。なお、総脂肪酸は、菌体の総脂質から遊離型の脂肪酸として抽出されることが好ましい。また、抽出工程後に総脂肪酸の粗抽出物から７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を分離・精製する精製工程を設けることも可能である。これにより、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さないが、黄色ブドウ球菌には抗菌性を示す黄色ブドウ球菌選択性抗菌剤がビフィズス菌由来材料として得られる。
【0033】
（アトピー性皮膚炎改善用飲食品・化粧料の製造方法）
本実施形態に係るアトピー性皮膚炎改善用飲食品又はアトピー性皮膚炎改善用化粧料の製造方法は、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有している。７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌、培養に用いる液体培地及び培養条件並びに培養液の利用態様については、上述した説明と同様であり、その作用効果も同様である。このようにしてビフィズス菌によって生産された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸は化学合成物ではなく、ビフィズス菌による発酵生産物である。さらに、ビフィズス菌はかねてからヨーグルト等の発酵食品やプロバイオティクスとしてヒトの健康維持のために利用されている細菌であり、安全性も高いため、サプリメントや飲料等の飲食品や乳液・クリーム等の化粧料へ利用し易い材料として７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が生産され得る。
本実施形態に係るアトピー性皮膚炎改善用飲食品又はアトピー性皮膚炎改善用化粧料の製造方法は、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌を液体培地で培養する工程を有している。７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産能を有するビフィドバクテリウム属細菌、培養に用いる液体培地及び培養条件並びに培養液の利用態様については、上述した説明と同様であり、その作用効果も同様である。このようにしてビフィズス菌によって生産された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸は化学合成物ではなく、ビフィズス菌による発酵生産物である。さらに、ビフィズス菌はかねてからヨーグルト等の発酵食品やプロバイオティクスとしてヒトの健康維持のために利用されている細菌であり、安全性も高いため、サプリメントや飲料等の飲食品や乳液・クリーム等の化粧料へ利用し易い材料として７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が生産され得る。
【0034】
ビフィズス菌によって生産された培養物を含む培養液・回収された菌体又はこれらの加工物や、回収菌体から抽出された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸は、錠剤やカプセル剤、粉末剤、顆粒剤、ゲル状剤などのサプリメント形態、発酵乳や乳酸菌飲料、清涼飲料水、スポーツ飲料などの飲料、ヨーグルトやアイスクリーム等の乳製品、アメやガム、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、調味料等のあらゆる態様の飲食品に利用することができ、アトピー性皮膚炎の改善、治療又は予防のために用いることができる。また、この飲食品には、他の機能性成分、他の微生物、糖類、ビタミン、ミネラル、アミノ酸若しくはタンパク質等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。
【0035】
また、ビフィズス菌によって生産された培養物を含む培養液・回収された菌体又はこれらの加工物や、回収菌体から抽出された７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸は、通常皮膚に適用される剤形として、従来慣用されている方法により種々の化粧料の剤型に適用されることができ、例えば、ローション等の液剤、乳液剤、ゲル剤、粉末剤又はクリーム剤、貼付剤、パック剤、クレンジング剤、石鹸又はヘアケア剤やメイクアップ製品に利用することができ、アトピー性皮膚炎の改善、治療又は予防のために用いることができる。また、この本発明の作用効果を損なわない範囲で、通常化粧料に配合される種々の成分を配合することができ、例えば、保湿剤、エモリエント剤、植物エキス、植物油脂、ｐＨ調整剤、界面活性剤、増粘剤、ビタミン類、アミノ酸類、防腐剤、香料及び色素などが挙げられる。なお、本明細書における化粧料には、化粧品だけでなく医薬部外品も含まれる。
【0036】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0037】
［実施例１］
１．炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィズス菌の検討
本実施例では、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸を生産する微生物の探索を行った。特に、飲食品や皮膚外用剤等の原材料として利用できるよう、食経験が豊富で安全性の高い発酵食品に利用される微生物を選択し、試験を行った。
１．炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸生産能を有するビフィズス菌の検討
本実施例では、炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸を生産する微生物の探索を行った。特に、飲食品や皮膚外用剤等の原材料として利用できるよう、食経験が豊富で安全性の高い発酵食品に利用される微生物を選択し、試験を行った。
【0038】
具体的には、試験は次のようにして行った。以下表１に示す組成からなるＭＲＳ液体培地を１２ｍＬネジ付き試験管に分注して各種保存菌株を接種し、ネジ付試験管を密封した状態で静置することにより液体静置培養を行った。培養温度は３７℃とし、ＯＤ６６０＝１の濁度となるまで培養して前培養液を得た。引き続いて、本培養として、ネジ付き試験管にＭＲＳ液体培地を１２ｍＬ分注した後、前培養液を１２０μＬ添加し、ネジ付試験管を密封した状態で静置して液体静置培養を行った。培養温度は３７℃、本培養の培養期間は２日間とした。
【0039】
【表1】
【0040】
本培養の培養液を３２６０×ｇで１０分間遠心分離して菌体を回収し、９５℃のオーブンで２時間乾燥させた。乾燥菌体重量は、菌体乾燥後の試験管重量から風袋量を差し引くことで算出した。内部標準にはトリコサン酸（Ｃ２３：０）を用い、濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるようにジクロロメタンに溶解した。乾燥菌体に、内部標準入りジクロロメタン１ｍＬと１０％塩酸－メタノール２ｍＬを加え、試験管を密閉して、５５℃で２時間インキュベートした。これにより、菌体からの脂肪酸抽出と、抽出された脂肪酸のメチルエステル化を同時に行った。純水１ｍＬとｎ－ヘキサン３ｍＬを加えて激しく混合した後、３２６０×ｇで１０分間遠心分離し、上層のヘキサン層を新しい試験管に移した。遠心エバポレーターによりヘキサンを除去した後、得られた脂肪酸メチルエステル画分をクロロホルム１００μＬに溶解させ、以下条件でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析に供した。なお、各脂肪酸成分は、内部標準の含有量と各脂肪酸ピークの面積値から相対的に定量した。
・カラム：脂肪酸分離用ＧＣキャピラリーカラム（型番：ＴＣ－７０、ジーエルサイエンス株式会社製品）
・カラムサイズ：内径０．２５ｍｍ×長さ６０ｍ、膜厚０．２５μｍ
・カラム温度：１６０℃
・昇温レート：２℃／ｍｉｎ ｔｏ ２３０℃
・ホールド時間：２３０℃で１０分間
・気化室温度：２５０℃
・検出器温度：２５０℃
・注入量：１μＬ
・カラム：脂肪酸分離用ＧＣキャピラリーカラム（型番：ＴＣ－７０、ジーエルサイエンス株式会社製品）
・カラムサイズ：内径０．２５ｍｍ×長さ６０ｍ、膜厚０．２５μｍ
・カラム温度：１６０℃
・昇温レート：２℃／ｍｉｎ ｔｏ ２３０℃
・ホールド時間：２３０℃で１０分間
・気化室温度：２５０℃
・検出器温度：２５０℃
・注入量：１μＬ
【0041】
この結果、ヨーグルトの生産菌で、プロバイオティクスとして良く知られるビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）に炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の生産を見出した。結果を以下表２に示す。総脂肪酸（ｍｇ／Ｌ）は培養液中に含まれる総脂肪酸量を示し、７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１（％）は、総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合を示している。これらビフィズス菌が生産する炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の構造を決定した結果、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）であることが明らかになった。ビフィズス菌のうち、特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍには、総脂肪酸のうち、２％近くもの７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１が蓄積されていることがわかった。
【0042】
【表2】
【0043】
［実施例２］
２．ビフィズス菌が生産する炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の局在性の検討
本実施例では、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産するビフィズス菌において、どのような脂質形態で７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が菌体内に蓄積されているか、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を用いて分析を行った。
２．ビフィズス菌が生産する炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸の局在性の検討
本実施例では、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産するビフィズス菌において、どのような脂質形態で７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が菌体内に蓄積されているか、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を用いて分析を行った。
【0044】
具体的には、試験は次のようにして行った。以下表３に示す組成からなるＴＯＳ液体培地をネジ付き試験管に１２ｍＬ分注し、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（以下、「ＪＣＭ７０４２株」という）を接種し、ネジ付試験管を密封した状態で静置することにより液体静置培養を行った。培養温度は３７℃とし、ＯＤ６６０＝１の濁度となるまで培養して前培養液を得た。次に、本培養として、１ＬのＴＯＳ液体培地に前培養液を１０ｍＬ添加し、密栓した状態で液体静置培養を行った。培養温度は３７℃、本培養の培養期間は３日間とした。
【0045】
【表3】
【0046】
本培養の培養液１Ｌを遠心分離して大量に菌体を回収した。湿菌体からの総脂質の抽出はＢｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒ法により行い、水／クロロホルム／メタノール（最終比率２／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）を使用して抽出した。抽出した総脂質は、薄層クロマトグラフィー上で、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１の展開溶媒にて展開した後、０．０１％（ｗ／ｖ）プリムリンを含む８０％アセトン溶液を噴霧し、３６５ｎｍの紫外光で脂質スポットを検出した。このようにして、菌体内の脂質を抽出及び分画し、脂質種ごとの脂肪酸組成と構成量を解析した。多数の脂肪酸は極性脂質（主にリン脂質）の構成脂肪酸として存在しており、図１のグラフに示すように、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）も同様に極性脂質に含まれていることが確認された。なお、図１のグラフ中のＵＫ１及びＵＫ２は未知物質を示す。
【0047】
［実施例３］
３．ビフィズス菌が生産する脂肪酸の抗菌活性の検討
本実施例では、実施例１、２において、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の有効な生産が確認されたビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株）の培養菌体から総脂肪酸を抽出し、その粗抽出物の抗菌活性について調べた。
３．ビフィズス菌が生産する脂肪酸の抗菌活性の検討
本実施例では、実施例１、２において、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の有効な生産が確認されたビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株）の培養菌体から総脂肪酸を抽出し、その粗抽出物の抗菌活性について調べた。
【0048】
具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用いた。実施例２と同様に、表３に示すＴＯＳ液体培地を用いて前培養を行った。培養温度は３７℃とし、ＯＤ６６０＝１．０の濁度となるまで培養して前培養液を得た。引き続いて、本培養として、１４ｍＬのＴＯＳ液体培地に前培養液を０．１４ｍＬ添加し、密栓した状態で３７℃条件下にて液体静置培養を行った。ＯＤ６６０＝１．０の濁度となるまで培養した後、１５ｍＬチューブに全量を移した。４℃条件下にて４０００×ｇで１５分間遠心分離し、菌体を回収した。菌体をＰＢＳで１回洗浄した後、１００μＬのＰＢＳに懸濁した。ここに５０μＬの５ＮのＨＣＬと、４００μＬのアセトニトリルを加え、１分間ボルテックスした後、１００℃条件下で１時間インキュベートし、室温まで冷却した。引き続いて、メタノール１００μＬ、ｔ－ブチルメチルエーテル８００μＬ及び超純水４００μＬを加え、１分間ボルテックスした。３００×ｇで５分間遠心分離し、上層を新しい１５ｍＬチューブに回収した。回収した上層に超純水８００μＬを加え、１分間ボルテックスした後、３００×ｇで５分間遠心分離し、上層を新しい１５ｍＬチューブに回収した。上層を乾燥させた１．５ｍＬチューブに回収し、遠心エバポレーターで乾固した。この際、１．５ｍＬチューブの重量を量り、脂肪酸抽出物の回収量を計量した。このようにして、ビフィズス菌の菌体由来の総脂肪酸を、全脂質から切り離された遊離型脂肪酸の粗抽出物として得た。
【0049】
抗菌活性を測定する対象には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を用いた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＪＣＭ２０６２４株（基準株）とＳ．ａｕｒｅｕｓ １５Ｒ２株を用い、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ １５Ｒ５株を用いた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ １５Ｒ２株とＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ １５Ｒ５株は、アトピー性皮膚炎の重症患者である同一人から単離された菌株である（岐阜大学環境微生物工学研究室保有菌株）。
【0050】
９６ｗｅｌｌ丸底プレートを２枚使用し、１枚目をビフィズス菌の脂肪酸抽出物の希釈に、２枚目を培養に用いた。まず、１枚目のプレートで脂肪酸抽出物を段階希釈した。３～１０列及び１２列目に１１μＬのＤＭＳＯと９９μＬのＮＢ培地を入れた。２列目にＤＭＳＯに溶解した２００００ｐｐｍの脂肪酸抽出物２２μＬとＮＢ培地１９８μＬを入れた。２列目をピペッティングで混合し、ここから１１０μＬを３列目に加えた。３列目をピペッティングで混合し、４列目に１１０μＬ加えた。この動作を繰り返し、１０列目の１１０μＬは１１列目に入れた。１２列目は触らなかった。次に、２枚目のプレートで菌液の準備をした。ＯＤ＝１．０まで培養した上記菌株の前培養液を１０００倍希釈し、１．０×１０５ＣＦＵ／ｍＬとなるように菌液の濃度を調整した。２～１０列目、１２列目のウェルにこの菌液を１００μＬずつ入れた。１１列目は陰性対照とし、ＮＢ培地のみを１００μＬ入れた。１枚目の９６ｗｅｌｌプレートで調製した脂肪酸抽出物の希釈物１００μＬを２枚目の９６ｗｅｌｌプレートの対応するウェルに夫々添加し、ピペッティングで混合した。このようにして、培地中の脂肪酸抽出物を１０００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、６３ｐｐｍ、３１ｐｐｍ、１６ｐｐｍ、８ｐｐｍ、４ｐｐｍ、０ｐｐｍの１０段階の濃度にした。２枚目のプレートに、ガス交換可能なプレートシール（ブリーズイージー、Diversified Biotech社製品）で蓋をし、３７℃で静置培養した。培養後、各ウェルのＯＤ６６０での濁度を測定し、脂肪酸抽出物濃度０ｐｐｍの濁度を１００％としたときの、各ウェルの濁度の割合を生育度（％）として求めた。
【0051】
図２に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株の培養菌体から得られた脂肪酸抽出物の抗菌活性を示す。この結果によれば、この脂肪酸抽出物が６０ｐｐｍ以上存在すると、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生育度が５０％以下となるが、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、脂肪酸抽出物の濃度が０～１０００ｐｐｍに亘り、６０％以上の生育度を保持した。このことから、この７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を含む脂肪酸抽出物は、このようにクルードな状態であっても、皮膚炎症の原因菌である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する選択的抗菌活性を示すことが示された。また、本実施例で得られた脂肪酸の粗抽出物に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合は２～４％程度であることから、本実施例の脂肪酸抽出物による生育度の低下がみられた濃度（６０ｐｐｍ程度）における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の濃度は１．２～２．４μｇ／ｍＬ程度と算出された。なお、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸そのものの黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣは３μｇ／ｍＬ程度である。
【0052】
［実施例４］
４．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（１）
７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産するビフィズス菌について、異なる種類の培地を用いて培養を行い、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性との関係について検討を行った。
４．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（１）
７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸を生産するビフィズス菌について、異なる種類の培地を用いて培養を行い、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性との関係について検討を行った。
【0053】
ビフィズス菌としてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ ＪＣＭ１２１１株（ｂｏｕｍ１２１１株）を用い、実施例１におけるＭＲＳ液体培地を、表３に示すＴＯＳ液体培地又は以下表４に示す組成から成るＣＳＬ液体培地に替えた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
【0054】
【表4】
【0055】
図３（ａ）にＪＣＭ７０４２株の結果を、図３（ｂ）にｂｏｕｍ１２１１株の結果を示す。７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１（ｍｇ／Ｌ）は培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の量を示し、７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１（％）は、総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合を示している。なお、ＭＲＳ液体培地については実施例１で得たデータと同様である。
【0056】
この結果によれば、培地としてＭＲＳ液体培地を用いることにより、ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産が促進され、培養液中における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の濃度が２ｍｇ／Ｌ以上となることが示された。他方、ＴＯＳ液体培地を用いた場合には、培養液中における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の濃度はＭＲＳ液体培地より低いものの、総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合が向上することが分かった。
【0057】
［実施例５］
５．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（２）
表３に示す組成のＴＯＳ液体培地に対し、ＭＲＳ培地に含まれる成分や脂肪酸生産に関与すると考えられる成分を追加添加又は置換添加することにより、ビフィズス菌の増殖と７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産に与える影響を調べた。
５．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（２）
表３に示す組成のＴＯＳ液体培地に対し、ＭＲＳ培地に含まれる成分や脂肪酸生産に関与すると考えられる成分を追加添加又は置換添加することにより、ビフィズス菌の増殖と７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産に与える影響を調べた。
【0058】
具体的には、試験は次のようにして行った。表３に示す組成からなるＴＯＳ液体培地に対し、以下表５に示す添加成分を各々添加し、液体培地を調製した。このうち、添加成分が「グルコース」の液体培地については、ＴＯＳ液体培地の組成のうちのガラクトオリゴ糖と置換する目的のため、ガラクトオリゴ糖を省いてグルコースを添加した。また、添加成分が「ペプトン」及び「カザミノ酸」の液体培地については、ＴＯＳ液体培地の組成のうちのトリプトンと置換する目的のため、トリプトンを省いて、ペプトン又はカザミノ酸を添加した。さらに、表５中に＊印で示す、添加成分が「トリプトン」の液体培地については、ＴＯＳ液体培地に元々「トリプトン」が含まれているので、比較のために、ＴＯＳ液体培地の組成からトリプトンを省いた組成の液体培地を調製して対照試験を行った。同様に、表５中＊印で示す、添加成分が「Ｌ－システイン塩酸塩」の液体培地については、ＴＯＳ液体培地に元々「Ｌ－システイン塩酸塩」が含まれているので、比較のために、ＴＯＳ液体培地の組成からＬ－システイン塩酸塩を省いた組成の液体培地を調製して対照試験を行った。
【0059】
ビフィズス菌としてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用い、実施例１におけるＭＲＳ液体培地を、上述のようにして調製した各種液体培地に替えた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各種培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。ビフィズス菌の増殖については、添加成分なし（対照）と比較して、菌体重量が増加していた場合を「◎」、菌体重量が維持されていた場合を「○」、菌体重量が減少していた場合を「△」、菌体重量が大幅に減少していた場合を「×」と評価した。また、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸（７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１）の生産については、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産量が増加していた場合を「◎」、生産量が維持されていた場合を「○」、生産量が減少していた場合を「△」、生産量が大幅に減少していた場合を「×」と評価した。なお、添加成分が「トリプトン」又は「Ｌ－システイン塩酸塩」については、これらの成分を省いた液体培地での対照試験結果と比較して評価を行った。結果を以下表５に示す。
【0060】
【表5】
【0061】
この結果によれば、Ｌ－システインはビフィズス菌の培養における必須アミノ酸であり、ビフィズス菌の増殖を向上させる効果を有しているが、それと併せて、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性をも向上させる効果があることが明らかとなった。なお、炭酸カルシウムやオレイン酸メチルエステルを添加した液体培地では、ビフィズス菌の増殖は向上するものの、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産量には影響しないか、生産量が低下することが示された。
【0062】
［実施例６］
６．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（３）
実施例４及び実施例５にて７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の高生産性が示された液体培地及び添加成分を組み合わせることにより、さらなる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上が可能であるか検討を行った。
６．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（３）
実施例４及び実施例５にて７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の高生産性が示された液体培地及び添加成分を組み合わせることにより、さらなる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上が可能であるか検討を行った。
【0063】
具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ ＪＣＭ１２１１株（ｂｏｕｍ１２１１株）を用いた。表１に示すＭＲＳ液体培地と、表１に示すＭＲＳ液体培地にＬ－システイン塩酸塩１水和物を０．５ｇ／Ｌとなるように添加したＭＲＳ＋Ｌ－Ｃｙｓ液体培地を調製し、実施例１と同様にして、これら２種の液体培地で前培養及び本培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各本培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
【0064】
図４（ａ）にＪＣＭ７０４２株の結果を、図４（ｂ）にｂｏｕｍ１２１１株の結果を示す。７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１（ｍｇ／Ｌ）は培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の量を示し、７－ｃｉｓ－Ｃ１６：１（％）は、総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合を示している。なお、ＭＲＳ液体培地については実施例１で得たデータと同様である。
【0065】
この結果によれば、培地としてＭＲＳ液体培地にＬ－システインをさらに添加した液体培地を用いることにより、ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産が促進され、培養液中における７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の濃度が４ｍｇ／Ｌ超となることが示された。また、総脂肪酸中に占める７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の割合も向上することが分かった。
【0066】
［実施例７］
７．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（４）
ビフィズス菌のスケールアップ培養を行うにあたり、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性を高める培養条件について検討を行った。
７．ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上（４）
ビフィズス菌のスケールアップ培養を行うにあたり、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性を高める培養条件について検討を行った。
【0067】
具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用いた。表１に示すＭＲＳ液体培地、表１に示すＭＲＳ液体培地にＬ－システイン塩酸塩１水和物を０．５ｇ／Ｌとなるように添加したＭＲＳ＋Ｌ－Ｃｙｓ液体培地及び表３に示すＴＯＳ液体培地をそれぞれ調製し、各液体培地を用いて前培養を行った。培養温度は３７℃とし、ＯＤ＝１の濁度となるまで培養して前培養液を得た。引き続いて、本培養として、前培養液と同じ液体培地を３Ｌ入れた３．５Ｌ容量のメジウム瓶に、前培養液を３０ｍＬ添加した。メジウム瓶内に純炭酸ガス又は純窒素ガスを通気し、スターラーで７００ｒｐｍで撹拌しながら、３７℃で培養を行った。所定のサンプリング時間に各培養液をシリンジで採取し、培養液５ｍＬ分を遠心分離して菌体を回収した。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
【0068】
結果を図５に示す。図５のグラフ中、実線及び黒丸のマーカーはＭＲＳ＋Ｌ－Ｃｙｓ液体培地に炭酸ガスを通気させて培養したもの、実線及び星印のマーカーはＭＲＳ液体培地に炭酸ガスを通気させて培養したもの、破線及び三角のマーカーはＭＲＳ液体培地に窒素ガスを通気させて培養したもの、実線及び四角のマーカーはＴＯＳ液体培地に炭酸ガスを通気させて培養したもの、破線及び菱形のマーカーはＴＯＳ液体培地に窒素ガスを通気させて培養したものの結果を示している。縦軸は培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の量を示し、横軸は本培養を行った時間（ｈ）を示している。
【0069】
このスケールアップ培養試験の結果によれば、窒素ガスを通気した試験区と比較すると、炭酸ガスを通気することにより、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の最大蓄積量が約２倍となり、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産量が大きく向上することが明らかとなった。さらに、ＭＲＳ液体培地へのＬ－システインの添加により、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産速度が大きくなり、Ｌ－システインを添加していないＭＲＳ培地と比較して、最大蓄積量に達する時間が約半減することが分かった。
【0070】
［実施例８］
８．液体培地中のＬ－システイン濃度の検討
Ｌ－システインの添加量を種々変更したＭＲＳ培地を調製し、ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産に与える影響を調べた。具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用いた。表１に示す組成のＭＲＳ液体培地に対し、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物を０．００１ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ及び５．０ｇ／Ｌとなるように添加し、Ｌ－システイン配合のＭＲＳ液体培地を調製した。これらのＬ－システイン入りＭＲＳ液体培地及び対照のＭＲＳ液体培地（Ｌ－システイン添加無し）について、実施例１と同様にして培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
８．液体培地中のＬ－システイン濃度の検討
Ｌ－システインの添加量を種々変更したＭＲＳ培地を調製し、ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産に与える影響を調べた。具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用いた。表１に示す組成のＭＲＳ液体培地に対し、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物を０．００１ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ及び５．０ｇ／Ｌとなるように添加し、Ｌ－システイン配合のＭＲＳ液体培地を調製した。これらのＬ－システイン入りＭＲＳ液体培地及び対照のＭＲＳ液体培地（Ｌ－システイン添加無し）について、実施例１と同様にして培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
【0071】
結果を図６に示す。この結果によれば、液体培地中のＬ－システイン塩酸塩の濃度が５．０ｇ／Ｌと高濃度であると７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産が大きく阻害されることがわかった。そのため、液体培地中におけるＬ－システイン塩酸塩の濃度は、０．００１～１．０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、０．０１～０．７ｇ／Ｌの範囲がより好ましいと推測された。
【0072】
［実施例９］
９．培養温度の検討
培養温度を変化させて本培養を行い、ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産に与える影響を調べた。具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用いた。表１に示す組成のＭＲＳ液体培地を用い、実施例１と同様にして３７℃で前培養を行った。引き続いて、本培養を行うにあたって培養温度を２８℃～３７℃の範囲で設定し、それぞれの培養温度で培養を行った以外は、実施例１と同様にして本培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
９．培養温度の検討
培養温度を変化させて本培養を行い、ビフィズス菌による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産に与える影響を調べた。具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用いた。表１に示す組成のＭＲＳ液体培地を用い、実施例１と同様にして３７℃で前培養を行った。引き続いて、本培養を行うにあたって培養温度を２８℃～３７℃の範囲で設定し、それぞれの培養温度で培養を行った以外は、実施例１と同様にして本培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
【0073】
結果を図７に示す。この結果によれば、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性向上に好ましい培養温度は３０℃～３７℃であることがわかった。このうち、特に３２℃～３５℃の範囲において、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性に優れ、培養液中の７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸濃度が２．５ｍｇ／Ｌ超に達することが示された。
【0074】
そこで、上述した実施例７で行ったスケールアップ培養において、本培養の培養温度を３４度に変更した以外は、実施例７と同様の手順及び方法にて、炭酸ガスを通気したスケールアップ培養を行い、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性がさらに向上するかどうか、確認する試験を行った。ビフィズス菌にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株（ＪＣＭ７０４２株）を用い、液体培地は表１に示すＭＲＳ液体培地にＬ－システイン塩酸塩１水和物を０．５ｇ／Ｌとなるように添加したＭＲＳ＋Ｌ－Ｃｙｓ液体培地を用いた。
【0075】
結果を図８に示す。縦軸は培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の量を示し、横軸は本培養を行った時間（ｈ）を示している。この結果によれば、３４℃で培養することによって、７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産性がさらに向上し、培養液中の７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸が４ｍｇ／Ｌにまで達することが示された。
【0076】
［実施例１０］
１０．突然変異導入による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産増強株の創出
本実施例では、突然変異導入法による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産増強株の取得を試みた。具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌の親株にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を用いた。表３に示す組成からなるＴＯＳ液体培地をネジ付き試験管に１２ｍＬ分注し、ＪＣＭ７０４２株を接種し、ネジ付試験管を密封した状態で静置することにより液体静置培養を行った。培養温度は３７℃とし、ＯＤ＝１の濁度となるまで培養した。この培養液１ｍＬに、メタンスルホン酸エチルを１０μＬ添加（終濃度１％（ｖ／ｖ））し、混和した後に３７℃で１時間インキュベートして突然変異導入処理を行った。
１０．突然変異導入による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産増強株の創出
本実施例では、突然変異導入法による７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産増強株の取得を試みた。具体的には、試験は次のようにして行った。ビフィズス菌の親株にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＪＣＭ７０４２株を用いた。表３に示す組成からなるＴＯＳ液体培地をネジ付き試験管に１２ｍＬ分注し、ＪＣＭ７０４２株を接種し、ネジ付試験管を密封した状態で静置することにより液体静置培養を行った。培養温度は３７℃とし、ＯＤ＝１の濁度となるまで培養した。この培養液１ｍＬに、メタンスルホン酸エチルを１０μＬ添加（終濃度１％（ｖ／ｖ））し、混和した後に３７℃で１時間インキュベートして突然変異導入処理を行った。
【0077】
本試験における指示試薬には、ナイルレッドを選択した。ナイルレッドは菌体の脂質画分に取り込まれることにより、赤色に呈色する。そのため、寒天培地上でより赤く、より早く赤色を呈したコロニーをピックアップすることで、脂肪酸の生産能が向上した変異株を取得することができる。このナイルレッドを表面塗布したＴＯＳ寒天培地に、突然変異導入処理後の菌液１００μＬを塗布し、脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパック（登録商標）・ケンキ）を用いて３７℃で嫌気培養を行った。本試験においては、生育したコロニーの赤色が強いものを優先してピックアップした。釣菌した各株について、ＴＯＳ液体培地で培養した以外は、実施例１と同様にして液体培養を行った。実施例１と同様の方法及び条件により、各培養液中に含まれる各脂肪酸の成分をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により定量した。
【0078】
この結果、一次スクリーニング、二次スクリーニングを経て、野生株であるＪＣＭ７０４２株よりも高い７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸生産性を示す変異株を２株取得することができた。図９（ａ）に、ＴＯＳ液体培地で培養した、野生株（ＪＣＭ７０４２株）と、変異株であるＡＤ１株及びＡＤ２株の培養液中に含まれる７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の量（ｍｇ／Ｌ）を示す。また、図９（ｂ）に、乾燥菌体重量あたりの７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の蓄積量（ｍｇ／ｇＤＣＷ）を示す。このうち、最も７－ｃｉｓ－ヘキサデセン酸の生産量が高かったＡＤ２株は、特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６として寄託された。
【0079】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【産業上の利用可能性】
【0080】
本発明は、有害な黄色ブドウ球菌には抗菌性を示すが、有益な表皮ブドウ球菌には抗菌性を示さない、選択的抗菌活性を示す炭素数１６のモノ不飽和脂肪酸及びそれを含有する食品や化粧料を提供するため、食品・化粧品分野や医薬部外品、医薬品等の分野の産業において幅広く役立つものである。
【受託番号】
【0081】
受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３５７６、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＤ２株、原寄託日：２０２１年１２月２２日、寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】