(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179291
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】接着細胞用培養基材及び分析方法
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20231212BHJP
C08F 20/58 20060101ALI20231212BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 A
C08F20/58
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022092537
(22)【出願日】2022-06-07
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】慈道 裕美子
(72)【発明者】
【氏名】平床 聖也
(72)【発明者】
【氏名】今富 伸哉
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 博之
【テーマコード（参考）】
4B029
4J100
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029BB11
4B029CC02
4J100AL08Q
4J100AM21P
4J100BA03P
4J100BA05Q
4J100BC43P
4J100CA01
4J100CA04
4J100JA50
(57)【要約】
【課題】
接着細胞を効率よく培養可能な細胞培養基材とその分析方法を提供すること。
【解決手段】
基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２である細胞培養基材は、接着細胞の培養において高い細胞接着性と増殖性を発現する。
【選択図】 なし
接着細胞を効率よく培養可能な細胞培養基材とその分析方法を提供すること。
【解決手段】
基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２である細胞培養基材は、接着細胞の培養において高い細胞接着性と増殖性を発現する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項2】
還元性水酸基がフェノール性水酸基であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項3】
フェノール性水酸基がカテコールであることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
【請求項4】
カテコールが、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを含むポリマー由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
【請求項5】
カテコールが、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを含むポリマー由来であることを特徴とする、請求項３に記載の細胞培養基材。
【請求項6】
基材表面の還元性水酸基の量をＢＣＡ法を用いて検出することを特徴とする、細胞培養基材の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、接着細胞を効率よく培養可能な細胞培養基材及びその分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞を原料とするバイオ医薬品は薬効の高さから普及が期待されており、原料細胞を効率よく培養する技術に注目が集まっている。用いられる原料細胞には浮遊細胞と接着細胞があり、接着細胞は基材に接着することで増殖するため、基材への接着性が培養効率に影響を及ぼす。そこで、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの被覆や、細胞接着性を有するポリマーの被覆により基材への細胞接着性を向上させる試みがなされている。タンパク質から成る細胞外マトリックスと比較して品質が安定するため、細胞接着性のポリマーを被覆した基材の研究が進められている。非特許文献１には、還元性水酸基を有するポリマーを被覆した基材において良好な細胞接着性を発現した例が報告されている。しかし、このような基材であっても細胞接着性にバラつきが生じ、実際に細胞培養を行った際に十分な細胞接着性を発現しない場合がある点が課題である。したがって、接着細胞が効率よく培養可能な基材とその品質を分析する方法が求められた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】S. H. Ku et al, “General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces”, Biomaterials, 31, 2010, p.2535-p.2541
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、接着細胞を効率よく培養可能な細胞培養基材とその分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、基材表面に特定量の還元性水酸基を有する細胞培養基材は、接着細胞の培養において高い細胞接着性と増殖性を発現することを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であることを特徴とする細胞培養基材。
＜２＞還元性水酸基がフェノール性水酸基であることを特徴とする、＜１＞に記載の細胞培養基材。
＜３＞フェノール性水酸基がカテコールであることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の細胞培養基材。
＜４＞カテコールが、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを含むポリマー由来であることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の細胞培養基材。
＜５＞カテコールが、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを含むポリマー由来であることを特徴とする、＜３＞に記載の細胞培養基材。
＜６＞
基材表面の還元性水酸基の量をＢＣＡ法を用いて検出することを特徴とする、細胞培養基材の分析方法。
＜１＞基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であることを特徴とする細胞培養基材。
＜２＞還元性水酸基がフェノール性水酸基であることを特徴とする、＜１＞に記載の細胞培養基材。
＜３＞フェノール性水酸基がカテコールであることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の細胞培養基材。
＜４＞カテコールが、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを含むポリマー由来であることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の細胞培養基材。
＜５＞カテコールが、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを含むポリマー由来であることを特徴とする、＜３＞に記載の細胞培養基材。
＜６＞
基材表面の還元性水酸基の量をＢＣＡ法を用いて検出することを特徴とする、細胞培養基材の分析方法。
【発明の効果】
【0006】
本発明の細胞培養基材は、接着細胞の培養において高い細胞接着性を発現する。また、本発明の方法によって細胞培養基材表面の還元性水酸基量を評価することで、効率よく接着細胞を培養可能な基材を得られる。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【0008】
本発明において、還元性水酸基とは還元性を示す水酸基（ヒドロキシ基）である。本発明の細胞培養基材は、基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２である。良好な細胞接着性と増殖性を発現し、接着細胞を効率よく培養できる基材表面の還元性水酸基の量は、好ましくは０．１５ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．２０ｎｍｏｌ／ｃｍ２～０．４０ｎｍｏｌ／ｃｍ２である。基材表面の還元性水酸基の量が０．１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２よりも少ないと、基材の細胞接着性が不十分であるため細胞が増殖せず、接着細胞を培養することができない。
【0009】
還元性水酸基の例として、フェノール性水酸基、アルコール性水酸基、還元糖の水酸基等が挙げられる。基材表面への付与が容易であることから、フェノール性水酸基が好ましい。
【0010】
フェノール性水酸基は、結合する水酸基の数によって１価フェノール、２価フェノール、３価フェノール等に分類される。本発明において特に限定はないが、２価フェノールの一つであるカテコールが還元性水酸基として好ましい。カテコールはベンゼン環のオルト位に二つの水酸基が結合した構造であり、水素結合や疎水性相互作用等の多様な相互作用を示すためである。
【0011】
本発明において、基材表面にカテコールを付与する方法として特に限定はなく、カテコールを有する化合物を化学的に結合させてもよく、カテコールを有する化合物を含む表面処理剤を用いて被覆させてもよい。カテコールを有する化合物の例として、２－（３，４―ジヒドロキシフェニル)エチルアミン、（３，４－ジヒドロキシフェニル）メチル（メタ）アクリレート、３，４－ジヒドロキシフェネチル（メタ）アクリレート、３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）プロピル（メタ）アクリレート、４－（３，４－ジヒドロキシフェニル）ブチル（メタ）アクリレート、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェニル）メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）（メタ）アクリルアミド（以下、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミドを「ＤＭＡ」と表記する）、Ｎ－［３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）プロピル］（メタ）アクリルアミド、Ｎ－［４－（３，４－ジヒドロキシフェニル）ブチル］（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【0012】
カテコールを有する化合物を含む表面処理剤を被覆させる場合には上記のカテコールを有する化合物を重合したポリマーを有機溶媒に溶解し表面処理剤として用いることができる。また、基材への被覆性や有機溶媒への溶解性を向上させるためにカテコールを含まないモノマーを共重合したポリマーを用いてもよい。本発明においてカテコールを含むポリマーに特に限定はないが、他のモノマーとの共重合が比較的容易であることから、Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミド（ＤＭＡ）を用いたポリマーであることが好ましい。
【0013】
本発明において基材の材質に特に限定はなく、例として、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、アクリル系ポリマー、メタクリル酸系ポリマー、シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、金属、セラミックス、ガラス等が挙げられる。また、基材の形状は特に限定はなく、例として、板状、シャーレ状、フィルム状、ビーズ状、繊維状の形状のほか、板状の基材に設けられた穴や溝や突起なども挙げられる。
【0014】
本発明は細胞培養基材であり、適用可能な細胞は特に限定はないが、例として、間葉系幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞、更に生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を用いることができる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等が挙げられる。
【0015】
また、本発明は基材表面の還元性水酸基の量をＢＣＡ法を用いて検出する、細胞培養基材の分析方法である。一般的に、ＢＣＡ法はタンパク質の定量に用いられる。アルカリ条件下においてタンパク質のペプチド結合により２価の銅イオンを１価の銅イオンに還元し、得られた１価の銅イオンとＢＣＡ（ビシンコニン酸）が反応すると青紫色の複合体を形成する。このときの吸光度を測定し、標準タンパク質で作成した検量線を用いてタンパク質を定量する。
本発明では、基材表面に存在する還元性水酸基により２価の銅イオンを１価の銅イオンに還元してＢＣＡとの複合体を形成したときの吸光度を測定し、還元性水酸基量が既知の標準サンプルで作成した検量線を用いることで基材表面の還元性水酸基を定量できる。細胞接着に必要な還元性水酸基が光や酸素により劣化した場合には２価の銅イオンの還元反応に関与せず吸光度が低下するため、ＢＣＡ法の測定結果と細胞培養性能には相関があり、本発明の方法により細胞培養基材の品質を分析することができる。
本発明では、基材表面に存在する還元性水酸基により２価の銅イオンを１価の銅イオンに還元してＢＣＡとの複合体を形成したときの吸光度を測定し、還元性水酸基量が既知の標準サンプルで作成した検量線を用いることで基材表面の還元性水酸基を定量できる。細胞接着に必要な還元性水酸基が光や酸素により劣化した場合には２価の銅イオンの還元反応に関与せず吸光度が低下するため、ＢＣＡ法の測定結果と細胞培養性能には相関があり、本発明の方法により細胞培養基材の品質を分析することができる。
【0016】
本発明において、ＢＣＡ法に用いる２価の銅イオン濃度は０．１μｍｏｌ／ｍＬ～５．０μｍｏｌ／ｍＬであることが好ましい。より好ましくは０．１μｍｏｌ／ｍＬ～２．５μｍｏｌ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．２μｍｏｌ／ｍＬ～１．０μｍｏｌ／ｍＬである。０．１μｍｏｌ／ｍＬより低いと１価の銅イオンとＢＣＡの複合体が形成されにくく、吸光度が著しく低くなるため好ましくない。また、５．０μｍｏｌ／ｍＬより高いと１価の銅イオンとＢＣＡの複合体が過剰に形成され、吸光度が著しく高くなるため好ましくない。吸光度が０．０５未満の著しく小さい場合と１．０以上の著しく大きい場合は基材表面の還元性水酸基量と吸光度の比例関係が成立しなくなり、定量が困難なためである。
【0017】
本発明において、ＢＣＡ法は任意の温度で行うことができ、例として２０℃の室温で行ってもよく、タンパク質の定量を行う場合と同様に３７℃で行ってもよい。また、測定対象のサンプルにＢＣＡ溶液を加えてから吸光度を測定するまでの時間は任意に設定することができ、２価の銅イオンが１価の銅イオンに還元されＢＣＡとの複合体を形成すればよいため、例として５分～３０分間で行うことができる。
【実施例0018】
＜検量線の作成＞
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを１０００：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が０．２５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を調製した。ＤＭＡモノマーを任意の濃度でメタノールに溶解し、還元性水酸基量が既知の標準サンプルとした。標準サンプル２５μＬとＢＣＡ溶液２００μＬを混合して９６ウェルプレートに加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを１０００：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が０．２５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を調製した。ＤＭＡモノマーを任意の濃度でメタノールに溶解し、還元性水酸基量が既知の標準サンプルとした。標準サンプル２５μＬとＢＣＡ溶液２００μＬを混合して９６ウェルプレートに加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
【0019】
＜細胞数の計測＞
細胞懸濁液中から１０μＬを細胞数測定用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈ
ａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄ）に添加し自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（R） II）を用いて、細胞数を測
定した。
細胞懸濁液中から１０μＬを細胞数測定用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈ
ａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄ）に添加し自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（R） II）を用いて、細胞数を測
定した。
【0020】
（実施例１）
カテコールを含むポリマーとしてｐＤＭＡ（ＤＭＡ＝１００ｍｏｌ％、数平均分子量４４，０００）を用い、ｐＤＭＡの０．５ｗｔ％２－メトキシエタノール溶液を浮遊細胞用無処理ディッシュ（ＡＧＣテクノグラス（株）製、１０１０－０６０）に１００μＬ滴下し、３０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートすることで細胞培養基材１を作製した。 ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを１０００：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が０．２５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を細胞培養基材１に１ｍＬ加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線から細胞培養基材１の表面の還元性水酸基量を算出したところ、０．３４ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
カテコールを含むポリマーとしてｐＤＭＡ（ＤＭＡ＝１００ｍｏｌ％、数平均分子量４４，０００）を用い、ｐＤＭＡの０．５ｗｔ％２－メトキシエタノール溶液を浮遊細胞用無処理ディッシュ（ＡＧＣテクノグラス（株）製、１０１０－０６０）に１００μＬ滴下し、３０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートすることで細胞培養基材１を作製した。 ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを１０００：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が０．２５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を細胞培養基材１に１ｍＬ加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線から細胞培養基材１の表面の還元性水酸基量を算出したところ、０．３４ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
【0021】
また、細胞培養基材１にヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ロンザジャパン（株）製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ：ＰＴ－２５０１）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液にはＣｉＭＳＴＭ－ｓＡＦを添加したＣｉＭＳＴＭ－ＢＭ（（株）細胞科学研究所製）を用いた。３日間培養後、トリプシンを用いて細胞を回収し細胞数を計測したところ、４．５×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【0022】
（実施例２）
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡと２―メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）のランダム共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｒａｎ－ＭＥＡ）（ＤＭＡ／ＭＥＡ＝４０／６０ｍｏｌ％、数平均分子量４５，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材２を作製し、細胞培養基材２の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．３１ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡと２―メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）のランダム共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｒａｎ－ＭＥＡ）（ＤＭＡ／ＭＥＡ＝４０／６０ｍｏｌ％、数平均分子量４５，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材２を作製し、細胞培養基材２の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．３１ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
【0023】
また、細胞培養基材２を用いて実施例１と同様の方法で細胞の培養と回収を行ったところ、細胞数は３．３×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【0024】
（実施例３）
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡとｎ－ブチルアクリレート（ＢＡ）のブロック共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｂ－ＢＡ）－１（ＤＭＡ／ＢＡ＝７２／２８ｍｏｌ％、数平均分子量１０６，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材３を作製し、細胞培養基材３の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．１８ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡとｎ－ブチルアクリレート（ＢＡ）のブロック共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｂ－ＢＡ）－１（ＤＭＡ／ＢＡ＝７２／２８ｍｏｌ％、数平均分子量１０６，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材３を作製し、細胞培養基材３の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．１８ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
【0025】
また、細胞培養基材３を用いて実施例１と同様の方法で細胞の培養と回収を行ったところ、細胞数は２．９×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【0026】
（実施例４）
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡとＢＡのランダム共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｒａｎ－ＢＡ）（ＤＭＡ／ＢＡ＝７０／３０ｍｏｌ％、数平均分子量４７，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材４を作製し、細胞培養基材４の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．１６ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡとＢＡのランダム共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｒａｎ－ＢＡ）（ＤＭＡ／ＢＡ＝７０／３０ｍｏｌ％、数平均分子量４７，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材４を作製し、細胞培養基材４の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．１６ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
【0027】
また、細胞培養基材４を用いて実施例１と同様の方法で細胞の培養と回収を行ったところ、細胞数は２．３×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【0028】
（比較例１）
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡとＢＡのブロック共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｂ－ＢＡ）－２（ＤＭＡ／ＢＡ＝５２／４８ｍｏｌ％、数平均分子量８９，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材５を作製し、細胞培養基材５の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．０６ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
カテコールを含むポリマーとしてＤＭＡとＢＡのブロック共重合体ｐ（ＤＭＡ－ｂ－ＢＡ）－２（ＤＭＡ／ＢＡ＝５２／４８ｍｏｌ％、数平均分子量８９，０００）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞培養基材５を作製し、細胞培養基材５の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．０６ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
【0029】
また、細胞培養基材５を用いて実施例１と同様の方法で細胞の培養と回収を行ったところ、細胞数は０．８×１０５ｃｅｌｌｓであり細胞が増殖しなかった。
【0030】
（比較例２）
カテコールを含むポリマーとしてｐＤＭＡを用いて、実施例１と同様の方法で作製した細胞培養基材を自然光に１か月間曝すことで細胞培養基材６を作製した。細胞培養基材６の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．０８ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
カテコールを含むポリマーとしてｐＤＭＡを用いて、実施例１と同様の方法で作製した細胞培養基材を自然光に１か月間曝すことで細胞培養基材６を作製した。細胞培養基材６の表面の還元性水酸基量を測定したところ、０．０８ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。
【0031】
また、細胞培養基材６を用いて実施例１と同様の方法で細胞の培養と回収を行ったところ、細胞数は１．６×１０５ｃｅｌｌｓであり細胞がほとんど増殖しなかった。
【0032】
（比較例３）
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを５０００：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が０．０５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を調製した。実施例１と同様の方法で作製した細胞培養基材１にＢＣＡ溶液を１ｍＬ加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定したところ、０．０４であり、検出下限未満であるため還元性水酸基の定量が不可であった。
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを５０００：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が０．０５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を調製した。実施例１と同様の方法で作製した細胞培養基材１にＢＣＡ溶液を１ｍＬ加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定したところ、０．０４であり、検出下限未満であるため還元性水酸基の定量が不可であった。
【0033】
（比較例４）
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを４８：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が５．１５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を調製した。実施例１と同様の方法で作製した細胞培養基材１にＢＣＡ溶液を１ｍＬ加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定したところ１．６０であり、検出上限を超えているため還元性水酸基の定量が不可であった。
ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂを４８：１の割合で混合し、２価の銅イオン濃度が５．１５μｍｏｌ／ｍＬのＢＣＡ溶液を調製した。実施例１と同様の方法で作製した細胞培養基材１にＢＣＡ溶液を１ｍＬ加え、２０℃の室温で１０分間静置した後にプレートリーダー（コロナ電気（株）製、ＳＨ－１３００Ｌａｂ）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定したところ１．６０であり、検出上限を超えているため還元性水酸基の定量が不可であった。
【0034】
【表1】