特開 2023-180980 ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法、およびその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023180980

(43)【公開日】2023-12-21

(54)【発明の名称】ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法、およびその利用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20231214BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022094692

(22)【出願日】2022-06-10

(71)【出願人】

【識別番号】390011442

【氏名又は名称】株式会社マンダム

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】河野 まおり

(72)【発明者】

【氏名】高石 雅之

(72)【発明者】

【氏名】池田 英史

(72)【発明者】

【氏名】石原 康宏

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA07

4B063QQ89

4B063QR56

4B063QR72

4B063QS25

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】新規なＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法、およびその利用技術を提供する。
【解決手段】ＣＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン、および、ＣＣケモカイン受容体からなる群より選択される少なくとも１種の指標に基づいて、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法であって、
評価対象のＰＭ２．５をケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程と、
前記細胞における以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、
を有する、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体

【請求項2】

請求項１に記載の方法により、炎症誘導性を有すると評価されたＰＭ２．５と、炎症抑制物質の候補物質とを、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程と、
前記細胞における以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、
を有する、ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体

【請求項3】

以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子またはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価するための評価キット。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法、およびその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、大気汚染の問題が深刻化し、呼吸器系のみならず、皮膚および目への影響が懸念されている。大気汚染物質の代表として挙げられるＰＭ２．５（微小粒子状物質）は、自動車の排気ガスまたは工場からの排煙などに由来する微粒子状物質であり、皮膚および目に付着した後に当該組織に浸透することによって炎症を誘導し、当該組織を構成する細胞を損傷させることが知られている。

【0003】

これまでに、ＰＭ２．５に誘発される皮膚トラブルおよび呼吸器系疾患の増悪を抑制する成分がスクリーニングされている（特許文献１および特許文献２）。

【0004】

ＰＭ２．５によって炎症が誘発されるメカニズムとしては、転写因子であるＡｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｈＲ）にＰＭ２．５が作用することによって活性酸素種が発生し、当該活性酸素種のシグナル伝達経路の下流に存在するサイトカイン（例えば、ＰＧＥ２、およびＩＬ－８）の産生が誘導され、当該サイトカインによって炎症が誘発されるメカニズムが知られている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】再表２０１８／２２５７１８号公報

【特許文献2】特開２０２０－１２５２８１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Peng F. et al., “Potential role of PM2.5 in melanogenesis” Environment International, 2019 Nov;132:105063

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、ＰＭ２．５の炎症誘導性については、十分に理解されておらず、ＰＭ２．５の炎症誘導性（例えば、皮膚および目に対するＰＭ２．５の炎症誘導性）について、さらなる検討の余地があった。

【0008】

本発明は、上述の問題に鑑みなされたものであって、ＰＭ２．５が炎症を誘導する未知のメカニズムを明らかにし、当該メカニズムに基づいた、新規なＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法、およびその利用技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、以下の発明を包含する。

【0010】

〔１〕ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法であって、
評価対象のＰＭ２．５をケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程と、上記細胞における以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0011】

〔２〕〔１〕に記載の方法により、炎症誘導性を有すると評価されたＰＭ２．５と、炎症抑制物質の候補物質とを、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程と、上記細胞における以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、
を有する、ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0012】

〔３〕以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子またはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価するための評価キット：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、新規なＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法、およびその利用技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＰＭ２．５に接触させた後の、ケラチノサイト細胞におけるＣＸＣケモカイン、および、ＣＣケモカインの定量結果を示すグラフである。

【図2】ＰＭ２．５に接触させた後の、角膜上皮細胞におけるＣＸＣケモカイン、および、ＣＣケモカインの定量結果を示すグラフである。

【図3】炎症誘導性を有するＰＭ２．５および被験物質に接触させた後の、三次元皮膚モデル細胞におけるＣＸＣケモカインの定量結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。本発明は、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ｘ～Ｙ」は、「Ｘ以上Ｙ以下」を意図する。

【0016】

〔１．ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法〕
本発明の一実施形態に係るＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法は、評価対象のＰＭ２．５をケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程と、上記細胞における以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する；（ａ）ＣＸＣケモカイン、（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体、（ｃ）ＣＣケモカイン、（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0017】

ＰＭ２．５は、採取された時期および／または場所によって、含有する金属イオン等の組成が異なることが知られている。本発明者らは、上記課題について鋭意検討し、異なる場所で採取されたＰＭ２．５に関して、炎症を強く誘導することが知られているケモカインおよび／またはケモカイン受容体の発現に与える影響を調べた結果、特定のＰＭ２．５が、炎症を強く誘導することが知られているケモカインおよび／またはケモカイン受容体の発現に影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0018】

特に、従来、ＰＭ２．５は、サイトカインを介して炎症を誘導することが知られていたが、ケモカインおよび／またはケモカイン受容体との関連は報告がなく、全くの新規知見である。サイトカインのみならず、ケモカインおよび／またはケモカイン受容体の産生も誘導するＰＭ２．５は、毒性が高いと推測される。したがい、本発明によれば、サイトカインだけでなく、ケモカインおよび／またはケモカイン受容体の産生も誘導する、より悪性度が高い（皮膚への悪影響が大きい）ＰＭ２．５を評価し得る点で、技術的意義が大きいといえる。それゆえ、本発明は、ＰＭ２．５に関連する病気等の脅威の低減に繋がることから、例えば、持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の目標３（あらゆる年齢のすべての人々の健康的な生活を確保し、福祉を促進する）の達成に貢献し得る。

【0019】

本発明の一実施形態に係る「ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法」は、「ＰＭ２．５のケモカインおよび／またはケモカイン受容体の発現誘導性を評価する方法」であってもよい。

【0020】

本発明において、ＰＭ２．５により誘導される炎症としては、限定されるものではないが、例えば、皮膚、目（例えば、角膜、結膜、眼瞼など）、および呼吸器（例えば、肺、気管支など）などの器官で発症する炎症を挙げることができる。ケラチノサイト細胞および角膜上皮細胞などの上皮細胞は、上述した器官の表層に多く存在する。それ故に、上記構成であれば、より精度高く、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価することができる。

【0021】

〔１－１．接触工程〕
接触工程は、評価対象のＰＭ２．５を、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる工程である。

【0022】

（ＰＭ２．５）
ＰＭ２．５とは、大気中に浮遊している、粒径が２．５μｍ以下の粒子のことをいう。より具体的に、ＰＭ２．５は、粒径が２．５μｍ以下の粒子を分離できる分粒装置を用いて、大気中に浮遊する粒子から粒径が２．５μｍよりも大きい粒子を除去した後に採取される粒子であってもよい。

【0023】

評価対象のＰＭ２．５は、所望の地点で採取されたものであってもよく、所望の地点で採取された粒子から粒径が２．５μｍよりも大きい粒子を除去して得られるものであってもよく、市販製品であってもよい。

【0024】

（細胞）
本発明の一実施形態において用いられる細胞は、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞である。

【0025】

当該細胞は、例えば、生体から採取された野生型の細胞、生体から採取された細胞を株化した細胞、これらの形質転換細胞、組織モデル（例えば、三次元皮膚モデル）に含まれる生体から採取された野生型の細胞、組織モデル（例えば、三次元皮膚モデル）に含まれる生体から採取された細胞を株化した細胞、または、組織モデル（例えば、三次元皮膚モデル）に含まれるこれらの形質転換細胞であってもよい。また、用いられる細胞が多層化された市販の三次元モデルであってもよい。

【0026】

本発明の一実施形態において用いられる細胞の由来としては、哺乳動物であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ等が挙げられるが、ヒトであることが好ましい。

【0027】

（接触方法）
上記細胞をＰＭ２．５に接触させる方法は、特に限定されず、公知の方法であってよい。例えば、細胞を培養する培地に、ＰＭ２．５を添加してインキュベーションする方法、または、当該細胞にＰＭ２．５を直接添加する方法等が挙げられる。

【0028】

培地に被験物質を添加してインキュベーションする方法は、用いられる細胞の種類に応じて適宜に選択することができ、かかる方法としては、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法等が挙げられる。

【0029】

上記培地としては、用いられる細胞が生育するのに適した成分（例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ等）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等）を含む培地を用いることができる。上記培地は、市販されている培地であってもよい。細胞の培養に用いられる培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地等が挙げられる。用いられる細胞がケラチノサイト細胞である場合、ＥｐｉＬｉｆｅ培地等が用いられ得る。用いられる細胞が角膜上皮細胞である場合、ＥＭＥＭ培地等が用いられ得る。

【0030】

また、インキュベーション温度、および二酸化炭素濃度等の条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ケラチノサイト細胞を用いる場合、かかる細胞は、通常、４～６体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６．０～３８．０℃、好ましくは３６．５～３７．５℃でインキュベーションすればよく、角膜上皮細胞を用いる場合、かかる細胞は、通常、４～６体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６．０～３８．０℃、好ましくは３６．５～３７．５℃でインキュベーションすればよい。

【0031】

被験物質に接触させる細胞の数は、（ｉ）試験データの信頼性の観点から、ＰＭ２．５を含む培地１００μＬあたり、それぞれ１×１０^１細胞以上が好ましく、１×１０^３細胞以上がより好ましく、（ｉｉ）細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、１×１０^５細胞以下が好ましく、１×１０^４細胞以下がより好ましい。

【0032】

細胞にＰＭ２．５を直接添加する方法としては、特に限定されず、塗布、パッチ、滴下、噴霧等であってよい。細胞に接触させるＰＭ２．５の量は、ＰＭ２．５の種類、および／または、用いる細胞の種類に応じて適宜設定することができる。

【0033】

なお、細胞は、当該細胞をＰＭ２．５により引き起こされる生理学的事象を測定するのに適した状態に維持するために、当該細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。

【0034】

本発明の一実施形態において、細胞をＰＭ２．５に接触させる接触時間は、限定されない。細胞内シグナル伝達に要する時間を考慮すれば、細胞をＰＭ２．５に接触させる接触時間は、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは６時間以上であり、また、細胞毒性の影響を考慮して、好ましくは２４時間以内であり、より好ましくは１２時間以内である。

【0035】

〔１－２．培養工程〕
本発明の一実施形態に係る評価方法は、必要に応じて、上記接触工程の後に、ＰＭ２．５に接触させた細胞を、ＰＭ２．５を含まない培地中で所定時間培養する培養工程をさらに含んでもよい。

【0036】

接触工程において細胞をＰＭ２．５に接触させることにより、指標となる遺伝子および／またはタンパク質の生産に変化が生じ、当該変化が測定可能なレベルに到達するまでには、一定の時間がかかる場合がある。この場合は、接触工程の後に、培養工程を行うことが好ましい。

【0037】

細胞を培養する培養方法は、特に限定されず、用いられる細胞の種類に応じて適宜に選択することができ、かかる方法としては、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法等が挙げられる。

【0038】

上記培地としては、上記接触工程について説明したものと同じ培地を用いることができる。また、インキュベーション温度、二酸化炭素濃度等の条件は、上記接触工程について説明したものと同じ条件を用いることができる。

【0039】

培養時間は、用いられる細胞および測定する指標に応じて適宜設定され得るが、例えば、転写開始に要する時間を考慮して、１時間以上であり、より好ましくは６時間以上であり、また、細胞毒性の影響を考慮して、好ましくは２４時間以内であり、より好ましくは１２時間以内である。

【0040】

〔１－３．測定工程〕
測定工程は、上記接触工程においてＰＭ２．５に接触させた細胞における、少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する工程である。

【0041】

（指標）
本発明の一実施形態において用いられる指標は、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種であり、測定工程では、当該指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が測定される：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0042】

ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣケモカインファミリーを意図しており、αケモカイン（またはそのファミリー）とも称する。ＣＸＣケモカインとしては、例えば、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８（ＩＬ－８）、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７等が挙げられる。これらのＣＸＣケモカインの中では、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、および、ＣＸＣＬ８が、指標として特に好ましい。

【0043】

ＣＸＣケモカイン受容体は、ＣＸＣケモカイン受容体ファミリーを意図しており、例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ６等が挙げられる。これらのＣＸＣケモカイン受容体の中では、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、および、ＣＸＣＲ７が、指標として特に好ましい。

【0044】

ＣＣケモカインは、ＣＣケモカインファミリーを意図しており、βケモカイン（またはそのファミリー）とも称する。ＣＣケモカインとしては、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８等が挙げられる。これらのＣＣケモカインの中では、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、および、ＣＣＬ４が、指標として特に好ましい。

【0045】

ＣＣケモカイン受容体は、ＣＣケモカイン受容体ファミリーを意図しており、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲＬ２、ＮＣＣＲＰ１等が挙げられ。これらのＣＣケモカイン受容体の中では、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、および、ＣＣＲ５が、指標として特に好ましい。

【0046】

上記指標となるタンパク質および遺伝子のアクセッション番号を、以下の表１～表４に示す。

【0047】

【表1】

【0048】

【表2】

【0049】

【表3】

【0050】

【表4】

【0051】

（測定方法）
指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する方法は、特に限定されず、指標となるタンパク質の産生、または、遺伝子の発現を測定する公知の方法であってよい。遺伝子の発現量の測定は、例えば、ｍＲＮＡの発現を測定する方法を挙げることができる。

【0052】

ｍＲＮＡの発現を測定する方法としては、例えば、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、ノーザンブロット解析法、ドットブロット法、ＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析、マイクロアレイ、ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）等により測定する方法が挙げられる。

【0053】

タンパク質の発現を測定する方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、バイオアッセイ法等が挙げられる。

【0054】

上述した測定方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うこともでき、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。また、複数の遺伝子および／またはタンパク質等の発現量を測定する場合、それらの発現量は、例えば、それぞれ別個に測定してもよく、まとめて同時に測定してもよい。

【0055】

〔１－４．評価工程〕
本発明の一実施形態に係る評価方法は、上記測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する評価工程をさらに含んでもよい。

【0056】

より具体的に、評価工程において、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量と、対照の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量とを比較することで、当該ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価することができる。

【0057】

対照としては、限定されず、
ＰＭ２．５に接触させる前の細胞（対照Ａ）、
既知の炎症誘導性を有しないＰＭ２．５に接触させた後の細胞（対照Ｂ）、
既知の炎症誘導性を有しない物質に接触させた後の細胞（対照Ｃ）、
既知の炎症誘導性を有するＰＭ２．５に接触させた後の細胞（対照Ｄ）、
既知の炎症誘導性を有する物質に接触させた後の細胞（対照Ｅ）、
等を用いることができる。

【0058】

例えば、対照Ａ、対照Ｂまたは対照Ｃを対照とする場合、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ａ～Ｃ）における遺伝子発現量またはタンパク質産生量と比べて同等、または少ない場合、ＰＭ２．５が炎症誘導性を有しない、または有するが少ないと評価することができる。一方、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ａ～Ｃ）における遺伝子発現量またはタンパク質産生量と比べて多い場合、ＰＭ２．５が炎症誘導性を有すると評価することができる。

【0059】

例えば、対照Ｄまたは対照Ｅを対照とする場合、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ｄ～Ｅ）における遺伝子発現量またはタンパク質産生量と比べて同等、または多い場合、ＰＭ２．５が炎症誘導性を有すると評価することができる。一方、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ｄ～Ｅ）における遺伝子発現量またはタンパク質産生量と比べて少ない場合、ＰＭ２．５が炎症誘導性を有しない、または有するが低いと評価することができる。

【0060】

なお、本願明細書において、発現量または産生量が少ないとは、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が、対照における発現量または産生量と比較して、１．０倍未満であり、好ましくは１／２以下であり、より好ましくは１／５以下であり、最も好ましくは１／１０以下であることを指す。

【0061】

また、本願明細書において、発現量または産生量が多いとは、ＰＭ２．５に接触させた後の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が、対照における発現量または産生量と比較して、１．０倍超であり、好ましくは２．０倍以上であり、より好ましくは５．０倍以上であり、最も好ましくは１０倍以上であることを指す。

【0062】

〔２．ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法〕
本発明の一実施形態に係るＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法は、本発明の一実施形態に係るＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法（上述した〔１〕に記載の方法）により、炎症誘導性を有すると評価されたＰＭ２．５（本項目では、以降「炎症誘導性を有するＰＭ２．５（Ｘ）」と表記する）と、被験物質である炎症抑制物質の候補物質（本項目では、以降「被験物質（Ｙ）」と表記する）とを、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程と、上記細胞における以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する；（ａ）ＣＸＣケモカイン、（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体、（ｃ）ＣＣケモカイン、（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0063】

本発明に係るＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法によれば、ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質をスクリーニングすることができる。

【0064】

本発明の一実施形態に係る「ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法」は、「ＰＭ２．５に起因するケモカインおよび／またはケモカイン受容体の発現誘導を制御（例えば、抑制）する物質のスクリーニング方法」であってもよい。

【0065】

当該スクリーニング方法において用いられる細胞、接触方法、接触時間、指標、および測定方法は、上述のＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法において用いられるものと同様である。したがって、ここでは、その説明を省略する。

【0066】

ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質の候補物質（被験物質（Ｙ））としては、特に限定されず、化合物であってもよいし、組成物であってもよい。組成物としては、例えば、化粧品、医薬品などが挙げられる。また、化合物としては、上記化粧品または医薬品に含まれる各成分が挙げられる。

【0067】

当該スクリーニング方法は、上述のＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法と同様に、必要に応じて、炎症誘導性を有するＰＭ２．５（Ｘ）と、被験物質（Ｙ）とを、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞に接触させる接触工程の後に、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触された細胞を、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）を含まない培地中で所定時間培養する培養工程をさらに含んでもよい。当該培養工程の構成は、上述のＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法において用いられる構成と同様であり得るので、ここではその説明を省略する。

【0068】

当該スクリーニング方法は、接触工程の後、または、培養工程の後に、ケラチノサイト細胞および／または角膜上皮細胞における上述した（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程を有する。当該測定工程は、上述のＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する方法において用いられる構成と同様であり得るので、ここではその説明を省略する。

【0069】

当該スクリーニング方法は、上記測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、被験物質（Ｙ）がＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質であるか否かを評価する評価工程をさらに含んでもよい。

【0070】

より具体的に、評価工程において、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触させた後の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量と、対照の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量とを比較することで、被験物質（Ｙ）がＰＭ２．５（Ｘ）に起因する炎症を抑制する物質であるか否かを評価することができる。

【0071】

対照としては、限定されず、
炎症誘導性を有するＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触させる前の細胞（対照Ａ’）、
既知の炎症誘導性を有しないＰＭ２．５に接触させた後の細胞（対照Ｂ’）、
既知の炎症誘導性を有しない物質に接触させた後の細胞（対照Ｃ’）、
既知の炎症誘導性を有するＰＭ２．５に接触させた後の細胞（対照Ｄ’）、
既知の炎症誘導性を有する物質に接触させた後の細胞（対照Ｅ’）、
等を用いることができる。

【0072】

例えば、対照Ａ’、対照Ｂ’または対照Ｃ’を対照とする場合、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触させた後の細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ａ’～Ｃ’）における遺伝子発現量またはタンパク質産生量と比べて同等、または少ない場合、被験物質（Ｙ）がＰＭ２．５（Ｘ）に起因する炎症を抑制する物質であると評価することができる。

【0073】

例えば、対照Ｄ’または対照Ｅ’を対照とする場合、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触させた後の細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ｄ’～Ｅ’）における遺伝子発現量またはタンパク質産生量と比べて同等、または多い場合、被験物質（Ｙ）がＰＭ２．５（Ｘ）に起因する炎症を抑制する物質でないと評価することができる。

【0074】

なお、本願明細書において、発現量または産生量が少ないとは、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触させた後の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が、対照における発現量または産生量と比較して、１．０倍未満であり、好ましくは１／２以下であり、より好ましくは１／５以下であり、最も好ましくは１／１０以下であることを指す。

【0075】

また、本願明細書において、発現量または産生量が多いとは、ＰＭ２．５（Ｘ）および被験物質（Ｙ）に接触させた後の細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が、対照における発現量または産生量と比較して、１．０倍超であり、好ましくは２．０倍以上であり、より好ましくは５．０倍以上であり、最も好ましくは１０倍以上であることを指す。

【0076】

〔３．ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価するための評価キット〕
本発明の一実施形態に係るＰＭ２．５の炎症誘導性を評価するための評価キットは、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子またはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている；（ａ）ＣＸＣケモカイン、（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体、（ｃ）ＣＣケモカイン、（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0077】

より具体的に、本発明の一実施形態に係るＰＭ２．５の炎症誘導性を評価するための評価キット（例えば、マイクロアレイ用キット、ＰＣＲ用キット）は、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標のｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている；（ａ）ＣＸＣケモカイン、（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体、（ｃ）ＣＣケモカイン、（ｄ）ＣＣケモカイン受容体。

【0078】

本発明の一実施形態に係る「ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価するための評価キット」は、「ＰＭ２．５のケモカインおよび／またはケモカイン受容体の発現誘導性を評価するための評価キット」であってもよい。

【0079】

ｍＲＮＡに特異的に結合するプローブとしては、当該ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド等が挙げられる。また、タンパク質に特異的に結合するプローブとしては、当該タンパク質に特異的に結合する抗体等が挙げられる。

【0080】

上記プローブは、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため、本評価キットは、上記プローブを固定化した、マイクロアレイチップ、ＤＮＡチップ、タンパク質チップ等として提供するものであってもよい。上記固相としては、プローブを固定化できるものであれば特に制限されないが、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー等の基板を挙げることができる。

【0081】

本発明に係る評価キットは、さらに、プローブに捕捉されたｍＲＮＡまたはタンパク質を定量するために、当該ｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合する第２のプローブであって、標識化されている第２のプローブを備えていてもよい。第２のプローブとしては、ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする標識化されたポリヌクレオチド、タンパク質に特異的に結合する標識化された抗体を挙げることができる。なお、標識化する方法としては、特に限定されず、例えば、蛍光色素などを用いて標識化することができる。

【実施例0082】

〔１：細胞における、ＰＭ２．５との接触によるタンパク質の発現量解析〕
（ＰＭ２．５）
ＰＭ２．５の炎症誘導性を評価する試料として、採取地点が異なる、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の４種類のＰＭ２．５を用いた。

【0083】

なお、別途解析にて、ＰＭ２．５－（Ａ）、ＰＭ２．５－（Ｃ）は、皮膚等にて炎症を引き起こす物質（例えば、有機炭素）の含有量が少ない、「炎症誘導性が弱い」ＰＭ２．５であり、ＰＭ２．５－（Ｂ）、ＰＭ２．５－（Ｄ）は、皮膚等にて炎症を引き起こす物質（例えば、有機炭素）の含有量が多い、「炎症誘導性が強い」ＰＭ２．５であることを確認している。

【0084】

（細胞の培養）
三次元皮膚モデル（ＬａｂＣｙｔｅＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製、ケラチノサイト細胞を多層化したモデル）を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下にて、ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ培地（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）で２４時間培養した。また、三次元角膜モデル（ＬaｂＣｙｔｅ ＣＯＲＮＥＡ－ＭＯＤＥＬ、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製、角膜上皮細胞を多層化したモデル）を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下にて、ＣＯＲＮＥＡ－ＭＯＤＥＬ培地（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）で２４時間培養した。

【0085】

培養を開始してから２４時間後に、細胞上清を回収し、指標であるタンパク質（ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４）の発現量を、市販のキット（ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘイムノアッセイキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて解析した。

【0086】

対照として、三次元皮膚モデルまたは三次元角膜モデルを、ＰＭ２．５を含まない培地で培養し、無処置の細胞試料（図１、２中に示す「ｕｎｔ」）を得た。

【0087】

図１に示すように、三次元皮膚モデルにおいて、「炎症誘導性が弱い」ＰＭ２．５－（Ａ）、ＰＭ２．５－（Ｃ）と接触させた場合に比して、「炎症誘導性が強い」ＰＭ２．５－（Ｂ）、ＰＭ２．５－（Ｄ）と接触させた場合に、指標であるタンパク質の発現量の顕著な増加が認められた。

【0088】

図２に示すように、三次元角膜モデルにおいて、「炎症誘導性が弱い」ＰＭ２．５－（Ａ）、ＰＭ２．５－（Ｃ）と接触させた場合に比して、「炎症誘導性が強い」ＰＭ２．５－（Ｂ）、ＰＭ２．５－（Ｄ）と接触させた場合に、指標であるタンパク質の発現量の顕著な増加が認められた。

【0089】

〔２：細胞における、炎症誘導性を有すると評価されたＰＭ２．５および被験物質との接触によるｍＲＮＡの発現量の変動解析〕
（細胞の培養）
三次元皮膚モデル（ＬａｂＣｙｔｅＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下にて、ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ培地（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）で２４時間培養した。

【0090】

水のみを含む水溶液１を作製した（図３の「untreated」に対応）。被験物質（具体的には、炎症抑制効果を有することが知られているトロロックス）を含まず、かつ、ＰＭ２．５－（Ｂ）を含む水溶液２を作製した（図３の「PM2.5_B w/o compd」に対応）。被験物質（具体的には、炎症抑制効果を有することが知られているトロロックス）を含み、かつ、ＰＭ２．５－（Ｂ）を含む水溶液３を作製した（図３の「PM2.5_B w/ compd」に対応）。

【0091】

水溶液１～３の各々を、上記で作製した三次元皮膚モデルを含むウェル内の培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６時間インキュベートした。

【0092】

６時間のインキュベート後に、各々のウェルから三次元皮膚モデル細胞を回収し、指標となる遺伝子（ＣＸＣＬ１、ＩＬ－８）のｍＲＮＡ発現量の変動を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により解析した。なお、細胞からのトータル ＲＮＡ抽出は市販のキット（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ ｃｅｌｌｓキット、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法は市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて行った。

【0093】

図３に示すように、三次元皮膚モデルをＰＭ２．５－（Ｂ）のみと接触させた場合（図３の「PM2.5_B w/o compd」）に、無処置の細胞試料（図３の「untreated」）に比して、指標である遺伝子のｍＲＮＡの発現量の顕著な増加が認められた。一方、三次元皮膚モデルをＰＭ２．５－（Ｂ）および被験物質と接触させた場合（図３の「PM2.5_B w/ compd」）に、ＰＭ２．５－（Ｂ）のみと接触させた細胞試料（図３の「PM2.5_B w/o compd」）に比して、指標である遺伝子のｍＲＮＡの発現量の顕著な減少が認められた。

【0094】

本実施例から、本発明の一実施形態に係るＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質のスクリーニング方法は、ＰＭ２．５に起因する炎症を抑制する物質を正確にスクリーニングできることが明らかになった。

【産業上の利用可能性】

【0095】

本発明は、大気汚染の評価に関する分野、より具体的にＰＭ２．５の評価に関する分野に利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】