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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182520
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】ステージ５ニューロンの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20231219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231219BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
C12N5/10
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023030877
(22)【出願日】2023-03-01
(31)【優先権主張番号】P 2022095627
(32)【優先日】2022-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2022178783
(32)【優先日】2022-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000006747
【氏名又は名称】株式会社リコー
(74)【代理人】
【識別番号】110001634
【氏名又は名称】弁理士法人志賀国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】林 和花
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 日佳流
(72)【発明者】
【氏名】塩本 周作
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ61
4B063QR77
4B063QR90
4B063QX01
4B065AC20
4B065BB40
(57)【要約】
【課題】未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンを、樹状突起スパインとポストシナプスが形成されたステージ５ニューロンへと成熟化させる技術を提供する。
【解決手段】未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、
成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法。
成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法。
【請求項2】
前記ステージ５ニューロンには、樹状突起スパインが形成されている、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記ステージ５ニューロンには、ドレブリン及びＰＳＤ９５を含むポストシナプス構造が形成されている、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記ステージ３ニューロンは、ＭＡＰ２及びニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）を含む神経マーカーを発現し、極性化されている、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項5】
前記ステージ３ニューロンが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化誘導により得られたものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項6】
前記ステージ３ニューロンが、前記ｉＰＳＣにおける転写因子の発現誘導により分化誘導されたものである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
容器中で単離培養されている、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロン。
【請求項8】
神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ３ニューロンを、被験物質の存在下で、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養し、ステージ５ニューロンを得る工程と、
前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、
前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、
前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項9】
被験物質の存在下で、所定期間、神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ５ニューロンを培養する工程と、
前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、
前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、
前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ステージ５ニューロンの製造方法に関する。より具体的には、本発明は、ステージ５ニューロンの製造方法、ステージ５ニューロン、及び、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
再生医療及び神経疾患の創薬のために、多能性幹細胞からヒトの神経細胞（ニューロン）を分化誘導する技術に期待がよせられている。特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をニューロンに分化誘導する方法は多数確立されているが、それらのニューロンが機能的な成熟性を獲得する過程と条件には不明な点が多い。
【0003】
ｉＰＳＣ由来ニューロンを数十～数百日間長期培養すると、自然に電気生理学的な機能が現れると報告されることもあるが、ｉＰＳＣ由来ニューロンでは、特に、神経伝達の信号を受ける樹状突起スパインとシナプス後部（ポストシナプス）の形成、及び、ポストシナプスのＮＭＤＡ受容体を介した興奮性応答が多くの場合不完全であることが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【0004】
脳の興奮性ポストシナプスはニューロンの樹状突起上の細胞微細構造であるスパイン（ｓｐｉｎｅ）に形成されることが知られており、それらの形態的・機能的な成熟化は認知や学習等の脳高次機能に重要な役割を担っている。スパインの形成と動態のマーカーとして、例えばアクチン結合タンパク質であるドレブリン（ｄｒｅｂｒｉｎ）が用いられる。ドレブリンには２種類のアイソフォームがあり、幼弱神経に発現する胚性型アイソフォームＥは突起成長円錐に存在し、成熟神経では成体型アイソフォームＡ（脳型ドレブリン）にスプライシングで変換され、樹状突起スパインに粒状（クラスター）に集合する。
【0005】
また、ＮＭＤＡ受容体を介した興奮性応答によるドレブリンの局在変化はシナプス可塑性の重要な機構であり、生体内又はげっ歯類の初代培養細胞において、ドレブリンクラスターの発現は神経興奮毒性や神経変性疾患等におけるシナプス障害の評価マーカーとして用いられる。
【0006】
原理的には、十分に成熟化したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにもドレブリンクラスターを含むスパインの形成が期待される。しかし、実際には、これまでドレブリンの局在変化等による機能的成熟性までを示せるスパインの存在はヒトｉＰＳＣ由来ニューロンでは報告されておらず、このような機能的成熟性を示すヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを得ることは困難であることが示唆されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【0007】
特に、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを用いた動物代替法や、シナプス障害に関係する創薬スクリーニング技術の開発には、工業的な実用化に適した安定性の高い成熟神経の製造方法が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
一般的に、ある程度の神経特異的マーカーが発現されており、電気発火するニューロンは、成熟ニューロン（Ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎ）と呼ばれることが多い。しかしながら、この定義では、樹状突起が未成熟であり、ポストシナプスが機能していないステージ３ニューロンも成熟ニューロンに含まれてしまう。
【0009】
本明細書では、「未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロン」と、「成熟樹状突起を持つステージ５ニューロン」を区別する。
【0010】
インビトロ培養におけるニューロンの分化・成熟過程は、厳密には以下の５段階のステージに分けられている（Dotti C., et al., The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture, J. Neurosci., 8, 1454-1468, 1988.、Arimura N. and Kaibuchi K., Neuronal polarity: From extracellular signals to intracellular mechanisms, Nat. Rev. Neurosci., 8, 194-205, 2007.等を参照）。
【0011】
ステージ１：播種直後でまだ突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）はなく、糸状仮足が出ている状態。
ステージ２：先端に成長円錐を持つ未成熟突起（Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｉｔｅｓ）が伸長し始めた状態。樹状突起と軸索の区別はまだできていない。
ステージ３：神経極性化が起こり、一本の未成熟突起が長く伸長して軸索（Ａｘｏｎ）となった状態。その他の未成熟突起は短いままである。この時点で、軸索は、例えばタウ（ＭＡＰＴ）やニューロフィラメント（ＮＦ）を発現していること、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）になりかけている未成熟突起は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）を発現していることで区別できる。
ステージ４：軸索がある程度成長した後、樹状突起が伸長・分岐し始め成熟化している状態。
ステージ５：成熟した樹状突起にスパインが形成され、化学シナプスによる神経伝達とシナプス可塑性が可能な状態。
ステージ２：先端に成長円錐を持つ未成熟突起（Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｉｔｅｓ）が伸長し始めた状態。樹状突起と軸索の区別はまだできていない。
ステージ３：神経極性化が起こり、一本の未成熟突起が長く伸長して軸索（Ａｘｏｎ）となった状態。その他の未成熟突起は短いままである。この時点で、軸索は、例えばタウ（ＭＡＰＴ）やニューロフィラメント（ＮＦ）を発現していること、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）になりかけている未成熟突起は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）を発現していることで区別できる。
ステージ４：軸索がある程度成長した後、樹状突起が伸長・分岐し始め成熟化している状態。
ステージ５：成熟した樹状突起にスパインが形成され、化学シナプスによる神経伝達とシナプス可塑性が可能な状態。
【0012】
図１は、発明者らが仮定したｉＰＳＣ由来ニューロンの分化・成熟化過程を示す模式図である。ｉＰＳＣ由来ニューロンの分化・成熟化過程は、上記の５段階のステージにしたがっていると仮定した。また、図１では、ドレブリンの局在変化も示した。本明細書におけるステージ１～ステージ５のニューロンは、図１に示す分化・成熟化過程に基づいて区別している。
【0013】
図１に示すように、ステージ１ニューロンは、まだ突起がない神経前駆細胞である。ステージ２ニューロンでは、突起伸長の開始が認められる。また、ドレブリンＥ（詳細については後述する。）は、細胞体周辺と伸長する突起の先端の成長円錐内に存在している。ステージ３ニューロンでは、神経極性化が認められる。樹状突起と軸索が見分けられ、神経新生は完了しているが、形態、機能共に未成熟な状態である。ステージ４ニューロンでは、樹状突起の成熟化（伸長・分岐）及びシナプス形成が開始される。ステージ５ニューロンでは、樹状突起が成熟し、ドレブリンＡ（詳細については後述する。）が粒状に凝集し、スパイン及び安定したポストシナプス構造が形成される。
【0014】
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンは、樹状突起がまだ未成熟であるステージ３に比較的容易に到達することは知られている。しかしながら、上述したように、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを、樹状突起スパインとポストシナプスが形成されたステージ５にまで成熟させることは困難である。
【0015】
非特許文献１は、ヒトｉＰＳＣを神経前駆細胞に分化させたあと、ニューロンへ分化誘導させ、脳型ドレブリンを指標にしたポストシナプス成熟評価法を開示している。
【0016】
非特許文献１には、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンが真に成熟しているというためには、ステージ３、４でも観察される遺伝子マーカーの発現やシナプス前部（プレシナプス）の評価だけではなく、スパインとポストシナプス形成まで確認する必要があることが記載されている。
【0017】
しかしながら、非特許文献１に記載されたニューロンは、脳型ドレブリンクラスターの発現が非常に少なく（１細胞あたり４～５個）、ポストシナプスマーカーであるＰｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ９５（ＰＳＤ９５）のクラスターに至っては存在が認められず、多点電極アレイを用いた電気生理学的評価でもシナプス伝達活動を示せていない。このように、非特許文献１では、構造的・機能的に成熟した樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造には成功していない。
【0018】
本発明は、未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンを、樹状突起スパインとポストシナプスが形成されたステージ５ニューロンへと成熟化させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明に係る成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法は、未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンを、樹状突起スパインとポストシナプスが形成されたステージ５ニューロンへと成熟化させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図17】図１７は、実験例９において、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより、ＮＭＤＡ受容体のサブユニットである、ＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２Ａ及びＧＲＩＮ２Ｂの相対的な発現レベルを測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0022】
［ステージ５ニューロンの製造方法］
一実施形態において、本発明は、成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法を提供する。
【0023】
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンを、樹状突起スパインとポストシナプスが形成されたステージ５ニューロンへと成熟化させることができる。したがって、本実施形態の製造方法は、ステージ３ニューロンのステージ５ニューロンへの成熟化誘導方法であるということもできる。
【0024】
Ｂ－２７ Ｐｌｕｓは、神経細胞培養に用いられるサプリメントであり、基本培地に添加して用いられる。Ｂ－２７ Ｐｌｕｓは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社より販売されている。Ｂ－２７ Ｐｌｕｓの主な成分を下記表１に示す。
【0025】
【表1】
【0026】
本実施形態の製造方法において、培地としては、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓを添加した基本培地を用いることができる。
【0027】
基本培地としては、特に限定されず、あらゆる無血清の細胞培養用基本培地を用いることができる。例えば、ｐＨ７．２以上ｐＨ７．６以下に緩衝化されている合成培地等が挙げられる。より具体的には、例えば、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地（ステムセルテクノロジーズ社）、ラットグリア細胞培養上清含有神経細胞用培地（富士フイルム和光純薬株式会社）、アドバンスト－ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０培地、アドバンストＲＰＭＩ培地等が挙げられる。
【0028】
Ｂ－２７ Ｐｌｕｓは、基本培地に、例えば０．１体積％以上、０．５体積％以上、１体積％以上、１．５体積％以上、添加することが好ましい。Ｂ－２７ Ｐｌｕｓの基本培地への添加量は、例えば１０体積％以下、８体積％以下、６体積％以下、４体積％以下、３体積％以下、２体積％以下であってもよい。これらの上限及び下限は任意に組み合わせることができる。例えば、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓは、基本培地に、０．１体積％以上１０体積％以下添加してもよく、０．５体積％以上５体積％以下添加してもよく、１体積％以上３体積％以下添加してもよく、２体積％添加してもよい。
【0029】
培地には、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ以外の添加物を添加してもよい。このような添加物としては、例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、アスコルビン酸、抗生物質、Ｎ－２サプリメント、ＤＡＰＴやＡｒａ－Ｃ等の細胞増殖抑制剤、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＩＧＦ－１等の成長因子等が挙げられる。
【0030】
実施例において後述するように、ステージ３ニューロンを、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で、例えば５０日間以上、６０日間以上、７０日間以上、８０日間以上培養することにより、ステージ５ニューロンを製造することができる。培養時間に上限はないが、例えば１２ヶ月以下、１０ヶ月以下、８ヶ月以下、６ヶ月以下程度であることが現実的である。
【0031】
本実施形態の製造方法において、ステージ３ニューロンは、ＭＡＰ２及びニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）を含む神経マーカーを発現し、極性化されていることが好ましい。また、ステージ３ニューロンが、多能性幹細胞の分化誘導により得られたものであることが好ましい。
【0032】
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法は、ニューロスフェアを経由せずに直接多能性幹細胞からステージ３ニューロンを高効率で製造することができる、転写因子誘導法を用いた場合に特に有効である。すなわち、ステージ３ニューロンは、多能性幹細胞における転写因子の発現誘導により分化誘導されたものであることが好ましい。
【0033】
多能性幹細胞における転写因子の発現誘導は、転写因子のｍＲＮＡを細胞にトランスフェクションしてもよいし、センダイウイルスベクター等のＲＮＡウイルスを用いて発現誘導してもよいし、レンチウイルスベクター等のＤＮＡウイルスを用いて発現誘導する遺伝子コンストラクトを導入してもよいし、ゲノム編集等の遺伝子改変を用いて発現誘導する遺伝子コンストラクトを導入してもよい。特に、長期に外来性の遺伝子がゲノムに組み込まれて残存するリスクがない、ｍＲＮＡのトランスフェクション又はＲＮＡウイルスを用いた発現誘導であることが好ましい。
【0034】
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等が挙げられる。多能性幹細胞は哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉類；ヒト、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられる。
【0035】
多能性幹細胞は、なかでも、ヒトの細胞であることが好ましい。また、多能性幹細胞は、野生型の細胞であってもよいし、神経疾患患者由来の細胞であってもよいし、野生型の細胞に遺伝子改変を行った細胞等であってもよい。
【0036】
本実施形態の製造方法において、ステージ５ニューロンには、樹状突起スパインが形成されている。また、ステージ５ニューロンには、ドレブリン及びＰＳＤ９５を含むポストシナプス構造が形成されていることが好ましい。
【0037】
［ステージ５ニューロン］
一実施形態において、本発明は、容器中で単離培養されている、成熟樹状突起を持つヒトｉＰＳ細胞由来のステージ５ニューロンを提供する。単離培養されているとは、例えば、組織切片中に存在する成熟ニューロン等ではないことを意味する。
一実施形態において、本発明は、容器中で単離培養されている、成熟樹状突起を持つヒトｉＰＳ細胞由来のステージ５ニューロンを提供する。単離培養されているとは、例えば、組織切片中に存在する成熟ニューロン等ではないことを意味する。
【0038】
従来、ヒトｉＰＳＣ由来の細胞において、インビトロで、樹状突起スパインとポストシナプスを有する、機能的なステージ５ニューロンの製造に成功した例は報告されていない。
【0039】
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、インビトロで、樹状突起スパインとポストシナプスが形成されたヒトｉＰＳＣ由来のステージ５ニューロンを製造することに初めて成功した。
【0040】
本実施形態のステージ５ニューロンは、上述した方法により、ステージ３ニューロンからインビトロで製造することができる。したがって、本実施形態のステージ５ニューロンは、容器中で単離培養されている。
【0041】
容器としては特に限定されず、通常細胞培養に用いるものを利用することができる。より具体的には、例えば、ディッシュ、マルチウェルプレート、ガラススライド、平面微小電極アレイ（Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ａｒｒａｙ、ＭＥＡ）等が挙げられる。
【0042】
本実施形態のステージ５ニューロンは、平面培養（２Ｄ培養）又はスフェロイド培養（３Ｄ培養）されていることが好ましい。また、本実施形態のステージ５ニューロンは、神経細胞のみから構成されており、他の細胞を含まないことが好ましい。
【0043】
すなわち、本実施形態のステージ５ニューロンは、複数の細胞を含み３Ｄ培養された脳オルガノイド等とは区別されるものである。
【0044】
［神経疾患の治療薬のスクリーニング方法］
一実施形態において、本発明は、神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ５ニューロンの機能又は表現型を、被験物質の存在下及び／又は非存在下で評価する工程を含む、薬剤のスクリーニング方法を提供する。ステージ５ニューロンは、典型的には上述の方法により得ることができる。被験物質の存在下及び／又は非存在下での機能又は表現系の評価としては、例えばステージ３ニューロンからステージ５ニューロンへの成熟段階や、ステージ５ニューロンへの成熟後において、前記被験物質に曝露した場合と曝露しない場合とを比較して、その機能又は表現型を評価する。
一実施形態において、本発明は、神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ５ニューロンの機能又は表現型を、被験物質の存在下及び／又は非存在下で評価する工程を含む、薬剤のスクリーニング方法を提供する。ステージ５ニューロンは、典型的には上述の方法により得ることができる。被験物質の存在下及び／又は非存在下での機能又は表現系の評価としては、例えばステージ３ニューロンからステージ５ニューロンへの成熟段階や、ステージ５ニューロンへの成熟後において、前記被験物質に曝露した場合と曝露しない場合とを比較して、その機能又は表現型を評価する。
【0045】
被験物質としては、特に限定されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ等を用いることができる。
【0046】
ステージ５ニューロンの機能又は表現型としては、特に限定されず、樹状突起の成熟度、電気生理学的特性等が挙げられる。樹状突起の成熟度としては、例えば、樹状突起スパインの形状、ポストシナプス構造の形成の有無、ポストシナプス構造の形状、ドレブリンの局在、ＰＳＤ９５の局在等が挙げられる。電気生理学的特性としては、例えば、電気活動検出電極数、自発発火、同期されたネットワークバースト頻度、電気依存的カルシウム流入、これらに対する薬物の影響等が挙げられる。薬物としては、カリウムチャンネル阻害剤、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体阻害剤、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メソオキサゾール－４－プロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体阻害剤、各種神経伝達物質（例えばグルタミン酸等）のアゴニストやアンタゴニスト等が挙げられる。
【0047】
神経疾患患者由来ｉＰＳＣとしては、神経疾患患者由来の細胞から作製されたｉＰＳＣ、神経疾患患者と同様の遺伝子変異を導入されたｉＰＳＣ等を用いることができる。
【0048】
被験物質の存在下におけるステージ５ニューロンの機能又は表現型が、被験物質の非存在下と比較して、より野生型に近い表現型を示した場合、当該被験物質は神経疾患の治療薬の候補であると判断することができる。また逆に、被験物質の存在下におけるステージ５ニューロンの機能又は表現型が、被験物質の非存在下と比較して、より疾患の特徴を強く発現した場合、当該被験物質は神経疾患の原因物質又は疾患を助長する物質の候補であると判断することができる。
【0049】
（第１実施形態）
第１実施形態のスクリーニング方法では、被験物質への曝露をステージ３ニューロンからステージ５ニューロンへの成熟段階で実施する。本形態のスクリーニング方法により神経疾患の治療薬の候補が得られた場合、当該治療薬は、ステージ３ニューロンがステージ５ニューロンに成熟化する前に投与することにより、神経疾患の表現型が発現することを予防できることが期待される。すなわち、本実施形態のスクリーニング方法で得られた候補化合物は、神経疾患の予防薬として利用できる可能性が考えられる。
第１実施形態のスクリーニング方法では、被験物質への曝露をステージ３ニューロンからステージ５ニューロンへの成熟段階で実施する。本形態のスクリーニング方法により神経疾患の治療薬の候補が得られた場合、当該治療薬は、ステージ３ニューロンがステージ５ニューロンに成熟化する前に投与することにより、神経疾患の表現型が発現することを予防できることが期待される。すなわち、本実施形態のスクリーニング方法で得られた候補化合物は、神経疾患の予防薬として利用できる可能性が考えられる。
【0050】
（第２実施形態）
第２実施形態のスクリーニング方法では、被験物質への暴露をステージ５ニューロンへの成熟後に実施する。したがって、第２実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法と比較して、被験物質を作用させる時期が主に異なる。
第２実施形態のスクリーニング方法では、被験物質への暴露をステージ５ニューロンへの成熟後に実施する。したがって、第２実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法と比較して、被験物質を作用させる時期が主に異なる。
【0051】
第１実施形態のスクリーニング方法では、ステージ３ニューロンからステージ５ニューロンを得る工程において被験物質を作用させるのに対し、第２実施形態のスクリーニング方法では、ステージ５ニューロンを得た後に、被験物質を作用させる。
【0052】
第２実施形態のスクリーニング方法において、被験物質、ステージ５ニューロンの表現型、神経疾患患者由来ｉＰＳＣ等については、第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。
【0053】
第２実施形態のスクリーニング方法において、被験物質の存在下でステージ５ニューロンを培養する所定期間としては、特に限定されず、例えば、１分間以上、３分間以上、５分間以上、１０分間以上、３０分間以上、１時間以上、１日間以上、３日間以上、１週間以上、２週間以上、１ヶ月間以上、３ヶ月間以上等であってよい。被験物質の存在下でステージ５ニューロンを培養する所定期間は、例えば、３ヶ月間以下、１ヵ月間以下、１週間以下、３日間以下、１日間以下、１２時間以下、６時間以下、１時間以下、３０分間以下、１０分間以下等であってもよい。これらの上限及び下限は任意に組み合わせることができる。被験物質の存在下でステージ５ニューロンを培養する所定期間は、例えば、１分間であってもよいし、３分間であってもよいし、５分間であってもよいし、１０分間であってもよいし、３０分間であってもよいし、１時間であってもよいし、６時間であってもよいし、１２時間であってもよいし、約１日間であってもよいし、約１週間であってもよいし、約１ヶ月間であってもよい。
【0054】
第２実施形態のスクリーニング方法で神経疾患の治療薬の候補が得られた場合、当該治療薬は、既に神経疾患の表現型を示したステージ５ニューロンに投与することにより、より正常な表現型に治療できることが期待できる。
【実施例0055】
［実験例１］
（転写因子の発現誘導によりｉＰＳＣから分化誘導したニューロンの検討）
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を培養し、その形状を観察した。このニューロンは、ｉＰＳＣに、ニューロンへの分化誘導を促進する転写因子のｍＲＮＡを導入し、３日後に凍結保存されたものである。
（転写因子の発現誘導によりｉＰＳＣから分化誘導したニューロンの検討）
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を培養し、その形状を観察した。このニューロンは、ｉＰＳＣに、ニューロンへの分化誘導を促進する転写因子のｍＲＮＡを導入し、３日後に凍結保存されたものである。
【0056】
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを解凍し、メーカー推奨培地に懸濁し、予め０．０５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、シグマ社）及び２０μｇ／ｍＬのラミニン溶液（シグマ社）でコーティングしておいた９６ウェル培養プレートに５０，０００個／ｃｍ２の細胞密度で播種した。
【0057】
ｉＰＳＣに転写因子を導入して分化誘導を開始した日をＤａｙ０とした。Ｄａｙ３で凍結保存されるため、解凍・播種の翌日をＤａｙ４とした。Ｄａｙ４から３～４日ごとに培地を半量交換した。Ｄａｙ４からＤａｙ１０のいずれかの日に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ基礎培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）２％、神経細胞用培地（富士フイルム和光純薬株式会社）１０％、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１％、ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１％、２００ｍＭアスコルビン酸０．１％、抗生物質（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）１％を添加した培地に半量交換した。
【0058】
図２は、播種後１日目（Ｄａｙ４）及びＤａｙ８の細胞の位相差顕微鏡画像である。スケールバーは１００μｍである。その結果、Ｄａｙ４で突起が伸び始め、Ｄａｙ８には長い軸索が形成されていることが確認された。
【0059】
Ｄａｙ１０、３７及びＤａｙ７１に、細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により、樹状突起マーカーであるＭＡＰ２、軸索マーカーであるニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）の発現を検討した。また、核をＤＡＰＩで染色した。
【0060】
図３は、免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡画像である。スケールバーは１００μｍである。その結果、培養初期のＤａｙ１０では、細胞体はＭＡＰ２を発現しているが、この段階で樹状突起は殆ど発達していないことが示された。また、各細胞ごとに１本長い突起が伸びて、その延長にＮＦ－Ｈ陽性軸索を形成している様子が観察された。以上の結果から、Ｄａｙ１０の時点で、神経極性が形成されたステージ３ニューロンの状態であることが示唆された。培養後期のＤａｙ３７では、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）陽性軸索が発達していると共に、ＭＡＰ２陽性樹状突起が伸長と分岐していることが示された。Ｄａｙ７１では、更に多くのＭＡＰ２陽性樹状突起が伸長と分岐していることが示された。以上の結果から、Ｄａｙ７１の時点では、Ｄａｙ１０のステージ３ニューロンよりも後のステージの状態に到達していることが示唆された。
【0061】
［実験例２］
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析１）
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を実験例１と同様にして培養し、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。但し、大量の細胞を容易にハンドリングするために、非接着Ｕ底９６ウェル培養プレートに１０，０００個／ウェルの細胞密度で播種し、スフェロイドを形成した。
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析１）
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を実験例１と同様にして培養し、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。但し、大量の細胞を容易にハンドリングするために、非接着Ｕ底９６ウェル培養プレートに１０，０００個／ウェルの細胞密度で播種し、スフェロイドを形成した。
【0062】
Ｄａｙ０、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ３２、Ｄａｙ５７、Ｄａｙ８８にＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。対照であるＤａｙ０については、２つの独立に培養した未分化のｉＰＳＣ（ｉＰＳＣ－１及びｉＰＳＣ－２）について解析を行った。
【0063】
図４は、主成分分析の結果を示すグラフである。その結果、未成熟ｉＰＳ細胞からの素早い分化と、長期培養を必要とする成熟化の２種類の軌道が示された。
【0064】
各細胞型への分化の方向は、細胞型特異的マーカー遺伝子の因子負荷の平均ベクトルをプロットすることによって推定した。細胞型特異的マーカー遺伝子セットは、Polioudakis D., et al., A Single-Cell Transcriptomic Atlas of Human Neocortical Development during Mid-gestation, Neuron 103, 785-801, 2019.から取得した。与えられた細胞型について、対応する因子負荷の平均は、下記式（１）に基づいて算出される、分化の方向Ｖ（ＰＣ１、ＰＣ２）として定義した。
【0065】
【数1】
【0066】
図５は、各細胞型の平均ベクトルを示すグラフである。図５中、「Ｐｇ」は増殖する未成熟細胞を示し、「ＩＰ」は中間前駆細胞を示し、「ＥｘＮ」は遊走している興奮性ニューロンを示し、「ＥｘＭ」は成熟途中の興奮性ニューロンを示し、「ＥｘＭ－Ｕ」は皮質上層濃縮興奮性ニューロンを示し、「ＥｘＤｐ１」は皮質深層１を示し、「ＥｘＤｐ２」は皮質深層２を示し、「ＲＧ」は放射状グリアを示し、「Ｍｉｃ」はミクログリアを示し、「ＯＰＣ」はオリゴデンドロサイト前駆細胞を示す。
【0067】
その結果、Ｄａｙ０の細胞は増殖する未成熟細胞（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）に近く、Ｄａｙ１０では中間前駆細胞と、遊走している興奮性ニューロン／成熟途中の興奮性ニューロンとの中間の状態であり、Ｄａｙ３２では皮質上層濃縮興奮性ニューロンに近く、Ｄａｙ５７～８８には成熟した皮質深層（Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ Ｄｅｅｐ Ｌａｙｅｒ）のニューロンに近い状態であることが示された。
【0068】
この結果は、細胞周期の終了と神経新生がＤａｙ１０に完了するものの、その後、時間をかけてニューロンがより成熟した状態に変化することを示す。また、後述するスパイン形成及び生後脳発生の特徴的な分子イベントとされるドレブリンアイソフォームの切り替え及びＮＭＤＡ受容体サブユニットの切り替えを含め、Ｄａｙ３２以降に更に段階的に状態が変化することを示す。
【0069】
同様の実験を、平面培養したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを用いて行った。その結果、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを平面培養した場合においても、スフェロイド培養した場合と同様の軌道を描き、Ｄａｙ８８で右下の位置にたどり着くことが示された。この結果から、スフェロイド培養であっても平面培養であっても同等にニューロンが成熟することが示された。
【0070】
続いて、本実験例で取得したＲＮＡ－Ｓｅｑデータを用いて、Ｂｒａｉｎｓｐａｎデータとの時間軸による相関性を求めた。Ｂｒａｉｎｓｐａｎはヒトの胎児から出生後の脳の発生・発達における遺伝子発現の網羅的解析をまとめた公開データベースである（http://www.brainspan.org, Li M., et al., Integrative functional genomic analysis of human brain development and neuropsychiatric risks, Science 362, 139-148, 2018）。図６は、Ｄａｙ１０～８８のヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの全体遺伝子発現と、各時間帯におけるヒトの前頭前皮質の全体遺伝子発現との間のピアソン相関係数を示すヒートマップである。その結果、Ｄａｙ３２までは出生前の脳の状態との相関性が高く（受胎後８から２４週目）、Ｄａｙ５７以降は出生後の脳の状態との相関性が高いことが分かった（出生後４か月～４０年）。Ｄａｙ８８では更に出生前との相関性は下がり、出生後の脳神経に移行することが分かった。
【0071】
したがって、Ｄａｙ３２までの細胞は胎児脳に近い未成熟な状態のステージ３ニューロンを多く含み、Ｄａｙ３２からＤａｙ５７の間に、より成熟したステージ５ニューロンへ移行し、Ｄａｙ８８では出生後の脳神経に近い状態のステージ５ニューロンが多く含まれることが示唆された。ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの遺伝子発現がこのように胎児脳から生後脳の状態に移行可能であることは、これまで２５０日以上の長期３Ｄ培養された脳オルガノイドのみで報告されている（Gordon A., et al., Long-term maturation of human cortical organoids matches key early postnatal transitions, Nat. Neurosci. 24, 331-342, 2021）。しかしながら、神経細胞のみから構成された平面培養又は単純なスフェロイド培養で、比較的短時間で（５７～８８日）、大部分が生後脳の状態に移行する成功例はこれまで報告されておらず、困難であることが示唆されている。また、脳オルガノイドは培養条件が複雑であり、複数種細胞を含む構成と細胞同士の凝集のため、後述するスパインやポストシナプス構造の可視化や定量化が不可能であるため、創薬スクリーニング等にはより実用化に適した成熟神経の製造方法が求められる。
【0072】
［実験例３］
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析２）
実験例２で取得したＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づいて、既知のニューロン特異的マーカーの発現プロファイルを検討した。
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析２）
実験例２で取得したＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づいて、既知のニューロン特異的マーカーの発現プロファイルを検討した。
【0073】
図７は、ＲＮＡ－Ｓｅｑ発現プロファイルのヒートマップである。主要な未分化マーカー及び神経特異的マーカーの発現を示す。その結果、転写プログラムの時間依存性調節が確認された。具体的には、幹細胞マーカー及び増殖マーカーはＤａｙ１０に下方制御され、ほとんどの細胞が効率的に分化したことが示唆された。
【0074】
Ｄａｙ１０のニューロンは、神経前駆細胞マーカー（ＰＡＸ６、ＮＥＳ等）といくつかのニューロンマーカー（ＮＥＵＲＯＤ１、ＣＤＨ２、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＭＡＰＴ等）を発現した。この結果は、それらが未成熟ニューロン段階にあることを示した。
【0075】
その後、ほとんどの神経前駆細胞マーカー、未成熟ニューロンマーカーの発現が減少した。対照的に、成熟ニューロンマーカー（ＮＥＦＨ、ＢＤＮＦ）、プレシナプスマーカー（ＳＹＮ１、ＳＹＰ、ＳＮＡＰ２５）及びポストシナプスマーカー（ＤＬＧ４、ＣＡＭＫ２）はＤａｙ３２以降に上昇が観察された。
【0076】
また、グルタミン酸小胞トランスポーター（ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＬＣ１７Ａ７）、ＡＭＰＡ受容体（ＧＲＩＡ１－４）の上方制御、続いてＮＭＤＡ受容体（ＧＲＩＮ１、－２Ａ、－２Ｂ）の上方制御が観察され、興奮性伝達が可能なグルタミン酸作動性ニューロンの存在が示された。
【0077】
［実験例４］
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析３）
実験例２で取得したＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づいて、発現プロファイルの階層的クラスタリング分析によって遺伝子をグループ化し、遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析を行った。
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析３）
実験例２で取得したＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づいて、発現プロファイルの階層的クラスタリング分析によって遺伝子をグループ化し、遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析を行った。
【0078】
図８は、Ｄａｙ０、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ３２、Ｄａｙ５７、Ｄａｙ８８の各遺伝子の発現レベルの平均に基づいて遺伝子発現プロファイルを６つのパターンに分類した結果を示すグラフである。
【0079】
【0080】
【0081】
その結果、Ｄａｙ１０で直ちに上方制御された遺伝子（クラスターＵＰ１）が、主に、軸索形成、ニューロン投射及びプレシナプス小胞の形成と輸送に関連しており、活発なニューロンの発達が示された。
【0082】
対照的に、Ｄａｙ３２以降に強く上方制御された遺伝子（クラスターＵＰ２）は、より成熟したポストシナプス構造を必要とする機能（学習又は記憶、可塑性、長期増強）、膜貫通イオン輸送及びシナプス機能の調節に関与するものであった。これは、遅い時点でのシナプス形成と神経伝達活動の増加を示唆した。
【0083】
クラスターＵＰ３は、プリン代謝、酸化的リン酸化、呼吸機能が豊富であり、神経新生及び神経伝達におけるＡＴＰ合成の高い需要を満たすためであると考えられた。
【0084】
下方制御されたクラスターには、複雑な細胞分化を達成するために必要な劇的な翻訳変化を反映して、ＲＮＡプロセシング及びスプライシング機能がほとんど濃縮されていた。クラスターＤＯＷＮ２には、核分裂及び染色体／染色分体分離に関連する遺伝子が含まれており、おそらく分化したニューロンの細胞周期終了に関連するものであった。
【0085】
以上のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析の結果から、分化の初期誘導に続いて、特定の長期転写プログラムが、ニューロンの成熟とシナプス形成を調節することが示唆された。
【0086】
［実験例５］
（免疫染色による検討１）
実験例１と同様にして培養した、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を免疫染色し、神経突起の成長とシナプス構造の形成を観察した。
（免疫染色による検討１）
実験例１と同様にして培養した、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を免疫染色し、神経突起の成長とシナプス構造の形成を観察した。
【0087】
図１１は、Ｄａｙ３７及びＤａｙ７１の各ニューロンを免疫染色した代表的な結果を示す蛍光顕微鏡画像である。下段に、それぞれ中段のＤａｙ７１の画像中、四角で囲んだ領域の拡大画像を示す。上段のスケールバーは１００μｍであり、下段のスケールバーは２０μｍである。図１１中、軸索マーカーであるニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）及びプレシナプスマーカーであるシナプシンＩ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ）の染色結果を左に示し、樹状突起マーカーであるＭＡＰ２及びポストシナプスマーカーであるドレブリン（ｄｒｅｂｒｉｎ）の染色結果を中央に示し、それぞれのニューロンの状態を解釈する模式図を右に示す。
【0088】
ｉＰＳＣ由来ニューロンは、培養開始後１ヶ月で短いＭＡＰ２陽性樹状突起と急速に伸長するニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）陽性軸索を発達させた。実施例１と同様に、ＭＡＰ２陽性樹状突起は時間の経過とともに成長と分岐を続けた。
【0089】
これに付随して、プレシナプスマーカーであるシナプシンＩの発現が増加した。シナプシンＩは、初期培養では軸索と細胞体の周囲に拡散し、Ｄａｙ７１の後期培養では成熟樹状突起に沿って凝集した。これは、ニューロンの発達がステージ４以降に進むにつれて、シナプシンＩがシナプス部位に集中することを示す。
【0090】
続いて、アクチン結合タンパク質であるドレブリンの細胞内局在を評価した。培養開始からＤａｙ３７の初期の培養では、ドレブリンは、細胞体の周りと発達中の樹状突起の終わりにある成長円錐に分布していた。Ｄａｙ７１では、ドレブリンは成熟したＭＡＰ２陽性樹状突起に沿ってクラスターを形成した。
【0091】
［実験例６］
（免疫染色による検討２）
神経細胞分化キット（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－ＳｅＶ Ｋｉｔ」、エリクサジェンサイエンティフィク社）を用いて、健常者由来ｉＰＳＣから、メーカーのプロトコール通りにステージ３ニューロンを作製した。健常者由来ｉＰＳＣとしては、１２３１Ａ３株を使用した。実験例１とは異なる株を用いることで成熟化の再現性を確認し、より高解像度の免疫染色画像を取得した。
（免疫染色による検討２）
神経細胞分化キット（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－ＳｅＶ Ｋｉｔ」、エリクサジェンサイエンティフィク社）を用いて、健常者由来ｉＰＳＣから、メーカーのプロトコール通りにステージ３ニューロンを作製した。健常者由来ｉＰＳＣとしては、１２３１Ａ３株を使用した。実験例１とは異なる株を用いることで成熟化の再現性を確認し、より高解像度の免疫染色画像を取得した。
【0092】
図１２は、Ｄａｙ７３におけるｉＰＳＣ由来ニューロンを免疫染色した代表的な結果を示す蛍光顕微鏡画像である。下段は、それぞれ上段の四角で囲んだ領域の拡大画像である。上段のスケールバーは１００μｍであり、下段のスケールバーは１０μｍである。
【0093】
その結果、Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ９５（ＰＳＤ９５）の発現も観察された。そして、プレシナプスマーカーのシナプシンＩと、ポストシナプスマーカーのドレブリン及びＰＳＤ９５が樹状突起の上又は近くにクラスターを形成していることが示された。
【0094】
また、図１２の中央の図において、シナプシンＩとドレブリンのクラスターが隣接又は部分的に共局在しており（白い矢印）、樹状突起スパインにおいて、プレシナプス及びポストシナプスが結合してシナプス結合を確立したことが示された。
【0095】
以上の結果は、ｉＰＳＣ由来ニューロンが、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンへと成熟化したことを示す。すなわち、ステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養することにより、ステージ５ニューロンを製造できることが示された。
【0096】
［実験例７］
（免疫染色による検討３）
実験例１と同様にして培養した、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を免疫染色し、既知の神経特異的マーカーの発現を観察した。また、核をＤＡＰＩで染色した。
（免疫染色による検討３）
実験例１と同様にして培養した、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）を免疫染色し、既知の神経特異的マーカーの発現を観察した。また、核をＤＡＰＩで染色した。
【0097】
図１３は、ｉＰＳＣ由来ニューロンを免疫染色した代表的な結果を示す蛍光顕微鏡画像である。スケールバーは１００μｍである。その結果、殆ど（９５％以上）の細胞がＤａｙ２８でグルタミン酸作動性神経マーカーであるｖＧＬＵＴ１を発現し、Ｄａｙ８５で成熟神経マーカーであるＮｅｕＮを発現することが確認された。また、一部（５％以下）の細胞がＤａｙ８５でＧＡＢＡ作動性神経マーカーであるＧＡＤ６４と、ドパミン作動性神経マーカーであるＴＨを発現していることが確認された。
【0098】
［実験例８］
（ドレブリンアイソフォームの検討）
ニューロンの発達における、ドレブリンの細胞内局在の変化は、ドレブリンの選択的スプライシングによって引き起こされることが知られている。胚性型アイソフォームのドレブリンＥは、未成熟なニューロンの移動と神経突起の成長に役割を果たし、ニューロンの成熟に伴って樹状突起スパインの形成と可塑性を調節する成熟した脳特異的な成体型アイソフォームであるドレブリンＡに置き換わる。
（ドレブリンアイソフォームの検討）
ニューロンの発達における、ドレブリンの細胞内局在の変化は、ドレブリンの選択的スプライシングによって引き起こされることが知られている。胚性型アイソフォームのドレブリンＥは、未成熟なニューロンの移動と神経突起の成長に役割を果たし、ニューロンの成熟に伴って樹状突起スパインの形成と可塑性を調節する成熟した脳特異的な成体型アイソフォームであるドレブリンＡに置き換わる。
【0099】
図１４は、ＲＮＡ－ＳｅｑデータをヒトリファレンスゲノムのＤＢＮ１遺伝子座にマッピングすることにより同定された２つのドレブリンアイソフォームの塩基配列を比較した図である。
【0100】
追加のエクソン１１を含む転写物は、成熟した脳特異的な成体型アイソフォームＡであると想定され、より短い転写物は、胚性型アイソフォームＥであると想定された。
【0101】
実験例２で取得したＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づいて、ドレブリンアイソフォームの発現レベルを解析した。図１５は、ＲＮＡ－Ｓｅｑデータの解析により検出されたドレブリンの全体転写物及び各アイソフォームの発現レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ、ＴＰＭ）を示すグラフである。
【0102】
その結果、ドレブリン（全体）及び胚性型アイソフォームＥは、未分化のｉＰＳＣで発現し、分化誘導時に上方制御され、後の時点で再び下方制御されることが示された。成体型アイソフォームＡは分化の初期段階ではほとんど存在せず、後期段階で発現が誘導されることが示された。
【0103】
図１６は、実験例１と同様にして培養したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンについて、ドレブリン（全体）及びドレブリンアイソフォームＡの発現量を定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。図１６中、「ＤＢＮ１」はドレブリン（全体）の発現量であることを示し、「ＤＢＮ１ ｉｓｏｆｏｒｍ Ａ」はドレブリンアイソフォームＡの発現量であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを示す。その結果、アイソフォームＡが特にＤａｙ５７以降に上方制御されることが確認された。
【0104】
以上の結果から、ｉＰＳＣ由来ニューロンの成熟は、げっ歯類の海馬ニューロンで以前に知られているドレブリンアイソフォーム切り替えの分子イベントを再現しているように見受けられた。
【0105】
［実験例９］
（ＮＭＤＡ受容体のサブユニットの検討）
ＮＭＤＡ受容体の特性は成熟中に変化し、サブユニットＧｌｕＮ２Ｂ（ＧＲＩＮ２Ｂ）からＧｌｕＮ２Ａ（ＧＲＩＮ２Ａ）への発生上の切り替えが起こることが知られている。
（ＮＭＤＡ受容体のサブユニットの検討）
ＮＭＤＡ受容体の特性は成熟中に変化し、サブユニットＧｌｕＮ２Ｂ（ＧＲＩＮ２Ｂ）からＧｌｕＮ２Ａ（ＧＲＩＮ２Ａ）への発生上の切り替えが起こることが知られている。
【0106】
図１７は、実験例１と同様にして培養したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンについて、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより、ＮＭＤＡ受容体のサブユニットである、ＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２Ａ及びＧＲＩＮ２Ｂの相対的な発現レベルを測定した結果を示すグラフである。図１７中、「＊＊＊」はＤａｙ１０の結果に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示し、「＃＃＃」はＧＲＩＮ２ＢのＤａｙ５７の結果に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【0107】
その結果、ＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２ＢがＤａｙ３２に有意に上方制御され、ＧＲＩＮ２ＡがＤａｙ５７に有意に上方制御されたことが示された。また、ＧＲＩＮ２Ｂは、Ｄａｙ８８に再び有意に下方制御され、ＧｌｕＮ２ＢからＧｌｕＮ２Ａへの発生スイッチの誘導が示唆された。
【0108】
［実験例１０］
（タウアイソフォームの検討）
神経細胞において微小管を安定化するタウ（遺伝子名：ＭＡＰＴ）は、選択的スプライシングによって６種類のアイソフォームを発現し、そのうち３種は３つの反復配列を持ち（３Ｒタウアイソフォーム）、その他３種は４つの反復配列を持つことで（４Ｒタウアイソフォーム）見分けられることが知られている。胎生期には３Ｒタウしか発現していないが、成熟と共に発現するアイソフォームの種類が増え、生体の脳では４Ｒタウが発現していることが知られている。
（タウアイソフォームの検討）
神経細胞において微小管を安定化するタウ（遺伝子名：ＭＡＰＴ）は、選択的スプライシングによって６種類のアイソフォームを発現し、そのうち３種は３つの反復配列を持ち（３Ｒタウアイソフォーム）、その他３種は４つの反復配列を持つことで（４Ｒタウアイソフォーム）見分けられることが知られている。胎生期には３Ｒタウしか発現していないが、成熟と共に発現するアイソフォームの種類が増え、生体の脳では４Ｒタウが発現していることが知られている。
【0109】
図１８は、実験例１と同様にして培養したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンについて、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより、タウ（全体）、３Ｒタウ、４Ｒタウ及びドレブリンアイソフォームＡの相対的な発現レベルを測定した結果を示すグラフである。その結果、タウ（全体）及び３ＲタウはＤａｙ３８から高く発現しており、対して４ＲタウはドレブリンアイソフォームＡと同様にＤａｙ６６とＤａｙ８７に上方制御されたことが示された。
【0110】
［実験例１１］
（興奮性ポストシナプスタンパク質の機能的活性の検討１）
高密度微小電極アレイシステム（Ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ、ＨＤ－ＭＥＡ、マックスウェル バイオシステムズ社）を使用して、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの電気生理学的応答を解析した。
（興奮性ポストシナプスタンパク質の機能的活性の検討１）
高密度微小電極アレイシステム（Ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ、ＨＤ－ＭＥＡ、マックスウェル バイオシステムズ社）を使用して、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの電気生理学的応答を解析した。
【0111】
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」、エリクサジェン サイエンティフィック社）高密度微小電極アレイ（ＨＤ－ＭＥＡ）の電極上に１００，０００個／ウェルの細胞密度で播種した点以外は実験例１と同様にして培養し、経時的に局所電場電位を測定した。
【0112】
図１９は、培養されたｉＰＳＣ由来ニューロンの４つの独立したウェルで経時的に測定した、電気活動検出電極数（Ａｃｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）及び同期されたネットワークバースト頻度（Ｎｅｔｗｏｒｋ ｂｕｒｓｔ ｒａｔｅ）を示すグラフである。電気活性検出電極数は自発発火する細胞の存在と比例しており、発火活動の指標である。同期されたネットワークバーストは、培養ニューロン間の接続の確立の指標である。
【0113】
その結果、Ｄａｙ３１以降に、発火活動が上昇し、再現性のあるネットワークバーストが出現したことが示された。ネットワークバーストは、培養開始後８週目頃まで安定して測定され、その後、成熟とともに再び減少した。発火活動の減少は見られなかったため、個々の細胞の電気活動自体や生存率が低下しているのではなく、抑制性神経の成熟化、又はポストシナプス機能を必要としないギャップジャンクション経由の電気シナプスから、より選択的な制御を可能にする化学シナプスに置き換わるためであると考えられた。
【0114】
培養開始後８週目のｉＰＳＣ由来ニューロンの培地に、カリウムチャンネル阻害剤である４－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（４－ＡＰ）及びＮＭＤＡ受容体阻害剤であるＤ－２－Ａｍｉｎｏ－５－ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｄ－ＡＰ５）を、それぞれ濃度を増加させながら添加し、１ウェルあたり１，０２４個の電極によって集団発火頻度ヒストグラムを記録した。各濃度について１分間の安定化と１０分間の記録を行った。最後に、ｉＰＳＣ由来ニューロンを３回の培地交換で洗浄し、１日放置して、各薬物の効果が消失したことを確認した。
【0115】
図２０は、代表的な集団発火頻度ヒストグラムを示すグラフである。図２１は、図２０に基づいて作成した、４－ＡＰ及びＤ－ＡＰ５の用量反応曲線である。その結果、ｉＰＳＣ由来ニューロンの４－ＡＰとＤ－ＡＰ５に対する用量依存的な反応が観察された。この結果は、ｉＰＳＣ由来ニューロンにおける神経伝達が機能していることを示す。特に成熟した中枢神経において重要であるＮＭＤＡ受容体を介したシナプス伝達が機能していることが示唆された。
【0116】
図２２は、Ｄａｙ６３及びＤａｙ８４において１，０２４個の電極を用いて６００秒間測定した発火頻度のラスタープロット及びネットワークバーストを示す代表的な集団発火頻度ヒストグラムである。Ｄａｙ６３に比べてＤａｙ８４においてはネットワークバーストの頻度が減少し、同時にバースト持続時間、バースト内平均発火頻度、バースト間隔が増加したことが示された。
【0117】
図２３は、Ｄａｙ６３及びＤａｙ８４において、軸索追跡アッセイを行い、２６，４００個の電極を含む４ｍｍ×２ｍｍの領域に活動電位の伝播経路を再構築した代表的な神経伝達マップを示すグラフである。スケールバーは１００μｍである。その結果、Ｄａｙ６３に比べＤａｙ８４においては活動電位の伝播距離とネットワークの複雑性が増加することが示された。これらの結果から、成熟したステージ５ニューロンでは、電気活動が衰えることなく、神経ネットワークの接続性と安定性が増加していることが示唆された。
【0118】
［実験例１２］
（興奮性ポストシナプスタンパク質の機能的活性の検討２）
ヒトｉＰＳＣ由来の成熟したステージ５ニューロンを、１００μＭグルタミン酸で１０分間処理した後に免疫染色し、ドレブリンの局在変化を検討した。また、比較のために、グルタミン酸処理を行わずに免疫染色した試料も用意した。
（興奮性ポストシナプスタンパク質の機能的活性の検討２）
ヒトｉＰＳＣ由来の成熟したステージ５ニューロンを、１００μＭグルタミン酸で１０分間処理した後に免疫染色し、ドレブリンの局在変化を検討した。また、比較のために、グルタミン酸処理を行わずに免疫染色した試料も用意した。
【0119】
図２４は、代表的な免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。図２４中、左欄は、グルタミン酸処理を行わずに免疫染色した結果を示し、右欄は１００μＭグルタミン酸で１０分間処理した後に免疫染色した結果を示す。
【0120】
図２４中、左上上段は、ＭＡＰ２、ドレブリン及び核の染色結果をマージした画像であり、左上下段は、左上上段の四角で囲んだ領域の拡大画像である。左上上段のスケールバーは１００μｍであり、左上下段のスケールバーは２０μｍである。
【0121】
また、左下上段は、別の細胞について、ＭＡＰ２、ドレブリン及び核の染色結果をマージした画像であり、左下下段は、左下上段の四角で囲んだ領域の拡大画像である。左下上段のスケールバーは１００μｍであり、左下下段のスケールバーは２０μｍである。
【0122】
また、右上上段は、ＭＡＰ２、ドレブリン及び核の染色結果をマージした画像であり、右上下段は、右上上段の四角で囲んだ領域の拡大画像である。右上上段のスケールバーは１００μｍであり、右上下段のスケールバーは２０μｍである。
【0123】
また、右下上段は、別の細胞について、ＭＡＰ２、ドレブリン及び核の染色結果をマージした画像であり、右下下段は、右下上段の四角で囲んだ領域の拡大画像である。右下上段のスケールバーは１００μｍであり、右下下段のスケールバーは２０μｍである。
【0124】
その結果、ヒトｉＰＳＣ由来の成熟したステージ５ニューロンを、１００μＭグルタミン酸で１０分間処理すると、ドレブリンがスパイン内のクラスターから流出し、遊離ドレブリンが樹状突起の軸（Ｓｈａｆｔ）に移動する「ｄｒｅｂｒｉｎ ｅｘｏｄｕｓ」と呼ばれる現象が観察された。
【0125】
げっ歯類において、ニューロンが死なないレベルのグルタミン酸を加えると、「ｄｒｅｂｒｉｎ ｅｘｏｄｕｓ」が観察され、「シナプス毒性」が誘導されることが知られている。ヒトニューロンでシナプス毒性が確認されたのは初めてである。また、この現象はＮＭＤＡ受容体を介したシナプス可塑性の重要な機構であることが知られており、ヒトｉＰＳＣ由来神経でもシナプス可塑性を起こせる可能性が示唆された。
【0126】
この結果は、ヒトｉＰＳＣ由来のステージ５ニューロンが、正常に機能するポストシナプスを有していることを示す。
【0127】
［実験例１３］
（ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの培地組成の影響の検討）
下記表２に組成を示す様々な培地を用いた以外は実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを培養した。続いて、Ｄａｙ７７に細胞を固定して免疫染色を行い、ステージ５ニューロンが得られたか否かを評価した。下記表２中、「ＮＢ Ｐｌｕｓ」はＮｅｕｒｏＢａｓａｌ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を示し、「ＢｒａｉｎＰｈｙｓ」はＢｒａｉｎＰｈｙｓ（ステムセルテクノロジーズ社）を示し、「Ｂ２７ Ｐｌｕｓ」はＢ－２７ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を示し、「ＣＤＩ」はｉＣｅｌｌ神経系サプリメント及びｉＣｅｌｌ神経用サプリメントＢ（富士フイルム・セルラー・ダイナミクス社）を示し、「ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ」はＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）を示し、「－」は添加しないことを示し、「＋」は添加することを示す。下記表２における培地２は、実験例１で用いた培地である。また、「スパインＯＫ」は、後述する免疫染色の結果、ドレブリンがスパインの中に凝集してクラスターを形成した、成熟樹状突起が形成されたことを意味し、ステージ５ニューロンが得られたことを示す。また、「スパインなし」はスパインが形成されず、ステージ５ニューロンが得られなかったことを示す。
（ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの培地組成の影響の検討）
下記表２に組成を示す様々な培地を用いた以外は実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを培養した。続いて、Ｄａｙ７７に細胞を固定して免疫染色を行い、ステージ５ニューロンが得られたか否かを評価した。下記表２中、「ＮＢ Ｐｌｕｓ」はＮｅｕｒｏＢａｓａｌ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を示し、「ＢｒａｉｎＰｈｙｓ」はＢｒａｉｎＰｈｙｓ（ステムセルテクノロジーズ社）を示し、「Ｂ２７ Ｐｌｕｓ」はＢ－２７ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を示し、「ＣＤＩ」はｉＣｅｌｌ神経系サプリメント及びｉＣｅｌｌ神経用サプリメントＢ（富士フイルム・セルラー・ダイナミクス社）を示し、「ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ」はＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）を示し、「－」は添加しないことを示し、「＋」は添加することを示す。下記表２における培地２は、実験例１で用いた培地である。また、「スパインＯＫ」は、後述する免疫染色の結果、ドレブリンがスパインの中に凝集してクラスターを形成した、成熟樹状突起が形成されたことを意味し、ステージ５ニューロンが得られたことを示す。また、「スパインなし」はスパインが形成されず、ステージ５ニューロンが得られなかったことを示す。
【0128】
【表2】
【0129】
図２５は、上記表２に示す、培地２、培地５、培地７でそれぞれ培養したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡画像である。
【0130】
その結果、培地２及び培地７では、同様に樹状突起が成熟し、ドレブリンクラスターが観察された。一方、培地５では、樹状突起の成長が悪く、ドレブリンの糸状仮足は多く発生していたがクラスター状のスパインにまでは成熟していないことが観察された。上記表２には、各培地を用いた場合の免疫染色の結果も示す。
【0131】
以上の結果から、ステージ５ニューロンを得るためには、培地にＢ－２７ Ｐｌｕｓを加えることが重要であり、基本培地はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ＰｌｕｓであってもＢｒａｉｎＰｈｙｓであってもよいことが示された。
【0132】
［実験例１４］
（ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの培地に添加するＢ－２７ Ｐｌｕｓの量の影響の検討）
実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを培養した。実験例１では、培地にＢ－２７ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を２％加えていたところを、本実験例では、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ ４％又はＢ－２７ Ｐｌｕｓ １０％に置き換えた。続いて、Ｄａｙ６３に細胞を固定して免疫染色を行い、ステージ５ニューロンが得られたか否かを評価した。
（ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの培地に添加するＢ－２７ Ｐｌｕｓの量の影響の検討）
実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを培養した。実験例１では、培地にＢ－２７ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を２％加えていたところを、本実験例では、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ ４％又はＢ－２７ Ｐｌｕｓ １０％に置き換えた。続いて、Ｄａｙ６３に細胞を固定して免疫染色を行い、ステージ５ニューロンが得られたか否かを評価した。
【0133】
図２６は、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ ２％、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ ４％、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ １０％を添加した培地でそれぞれ培養したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡画像である。
【0134】
その結果、いずれの培地組成でも樹状突起が成熟し、ドレブリンクラスターの集積が始まっていることが観察された。しかし、培養期間を成熟化の完了予測時期より１週間短く設定したため、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ ２％ではまだ糸状仮足が多く残っており、ドレブリンが突起周辺に拡散され集積が完了していない様子が観察された。Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ ４％でも糸状仮足が多く残っているが、突起周辺のドレブリン発現が若干上昇しているように見られた。一方、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ １０％では、数多くの小さい粒状のドレブリンクラスターが観察され、より早くスパインが安定化していることが示唆された。
【0135】
以上の結果から、ステージ５ニューロンを得るためには、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓの基本培地への添加量は２％でもよいが、４％、１０％と高く上げるほどステージ５ニューロンへの成熟化効率が上がることが示唆された。
【0136】
［実験例１５］
（神経疾患患者由来ｉＰＳＣからのステージ５ニューロンの作製）
神経細胞分化キット（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－ＳｅＶ Ｋｉｔ」、エリクサジェンサイエンティフィク社）を用いて、健常者由来ｉＰＳＣ及び神経疾患患者由来ｉＰＳＣから、メーカーのプロトコール通りにステージ３ニューロンを作製した。健常者由来ｉＰＳＣとしては、１３８３Ｄ２株及び１２３１Ａ３株を使用した。神経疾患患者由来ｉＰＳＣとしては、レット症候群疾患患者由来のＨＰＳ３０３６株を使用した。
（神経疾患患者由来ｉＰＳＣからのステージ５ニューロンの作製）
神経細胞分化キット（製品名「Ｑｕｉｃｋ－ＮｅｕｒｏｎＴＭ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ－ＳｅＶ Ｋｉｔ」、エリクサジェンサイエンティフィク社）を用いて、健常者由来ｉＰＳＣ及び神経疾患患者由来ｉＰＳＣから、メーカーのプロトコール通りにステージ３ニューロンを作製した。健常者由来ｉＰＳＣとしては、１３８３Ｄ２株及び１２３１Ａ３株を使用した。神経疾患患者由来ｉＰＳＣとしては、レット症候群疾患患者由来のＨＰＳ３０３６株を使用した。
【0137】
その後、実験例１と同様にして、ｉＰＳＣ由来ニューロンを培養した。続いて、Ｄａｙ９０、Ｄａｙ９１、Ｄａｙ１１２に免疫染色を行い、ステージ５ニューロンが得られたか否かを評価した。
【0138】
図２７は、代表的な免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。ＭＡＰ２、ドレブリン及び核の染色結果をマージした画像である。その結果、樹状突起の上又は近くにドレブリンクラスターの形成が観察され、健常者由来ｉＰＳＣ及び神経疾患患者由来ｉＰＳＣのいずれを用いた場合においてもステージ５ニューロンが得られることが示された。
【0139】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法。
［２］前記ステージ５ニューロンには、樹状突起スパインが形成されている、［１］に記載の製造方法。
［３］前記ステージ５ニューロンには、ドレブリン及びＰＳＤ９５を含むポストシナプス構造が形成されている、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記ステージ３ニューロンは、ＭＡＰ２及びニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）を含む神経マーカーを発現し、極性化されている、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記ステージ３ニューロンが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化誘導により得られたものである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記ステージ３ニューロンが、前記ｉＰＳＣにおける転写因子の発現誘導により分化誘導されたものである、［５］に記載の製造方法。
［７］容器中で単離培養されている、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロン。
［８］神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ３ニューロンを、被験物質の存在下で、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養し、ステージ５ニューロンを得る工程と、前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［９］被験物質の存在下で、所定期間、神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ５ニューロンを培養する工程と、前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［１］未成熟樹状突起を持つステージ３ニューロンをＢ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養する工程を含む、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロンの製造方法。
［２］前記ステージ５ニューロンには、樹状突起スパインが形成されている、［１］に記載の製造方法。
［３］前記ステージ５ニューロンには、ドレブリン及びＰＳＤ９５を含むポストシナプス構造が形成されている、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記ステージ３ニューロンは、ＭＡＰ２及びニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）を含む神経マーカーを発現し、極性化されている、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記ステージ３ニューロンが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化誘導により得られたものである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記ステージ３ニューロンが、前記ｉＰＳＣにおける転写因子の発現誘導により分化誘導されたものである、［５］に記載の製造方法。
［７］容器中で単離培養されている、成熟樹状突起を持つステージ５ニューロン。
［８］神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ３ニューロンを、被験物質の存在下で、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓを含有する培地中で培養し、ステージ５ニューロンを得る工程と、前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［９］被験物質の存在下で、所定期間、神経疾患患者由来ｉＰＳＣから分化誘導されたステージ５ニューロンを培養する工程と、前記ステージ５ニューロンの表現型を評価する工程と、を含み、前記被験物質の非存在下と比較して、前記被験物質の存在下における前記ステージ５ニューロンの表現型が、より野生型に近い表現型を示すことが、前記被験物質が前記神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0140】
【特許文献1】特開２０２０－１５６４６３
【非特許文献】
【0141】
【非特許文献1】Togo K., et al., Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro, Mol Brain 14:149, 2021.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
