特開 2023-183020 ウイルス感染阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023183020

(43)【公開日】2023-12-27

(54)【発明の名称】ウイルス感染阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20231220BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231220BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20231220BHJP

   C07K 14/42 20060101ALN20231220BHJP

   A61K 36/04 20060101ALN20231220BHJP

   A61K 36/05 20060101ALN20231220BHJP

   A61K 36/06 20060101ALN20231220BHJP

   A61K 36/07 20060101ALN20231220BHJP

   A61K 36/12 20060101ALN20231220BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

A61P31/14

A61P31/16

C07K14/42 ZNA

A61K36/04

A61K36/05

A61K36/06

A61K36/07

A61K36/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022096374

(22)【出願日】2022-06-15

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年６月１８日に令和３年度中四国乳酸菌研究会にて発表 令和３年１１月１６日に第６８回日本ウイルス学会学術集会にて発表

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】堀 貫治

(72)【発明者】

【氏名】坂口 剛正

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

4C088

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA44

4C084CA13

4C084NA14

4C084ZB33

4C087AA01

4C087BC11

4C087NA14

4C087ZB33

4C088AA03

4C088AA14

4C088AA15

4C088AA18

4C088BA16

4C088NA14

4C088ZB33

4H045AA10

4H045CA30

4H045DA80

4H045EA29

(57)【要約】

【課題】ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を効果的に阻害する可能性があるレクチンを探索し、そのようなレクチンを含むウイルス感染阻害剤を提供できるようにする。
【解決手段】本発明に係るウイルス感染阻害剤は、フコース認識レクチンを含み、インフルエンザウイルス又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を阻害することを特徴とするものである。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フコース認識レクチンを含み、インフルエンザウイルス又はＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染を阻害するウイルス感染阻害剤。

【請求項2】

前記フコース認識レクチンは、α１－６フコースに特異的に結合するレクチンである請求項１に記載のウイルス感染阻害剤。

【請求項3】

前記フコース認識レクチンは、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ又はＡＡＬである請求項２に記載のウイルス感染阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルス感染阻害剤に関し、特にフコース認識レクチンを含むウイルス感染阻害剤に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞表面や体液中に存在する糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質の糖鎖は、一種の情報素子として機能し、発生、免疫、がん、感染等の重要な生命現象に深く関わっている。一方、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンは糖鎖認識分子として機能し、糖鎖と同様に生物学的に重要な役割を担っている。

【0003】

これまでに、海藻類又は藻類（淡水産藍藻）から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。藻類レクチンは、その結合性に基づいて大きくは高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖又は混成型糖鎖に結合するもの、セリン、スレオニン等と結合するＯ－グリコシド結合糖鎖（Ｏ型糖鎖）に結合するもの、その他にフコース含有糖鎖に結合するもの等に大別できる。レクチンの一部は、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス等のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献１～１２）。藍藻Oscillatoria agardhii 由来レクチンであるＯＡＡ（Oscillatoria agardhii agglutinin）、紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンであるＫＡＡ（Kappaphycus alvarezii agglutinin）、緑藻Boodlea coacta由来レクチンであるＢＣＡ（Boodlea coacta agglutinin）及び紅藻Meristotheca papulosa由来レクチンであるＭＰＬ（Meristotheca papulosa lectin）は高マンノース型糖鎖との強い結合特異性からＨＩＶやインフルエンザウイルスといった表面に高マンノース型糖鎖を有するウイルスを認識できると期待されている。特に、非特許文献１２には、ＫＡＡはＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０を認識することが開示されており、抗ＨＩＶ活性を示し、医薬素材としての活用が期待されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530, 1997.

【非特許文献2】O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003.

【非特許文献3】Helle, F., .et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006.

【非特許文献4】Barrientos, L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.

【非特許文献5】Dey, B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.

【非特許文献6】O’Keefe, B. R. et al.,J. Virol. 84, 2511-2521, 2010.

【非特許文献7】Hori, K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.

【非特許文献8】Sato, Y., Okuyama, S., and Hori, K., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.

【非特許文献9】Sato, Y., Morimoto, K., Hirayama, M., and Hori, K. Biochem. Biophys. Res. commun. 405, 291-296, 2011.

【非特許文献10】佐藤雄一郎、平山 真、藤原佳史、森本金治郎、堀 貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)

【非特許文献11】Sato, Y., Hirayama, M., Morimoto,K., Yamamoto, N., Okuyama, S., and Hori, K. J. Biol. Chem. 286, No.22, 19446-19458, 2011.

【非特許文献12】Hirayama, M., Shibata, H., Imamura, K., Sakaguchi, T., and Hori, K. Mar Biotechnol. 18, issue 2, 215-231, 2016.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、現在のところＨＩＶウイルスやインフルエンザウイルス等の表面に存在する糖鎖に特異的に結合し、上記ウイルスの感染を効果的に阻害する物質はまだ十分に知られているとは言いがたく、その数は限られているため、上記物質が十分に供給できる状況にはなっていない。さらには、現在、全世界で感染が広がっているＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対して感染阻害効果を示す物質についても求められている。このように、ウイルス感染阻害効果を示す有用な物質がさらに多く見出され、その特性が明らかにされることが必要である。

【0006】

レクチンに関しては、上記のような高マンノース型糖鎖特異的レクチンにおいて、ウイルス感染に対する阻害効果を示す可能性のあるものも見出されてはいるが、他の型のレクチンでは、未だそのような報告が無く、有用なレクチンが求められている。

【0007】

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、上記のようなウイルス感染、特に、インフルエンザウイルス又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を効果的に阻害する可能性があるレクチンを探索し、そのようなレクチンを含むウイルス感染阻害剤を提供できるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、レクチンのうちフコース認識レクチンがウイルス感染を阻害する効果を示すことを見出して本発明を完成した。

【0009】

具体的に、本発明に係るウイルス感染阻害剤は、フコース認識レクチンを含むことを特徴とする。

【0010】

本発明に係るウイルス感染阻害剤において、前記フコース認識レクチンは、α１－６フコースに特異的に結合するレクチンであることが好ましい。

【0011】

本発明に係るウイルス感染阻害剤において、前記フコース認識レクチンは、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ又はＡＡＬであることがより好ましい。

【発明の効果】

【0012】

本発明に係るウイルス感染阻害剤は、ウイルスに対する中和活性が高いレクチンを含むため、ウイルス感染を効果的に阻害することができて極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２の生成方法を説明するための図であり、具体的にはｐＵＣ５７－ｈｙｐの構造を示す図である。

【図2】図２は、Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２の生成方法を説明するための図であり、具体的にはＨｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ－ｈｙｐ）の調製方法を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0015】

本発明の一実施形態は、フコース認識レクチンを含むウイルス阻害剤である。本実施形態において、フコース認識レクチンとは、糖鎖のうちＮ－結合型糖鎖（アスパラギン結合型糖鎖）の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンに結合したフコースを認識して結合するレクチンをいう。糖鎖において、フコースは、Ｎ－アセチルグルコサミンに対していくつかの異なる形態で結合したものが知られており、α１－６結合、α１－４結合、α１－３結合及びα１－２結合したもの等が知られており、本明細書において、それらをそれぞれα１－６フコース、α１－４フコース、α１‐３フコース及びα１－２フコースと呼び、それらを含む糖鎖をそれぞれα１－６フコース糖鎖、α１－４フコース糖鎖、α１‐３フコース糖鎖及びα１－２フコース糖鎖と呼ぶ。フコース認識レクチンとしては、例えばＨｙｐｎｉｎ Ａ、ＣＬＡ、ＡＯＬ、ＡＡＬ及びＵＥＡ Ｉ等が挙げられる。

【0016】

Ｈｙｐｎｉｎ Ａは、紅藻カギイバラノリ（Hypnea japonica）に由来するレクチンであり、例えばBiochim Biophys Acta. 1474(2000):226-36や特許第５１０９００１号公報に記載された方法によって抽出及び精製することができる。なお、Ｈｙｐｎｉｎ Ａは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等による精製過程でＨｙｐｎｉｎ Ａ－１、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２及びＨｙｐｎｉｎ Ａ－３に分離され得るが、本実施形態において、それぞれ単独又は混合物の形態で用いることができる。Ｈｙｐｎｉｎ Ａは、糖鎖におけるフコースのうちα１－６フコースに対して特に親和性が高いことが知られている。

【0017】

ＣＬＡは、緑藻ヒラミル（Codium latum）に由来するレクチンであり、糖鎖におけるフコースのうち特にα１－３フコースに対して高い親和性で結合するレクチンである。ＣＬＡは、配列番号１のアミノ酸配列を有する約１６ｋＤａのレクチンである（特願２０２１－１４１７３３号を参照）。

【0018】

ＡＯＬは、麹菌（Aspergillus oryzae）に由来するレクチンであり、糖鎖におけるフコースのうちα１－６、α１－４、α１－３及びα１－２フコースを認識して結合するレクチンである。ＡＯＬは、例えば東京化成工業株式会社（製品コード：Ｌ０１６９）から入手可能である。

【0019】

ＡＡＬは、ヒイロチャワンタケ（Aleuria Aurantia）に由来するレクチンであり、糖鎖におけるフコースのうちα１－６、α１－４、α１－３及びα１－２フコースを認識して結合するレクチンである。例えばコスモ・バイオ株式会社（品番：Ｊ１０１－Ｒ）から入手可能である。

【0020】

ＵＥＡ Ｉは、ハリエニシダ（Ulex europaeus）に由来するレクチンであり、糖鎖におけるフコースのうちα１－６、α１－４、α１－３及びα１－２フコースを認識して結合するレクチンである。例えばコスモ・バイオ株式会社（品番：Ｊ１１９）から入手可能である。

【0021】

本実施形態に係るレクチンは、藻類等から抽出及び生成された天然起源のレクチンであってもよく、また、原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物、及び化学合成手順の産物であってもよい。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るタンパク質は、グリコシル化され得るか又は非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るタンパク質は、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。なお、本実施形態に係るレクチンは、組換え産生手順等を利用した人工物である場合、上記のようなα１－６、α１－４、α１－３及びα１－２フコースを認識して結合することができるものであれば、対応する天然起源のレクチンと比較して、アミノ酸配列に欠失、挿入、逆転、反復、及びタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）等の変異が含まれていてもよい。特に、レクチンにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのレクチンの活性にほとんど影響しない。

【0022】

レクチンのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このレクチンの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のレクチンにおいて、当該レクチンの構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

【0023】

当業者は、周知技術を使用してレクチンのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、レクチンをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、レクチンをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。

【0024】

上記「１又は数個のアミノ酸」の変異とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、若しくは付加できる程度の数（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されていることを意味する。

【0025】

他の実施形態において、本発明に係るレクチンは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間又は引き続く操作及び保存の間の安定性及び持続性を改善するために、レクチンのＮ末端に付加され得る。

【0026】

組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、当該分野で周知のベクター及び細胞等を用いて行なうことができる。

【0027】

本実施形態に係るウイルス感染阻害剤は、特にインフルエンザウイルス又はＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染を阻害するものである。本実施形態に係るウイルス感染阻害剤に含まれるフコース認識レクチンは、後に実施例にて詳細に説明するように、インフルエンザウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性が高く、感染防止効果を有する。

【0028】

本実施形態に係るウイルス感染阻害剤は、例えばインビトロで試験のために用いることができ、さらに、ヒト又は動物である対象の体内に投与して治療又は予防の目的で用いることもできる。その場合、ウイルス感染阻害剤は、経口製剤又は非経口製剤のいずれであってもよい。また、剤型は特に限定されるものではなく、常法に従い、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤、マイクロカプセル剤あるいは懸濁液剤等に製剤化して用いることができる。

【0029】

非経口的に投与する場合には、例えば、本発明に係るポリペプチドを含有する溶液を点鼻噴霧することや、注射剤として投与することができる。経口的に投与する場合には、食前、食後、食間のいずれに投与してもよい。

【0030】

本実施形態に係るウイルス感染阻害剤は、必要に応じて、担体、賦形剤、結合剤、膨化剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、防腐剤、安定剤、被覆剤等の材料を含有することができる。

【0031】

本実施形態に係るウイルス感染阻害剤において、例えば錠剤、カプセル剤等に含有することができる具体的な成分としては、トラガント、アラビアゴム、コーンスターチ及びゼラチンのような結合剤； 微晶性セルロース、結晶セルロースのような賦形剤； コーンスターチ、前ゼラチン化デンプン、アルギン酸、デキストリンのような膨化剤； ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤； 微粒二酸化ケイ素のような流動性改善剤； グリセリン脂肪酸エステルのような滑沢剤； ショ糖、乳糖及びアスパルテームのような甘味剤； ペパーミント、ワニラ香料及びチェリーのような香味剤等を挙げることができる。

【0032】

調剤単位形態がカプセル剤である場合には上記のタイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。

【0033】

また、種々の他の材料を、被覆剤として又は調剤単位の物理的形態を変化させるために含有させることができる。錠剤の被覆剤としては、例えば、シェラック、砂糖又はその両方が挙げられる。シロップ剤又はエリキシル剤は、例えば、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素及びチェリー又はオレンジ香味等を含有することができる。その他、各種ビタミン類、各種アミノ酸類を含有しても良い。

【0034】

本実施形態に係るウイルス感染阻害剤の投与量は、適用対象が必要とする量を確保できるように設定すればよく、製剤化して用いたり、飲食品に配合して上記ウイルス感染阻害剤を用いることができる。

【実施例0035】

以下に、本発明に係るウイルス感染阻害剤について詳細に説明するための実施例を示す。

【0036】

［実施例１：インフルエンザウイルスに対するフコース認識レクチンの感染阻害効果の検討］
まず、種々のフコース認識レクチンがインフルエンザウイルスに対して感染阻害効果を示すか否かについて検討するために、インフルエンザウイルスに対して種々のフコース認識レクチンを処理してインフルエンザウイルスの細胞感染能を評価した。その方法及び結果を以下に説明する。

【0037】

（材料）
本実施例において、インフルエンザウイルスとしてＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株（Ｒ．Ａ．Ｌａｍｂ教授（米国ノースウェスタン大学）より分与された）を用いた。また、フコース認識レクチンとしては、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ、ＣＬＡ、ＡＯＬ及びＡＡＬを用いた。なお、ＡＯＬは東京化成工業株式会社（製品コード：Ｌ０１６９）より購入したものを用い、ＡＡＬはコスモ・バイオ株式会社（品番：Ｊ１０１－Ｒ）より購入したものを用いた。また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａとしては、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２の組換え型であり、Ｈｉｓタグが融合されたＨｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２を用い、ＣＬＡは、特願２０２１－１４１７３３号に記載の方法で得たＨｉｓタグが融合された組換え型のＨｉｓ－ｒＣＬＡを用いた。Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２及びＨｉｓ－ｒＣＬＡの生成方法について以下に説明する。

【0038】

まず、Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２の生成方法について説明する。まず、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２のアミノ酸配列を基に、大腸菌コドンユーセージを用いて、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２の合成遺伝子を設計した。なお、同塩基配列の合成及び同配列を含むｐＵＣ５７組換え体の調製はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に依頼した。すなわち、ＮｄｅＩ認識サイト、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ（プロテアーゼ切断サイト）、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２、ストップコドン及びＥｃｏＲＩ認識サイトをこの順序でコードする塩基配列（配列番号２）を設計し、この合成ＤＮＡをｐＵＣ５７に挿入したものを調製した（図１を参照）。

【0039】

Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２をコードする合成ＤＮＡを含むｐＵＣ５７（ｐＵＣ５７－ｈｙｐと略記）の大量調製は、以下のように行った。すなわち、同プラスミドを１ｍＭ ＥＤＴＡ－１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＥと略記）に溶解し、プラスミド１００ｎｇ相当量を６００μｌの大腸菌（ＤＨ５α；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）懸濁液に加えて、氷上で１５分間静置した。これを湯浴中、ヒートショック（４２℃、４５秒）を用いる形質転換に付した後、氷上で３分間静置した。これに８００μｌのＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＯＣ）培地（２％バクトトリプトン－０．５％酵母抽出物－１０ｍＭ ＮａＣｌ－１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４－１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２－２０ｍＭグルコース）を加えて、恒温槽内において３７℃下で３０分間予備培養した。この予備培養液を５ｍｌのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）－ａｍｐ液体培地（１％バクトトリプトン－０．５％酵母抽出物－２０ｍＭ ＮａＣｌ－１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液を遠心（１２０００ｒｐｍ、５分）して菌体を回収した。この菌体を１２０μｌのｓｏｌ Ｉ（５０ｍＭグルコース－１０ｍＭ ＥＤＴＡ－２５ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、２４０μｌのｓｏｌ ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ－１．０％ＳＤＳ）を加えて、穏やかに転倒混和した後、氷上に５分間静置した。これに、１８０μｌのｓｏｌ ＩＩＩ（１１．５％酢酸－３Ｍ酢酸カリウム）を加えて、穏やかに撹拌後、氷上に５分間静置した。次に、１０μｌのクロロホルムを加えて混和後、遠心（１６０００ｒｐｍ、５分）して水層を回収した。同水層に４００μｌのＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソプロピルアルコール＝２５：２４：１）を加えて、ボルテックス後、遠心（１６０００ｒｐｍ、１０分）（以下、「ＰＣＩ処理」と略す）し、水層を回収し、１μｌグリコーゲン（２０μｇ／μｌ）、１／１０容５Ｍ塩化リチウム液、２．５倍容１００％エタノールを加えて遠沈（１６０００ｒｐｍ、１分）（以下、「エタノール沈殿処理」と略す）して沈殿を得た。この沈殿に７０％エタノールを１ｍｌ加えて、遠心洗浄（１６０００ｒｐｍ、１０分）（以下、「７０％エタノール洗浄処理」と略す）後、風乾してエタノールを完全に除去した。得られた沈殿を５０μｌのＴＥに溶解し、０．５μｌのＲＮａｓｅＡ（１μｇ／μｌ）を加え、３７℃で１時間酵素処理した。一方、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）については、１００ｎｇ相当量を同様にＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ－ｋａｎ液体培地（１％バクトトリプトン－０．５％酵母抽出物－２０ｍＭ ＮａＣｌ－５０μｇ／ｍｌカナマイシン）で培養した後、前述と同様の方法を用いて同プラスミドを大量調製した。

【0040】

続いて、ｐＵＣ５７－ｈｙｐを制限酵素処理（ＳａｃＩ及びＮｄｅＩ）して得たｈｙｐｎｉｎ Ａ－２合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を、同様の制限酵素処理に付したｐＥＴ２８ａにライゲーションして、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２発現ベクターを構築した（図２を参照）。すなわち、２．２５μｇ相当量のｐＵＣ５７－ｈｙｐを２０μｌの酵素反応液（２μｌ Ｌバッファー、１μｌ ＳａｃＩ（１０Ｕ）、１７μｌ滅菌水）中、３７℃で２時間酵素消化した。これを、ＰＣＩ処理、エタノール沈殿処理及び７０％エタノール洗浄処理に順次付し、このうち２．１４μｇを２０μｌの酵素反応液（２μｌ Ｈバッファー、１μｌ ＮｄｅＩ（１０Ｕ）、１７μｌ滅菌水）中、３７℃で２時間酵素消化した。両酵素処理で得られた消化物を１．２％低融点アガロースによる電気泳動に供して、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２合成遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）と略記）をゲルより切り取った。これをマイクロチューブ中、ゲルの約５倍容のＴＥを加えて、６５℃でゲルが完全に溶解するまで湯浴した。加熱後、室温まで冷やしてから、等容のトリス－フェノールを加えて混和後、遠心分離（１６０００ｒｐｍ、１０分）して（以下、「トリス－フェノール処理」と略す）、水層を回収した。これを再度トリス－フェノール処理して得た水層に１ｍｌのクロロホルムを加えて混和後、遠心分離し（１６０００ｒｐｍ、１０分）、水層を回収した。これをエタノール沈澱および７０％エタノール洗浄処理後、風乾し、５μｌの滅菌水に溶解して、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）画分を得た。なお、ＤＮＡ量は１．０％アガロース電気泳動での蛍光バンドの強度から概算した。一方、ｐＵＣ５７－ｈｙｐとほぼ同量のｐＥＴ２８ａを同様の方法でＳａｃＩ及びＮｄｅＩの制限酵素処理に順次付し、遊離の両制限酵素サイトをもつｐＥＴ２８ａ（ｐＥＴ２８ａ（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ））を調製した。前述の方法で得たｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（インサート）とｐＥＴ２８ａ（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（ベクター）を３：１（インサート／ベクター）のモル比でライゲーションした。すなわち１０μｌの反応液（０．５μｌ Ｔ４リガーゼ（３．５Ｕ）、１μｌリガーゼバッファー、３μｌ ｐＥＴ２８ａ（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（３００ｎｇ）、５μｌ ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（５０ｎｇ）、０．５μｌ滅菌水）を調製し、１６℃で１６時間反応させた。次に、反応液の２．５及び５μｌを、それぞれ各２００μｌの大腸菌（ＤＨ５α）懸濁液に加え、ヒートショック法により形質転換した。これに、８００μｌのＳＯＣ培地を加え３７℃で３０分間予備培養後、ＬＢ－ｋａｎ寒天培地に適量塗布して、３７℃で一晩培養した。生じた各コロニーをそれぞれ５ｍｌのＬＢ－ｋａｎ液体培地に植菌し、一晩培養後に各ベクターをアルカリＳＤＳ溶菌に付し、得られたプラスミドを１０μｌのＴＥに溶解して、その一部を１％アガロース電気泳動に供して、その移動度によりインサートチェックを行った。さらに、インサートを含むと判断されたベクターについては、ＮｄｅＩ及びＳａｃＩを用いる制限酵素処理を行い、同電気泳動に供して、インサートが組み込まれていることを再確認した。また、インサートを含むことが確認されたプラスミドについては、ＤＮＡシークエンサーに供してその塩基配列解析を行った。

【0041】

上記のようにして得られたｐＥＴ２８ａ－ｈｙｐを用いて発現用大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を形質転換し、Ｈｉｓタグ融合組換えＨｙｐｎｉｎＡ－２発現株ｐＥＴ２８ａ－ｈｙｐ／ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓを得た。これを３ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、培養液を２５０ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に加え、３７℃で対数増殖期中期になるまで振盪培養した。ＯＤ６００が０．５～０．８に達したところで、２０℃で３０分間振盪培養して培養液を十分に冷却した。これに終濃度が０．５ｍＭとなるようにイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで発現誘導を開始し、２０℃で１６時間振盪培養した。これを遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）を添加及び懸濁した後、氷上で冷却しながら超音波破砕を行った。超音波破砕時の条件は「超音波破砕１分－休止１分」のセットを７回行った。破砕処理後、遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上清を可溶性画分とした。

【0042】

ニッケルキレートカラム（Ｖｔ＝１ｍＬ、Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ、ＧＥヘルスケア）を同緩衝液１０ｍＬで平衡化後、可溶性画分をカラムに添加し、Ｈｉｓタグ融合組換えレクチンを吸着させた。カラムに非特異的に吸着した夾雑成分を洗浄するため、イミダゾールを１５０ｍＭ含有する緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ）を用いてカラムを洗浄した。その後、溶出用緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）をカラムに６ｍＬ流し、精製Ｈｉｓタグ融合組換えＨｙｐｎｉｎＡ－２（Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２）を得た。

【0043】

次に、Ｈｉｓ－ｒＣＬＡの生成方法について説明する。まず、ＣＬＡ ｃＤＮＡがコードする翻訳領域の配列情報（配列番号３を参照）をもとにＣＬＡコード合成ＤＮＡを設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に依頼して作製した。制限酵素認識部位を５’末端に付加したプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＮｈｅＩ付加、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＸｈｏＩ付加）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲによりＣＬＡコードＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、同じく両制限酵素で処理したベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社）にサブクローニングし、ＣＬＡ発現用プラスミドｐＥＴ２８ａ－ｒＣＬＡを得た。さらにこのｐＥＴ２８ａ－ｒＣＬＡを用いて発現用大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を形質転換し、Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡ発現株ｐＥＴ２８ａ－ｒＣＬＡ／ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓを得た。

【0044】

上記のようにして得られたＨｉｓタグ融合組換えＣＬＡ（Ｈｉｓ－ｒＣＬＡ）発現用大腸菌株（ｐＥＴ２８ａ－ＣＬＡ／ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を３ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、培養液を２５０ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に加え、３７℃で対数増殖期中期になるまで振盪培養した。ＯＤ６００が０．５に達したところで、終濃度が０．５ｍＭとなるようにイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで発現誘導を開始し、２０℃で１６時間振盪培養した。これを遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）を添加及び懸濁した後、氷上で冷却しながら超音波破砕を行った。超音波破砕時の条件は「超音波破砕１分－休止１分」のセットを７回行った。破砕処理後、遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上清を可溶性画分とした。

【0045】

ニッケルキレートカラム（Ｖｔ＝１ｍＬ、Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ、ＧＥヘルスケア）を同緩衝液１０ｍＬで平衡化後、可溶性画分をカラムに添加し、Ｈｉｓタグ融合組換えレクチンを吸着させた。カラムに非特異的に吸着した夾雑成分を洗浄するため、イミダゾールを１５０ｍＭ含有する緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ）を用いてカラムを洗浄した。その後、溶出用緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）を３ｍＬ、２ｍＬの順に添加して回収して、精製Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡ（Ｈｉｓ－ｒＣＬＡ）を得た。

【0046】

（方法及び結果）
まず、１０μＬの上記インフルエンザウイルス（１．１×１０^８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と、９０μＬの上記各レクチン（１０μＭ）とを混合した。なお、これらとは別にコントロールとしてレクチンを含まないＤＭＥＭとインフルエンザウイルスとを混合した。その後、３０分間室温で反応させた後に、細胞維持液ＤＭＥＭで１０倍に稀釈して反応を停止した。さらに１０段階系列希釈して、種々の濃度のウイルス含有液を準備した。そして、予め９６ウェルプレートに播種されたＭＤＣＫ（＋）細胞（Noma, K. et al. Archives of Virology 143:1893-1909, 1998）に当該各濃度のウイルス含有液を接種して（５０μｌ／ｗｅｌｌ、各濃度４ｗｅｌｌずつ）、１時間吸着させた後に、接種液を吸引除去して、１００μｌ／ｗｅｌｌのＤＭＥＭを加えた。なお、その５日後に細胞変性効果が広がったところで、各ウェルを顕微鏡により観察して感染の有無を評価し、感染価を測定した。感染価の単位は、５０％細胞感染濃度（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌである。その結果を表１に示す。

【0047】

【表1】

【0048】

表１に示すように、各フコース認識レクチンにより処理されたインフルエンザウイルスはコントロール（ＤＭＥＭ）と比較して、不活化して感染価が低下した。特に、各フコース認識レクチンのうちα１－６フコースを認識できるレクチンであるＨｙｐｎｉｎ Ａ－２、ＡＯＬ及びＡＡＬを処理した場合の効果が高く、中でも、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２を処理した場合が特に感染価を低減できることが明らかとなった。また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２に次いでＡＡＬも比較的高い感染阻害効果を示すことがわかる。

【0049】

［実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するフコース認識レクチンの感染阻害効果の検討］
次に、種々のフコース認識レクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して感染阻害効果を示すか否かについて検討するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して種々のフコース認識レクチンを処理してインフルエンザウイルスの細胞感染能を評価した。その方法及び結果を以下に説明する。

【0050】

（材料）
本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２として広島県の患者検体より常法にて分離したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＪＰ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ－４６０５９Ｔ／２０２０株（Clade:GR、Lineage:B.1.1、GenBank/DDBJ/EMBL accession number:MZ853926、GISAID Accession ID:EPI_ISL_6289932）を用いた（Yamamotoya et al. Scientific Reports 11:18581, 2021を参照）。また、フコース認識レクチンとしては、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ、ＣＬＡ、ＡＯＬ、ＡＡＬ及びＵＥＡ Ｉを用いた。なお、ＣＬＡ、ＡＯＬ及びＡＡＬは、上記実施例１で用いたものと同一である。また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａとしては、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－１及びＨｙｐｎｉｎ Ａ－２を用い、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２は上記実施例１で用いたものと同一である。Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－１は、紅藻カギイバラノリ（Hypnea japonica）から、例えばBiochim Biophys Acta. 1474(2000):226-36や特許第５１０９００１号公報に記載された方法によって抽出及び精製した天然型レクチンを用いた。ＵＥＡ Ｉは、コスモ・バイオ株式会社（品番：Ｊ１１９）より購入したものを用いた。

【0051】

（方法及び結果）
まず、１０μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：１．１×１０^８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と、９０μＬの上記各レクチン（５μＭ）とを混合した。なお、これらとは別にコントロールとしてレクチンを含まないＤＭＥＭとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とを混合した。その後、３０分間室温で反応させた後に、細胞維持液ＤＭＥＭで１０倍に稀釈して反応を停止した。さらに１０段階系列希釈して、種々の濃度のウイルス含有液を準備した。そして、予め９６ウェルプレートに播種されたＶｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンク））に当該各濃度のウイルス含有液を接種して（５０μｌ／ｗｅｌｌ、各濃度４ｗｅｌｌずつ）、１時間吸着させた後に、接種液を吸引除去して、１００μｌ／ｗｅｌｌのＤＭＥＭを加えた。なお、その４日後に細胞変性効果が広がったところで、各ウェルを顕微鏡により観察して感染の有無を評価し、感染価を測定した。感染価の単位は、５０％細胞感染濃度（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌである。その結果を表２に示す。

【0052】

【表2】

【0053】

表２に示すように、各フコース認識レクチンにより処理されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコントロール（ＤＭＥＭ）と比較して、不活化して感染価が低下した。特に、各フコース認識レクチンのうちα１－６フコースを認識できるレクチンであるＨｙｐｎｉｎ Ａ、ＡＯＬ、ＡＡＬ及びＵＥＡ Ｉを処理した場合の効果が高く、中でも、Ｈｙｐｎｉｎ Ａを処理した場合が特に感染価を低減できることが明らかとなった。また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａに次いでＡＡＬも比較的高い感染阻害効果を示すことがわかる。

【0054】

以上の結果から、フコース認識レクチンは、インフルエンザウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染阻害効果があり、インビトロにおける試験や、これらのウイルス感染の治療や予防のための薬剤として利用可能性があるので極めて有用である。

【図1】

【図2】

【配列表】

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