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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023183863
(43)【公開日】2023-12-28
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法及びそのためのキット
(51)【国際特許分類】
C12N 7/02 20060101AFI20231221BHJP
C12N 1/02 20060101ALI20231221BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20231221BHJP
C07K 14/42 20060101ALI20231221BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20231221BHJP
C12Q 1/24 20060101ALI20231221BHJP
C12M 1/34 20060101ALN20231221BHJP
C12M 1/26 20060101ALN20231221BHJP
【ＦＩ】
C12N7/02
C12N1/02
C07K17/00
C07K14/42
C12Q1/70
C12Q1/24
C12M1/34 B
C12M1/26
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022097639
(22)【出願日】2022-06-16
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年６月１８日に令和３年度中四国乳酸菌研究会にて発表 令和３年１１月１６日に第６８回日本ウイルス学会学術集会にて発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「藻類由来レクチンによる濃縮とＬＡＭＰ法による迅速高感度ＣＯＶＩＤ－１９診断技術開発（基礎研究支援）」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】堀 貫治
(72)【発明者】
【氏名】坂口 剛正
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029BB13
4B029BB15
4B029CC03
4B029CC10
4B029FA04
4B029HA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR56
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR79
4B063QR82
4B063QS15
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
4B065AA95X
4B065BD14
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045AA40
4H045BA41
4H045BA60
4H045CA30
4H045DA80
4H045EA53
4H045FA74
4H045FA80
4H045FA82
(57)【要約】
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を効率的に濃縮できる方法及びそのためのキットを提供できるようにする。
【解決手段】本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法は、検体中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮する方法であって、藻類由来レクチンが固定された担体を準備するステップと、前記検体を前記担体に接触させるステップと、前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップとを含む。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法は、検体中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮する方法であって、藻類由来レクチンが固定された担体を準備するステップと、前記検体を前記担体に接触させるステップと、前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップとを含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮する方法であって、
藻類由来レクチンが固定された担体を準備するステップと、
前記検体を前記担体に接触させるステップと、
前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップとを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法。
藻類由来レクチンが固定された担体を準備するステップと、
前記検体を前記担体に接触させるステップと、
前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップとを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法。
【請求項2】
前記藻類由来レクチンは、ＯＡＡ、ＫＡＡ－１、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ又はＢＣＬ１１ａである請求項１に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法。
【請求項3】
前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の溶出のために、ＳＤＳを含む溶液を用いる、請求項１に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、
担体と、
前記担体に固定されるための藻類由来レクチンとを含む、キット。
担体と、
前記担体に固定されるための藻類由来レクチンとを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法及びそのためのキットに関し、特に藻類由来レクチンを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞表面や体液中に存在する糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質の糖鎖は、一種の情報素子として機能し、発生、免疫、がん、感染等の重要な生命現象に深く関わっている。一方、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンは糖鎖認識分子として機能し、糖鎖と同様に生物学的に重要な役割を担っている。
【0003】
これまでに、海藻類及び淡水産藍藻等の藻類から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。藻類由来レクチンは、その結合性に基づいて大きくは高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖又は混成型糖鎖に結合するもの、セリン、スレオニン等と結合するＯ－グリコシド結合糖鎖（Ｏ型糖鎖）に結合するもの、その他にフコース含有糖鎖に結合するもの等に大別できる。レクチンの一部は、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス等のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献１～１２）。藍藻Oscillatoria agardhii由来レクチンであるＯＡＡ（Oscillatoria agardhii agglutinin）、紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンであるＫＡＡ（Kappaphycus alvarezii agglutinin）、緑藻Boodlea coacta由来レクチンであるＢＣＡ（Boodlea coacta agglutinin）及び紅藻Meristotheca papulosa由来レクチンであるＭＰＬ（Meristotheca papulosa lectin）は高マンノース型糖鎖との強い結合特異性からＨＩＶやインフルエンザウイルスといった表面に高マンノース型糖鎖を有するウイルスを認識できると期待されている。特に、非特許文献１２には、ＫＡＡはＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０を認識することが開示されており、抗ＨＩＶ活性を示し、医薬素材としての活用が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530, 1997.
【非特許文献2】O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003.
【非特許文献3】Helle, F., .et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006.
【非特許文献4】Barrientos, L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.
【非特許文献5】Dey, B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.
【非特許文献6】O’Keefe, B. R. et al.,J. Virol. 84, 2511-2521, 2010.
【非特許文献7】Hori,K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.
【非特許文献8】Sato,Y., Okuyama, S., and Hori, K., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.
【非特許文献9】Sato,Y., Morimoto,K., Hirayama, M., and Hori, K. Biochem. Biophys. Res. commun. 405, 291-296, 2011.
【非特許文献10】佐藤雄一郎、平山 真、藤原佳史、森本金治郎、堀 貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)
【非特許文献11】Sato,Y., Hirayama, M., Morimoto,K., Yamamoto, N., Okuyama, S., and Hori, K. J. Biol. Chem. 286, No.22, 19446-19458, 2011.
【非特許文献12】Hirayama, M., Shibata, H., Imamura, K., Sakaguchi, T., and Hori, K. Mar Biotechnol. 18, issue 2, 215-231, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、現在のところ、上記のようなウイルスの表面に存在する糖鎖に特異的に結合し、それらのウイルスの濃縮に利用できる物質はまだ十分に知られているとは言いがたく、その数も限られているため、上記物質が十分に供給できる状況にはなっていない。また、現在、全世界で感染が広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断等のためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮するのに利用できる物質についても求められている。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮に利用できる有用な物質がさらに多く見出され、その特性が明らかにされることが必要である。
【0006】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を効率的に濃縮できる方法及びそのためのキットを提供できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、各種の藻類由来レクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を効率的に濃縮できることを見出して本発明を完成した。
【0008】
具体的に、本発明に係る検体中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮する方法は、藻類由来レクチンが固定された担体を準備するステップと、前記検体を前記担体に接触させるステップと、前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップとを含むことを特徴とする。
【0009】
本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法において、前記藻類由来レクチンは、ＯＡＡ、ＫＡＡ－１、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ又はＢＣＬ１１ａであることが好ましい。
【0010】
本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法は、前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の溶出のために、ＳＤＳを含む溶液を用いることが好ましい。
【0011】
また、本発明に係るキットは、上記本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法を行うためのキットであって、担体と、前記担体に固定されるための藻類由来レクチンとを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮する方法及びそのためのキットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高い効率で結合できる藻類由来レクチンを含み、該藻類由来レクチンからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高い効率で溶出できるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高い効率で濃縮することができて極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0015】
本発明の一実施形態は、検体中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮する方法である。特に、本実施形態に係る方法は、藻類由来レクチンが固定された担体を準備するステップと、前記検体を前記担体に接触させるステップと、前記担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップとを含むものである。
【0016】
本実施形態において、藻類由来レクチンとは、藻類を起源として藻類から抽出可能なレクチンであり、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖鎖に結合することができるレクチンを意味する。そのようなレクチンとしては、例えばＯＡＡ、ＫＡＡ－１、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ及びＢＣＬ１１ａが挙げられる。
【0017】
ＯＡＡは、糸状藍藻Oscillatoria agardhii に由来するレクチン（UniProtKB/Swiss-Prot Accession No:P84330：配列番号１）であり、例えばSato, Y. et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 125, 169-177（2000）に開示の方法で単離することができる。ＯＡＡは、システインを含まない１３２残基のアミノ酸からなり、６７アミノ酸の２リピート配列を有し、この重複配列間には約７５％の相同性が認められている。また三次構造においては、上記重複配列間が一部入れ換わったドメインスワップ構造をとり、これにより形づくられた２つのドメインがそれぞれ１つの糖結合部位を持つ。ＯＡＡは、単糖結合性を示さず、認識する最少糖構造はＭａｎ（α１－３）Ｍａｎ（α１－６）Ｍａｎ（β１－４）であり、Ｎ型糖鎖のうち、Ｄ２アームの（α１－３）Ｍａｎ残基が露出した高マンノース型糖鎖に特異的に結合する。ＯＡＡは、１分子あたり２つの糖結合部位を持ち、細胞を架橋・凝集することが知られており、エンベロープ等のウイルス表面に高マンノース型糖鎖が存在するウイルスを認識できると考えられる。
【0018】
ＫＡＡ－１は、紅藻Kappaphycus alvareziiに由来するレクチン（GenBank Accession No:LC007080、配列番号２）であり、例えば、Hung et al., Fish. Sci. 75, 723-730（2009）に開示の方法で単離することができる。ＫＡＡ－１は、上記ＯＡＡと６０．６％の相同性を示し、同じＯＡＡファミリーに属する。ＫＡＡ１は約６７アミノ酸の４リピート配列を有し、ＯＡＡが２つ連なったような構造からなり、ＯＡＡに極めてよく似た性状、機能を示す。すなわち、ＫＡＡ－１は、単糖結合性を示さず、認識する最少糖構造はＭａｎ（α１－３）Ｍａｎ（α１－６）Ｍａｎ（β１－４）であり、Ｎ型糖鎖のうち、Ｄ２アームの（α１－３）Ｍａｎ残基が露出した高マンノース型糖鎖に特異的に結合する。ＫＡＡ－１は、１分子あたり４つの糖結合部位を持ち、細胞を架橋・凝集することが知られており、エンベロープ等のウイルス表面に高マンノース型糖鎖が存在する種々のウイルスを認識できると考えられる。
【0019】
Ｈｙｐｎｉｎ Ａは、紅藻カギイバラノリ（Hypnea japonica）に由来するレクチンであり、例えばBiochim Biophys Acta. 1474(2000):226-36や特許第５１０９００１号公報に記載された方法によって抽出及び精製することができる。なお、Ｈｙｐｎｉｎ Ａは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等による精製過程でＨｙｐｎｉｎ Ａ－１、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２及びＨｙｐｎｉｎ Ａ－３に分離され得るが、本実施形態において、それぞれ単独又は混合物の形態で用いることができる。Ｈｙｐｎｉｎ Ａは、フコースを含む糖鎖（フコース糖鎖）のうちコアα１－６フコースに対して特に親和性が高いことが知られている（Okuyama, S. et al., Biosci.Biotechnol. Biochem., 73, 912-920 (2009)）。
【0020】
ＢＣＬ１１ａは、ネザシハシモ（Bryopsis corticulans）に由来するレクチンであり、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）／ＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）を認識して結合するレクチンである（配列番号３）。ＢＣＬ１１ａは、例えば国際公開第２０１２／１３３１２７号に記載された方法により組換型を得ることもできる（国際公開第２０１２／１３３１２７号のＢＣＬ１１に相当）。
【0021】
本実施形態で用いられる藻類由来レクチンは、藻類から抽出及び生成された天然起源のレクチンであってもよく、また、原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物、及び化学合成手順の産物であってもよい。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るタンパク質は、グリコシル化され得るか又は非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るタンパク質は、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。なお、本実施形態に係るレクチンは、組換え産生手順等を利用した人工物である場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に存在する糖鎖を認識して結合することができるものであれば、対応する天然起源のレクチンと比較して、アミノ酸配列に欠失、挿入、逆転、反復、及びタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）等の変異が含まれていてもよい。特に、レクチンにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのレクチンの活性にほとんど影響しない。
【0022】
レクチンのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このレクチンの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のレクチンにおいて、当該レクチンの構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【0023】
当業者は、周知技術を使用してレクチンのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、レクチンをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、レクチンをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。
【0024】
上記「１又は数個のアミノ酸」の変異とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、若しくは付加できる程度の数（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されていることを意味する。
【0025】
他の実施形態において、本発明に係るレクチンは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間又は引き続く操作及び保存の間の安定性及び持続性を改善するために、レクチンのＮ末端に付加され得る。
【0026】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、当該分野で周知のベクター及び細胞等を用いて行なうことができる。
【0027】
本実施形態において、担体は、一般に用いられているもの、例えばカラムとして用いることができるものであって、上記レクチンを固定できるものであれば特に限定されないが、例えば材料としてはシリカからなる担体を用いることができ、好適には多孔性シリカモノリスからなるカラム等を用いることができる。
【0028】
本実施形態において、検体を担体に接触させるステップは、上記のような担体としてのカラムに検体を流すことで行うことができる。本実施形態において、検体は、例えばヒト等の被験者から採取された唾液、血液、リンパ液若しくは尿等の体液、又は例えば下水等の環境水を用いることができるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む可能性がある液体であれば特に限定されない。
【0029】
本実施形態において、担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するステップは、例えば上記検体を担体に接触させるステップにおいてカラムに固定されたレクチンに結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するための溶出液をカラムに流すことによって行われる。なお、本実施形態において、溶出とは、担体に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を破壊することなく回収することのみならず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面膜を破壊してウイルス内容物を溶出させることも含む。溶出液は、藻類由来レクチンとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合を解除できる溶液であれば特に限定されず、例えば上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面膜を破壊してウイルス内容物を溶出させる場合は、ＳＤＳ等の界面活性剤を利用することができる。
【0030】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法によると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合可能な藻類由来レクチンが固定された担体を利用するため、検体に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を担体に高い効率で結合させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を担体から高い効率で溶出させるため、高い効率でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を濃縮することが可能となる。
【0031】
本発明に係る他の実施形態は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法を行うためのキットであり、当該キットは、上記のような担体と、担体に固定されるための上記のような藻類由来レクチンとを含む。本実施形態に係るキットにおいて、担体と藻類由来レクチンとはそれぞれ別々に含まれていてもよく、既に担体に藻類由来レクチンが固定された状態で含まれていてもよい。また、本実施形態に係るキットは、上記担体及び藻類由来レクチンの他に、担体の洗浄液やＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を溶出するための溶出液等を含んでいてもよい。本実施形態に係るキットにおいて利用可能な担体、藻類由来レクチン及び溶出液は、具体的に、上述した担体、藻類由来レクチン及び溶出液の具体例を利用することができる。また、洗浄液は、藻類由来レクチンとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合に影響せず、担体や藻類由来レクチンに非特異的に結合した不要な成分を洗い流すことができるものであれば特に限定されず、例えば生理食塩水等を用いることができる。
【0032】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法及びそのためのキットによると、上記の通りＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖鎖に結合することができるレクチンを利用するため、当該レクチンが固定された担体を利用することでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を効果的に濃縮することができる。
【実施例0033】
以下に、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法について詳細に説明するための実施例を示す。本実施例では、数種のレクチンがそれぞれ固定されたカラムを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮可能性について検討した。その方法及び結果を以下に説明する。
【0034】
（材料）
本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２として本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２として広島県の患者検体より常法にて分離したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＪＰ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ－４６０５９Ｔ／２０２０株（Clade:GR、Lineage:B.1.1、GenBank/DDBJ/EMBL accession number:MZ853926、GISAID Accession ID:EPI_ISL_6289932）を用いた（Yamamotoya et al. Scientific Reports 11:18581, 2021を参照）。ウイルス増殖用の細胞としては、Ｖｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンク））を用いた。また、藻類由来レクチンとしては、ＯＡＡ、ＢＣＬ１１ａ及びＨｙｐｎｉｎ Ａを用いた。なお、ＯＡＡはＨｉｓタグが融合された組換え型Ｈｉｓ－ｒＯＡＡを用い、ＢＣＬ１１ａはＨｉｓタグが融合された組換え型Ｈｉｓ－ｒＢＣＬ１１ａを用いた。また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａとしては、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２の組換え型であり、Ｈｉｓタグが融合されたＨｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２を用いた。レクチンを固定するカラムは、多孔性シリカモノリスからなりマクロポア径が２μｍのカラムを用いた。具体的に、ＯＡＡカラム、ＢＣＬ１１ａカラム及びＨｙｐｎｉｎ Ａ－２カラムは、Ｎｉ－ＮＴＡ－シリカモノリススピンカラム（２７μＬ容、京都モノテック社製）に対して、常法により上記各レクチンを固定して作製した。
本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２として本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２として広島県の患者検体より常法にて分離したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＪＰ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ－４６０５９Ｔ／２０２０株（Clade:GR、Lineage:B.1.1、GenBank/DDBJ/EMBL accession number:MZ853926、GISAID Accession ID:EPI_ISL_6289932）を用いた（Yamamotoya et al. Scientific Reports 11:18581, 2021を参照）。ウイルス増殖用の細胞としては、Ｖｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンク））を用いた。また、藻類由来レクチンとしては、ＯＡＡ、ＢＣＬ１１ａ及びＨｙｐｎｉｎ Ａを用いた。なお、ＯＡＡはＨｉｓタグが融合された組換え型Ｈｉｓ－ｒＯＡＡを用い、ＢＣＬ１１ａはＨｉｓタグが融合された組換え型Ｈｉｓ－ｒＢＣＬ１１ａを用いた。また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａとしては、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２の組換え型であり、Ｈｉｓタグが融合されたＨｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２を用いた。レクチンを固定するカラムは、多孔性シリカモノリスからなりマクロポア径が２μｍのカラムを用いた。具体的に、ＯＡＡカラム、ＢＣＬ１１ａカラム及びＨｙｐｎｉｎ Ａ－２カラムは、Ｎｉ－ＮＴＡ－シリカモノリススピンカラム（２７μＬ容、京都モノテック社製）に対して、常法により上記各レクチンを固定して作製した。
【0035】
上記Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２は、以下の方法で得た。まず、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２のアミノ酸配列を基に、大腸菌コドンユーセージを用いて、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２の合成遺伝子を設計した。なお、同塩基配列の合成及び同配列を含むｐＵＣ５７組換え体の調製はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に依頼した。すなわち、ＮｄｅＩ認識サイト、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ（プロテアーゼ切断サイト）、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２、ストップコドン及びＥｃｏＲＩ認識サイトをこの順序でコードする塩基配列（配列番号４）を設計し、この合成ＤＮＡをｐＵＣ５７に挿入したものを調製した（図１を参照）。
【0036】
Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２をコードする合成ＤＮＡを含むｐＵＣ５７（ｐＵＣ５７－ｈｙｐと略記）の大量調製は、以下のように行った。すなわち、同プラスミドを１ｍＭ ＥＤＴＡ－１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＥと略記）に溶解し、プラスミド１００ｎｇ相当量を６００μｌの大腸菌（ＤＨ５α；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）懸濁液に加えて、氷上で１５分間静置した。これを湯浴中、ヒートショック（４２℃、４５秒）を用いる形質転換に付した後、氷上で３分間静置した。これに８００μｌのＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＯＣ）培地（２％バクトトリプトン－０．５％酵母抽出物－１０ｍＭ ＮａＣｌ－１０ｍＭ ＭｇＳＯ４－１０ｍＭ ＭｇＣｌ２－２０ｍＭグルコース）を加えて、恒温槽内において３７℃下で３０分間予備培養した。この予備培養液を５ｍｌのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）－ａｍｐ液体培地（１％バクトトリプトン－０．５％酵母抽出物－２０ｍＭ ＮａＣｌ－１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液を遠心（１２０００ｒｐｍ、５分）して菌体を回収した。この菌体を１２０μｌのｓｏｌ Ｉ（５０ｍＭグルコース－１０ｍＭ ＥＤＴＡ－２５ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、２４０μｌのｓｏｌ ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ－１．０％ＳＤＳ）を加えて、穏やかに転倒混和した後、氷上に５分間静置した。これに、１８０μｌのｓｏｌ ＩＩＩ（１１．５％酢酸－３Ｍ酢酸カリウム）を加えて、穏やかに撹拌後、氷上に５分間静置した。次に、１０μｌのクロロホルムを加えて混和後、遠心（１６０００ｒｐｍ、５分）して水層を回収した。同水層に４００μｌのＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソプロピルアルコール＝２５：２４：１）を加えて、ボルテックス後、遠心（１６０００ｒｐｍ、１０分）（以下、「ＰＣＩ処理」と略す）し、水層を回収し、１μｌグリコーゲン（２０μｇ／μｌ）、１／１０容５Ｍ塩化リチウム液、２．５倍容１００％エタノールを加えて遠沈（１６０００ｒｐｍ、１分）（以下、「エタノール沈殿処理」と略す）して沈殿を得た。この沈殿に７０％エタノールを１ｍｌ加えて、遠心洗浄（１６０００ｒｐｍ、１０分）（以下、「７０％エタノール洗浄処理」と略す）後、風乾してエタノールを完全に除去した。得られた沈殿を５０μｌのＴＥに溶解し、０．５μｌのＲＮａｓｅＡ（１μｇ／μｌ）を加え、３７℃で１時間酵素処理した。一方、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）については、１００ｎｇ相当量を同様にＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ－ｋａｎ液体培地（１％バクトトリプトン－０．５％酵母抽出物－２０ｍＭ ＮａＣｌ－５０μｇ／ｍｌカナマイシン）で培養した後、前述と同様の方法を用いて同プラスミドを大量調製した。
【0037】
続いて、ｐＵＣ５７－ｈｙｐを制限酵素処理（ＳａｃＩ及びＮｄｅＩ）して得たｈｙｐｎｉｎ Ａ－２合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を、同様の制限酵素処理に付したｐＥＴ２８ａにライゲーションして、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２発現ベクターを構築した（図２を参照）。すなわち、２．２５μｇ相当量のｐＵＣ５７－ｈｙｐを２０μｌの酵素反応液（２μｌ Ｌバッファー、１μｌ ＳａｃＩ（１０Ｕ）、１７μｌ滅菌水）中、３７℃で２時間酵素消化した。これを、ＰＣＩ処理、エタノール沈殿処理及び７０％エタノール洗浄処理に順次付し、このうち２．１４μｇを２０μｌの酵素反応液（２μｌ Ｈバッファー、１μｌ ＮｄｅＩ（１０Ｕ）、１７μｌ滅菌水）中、３７℃で２時間酵素消化した。両酵素処理で得られた消化物を１．２％低融点アガロースによる電気泳動に供して、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２合成遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）と略記）をゲルより切り取った。これをマイクロチューブ中、ゲルの約５倍容のＴＥを加えて、６５℃でゲルが完全に溶解するまで湯浴した。加熱後、室温まで冷やしてから、等容のトリス－フェノールを加えて混和後、遠心分離（１６０００ｒｐｍ、１０分）して（以下、「トリス－フェノール処理」と略す）、水層を回収した。これを再度トリス－フェノール処理して得た水層に１ｍｌのクロロホルムを加えて混和後、遠心分離し（１６０００ｒｐｍ、１０分）、水層を回収した。これをエタノール沈澱および７０％エタノール洗浄処理後、風乾し、５μｌの滅菌水に溶解して、ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）画分を得た。なお、ＤＮＡ量は１．０％アガロース電気泳動での蛍光バンドの強度から概算した。一方、ｐＵＣ５７－ｈｙｐとほぼ同量のｐＥＴ２８ａを同様の方法でＳａｃＩ及びＮｄｅＩの制限酵素処理に順次付し、遊離の両制限酵素サイトをもつｐＥＴ２８ａ（ｐＥＴ２８ａ（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ））を調製した。前述の方法で得たｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（インサート）とｐＥＴ２８ａ（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（ベクター）を３：１（インサート／ベクター）のモル比でライゲーションした。すなわち１０μｌの反応液（０．５μｌ Ｔ４リガーゼ（３．５Ｕ）、１μｌリガーゼバッファー、３μｌ ｐＥＴ２８ａ（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（３００ｎｇ）、５μｌ ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２（ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ）（５０ｎｇ）、０．５μｌ滅菌水）を調製し、１６℃で１６時間反応させた。次に、反応液の２．５及び５μｌを、それぞれ各２００μｌの大腸菌（ＤＨ５α）懸濁液に加え、ヒートショック法により形質転換した。これに、８００μｌのＳＯＣ培地を加え３７℃で３０分間予備培養後、ＬＢ－ｋａｎ寒天培地に適量塗布して、３７℃で一晩培養した。生じた各コロニーをそれぞれ５ｍｌのＬＢ－ｋａｎ液体培地に植菌し、一晩培養後に各ベクターをアルカリＳＤＳ溶菌に付し、得られたプラスミドを１０μｌのＴＥに溶解して、その一部を１％アガロース電気泳動に供して、その移動度によりインサートチェックを行った。さらに、インサートを含むと判断されたベクターについては、ＮｄｅＩ及びＳａｃＩを用いる制限酵素処理を行い、同電気泳動に供して、インサートが組み込まれていることを再確認した。また、インサートを含むことが確認されたプラスミドについては、ＤＮＡシークエンサーに供してその塩基配列解析を行った。
【0038】
上記のようにして得られたｐＥＴ２８ａ－ｈｙｐを用いて発現用大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を形質転換し、Ｈｉｓタグ融合組換えＨｙｐｎｉｎＡ－２発現株ｐＥＴ２８ａ－ｈｙｐ／ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓを得た。これを３ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、培養液を２５０ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に加え、３７℃で対数増殖期中期になるまで振盪培養した。ＯＤ６００が０．５～０．８に達したところで、２０℃で３０分間振盪培養して培養液を十分に冷却した。これに終濃度が０．５ｍＭとなるようにイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで発現誘導を開始し、２０℃で１６時間振盪培養した。これを遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）を添加及び懸濁した後、氷上で冷却しながら超音波破砕を行った。超音波破砕時の条件は「超音波破砕１分－休止１分」のセットを７回行った。破砕処理後、遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上清を可溶性画分とした。
【0039】
ニッケルキレートカラム（Ｖｔ＝１ｍＬ、Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ、ＧＥヘルスケア）を同緩衝液１０ｍＬで平衡化後、可溶性画分をカラムに添加し、Ｈｉｓタグ融合組換えレクチンを吸着させた。カラムに非特異的に吸着した夾雑成分を洗浄するため、イミダゾールを１５０ｍＭ含有する緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ）を用いてカラムを洗浄した。その後、溶出用緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）をカラムに６ｍＬ流し、精製Ｈｉｓタグ融合組換えＨｙｐｎｉｎＡ－２（Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２）を得た。
【0040】
上記Ｈｉｓ－ｒＯＡＡは、特開２０１６－１４１６７８号公報に記載の方法を利用して得た。
【0041】
上記Ｈｉｓ－ｒＢＣＬ１１ａは、国際公開第２０１２／１３３１２７号に記載された方法でＢＣＬ１１ａのｃＤＮＡをクローニングし、当該ｃＤＮＡを用いて上記Ｈｉｓ－ｒＨｙｐｎｉｎ Ａ－２を得た方法に準じて、Ｈｉｓ－ｒＢＣＬ１１ａを調製した。
【0042】
（方法及び結果）
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を常法によってＶｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に感染させて増殖させた。その後、ダイレクトＰＣＲキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を用いてゲノムＲＮＡコピー数を定量し、１０６コピーを健常人唾液５００μｌに加えて、試験検体とした。
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を常法によってＶｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に感染させて増殖させた。その後、ダイレクトＰＣＲキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を用いてゲノムＲＮＡコピー数を定量し、１０６コピーを健常人唾液５００μｌに加えて、試験検体とした。
【0043】
得られた試験検体５００μｌを上記ＯＡＡカラム、ＢＣＬ１１ａカラム及びＨｙｐｎｉｎ Ａ－２カラムのそれぞれにロードして、微量高速遠心機で１００００ｒｐｍ、５分間遠心し、カラムを通過させた。続いて各カラムに生理食塩水５００μｌを添加して、微量高速遠心機で１００００ｒｐｍ、５分間遠心してカラムを洗浄した。さらに各カラムに５０μｌの０．４％ＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含有する溶液を加えて、微量高速遠心機で１００００ｒｐｍ、２分間遠心し、結合したウイルスをカラムから溶出した。
【0044】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各カラムへの結合率を算出するために、カラム素通り画分、洗浄時流出画分、溶出画分を分取した。さらに溶出後にカラムに残存しているウイルスを定量するために、溶出後にＴＲＩｚｏｌ液（Thermo Fisher Scientific社）５００μｌを各カラムに添加して微量高速遠心機で１００００ｒｐｍ、５分間遠心して通過液を回収し、カラム残存画分とした。それぞれの画分からＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲキット（One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix タカラバイオ社）及び新型コロナウイルス検出用プライマー・プローブセット（タカラバイオ社）を用いてウイルスゲノムＲＮＡを定量した。その結果を表１に示す。
【0045】
【表1】
【0046】
表１に示すように、カラムへの結合率（カラムを素通りしなかった割合）及びカラムからの溶出率は、ＯＡＡカラム及びＢＣＬ１１ａカラムでいずれも９６％以上と極めて高く、また、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２カラムでも約６６％と高い割合を示した。上述の通り５００μｌをカラムにロードし、５０μｌで溶出したので、体積は１０倍に濃縮されている。ＯＡＡカラム及びＢＣＬ１１ａカラムでは、上記の通り１００％に近い結合率及び溶質率を示したためウイルス自体もほぼ１０倍に濃縮されており、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ－２カラムでも７倍程度に濃縮されている。最初の試験検体量を増やす、あるいは溶出液の量を減らすことによって、さらに濃縮率を上げることができると考えられる。
【0047】
以上の結果から、本発明では、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するＯＡＡ、ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを認識して結合するＢＣＬ１１ａ、及びフコース糖鎖を認識してＨｙｐｎｉｎ Ａ等の種々の型の藻類由来レクチンを利用することができ、藻類由来レクチンが固定された担体を利用することでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高い効率で濃縮することができることが明らかとなった。従って、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮方法及びそのためのキットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の濃縮に極めて有用であるといえる。
【図1】
【図2】
【配列表】