(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023184470
(43)【公開日】2023-12-28
(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルスの精製法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20231221BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231221BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/13 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023095990
(22)【出願日】2023-06-12
(31)【優先権主張番号】P 2022097829
(32)【優先日】2022-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】牧野 友理子
(72)【発明者】
【氏名】吉田 浩平
(72)【発明者】
【氏名】田中 亨
(57)【要約】
【課題】
アフィニティクロマトグラフィを利用して、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、温和な条件で精製可能な方法を提供すること。
【解決手段】
不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤にＡＡＶを含む試料を添加し当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液を用いて溶出させる工程とを含む、試料中に含まれるＡＡＶの精製方法により、前記課題を解決する。
【選択図】 図１
アフィニティクロマトグラフィを利用して、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、温和な条件で精製可能な方法を提供すること。
【解決手段】
不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤にＡＡＶを含む試料を添加し当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液を用いて溶出させる工程とを含む、試料中に含まれるＡＡＶの精製方法により、前記課題を解決する。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質とを含む吸着剤にＡＡＶを含む試料を添加し当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、試料中に含まれるＡＡＶの精製方法であって、
前記溶出液が、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液である、前記精製方法。
前記溶出液が、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液である、前記精製方法。
【請求項2】
溶出液が、アンモニウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンをさらに含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項3】
溶出液が、ナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンを４５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上さらに含む、請求項２に記載の精製方法。
【請求項4】
ＡＡＶを溶出させる工程を、溶出液中に含まれる塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンの濃度を変化させるグラジエントで行なう、請求項１に記載の精製方法。
【請求項5】
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドまたはＡＡＶと結合可能な重鎖抗体可変領域を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載の精製方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の精製法に関する。特に本発明は、アフィニティクロマトグラフィを利用して、試料中に含まれるＡＡＶを温和に精製可能な方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【0003】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【0004】
遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単にＡＡＶベクターとも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。
【0005】
ＡＡＶベクターの精製にあたっては、不溶性担体と、当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を用いたアフィニティクロマトグラフィによる方法が知られており（特許文献１および２、ならびに非特許文献１）、当該方法ではＡＡＶベクターの溶出に酸性緩衝液を用いている（例えば、特許文献２ではｐＨ２．５のリン酸緩衝液で溶出）。しかしながら、酸性緩衝液に曝露されたＡＡＶベクターは細胞への感染力価が低下することが知られている（非特許文献２）。感染力価の低下したＡＡＶベクターが、患者に投与する治療用ＡＡＶベクター製剤に含まれていると、薬効の低下による治療効果の減少や、高投与量負荷による重篤な副作用の誘因につながる可能性を有している。したがって、高品質な治療用ＡＡＶベクター製剤を製造するには、中性緩衝液のような温和な条件で精製する方法が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特表２０１８－５０７７０７号公報
【特許文献2】ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｇｅｒａｒｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，３６，２９（２０１９）
【非特許文献2】Ｂ Ｌｉｎｓ－Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，１２，６６８（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、アフィニティクロマトグラフィを利用して、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルスを、温和な条件で精製可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは鋭意検討した結果、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤として、不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質とを含む吸着剤を用い、かつ当該吸着剤に吸着したＡＡＶの溶出に特定の陰イオンを高濃度含む緩衝液で溶出させることで、中性領域で温和にＡＡＶを溶出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下の［１］から［５］に示す態様を包含する。
【0011】
［１］不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤にＡＡＶを含む試料を添加し当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、試料中に含まれるＡＡＶの精製方法であって、前記溶出液が塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液である、前記精製方法。
【0012】
［２］ 溶出液が、アンモニウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンをさらに含む、［１］に記載の精製方法。
【0013】
［３］溶出液がナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンを４５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上さらに含む、［２］に記載の精製方法。
【0014】
［４］ＡＡＶを溶出させる工程を溶出液中に含まれる塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンの濃度を変化させるグラジエントで行なう、［１］から［３］のいずれかに記載の精製方法。
【0015】
［５］ＡＡＶ結合性タンパク質が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドまたはＡＡＶと結合可能な重鎖抗体可変領域を少なくとも含むポリペプチドである、［１］から［４］のいずれかに記載の精製方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質とを含む吸着剤に吸着させたＡＡＶを、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液で溶出させることを特徴としている。本発明により、試料中に含まれるＡＡＶを温和な条件で精製できるため、細胞への感染力価を低下させずにＡＡＶを精製できる。本発明はｐＨ変化を利用する従来のＡＡＶ精製方法では困難な、細胞への感染力価を維持したままＡＡＶを精製できるため、ＡＡＶの工業的生産における品質向上が達成できる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】溶液Ｂの違いによる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）吸着剤に吸着したＡＡＶの溶出比率を比較した結果である。図中、白はＥｌｕｔｅ １（溶液Ｂでの溶出画分）で、黒はＥｌｕｔｅ ２（溶液Ｃでの溶出画分）で、それぞれ溶出したＡＡＶの比率を表している。またＡＡＶ吸着剤として、ａ）およびｃ）はｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを、ｂ）はＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、それぞれ用いたときの結果である。
【図2】希釈液の違いによるＡＡＶベクターの細胞への感染陽性率を比較した図である。ＡＡＶ遺伝子型として、ａ）はＡＡＶ２を、ｂ）はＡＡＶ８を、それぞれ用いたときの結果である。
【図3】溶離液条件の違いによるＡＡＶベクター溶液を精製したときのクロマトパターンを比較した図である。ａ）は溶離液条件１のときの、ｂ）は溶離液条件２のときの、それぞれ結果である。
【図4】溶液Ｂの違いによる、ＡＡＶの溶出比率を比較した結果である。図中、縦線はグラジエント溶出に供する前の素通り／洗浄（Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ／ｗａｓｈ）で、白はＥｌｕｔｅ １で、黒はＥｌｕｔｅ ２で、それぞれ溶出したＡＡＶの比率を表している。
【図5】ＡＡＶ遺伝子型の違いによる、ＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶの溶出比率を比較した結果である。図中、白はＥｌｕｔｅ １で、黒はＥｌｕｔｅ ２で、それぞれ溶出したＡＡＶの比率を表している。
【図6】不溶性担体に固定化したリガンド（ＡＡＶ結合性タンパク質）の違いによる、ＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶの溶出比率を比較した結果である。図中、縦線はＦｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ／ｗａｓｈで、白はＥｌｕｔｅ １で、黒はＥｌｕｔｅ ２で、それぞれ溶出したＡＡＶの比率を表している。またリガンドとして、ａ）はｍ１０ｓ＿Ｔ１（配列番号４）を、ｂ）はｍ１０ｓ＿ＨＴ１（配列番号５）を、それぞれ用いたときの結果である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0019】
本発明では、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤（以下「ＡＡＶ吸着剤」とも表記する）を用いて、試料中に含まれるＡＡＶを精製する。ＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶと結合可能なポリペプチドであれば特に制限はなく、インテグリンなどのラミニン受容体、抗ＡＡＶ抗体やＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）が例示できる。
【0020】
ＡＡＶ結合性タンパク質が抗ＡＡＶ抗体である場合の好ましい態様として、ＡＡＶと結合可能な重鎖抗体可変領域（ＶＨＨ）を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。またＡＡＶ結合性タンパク質がＡＡＶＲである場合の好ましい態様として、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドがあげられる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0021】
なお配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＡＡＶＲの一態様であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（公式データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ、アクセッションナンバー：Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である。
【0022】
前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１およびＰＫＤ２に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、
ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
【0023】
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号４から７に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のＡＡＶ結合性タンパク質、があげられる。また前記（ｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換や、配列番号１の３３０番目にあるアラニンのバリンへの置換があげられる。
【0024】
前記（ｉｉ）における、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶＲの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、ＡＡＶ結合活性を有する限り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。
【0025】
なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶＲの由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0026】
前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0027】
本発明で用いるＡＡＶ吸着剤の構成要素である不溶性担体は、ＡＡＶを含む試料や精製に用いる溶液（溶出液、平衡化液、洗浄液など）に対して不溶性であれば特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（サイティバ社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されず、例えば、粒状物、モノリス状物、膜状物および繊維状物のいずれであってもよく、また多孔性および非多孔性のいずれであってもよい。中でもカラムに充填できる形状とすると好ましい。
【0028】
本発明で用いるＡＡＶ吸着剤を製造する際、不溶性担体へのＡＡＶ結合性タンパク質への固定化は、例えば、共有結合を介して固定化すればよい。具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介してＡＡＶ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化し、本発明で用いるＡＡＶ吸着剤を製造すればよい。前記活性基としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド基が挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもサイティバ社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。
【0029】
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。
【0030】
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。
【0031】
また担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
【0032】
また担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0033】
また担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0034】
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
【0035】
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、ＮＨＳ、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【0036】
ＡＡＶ結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－ＭｏｒｐｈｏｌｉｎｏＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性やＡＡＶ結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、４℃以上５０℃以下であってよく、好ましくは１０℃以上３５℃以下であってよい。
【0037】
本発明は、前述したＡＡＶ吸着剤にＡＡＶを含む試料を添加し当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程（以下、単に「吸着工程」とも表記）と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程（以下、単に「溶出工程」とも表記）と、を含む方法で試料中に含まれるＡＡＶを精製する際、前記溶出液として、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液を用いることを特徴としている。なお、ＡＡＶ吸着剤をカラムに充填した態様（以下、「ＡＡＶ吸着剤カラム」とも表記）とすると、これら工程を簡便に行なえる点で好ましい。以下、ＡＡＶ吸着剤カラムを用いた態様を例に、詳細に説明する。
【0038】
ＡＡＶを含む試料は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてＡＡＶ吸着剤カラムに添加できる。なお本明細書では、液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なおＡＡＶを含む試料は、ＡＡＶ吸着剤カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、ＡＡＶを含む試料をＡＡＶ吸着剤カラムに添加する前（すなわち吸着工程前）に、適切な緩衝液（平衡化液）を用いてＡＡＶ吸着剤カラムを平衡化してよい。前記平衡化により、例えば、ＡＡＶをより高純度に精製できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、中性領域（本明細書ではｐＨ５．０以上９．０以下、好ましくはｐＨ５．５以上８．０以下の領域を指す）で緩衝能を有する中性緩衝液であればよく、具体的には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから５０ｍＭのキレート剤を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、ＡＡＶを含む試料のＡＡＶ吸着剤カラムへの通液後に夾雑物質等のＡＡＶ以外の成分がＡＡＶ吸着剤カラムに残存している場合、ＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出させる前（すなわち溶出工程前）に、そのような成分をＡＡＶ吸着剤カラムから除去（洗浄）してよい。ＡＡＶ以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を洗浄液として用いることでＡＡＶ吸着剤カラムから除去できる。当該洗浄液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。
【0039】
本発明の精製方法では、前述した吸着工程によりＡＡＶ吸着剤に吸着させたＡＡＶを、溶出工程で、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含む中性緩衝液を用いて溶出させる。前述した高濃度の陰イオンを含んだ溶出液をＡＡＶ吸着剤カラムに通液することで、当該カラム内におけるイオン濃度変化が生じ、ＡＡＶとＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＡＶ吸着剤のリガンド）との相互作用が弱まるため、ＡＡＶ吸着剤に吸着させたＡＡＶを温和な条件である中性領域で溶出できる。したがって、溶出液として酸性緩衝液（例えば、ｐＨ１．５以上３．０以下の緩衝液）を用いた従来の溶出工程と比較し、溶出したＡＡＶの細胞への感染力価の低下が抑えられる。なお溶出液に、アンモニウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンをさらに含ませると、中性領域でのＡＡＶ溶出をより効率的に行なえるため、好ましく、ナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンを４５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上さらに含ませると、中性領域でのＡＡＶ溶出をさらに効率的に行なえるため、より好ましい。
【0040】
ホフマイスター系列（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ）とは、イオンと水を構造化させる能力の順に配列したものである。具体的には、陰イオンでは水を構造化させる能力の高い順に、炭酸イオン（ＣＯ３
２－）、硫酸イオン（ＳＯ４
２－）、チオ硫酸イオン（Ｓ２Ｏ３
２－）、リン酸二水素イオン（Ｈ２ＰＯ４
－）、フッ素イオン（Ｆ－）、塩化物イオン（Ｃｌ－）、臭化物イオン（Ｂｒ－）、硝酸イオン（ＮＯ３
－）、ヨウ化物イオン（Ｉ－）、過塩素酸イオン（ＣｌＯ４
－）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ－）であり、陽イオンでは水を構造化させる能力の高い順に、テトラメチルアンモニウムイオン（Ｎ（ＣＨ３）４
＋）、アンモニウムイオン（ＮＨ４
＋）、セシウムイオン（Ｃｓ＋）、ルビジウムイオン（Ｒｂ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）、リチウムイオン（Ｌｉ＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、バリウムイオン（Ｂａ２＋）である（ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ，５，６２２９－６２３９（２０２０））。
【0041】
すなわち本発明において、塩化物イオン（Ｃｌ－）または当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンとは、前述したホフマイスター系列の具体例に基づくと、Ｃｌ－、Ｂｒ－、ＮＯ３
－、Ｉ－、ＣｌＯ４
－、ＳＣＮ－のいずれかとなる。また前述したホフマイスター系列の具体例に基づくと、アンモニウムイオン（ＮＨ４
＋）または当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンとは、ＮＨ４
＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｂａ２＋のいずれかであり、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）または当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンとは、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｂａ２＋のいずれかとなる。
【0042】
イオン濃度変化に基づくＡＡＶの溶出は、単一イオン濃度を含む溶出液を用いたイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出で行なってもよいが、溶出液中のイオン濃度を溶出工程中に変化させるグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出のほうが、ＡＡＶを高効率かつ高純度に精製できる点で好ましい。なおグラジエント溶出の方法に特に限定はなく、イオン濃度を段階的（ステップワイズ（ｓｔｅｐｗｉｓｅ））に変化させるグラジエントでもよく、イオン濃度を直線的（リニア（ｌｉｎｅａｒ））な勾配をつけて変化させるグラジエントでもよい。溶出液のイオン濃度の変化のさせ方は、リガンドや不溶性担体などＡＡＶ吸着剤の構成要素により適宜決定すればよい。溶出液に含まれる塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンの濃度は、前述した通り８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上であればよいが、１．２ｍｏｌ／Ｌ以上とすると好ましく、１．５ｍｏｌ／Ｌ以上とするとより好ましく、２．０ｍｏｌ／Ｌ以上５．０ｍｏｌ／Ｌ以下とするとさらにより好ましい。溶出液に含まれる陽イオン濃度は、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすると好ましく、６５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上とするとより好ましく、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上５．０ｍｏｌ／Ｌ以下とするとさらにより好ましい。
【0043】
本発明の精製方法で用いる溶出液を調製するには、例えば、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを含む、水溶性の塩を、陰イオンとして８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上となるよう添加し、調製すればよい。前記塩の好ましい具体例として、アンモニウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンを含む塩である、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、塩化ルビジウム（ＲｂＣｌ）、ヨウ化マグネシウム（ＭｇＩ２）、チオシアン酸マグネシウム（Ｍｇ（ＳＣＮ）２）、ヨウ化カルシウム（ＣａＩ２）、チオシアン酸カルシウム（Ｃａ（ＳＣＮ）２）、ヨウ化リチウム（ＬｉＩ）、チオシアン酸リチウム（ＬｉＳＣＮ）、ヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）、チオシアン酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＣＮ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）があげられる。中でも、ナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンを含む塩である、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＩ２、Ｍｇ（ＳＣＮ）２、ＣａＩ２、Ｃａ（ＳＣＮ）２、ＬｉＩ、ＬｉＳＣＮ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮを添加すると、より好ましい。
【0044】
溶出液で用いる中性緩衝液は、前述した溶媒置換に用いる緩衝液、平衡化液および／または洗浄液と同様、中性領域で緩衝能を有する緩衝液であればよく、具体的には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。また溶媒置換に用いる緩衝液、平衡化液および／または洗浄液における緩衝液と同一の緩衝液としてもよく、異なる緩衝液としてもよい。
【実施例0045】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0046】
実施例１ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの調製
以降の実施例でＡＡＶとして使用するＡＡＶベクターを以下の方法で調製した。
以降の実施例でＡＡＶとして使用するＡＡＶベクターを以下の方法で調製した。
【0047】
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＧ）およびＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＴＣ）を、それぞれ付加したヌクレオチド配列（配列番号３）を設計した。
【0048】
（２）配列番号３に記載の配列からなるポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託、ｐＵＣ－ＥＧＦＰと命名）。ｐＵＣ－ＥＧＦＰで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体を培養した。培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＵＣ－ＥＧＦＰを抽出した。
【0049】
（３）（２）で得られたｐＵＣ－ＥＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した発現ベクターｐＡＡＶ－ＣＭＶ（タカラバイオ社製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【0050】
（４）（３）で得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）１Ｌが入った、５Ｌバッフルフラスコにて、３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後、遠心分離することで菌体を回収した。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、回収した菌体からｐＡＡＶ－ＥＧＦＰを大量に調製した。
【0051】
（５）血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型５（ＡＡＶ５）および血清型８（ＡＡＶ８）のうちいずれかのカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（以下、総称して「ｐＲＣＸ Ｖｅｃｔｏｒ」とも表記）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を用いて（４）と同様の操作を行なうことで、ｐＲＣＸ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒを大量に調製した。
【0052】
（６）１０％（ｖ／ｖ）のウシ血清を含むＤ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社製）４５ｍＬが入ったＴ－２２５フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１０枚でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。そこへ（４）で調製したｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ、（５）で調製したｐＲＣＸ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒならびにポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の複合体を添加することで遺伝子導入し、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素、３７℃の条件で３日間静置培養した。培養後、遠心分離により剥離した細胞を回収し、Ｔ－２２５フラスコ５枚分から得られた細胞ごとに－８０℃で冷凍保存した。
【0053】
（７）（６）で得られた冷凍細胞を解凍し、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムおよび０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬに懸濁した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルクミリポア社製）を１／２０００量加えて３７℃で１時間静置後、１３０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し上清を得た。得られた上清に１５％飽和となるよう硫安を添加し、再度同条件で遠心分離した。得られた上清を孔径０．４５μｍのフィルターに供し、浮遊物を除去した。
【0054】
（８）浮遊物を除去した上清を、あらかじめ０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、「平衡化液Ａ」とも表記する）で平衡化した、５ｍＬのＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（サイティバ社製、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ精製用）またはＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ以外精製用））にアプライした。
【0055】
（９）平衡化液Ａで洗浄後、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出した。得られた溶出液に、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む１ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を１／４量加えることで中和し、ＡＡＶベクターであるＡＡＶ１－ＥＧＦＰ、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ、ＡＡＶ５－ＥＧＦＰおよびＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液を得た（以下、総称して「ＡＡＶＸ－ＥＧＦＰ」とも表記）。
【0056】
（１０）（９）で得られた溶液中のＡＡＶＸ－ＥＧＦＰ濃度を、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｑＰＣＲで定量した。また前記溶液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて銀染色することで前記溶液中に含まれるＡＡＶベクターの純度を確認し、問題ないことを確認した。
【0057】
実施例２ ＡＡＶ結合性タンパク質の調製
（Ａ－１）配列番号４から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ないしＷ３１１０を形質転換し得られた、これらＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬないし５０ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
なお配列番号４から７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、
配列番号４および５において、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ ｍ１０ｓであり、
配列番号６および７において、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ ｍ１１ａであり、
配列番号５および７において、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がヒスチジンタグであり、
配列番号４から７のＣ末端側７残基が、不溶性担体へ固定化する際に有用な、システイン（Ｃｙｓ）を含むオリゴペプチドである。
またＡＶＲ ｍ１０ｓおよびＡＶＲ ｍ１１ａはいずれも、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸置換体であり、ＡＶＲ ｍ１０ｓは以下の（ｉ）から（ｘ）のアミノ酸置換が、ＡＶＲ ｍ１１ａは以下の（ｉ）から（ｘｉ）のアミノ酸置換が、それぞれ生じたポリペプチドである。
（ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号４から７では３０番目）のバリン（Ｖａｌ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換
（ｉｉ）配列番号１の３４２番目（配列番号４から７では５５番目）のチロシン（Ｔｙｒ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３６２番目（配列番号４から７では７５番目）のリジン（Ｌｙｓ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換
（ｉｖ）配列番号１の３７１番目（配列番号４から７では８４番目）のリジン（Ｌｙｓ）がアスパラギン（Ａｓｎ）に置換
（ｖ）配列番号１の３８１番目（配列番号４から７では９４番目）のバリン（Ｖａｌ）がアラニン（Ａｌａ）に置換
（ｖｉ）配列番号１の３８２番目（配列番号４から７では９５番目）のイソロイシン（Ｉｌｅ）がバリン（Ｖａｌ）に置換
（ｖｉｉ）配列番号１の３９０番目（配列番号４から７では１０３番目）のグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の３９９番目（配列番号４から７では１１２番目）のリジン（Ｌｙｓ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換
（ｉｘ）配列番号１の４７６番目（配列番号４から７では１８９番目）のセリン（Ｓｅｒ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換
（ｘ）配列番号１の４８７番目（配列番号４から７では２００番目）のアスパラギン（Ａｓｎ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換
（ｘｉ）配列番号１の３３０番目（配列番号６および７では４３番目）のアラニン（Ａｌａ）がバリン（Ｖａｌ）に置換。
（Ａ－１）配列番号４から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ないしＷ３１１０を形質転換し得られた、これらＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬないし５０ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
なお配列番号４から７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、
配列番号４および５において、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ ｍ１０ｓであり、
配列番号６および７において、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ ｍ１１ａであり、
配列番号５および７において、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がヒスチジンタグであり、
配列番号４から７のＣ末端側７残基が、不溶性担体へ固定化する際に有用な、システイン（Ｃｙｓ）を含むオリゴペプチドである。
またＡＶＲ ｍ１０ｓおよびＡＶＲ ｍ１１ａはいずれも、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸置換体であり、ＡＶＲ ｍ１０ｓは以下の（ｉ）から（ｘ）のアミノ酸置換が、ＡＶＲ ｍ１１ａは以下の（ｉ）から（ｘｉ）のアミノ酸置換が、それぞれ生じたポリペプチドである。
（ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号４から７では３０番目）のバリン（Ｖａｌ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換
（ｉｉ）配列番号１の３４２番目（配列番号４から７では５５番目）のチロシン（Ｔｙｒ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３６２番目（配列番号４から７では７５番目）のリジン（Ｌｙｓ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換
（ｉｖ）配列番号１の３７１番目（配列番号４から７では８４番目）のリジン（Ｌｙｓ）がアスパラギン（Ａｓｎ）に置換
（ｖ）配列番号１の３８１番目（配列番号４から７では９４番目）のバリン（Ｖａｌ）がアラニン（Ａｌａ）に置換
（ｖｉ）配列番号１の３８２番目（配列番号４から７では９５番目）のイソロイシン（Ｉｌｅ）がバリン（Ｖａｌ）に置換
（ｖｉｉ）配列番号１の３９０番目（配列番号４から７では１０３番目）のグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の３９９番目（配列番号４から７では１１２番目）のリジン（Ｌｙｓ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換
（ｉｘ）配列番号１の４７６番目（配列番号４から７では１８９番目）のセリン（Ｓｅｒ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換
（ｘ）配列番号１の４８７番目（配列番号４から７では２００番目）のアスパラギン（Ａｓｎ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換
（ｘｉ）配列番号１の３３０番目（配列番号６および７では４３番目）のアラニン（Ａｌａ）がバリン（Ｖａｌ）に置換。
【0058】
このうち、配列番号５および７に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質は、以下の（Ａ－２）から（Ａ－７）に示す方法により調製した。
【0059】
（Ａ－２）１Ｌのバッフルフラスコに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２００ｍＬの２ＹＴ液体培地に（Ａ－１）の前培養液を２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0060】
（Ａ－３）培養開始２．０時間後、氷上にて冷却し、終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加後、引き続き２５℃で一晩、好気的に振とう培養した。
【0061】
（Ａ－４）培養終了後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで菌体を回収した。
【0062】
（Ａ－５）（Ａ－４）で回収した菌体を１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁後、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ［久保田商事社製］）を用いて、８℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
【0063】
（Ａ－６）（Ａ－５）で得られた上清を、あらかじめ１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムおよび２０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「平衡化液Ｂ」とも表記する）で平衡化した、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）５０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（サイティバ社製）にアプライした。平衡化液Ｂで洗浄後、０．５ｍｏｌ／Ｌのイミダゾールおよび１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。
【0064】
（Ａ－７）（Ａ－６）で得た溶出液を、１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で透析することで、ＡＡＶ吸着剤作製に必要な量のＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号５および７）を調製した。
【0065】
一方、配列番号４および６に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質は、以下の（Ｂ－１）から（Ｂ－９）に示す方法により調製した。
【0066】
（Ｂ－１）オートクレーブ滅菌済の本培養培地（４．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．３％（ｗ／ｖ）リン酸三ナトリウム・十二水和物、０．９％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・十二水和物、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、０．２％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、１．０％（ｗ／ｖ）グルコース、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、５ｍｇ／Ｌ塩化マンガン・四水和物、５０μｇ／ｍＬカナマイシン）１．２Ｌが入った３Ｌ容量の培養槽に、（Ａ－１）の前培養液３６ｍＬを添加し、温度３０℃、撹拌数４００ｒｐｍ、ｐＨ６．９から７．１、通気量（空気）１．５Ｌ／分、溶存酸素濃度が飽和濃度の約３０％になるよう、撹拌回転数（最大７００ｒｐｍ）を自動制御する条件で本培養を開始した。なお、培地中のグルコースが消費され枯渇した時点で流加培地（４２．５％（ｗ／ｖ）グルコース、１４．２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物）をＤＯスタット法で添加した。
【0067】
（Ｂ－２）本培養開始から１７時間後に０．５ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１．５ｍＬ添加し、温度２５℃に、撹拌数を６００ｒｐｍに変更して、さらに４６時間培養を行なった。得られた培養液を遠心分離し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む大腸菌の菌体を回収した。
【0068】
（Ｂ－３）（Ｂ－２）で回収した菌体１ｇ（湿重量）に対して、抽出液（１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、２５０ｕｎｉｔｓ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）、０．００５％（ｗ／ｖ）リゾチーム、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０））を５ｍＬ加えることで、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
【0069】
（Ｂ－４）菌体抽出液を遠心分離し、上清を回収後、０．２μｍのフィルターでろ過することで、ＡＡＶ結合性タンパク質抽出液を得、これをＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料とした。
【0070】
（Ｂ－５）１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（平衡化液Ａ）であらかじめ平衡化した、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、東ソー社製）を充填した陰イオン交換カラム（容量２ｍＬ）に、（Ｂ－４）で得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料（５ｍＬ）を、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させた。
【0071】
（Ｂ－６）平衡化液Ａ１２ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内の不純物を洗い流す、洗浄工程を実施した。
【0072】
（Ｂ－７）（ａ）２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｂ）１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、および（ｃ）１８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムのいずれかを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２ｍＬを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
【0073】
（Ｂ－８）（Ｂ－７）で得た溶出液を、１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で透析することで、ＡＡＶ吸着剤作製に必要な量のＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４および６）を調製した。
【0074】
（Ｂ－９）１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）９ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
【0075】
（Ｂ－１０）（Ｂ－７）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のうち、（ａ）の緩衝液で溶出した画分を、サイズ排除クロマトグラフィ（使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を確認した。
以降、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１０ｓ＿Ｔ１と、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１０ｓ＿ＨＴ１と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１１ａ＿Ｔ１と、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１１ａ＿ＨＴ１と、それぞれ命名する。
以降、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１０ｓ＿Ｔ１と、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１０ｓ＿ＨＴ１と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１１ａ＿Ｔ１と、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ ｍ１１ａ＿ＨＴ１と、それぞれ命名する。
【0076】
実施例３ ＡＡＶ吸着剤の作製
（１）分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の表面のヒドロキシ基に化学修飾を施すことでヨードアセトアミド基を導入したゲルを調製し、これをＡＡＶ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体として用いた。
（１）分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の表面のヒドロキシ基に化学修飾を施すことでヨードアセトアミド基を導入したゲルを調製し、これをＡＡＶ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体として用いた。
【0077】
（２）（１）で調製したゲル７ｇに、実施例２で調製したＡＡＶ結合性タンパク質を１４ｍｇおよび還元剤として終濃度０．３ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２－ＣａｒｂｏｘｙＥｔｈｙｌ）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を加え、ｐＨ８．１、２５℃の条件で３時間振とうすることで反応させた。これによりＡＡＶ吸着剤である、ＡＡＶ結合性タンパク質を固定化したゲル（以降、ＡＡＶＲ固定化ゲルとも表記）を調製した。ＡＶＲ ｍ１０ｓ＿Ｔ１（配列番号４）を不溶性担体に固定化して得られたゲルをｍ１０ｓ＿Ｔ１固定化ゲルと、ＡＶＲ ｍ１０ｓ＿ＨＴ１（配列番号５）を不溶性担体に固定化して得られたゲルをｍ１０ｓ＿ＨＴ１固定化ゲルと、ＡＶＲ ｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）を不溶性担体に固定化して得られたゲルをｍ１１ａ＿Ｔ１固定化ゲルと、ＡＶＲ ｍ１１ａ＿ＨＴ１（配列番号７）を不溶性担体に固定化して得られたゲルをｍ１１ａ＿ＨＴ１固定化ゲルと、それぞれ命名する。
【0078】
実施例４ ＡＡＶＲ固定化ゲルによるＡＡＶ精製（その１）
（１）実施例３で調製したＡＡＶＲ固定化ゲルまたは市販のＡＡＶ吸着剤であるＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（抗ＡＡＶ重鎖抗体可変領域（ＶＨＨ）抗体、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）約５μＬを、それぞれコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し、ＡＡＶ精製用ミニカラムを作製した。
（１）実施例３で調製したＡＡＶＲ固定化ゲルまたは市販のＡＡＶ吸着剤であるＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（抗ＡＡＶ重鎖抗体可変領域（ＶＨＨ）抗体、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）約５μＬを、それぞれコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し、ＡＡＶ精製用ミニカラムを作製した。
【0079】
（２）（１）で作製したミニカラムに、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム溶液を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）（以下、「溶液Ａ」とも表記する）１９５μＬを添加し、遠心操作で液除去することで当該カラムを平衡化した。
【0080】
（３）平衡化後のミニカラムに、実施例１で調製したＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１０１３ＶＧ（ベクターゲノム）／ｍＬ）を５μＬアプライし、２５℃、１８０ｒｐｍで１５分間振とう後、遠心操作でミニカラム内のろ液２００μＬを回収した。
【0081】
（４）再度ミニカラムに溶液Ａを２００μＬ添加し、遠心操作によりろ液２００μＬを回収した。（３）で得られた、ろ液と合わせ（計４００μＬ）、これを「Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ」と命名した。
【0082】
（５）ミニカラムに溶液Ａを２００μＬ添加し、遠心操作で液除去することで当該カラムを洗浄した。前記操作で得られた洗浄液２００μＬを「Ｗａｓｈ」と命名した。
【0083】
（６）表１に記載の組成からなる中性緩衝液（溶液Ｂ）２００μＬをミニカラムに添加し、２５℃、１８０ｒｐｍで１５分間振とうした。振とう後、遠心操作で溶出液２００μＬを回収した。
【0084】
【表1】
【0085】
（７）（６）の操作を再度行ない溶出液２００μＬを回収した。
【0086】
（８）さらにミニカラムに溶液Ｂを２００μＬ添加し、遠心操作でろ液を除去することで当該カラムを洗浄した（２００μＬ）。（６）および（７）で回収した溶出液ならびに前記ろ液を合わせ（計６００μＬ）、これを溶液Ｂで溶出した画分とし「Ｅｌｕｔｅ １」と命名した。
【0087】
（９）ミニカラムに５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ２．０）（溶液Ｃ）を２００μＬ添加し、２５℃、１８０ｒｐｍで１５分間振とうした。振とう後、遠心操作を行ない、溶出液２００μＬを、中和緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む１ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５））１５０μＬを入れたチューブに回収し、当該溶出液を中和させた。
【0088】
（１０）（９）の操作を再度行ない、溶出液２００μＬを、（９）の溶出液および中和緩衝液が入ったチューブに回収した。
【0089】
（１１）さらにミニカラムに溶液Ｃを２００μＬ添加し、遠心操作でろ液を除去することで当該カラムを洗浄した。洗浄液２００μＬは、（９）および（１０）の溶出液ならびに中和緩衝液が入ったチューブに回収し、これを溶液Ｃで溶出した画分とし「Ｅｌｕｔｅ ２」と命名した（計７５０μＬ）。
【0090】
（１２）（４）で得られたＦｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、（５）で得られたＷａｓｈ、（８）で得られたＥｌｕｔｅ １、および（１１）で得られたＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶ８－ＥＧＦＰベクターゲノム数を、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｑＰＣＲで定量した。
【0091】
溶液Ｂの違いによる、Ｅｌｕｔｅ １とＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶ８－ＥＧＦＰベクターゲノム数の割合を比較した結果を図１に示す。なおＦｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈおよびＷａｓｈに含まれるＡＡＶ８－ＥＧＦＰベクターゲノム数の割合は、合わせても最大０．７％であり、ＡＡＶ吸着剤に未吸着のＡＡＶがＥｌｕｔｅ １に含まれていたとしても誤差範囲のため、結果からは除外している。また図１のうち、
ａ）はＡＡＶ吸着剤としてｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを、溶液Ｂとして表１のＢ－１からＢ－９のいずれかに示す組成からなる溶液を、それぞれ用いたときの結果を示しており、
ｂ）はＡＡＶ吸着剤としてＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（サーモフィッシャー社製）を、溶液Ｂとして表１のＢ－１およびＢ－９のいずれかに示す組成からなる溶液を、それぞれ用いたときの結果を示しており、
ｃ）はＡＡＶ吸着剤としてｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを、溶液Ｂとして表１のＢ－１、Ｂ－７、Ｂ－１０およびＢ－１１のいずれかに示す組成からなる溶液を、それぞれ用いたときの結果を示している。
ａ）はＡＡＶ吸着剤としてｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを、溶液Ｂとして表１のＢ－１からＢ－９のいずれかに示す組成からなる溶液を、それぞれ用いたときの結果を示しており、
ｂ）はＡＡＶ吸着剤としてＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（サーモフィッシャー社製）を、溶液Ｂとして表１のＢ－１およびＢ－９のいずれかに示す組成からなる溶液を、それぞれ用いたときの結果を示しており、
ｃ）はＡＡＶ吸着剤としてｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを、溶液Ｂとして表１のＢ－１、Ｂ－７、Ｂ－１０およびＢ－１１のいずれかに示す組成からなる溶液を、それぞれ用いたときの結果を示している。
【0092】
塩化物イオンを１５０ｍｍｏｌ／Ｌ含む中性緩衝液ではＡＡＶがＥｌｕｔｅ １（溶液Ｂでの溶出画分）にほとんど溶出されなかった（表１の溶液Ｂ－１およびＢ－２）が、塩化物イオンを１．０ｍｏｌ／Ｌ以上さらに含ませる（すなわち中性緩衝液に含まれる塩化物イオンとして１．２ｍｏｌ／Ｌ以上にする）とＡＡＶがＥｌｕｔｅ １に溶出されるようになった（表１の溶液Ｂ－５からＢ－１１）。一方、塩化物イオンの代わりに硫酸イオンを添加すると、Ｅｌｕｔｅ １にＡＡＶが全く溶出されなかった（表１の溶液Ｂ－３およびＢ－４）。硫酸イオンは塩化物イオンよりホフマイスター系列の大きい陰イオンである。以上の結果より、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤に吸着したＡＡＶを中性領域で溶出させるには、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列の小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませる必要があることがわかる。
【0093】
また、表１のＢ－５からＢ－９での結果（図１のａ））より、中性緩衝液に添加する陽イオンとして、カリウムイオン（表１の溶液Ｂ－５）、アンモニウムイオン（表１の溶液Ｂ－６）、ナトリウムイオン（表１の溶液Ｂ－７）、カルシウムイオン（表１の溶液Ｂ－８）、およびマグネシウムイオン（表１の溶液Ｂ－９）のいずれを用いても、塩化物イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませることにより、ＡＡＶがＥｌｕｔｅ １に溶出されたことから、中性緩衝液に添加する陽イオンは、少なくともアンモニウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンであればよいことがわかる。
【0094】
また、中性緩衝液に添加する陽イオンとして、ナトリウムイオン（表１の溶液Ｂ－７）、カルシウムイオン（表１の溶液Ｂ－８）、およびマグネシウムイオン（表１の溶液Ｂ－９）のいずれかを用いると、カリウムイオン（表１の溶液Ｂ－５）やアンモニウムイオン（表１の溶液Ｂ－６）を添加したときと比較し、Ｅｌｕｔｅ １に溶出されるＡＡＶの割合がより増大したことから、中性緩衝液に添加する陽イオンとして、ナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列の小さい陽イオンを用いると、より好ましいことがわかる。
【0095】
さらに図１のｃ）の結果（表１の溶液Ｂ－７、Ｂ－１０およびＢ－１１）より、表２の１に示す組成からなる中性緩衝液にさらに含ませる塩化物イオンを、１．０ｍｏｌ／Ｌ（表１の溶液Ｂ－１０、中性緩衝液に含まれる塩化物イオン濃度としては１．２ｍｏｌ／Ｌ）から、３．０ｍｏｌ／Ｌ（表１の溶液Ｂ－１１、中性緩衝液に含まれる塩化物イオン濃度としては３．２ｍｏｌ／Ｌ）または４．５ｍｏｌ／Ｌ（表１の溶液Ｂ－７、中性緩衝液に含まれる塩化物イオン濃度としては４．７ｍｏｌ／Ｌ）にすることでＥｌｕｔｅ １に溶出されるＡＡＶの割合が増大することがわかる。以上の結果から、中性緩衝液に含ませる塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列の小さい陰イオンの濃度は１．５ｍｏｌ／Ｌ以上とすると好ましく、２．０ｍｏｌ／Ｌ以上５．０ｍｏｌ／Ｌ以下とするとさらに好ましいことがわかる。
【0096】
実施例５ 緩衝液のｐＨおよび塩濃度によるＡＡＶ感染力価への影響
実施例４より、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列の小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませることで、中性領域であってもＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出できることがわかった。そこで前記高濃度の陰イオンがＡＡＶの感染力価に影響しないか、評価した。
実施例４より、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列の小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませることで、中性領域であってもＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出できることがわかった。そこで前記高濃度の陰イオンがＡＡＶの感染力価に影響しないか、評価した。
【0097】
（１）実施例１で調製したＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液またはＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（濃度はともに１．９×１０１３ｃｐ／ｍＬ）３０μＬを透析膜に入れた後、表２に示す組成からなる希釈液１から５のいずれかで１０倍希釈し、２５℃で１２時間静置した。
【0098】
【表2】
【0099】
（２）（１）の静置後、希釈液を封入した透析膜を透析液（組成は表２の希釈液１と同じ）１Ｌに移し替え、４℃で２４時間透析した。
【0100】
（３）（２）の透析後、各透析膜中から取り出した溶液に含まれるＡＡＶ２－ＥＧＦＰまたはＡＡＶ８－ＥＧＦＰ濃度を、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｑＰＣＲで定量した。
【0101】
（４）（３）で得られた定量結果を基に、ベクターゲノム（ＶＧ）濃度として５．０×１０１０ＶＧ／ｍＬに調整した、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液またはＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（以下、総称して「ＡＡＶ感染溶液」とも表記）を調製した。
【0102】
（５）２４ウェルマルチプレート（コーニング社製）の各ウェルにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で５００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培養後、細胞数を測定し、５．０×１０５／ｗｅｌｌであることを確認した。
【0103】
（６）（５）の培養後のウェルに（４）で得られたＡＡＶ感染溶液を１００μＬ添加し、３７℃で２４時間培養した。なお前記ＡＡＶ感染溶液のうち、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液は希釈液１で１０倍希釈したもの（濃度：５．０×１０９ＶＧ／ｍＬ）を添加し、ＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液はそのまま（濃度：５．０×１０１０ＶＧ／ｍＬ）添加した。すなわちＨＥＫ２９３Ｔ細胞１細胞当たりのＡＡＶ感染数は、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰで１．０×１０３ＶＧであり、ＡＡＶ８－ＥＧＦＰで１．０×１０４ＶＧである。
【0104】
（７）（６）の培養後、各ウェルの培養上清をチューブに回収した。ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を添加してウェルを洗浄後、細胞剥離液ＴｒｐＬＥ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１分間インキュベートすることでウェルに付着した細胞の剥離処理を行なった。
【0105】
（８）（７）で回収した培養上清をウェルに添加することで剥離処理を止めた後、当該培養上清ごとチューブに戻し、これを検出溶液とした。
【0106】
（９）測定前に（８）の検出溶液をピペットで数回懸濁し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（ルミネックス社製）を用いて、各細胞で発現されたＥＧＦＰ由来の蛍光強度を計測した。ＡＡＶ感染溶液を添加していない細胞と比較して蛍光強度が増強した細胞の割合を計測することで、各ＡＡＶ感染溶液に含まれるＡＡＶ２－ＥＧＦＰまたはＡＡＶ８－ＥＧＦＰに感染した細胞の割合（感染率）を算出した。
【0107】
希釈液の違いによる、ＡＡＶ感染率を比較した結果を図２に示す。希釈液１に対し、塩化物イオンを４．５ｍｏｌ／Ｌ（希釈液２、溶液中に含まれる塩化物イオン濃度としては４．７ｍｏｌ／Ｌ）または４．０ｍｏｌ／Ｌ（希釈液３および４、溶液中に含まれる塩化物イオン濃度としては４．２ｍｏｌ／Ｌ）添加しても、感染率への影響は殆どないことがわかる。以上の結果から、中性緩衝液であれば、５．０ｍｏｌ／Ｌの陰イオンが含まれていても、ＡＡＶが有する感染力価は維持されることがわかる。一方、酸性緩衝液（希釈液５、溶液中に含まれる塩化物イオン濃度としては１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、陰イオンをほとんど含まなくても感染率が大幅に低下した。以上の結果から、ＡＡＶ吸着剤からのＡＡＶ溶出をｐＨ低下で行なう従来の精製法では、感染力価が低下したＡＡＶを取得するおそれがあることがわかる。
【0108】
実施例６ 緩衝液の塩濃度によるクロマトグラムへの影響
実施例５より、高濃度の陰イオンが含まれていても中性緩衝液であれば、ＡＡＶが有する感染力価が維持されることがわかった。次に、高濃度の陰イオンを含む中性緩衝液を溶出液としたときの、クロマトグラムへの影響を評価した。
実施例５より、高濃度の陰イオンが含まれていても中性緩衝液であれば、ＡＡＶが有する感染力価が維持されることがわかった。次に、高濃度の陰イオンを含む中性緩衝液を溶出液としたときの、クロマトグラムへの影響を評価した。
【0109】
（１）実施例３で調製したＡＡＶＲ固定化ゲル１．２５ｍＬを、ステンレス製空カラム（φ４．６ｍｍ×７５ｍｍ、東ソー社製）に充填し、ＡＡＶ吸着剤カラムを作製した（以降、「ＡＡＶＲカラム」とも表記）。
【0110】
（２）作製したＡＡＶＲカラムを、ＨＰＬＣ Ｍ４０Ａ（島津製作所社製）に接続し、表３に示す組成からなる溶液Ａで平衡化後、実施例１で調製したＡＡＶ２－ＥＧＦＰまたはＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（濃度はともに１．９×１０１２ｃｐ／ｍＬ）を、流速０．５ｍＬ／分で０．０５ｍＬアプライした。
【0111】
【表3】
【0112】
（３）溶液Ａで１０分間洗浄後、表３に示す組成からなる溶液Ｂを、４５分間で溶液Ｂが０％から１００％になるリニアグラジエントとなるよう、ＡＡＶＲカラムに送液した。グラジエント終了後は、表３に示す組成からなる溶液Ｃを送液することでＡＡＶＲカラムに残存するＡＡＶを溶出後、表３に示す組成からなる溶液ＡをＡＡＶＲカラムに送液することで当該カラムを再平衡化した。
【0113】
（４）ＡＡＶＲカラムから溶出したＡＡＶ２－ＥＧＦＰおよびＡＡＶ８－ＥＧＦＰを、２８０ｎｍ励起光に対する３５０ｎｍの蛍光強度で検出した。
【0114】
得られたクロマトパターンを図３に示す。図３のうち、ａ）は表３に示す溶離液条件１で得られたクロマトグラムであり、ｂ）は表３に示す溶離液条件２で得られたクロマトグラムである。表３に示す溶離液条件１および２、ともにＡＡＶに相当する溶出ピークを確認した。具体的には、溶離液条件１では溶出時間３２分付近にＡＡＶ２の溶出ピーク（図３のａ））が、溶離液条件２では溶出時間２６分付近にＡＡＶ２の溶出ピークが、３２分付近にＡＡＶ８の溶出ピークが（図３のｂ））、それぞれ確認された。以上の結果から、中性緩衝液中に含まれる、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンの濃度を変化させるグラジエントでＡＡＶを溶出させることで、酸性緩衝液でＡＡＶを溶出させたとき（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）と同様のクロマトグラムが得られることがわかる。
【0115】
実施例７ 中性緩衝液中に含まれるイオン濃度の検討
実施例４の結果、Ｅｌｕｔｅ １（溶液Ｂでの溶出画分）へのＡＡＶ溶出量が最も良好であった、塩化マグネシウムを含む中性緩衝液（表１のＢ－９）を用い、中性緩衝液中に含まれるイオン濃度の最適値を検討した。
実施例４の結果、Ｅｌｕｔｅ １（溶液Ｂでの溶出画分）へのＡＡＶ溶出量が最も良好であった、塩化マグネシウムを含む中性緩衝液（表１のＢ－９）を用い、中性緩衝液中に含まれるイオン濃度の最適値を検討した。
【0116】
具体的には、ＡＡＶ精製用ミニカラムとして実施例３で調製したｍ１１ａ＿ＨＴ１（配列番号７）固定化ゲル約５μＬをコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し作製したカラムを、ＡＡＶベクターとして実施例１で調製したＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．２×１０１２ＶＧ／ｍＬ）を１０μＬ、溶液Ｂとして表４に示すいずれかを、それぞれ用いた他は、実施例４と同様な方法で、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、Ｗａｓｈ、Ｅｌｕｔｅ １、およびＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶ２－ＥＧＦＰベクターゲノム数を定量した。
【0117】
【表4】
【0118】
溶液Ｂの違いによる、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、Ｗａｓｈ、Ｅｌｕｔｅ １、およびＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶ２－ＥＧＦＰベクターゲノム数の比率を比較した結果を図４に示す。なお、Ｆｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈとＷａｓｈは合計値の比率で示している。
【0119】
塩化マグネシウム添加量２５０ｍｍｏｌ／Ｌ（すなわち中性緩衝液に含まれる塩化物イオンとして６５０ｍｍｏｌ／Ｌ）以下の溶液Ｂ（表４の溶液Ｂ－１、Ｂ－１２およびＢ－１３）では、Ｅｌｕｔｅ １（溶液Ｂでの溶出画分）にＡＡＶは殆ど含まれなかった。一方、塩化マグネシウム添加量５００ｍｍｏｌ／Ｌ（すなわち中性緩衝液に含まれる塩化物イオンとして１．２ｍｏｌ／Ｌ）以上の溶液Ｂ（表４の溶液Ｂ－１４、Ｂ－１５およびＢ－９）では、Ｅｌｕｔｅ １（溶液Ｂでの溶出画分）にＡＡＶが溶出されるようになり、１．０ｍｏｌ／Ｌ以上（中性緩衝液に含まれる塩化物イオンとしては２．２ｍｏｌ／Ｌ以上）添加するとほぼすべてのＡＡＶがＥｌｕｔｅ １に溶出されていることがわかる。以上の結果より、ＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶを中性緩衝液で溶出させるには、塩化物イオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陰イオンを８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませる必要があり、１．５ｍｏｌ／Ｌ以上とすると好ましく、２．０ｍｏｌ／Ｌ以上５．０ｍｏｌ／Ｌ以下とするとさらに好ましいことがわかる。
【0120】
また図４の結果を、中性緩衝液中に含まれるナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンの濃度から評価すると、これらイオンの濃度が４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の溶液Ｂ（表４の溶液Ｂ－１、Ｂ－１２およびＢ－１３）では、Ｅｌｕｔｅ １にＡＡＶが殆ど含まれていないが、６５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の溶液Ｂ（表４の溶液Ｂ－１４、Ｂ－１５およびＢ－９）とすると、Ｅｌｕｔｅ １にＡＡＶが溶出されるようになることがわかる。以上の結果から、中性緩衝液中に含まれるナトリウムイオンまたは当該イオンよりもホフマイスター系列が小さい陽イオンの濃度は４５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませるとよく、６５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上とするとより好ましく、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上とするとさらに好ましく、１．０ｍｏｌ／Ｌ以上２．５ｍｏｌ／Ｌ以下とするとよりさらに好ましいことがわかる。
【0121】
実施例８ ＡＡＶＲ固定化ゲルによるＡＡＶ精製（その２）
ＡＡＶ精製用ミニカラムとして実施例３で調製したｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲル約５μＬをコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し作製したカラムを、ＡＡＶベクターとして実施例１で調製したＡＡＶ１－ＥＧＦＰ溶液（濃度：３．０×１０１１ＶＧ／ｍＬ）４０μＬ、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．５×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬ、ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．１×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬおよびＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．２×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬのいずれかを、溶液Ａ、ＢおよびＣとして表５の溶離液条件３および４に示す溶液を、それぞれ用いた他は、実施例４と同様な方法で、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、Ｗａｓｈ、Ｅｌｕｔｅ １、およびＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶベクターゲノム数を定量した。
ＡＡＶ精製用ミニカラムとして実施例３で調製したｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲル約５μＬをコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し作製したカラムを、ＡＡＶベクターとして実施例１で調製したＡＡＶ１－ＥＧＦＰ溶液（濃度：３．０×１０１１ＶＧ／ｍＬ）４０μＬ、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．５×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬ、ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．１×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬおよびＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．２×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬのいずれかを、溶液Ａ、ＢおよびＣとして表５の溶離液条件３および４に示す溶液を、それぞれ用いた他は、実施例４と同様な方法で、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、Ｗａｓｈ、Ｅｌｕｔｅ １、およびＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶベクターゲノム数を定量した。
【0122】
【表5】
【0123】
Ｅｌｕｔｅ １とＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶベクターゲノム数の割合を比較した結果を図５に示す。なおＦｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈおよびＷａｓｈに含まれるＡＡＶベクターゲノム数の割合は、合わせても最大０．７％であり、ＡＡＶ吸着剤に未吸着のＡＡＶがＥｌｕｔｅ １に含まれていたとしても誤差範囲のため、結果からは除外している。いずれの血清型を用いても、Ｅｌｕｔｅ １に８０％以上のＡＡＶが溶出されており、本発明の精製方法は血清型を問わず適用できることがわかる。
【0124】
実施例９ ＡＡＶＲ固定化ゲルによるＡＡＶ精製（その３）
実施例８では、ＡＡＶ吸着剤としてｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを用いたが、本実施例ではｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）以外のＡＡＶ結合性タンパク質を固定化したゲルをＡＡＶ吸着剤として用い、本発明の精製を行なった。
実施例８では、ＡＡＶ吸着剤としてｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルを用いたが、本実施例ではｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）以外のＡＡＶ結合性タンパク質を固定化したゲルをＡＡＶ吸着剤として用い、本発明の精製を行なった。
【0125】
具体的には、ＡＡＶ精製用ミニカラムとして実施例３で調製したｍ１０ｓ＿Ｔ１（配列番号４）固定化ゲルまたはｍ１０ｓ＿ＨＴ１（配列番号５）固定化ゲル約５μＬをコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し作製したカラムを、ＡＡＶベクターとして実施例１で調製したＡＡＶ１－ＥＧＦＰ溶液（濃度：３．０×１０１１ＶＧ／ｍＬ）４０μＬ、ＡＡＶ２－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．５×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬ、ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．１×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬおよびＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液（濃度：１．２×１０１２ＶＧ／ｍＬ）１０μＬのいずれかを、溶液Ａ、ＢおよびＣとして表５の溶離液条件３に示す溶液を、それぞれ用いた他は、実施例４と同様な方法で、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ、Ｗａｓｈ、Ｅｌｕｔｅ １、およびＥｌｕｔｅ ２に含まれるＡＡＶベクターゲノム数を定量した。
【0126】
結果を図６に示す。図６のうち、ａ）はＡＡＶ吸着剤としてｍ１０ｓ＿Ｔ１（配列番号４）固定化ゲルを、ｂ）はＡＡＶ吸着剤としてｍ１０ｓ＿ＨＴ１（配列番号５）固定化ゲルを、それぞれ用いたときの結果である。ＡＡＶ吸着剤を、ｍ１０ｓ＿Ｔ１（配列番号４）固定化ゲルまたはｍ１０ｓ＿ＨＴ１（配列番号５）固定化ゲルに替えても、全ての血清型でＥｌｕｔｅ １にＡＡＶが溶出されていることがわかる。以上の結果から、本発明の精製法は、ＡＡＶ吸着剤のリガンド（ＡＡＶ結合性タンパク質）に依存せず実施できることがわかる。
【0127】
なおＡＡＶ５は、ｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲル（実施例８）をＡＡＶ吸着剤として用いたときのほうが、Ｅｌｕｔｅ １へのＡＡＶ溶出比率が優れていた。以上の結果から、遺伝子型を問わず中性領域で高効率にＡＡＶを精製したい場合は、ｍ１１ａ＿Ｔ１（配列番号６）固定化ゲルをＡＡＶ吸着剤としたほうが好ましいことがわかる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】