特開 2023-19942 細胞培養基材、及び細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023019942

(43)【公開日】2023-02-09

(54)【発明の名称】細胞培養基材、及び細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20230202BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20230202BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20230202BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 Z

C12N5/074

C12N5/0735

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021125028

(22)【出願日】2021-07-30

(71)【出願人】

【識別番号】591244199

【氏名又は名称】廣瀬製紙株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100190067

【弁理士】

【氏名又は名称】續 成朗

(72)【発明者】

【氏名】岸本 祐輝

(72)【発明者】

【氏名】岸本 吉則

(72)【発明者】

【氏名】劉 莉

(72)【発明者】

【氏名】澤 芳樹

(72)【発明者】

【氏名】宮川 繁

(72)【発明者】

【氏名】李 俊君

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC01

4B029CC13

4B029DG08

4B065AA90X

4B065BB31

4B065BB32

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】ゼラチン、コラーゲン等のタンパク質からなるナノファイバーを安価で簡便な処方により耐水性を付与し、多能性幹細胞を長期間、未分化培養できる、安価な培養基材を提供し、当該基材を用いた多能性幹細胞の培養方法を提供すること。
【解決手段】ゼラチン又はコラーゲンからなる、物理架橋されたナノファイバーを含有してなり、該ナノファイバーは、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基定量法による架橋度が５０～８５％である、多能性幹細胞の培養基材。上記基材上に多能性幹細胞を播種し、該細胞を静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゼラチン又はコラーゲンからなる、物理架橋されたナノファイバーを含有してなり、該ナノファイバーは、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基定量法による架橋度が５０～８５％である、多能性幹細胞の培養基材。

【請求項2】

前記ナノファイバーは、前記ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法による架橋度が７５～８０％である、請求項１に記載の基材。

【請求項3】

前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１又は２に記載の基材。

【請求項4】

前記多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の基材。

【請求項5】

請求項１又は２に記載の基材上に多能性幹細胞を播種し、該細胞を静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法。

【請求項6】

酵素を含まない解離液を用いて基材から多能性幹細胞を解離させ、該細胞を請求項１又は２に記載の基材上に播種し、該細胞をさらに静置培養することを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

継代時に、多能性幹細胞を単一細胞にまで分散させることを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

多能性幹細胞を無血清培地で培養することを特徴とする、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記無血清培地がｘｅｎｏフリー培地である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記無血清培地がタンパク質不含培地である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記多能性幹細胞がヒト由来である、請求項５～１１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養基材、及び細胞培養方法に関する。具体的には、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞の培養に適した培養基材、並びにそれを用いた多能性幹細胞の培養方法に関する。より詳細には、本発明は、ゼラチン、コラーゲン等のタンパク質からなるナノファイバーを用いた多能性幹細胞の培養用基材、並びにそれを用いて、継代時、酵素処理を行うことなく単一細胞にまで分散させることによる、多能性幹細胞の維持増幅方法に関する。

【背景技術】

【0002】

多能性幹細胞（ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞、又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）を含む）は無限に増殖することができ、人間のあらゆる体細胞に分化する性質を持つことより、再生医療や創薬スクリーニングなどの応用が期待されており、ｉＰＳ細胞から作製された角膜や心筋シートなどが、既に臨床試験で使用されている。これまで報告されてきた多能性幹細胞の接着培養では遺伝子組み換えタンパクであるラミニンやマトリゲルといった細胞培養基材が使用されてきたが、これらの基材は培養開始までの準備工程が多くありコンタミネーションの危険性や、ロット間での性能の差があることなどが課題とされてきた。特にマトリゲルは動物由来であり、ｘｅｎｏフリーの基材材料ではない。

【0003】

一方、これ以外の培養基材として電界紡糸法（エレクトロスピニング法）から作製されるナノファイバーを用いたｉＰＳ細胞の培養方法が提唱されている。特にゼラチンをナノファイバーに加工し、その上でｉＰＳ細胞を培養すると２０継代以上の長期培養でも未分化状態と分化能を維持することが分かっている（非特許文献１）。また、ゼラチンナノファイバーとｉＰＳ細胞は比較的弱い接着力にて接着しているため、細胞を回収する際にトリプシン等のタンパク質分解酵素を使用しなくても回収できるため、細胞ダメージを最小限に抑えた培養ができ、多能性能がゼラチンナノファイバー以外の基材で培養した場合より高くなることも明らかとなっている。さらに、ゼラチンナノファイバーを用いることでヘテロなｉＰＳ細胞群から２つの性質の異なるｉＰＳ細胞をシングルレベルで単離することも可能となっており、性能の揃ったｉＰＳ細胞を供給できるため、より安全な細胞の供給や再現性の高い研究などへの期待ができる（非特許文献２）。そして、ゼラチンナノファイバー上で培養したｉＰＳ細胞を直接に神経、心筋細胞へ分化誘導させると、得られた神経と心筋細胞の成熟度が高く、機能性が高いことも報告されている（非特許文献３、４）。よって、ゼラチンナノファイバーは従来の培養方法では得られない高性能を持つｉＰＳ細胞、分化細胞の供給に期待ができる材料である。

【0004】

ゼラチンナノファイバーはゼラチン粉末を溶媒に溶解した溶液をエレクトロスピニング法にて作製することができる。通常、ゼラチンナノファイバーは水に対する溶解性が極めて高いため、架橋処理により耐水性を付与する必要がある。

【0005】

一般に、ゼラチンナノファイバーを細胞培養基材として使用する場合には化学架橋剤にてゼラチン分子間を架橋させ耐水化した後に使用するが、化学架橋剤には細胞毒性のある水溶性カルボジイミドやアルデヒド系の架橋剤が用いられる（特許文献１）。これらの薬剤はゼラチンナノファイバーを利用した細胞培養基材を製造するにあたり高コストの原因となる。架橋処理時間も数時間から数十時間を要することがゼラチンナノファイバーを利用した細胞培養基材の生産における実用上の課題であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第６０２４０４７号

【特許文献2】特許第６４５０８９４号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】L. Liu, et. al., Biomaterial 35, 6259-6267 (2014) doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.04.024

【非特許文献2】L. Yu et. al., Stem Cell Reports. 11(1), 142-156 (2018)

【非特許文献3】Y. Tang, et. al., Journal of Materials Chemistry B 4, 3305-3312 (2016)

【非特許文献4】L. Yu et.al., Advanced Healthcare Materials 8(13), 190016 (2019) doi.org/10.1002/adhm.201900165

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、ゼラチン、コラーゲン等のタンパク質からなるナノファイバーを安価で簡便な処方により耐水性を付与し、多能性幹細胞を長期間、未分化培養できる、安価な培養基材を提供することである。また、本発明は、当該基材を用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記の目的を達成すべく、未架橋のゼラチンナノファイバーを物理的な処理により架橋させ、耐水化させる方法に着目した。

【0010】

物理的な処理によりゼラチンを耐水化させる方法として、減圧下で１４０℃程度の高温で一定時間加熱する方法が提案されている（特許文献２）。この方法はマイクロファイバーからなるゼラチン不織布を加熱処理による脱水縮合反応を用いてゼラチン分子を架橋し耐水化させている。しかしこの方法は処理時間に４８時間を要する。また、ゼラチンナノファイバーの耐水化は上記の条件では達成できない。

【0011】

本発明者らは、エレクトロスピニング法にて作製したゼラチンナノファイバーをガラス製のカルチャーガラスに吹き付けた後、２２０℃前後の高温で加熱した。その結果、ゼラチンナノファイバーは耐水性を示し、水中でも繊維構造を維持していることを確認した。さらにヒトｉＰＳ細胞の１０継代に及ぶ長期培養も可能であることが判明した。さらに、免疫細胞染色法とフローサイトメトリー法による評価にて１０継代目のｉＰＳ細胞が９０％以上未分化状態で維持増殖していることが分かり、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］ ゼラチン又はコラーゲンからなる、物理架橋されたナノファイバーを含有してなり、該ナノファイバーは、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸(ＴＮＢＳ)を用いたアミノ基定量法による架橋度が５０～８５％である、多能性幹細胞の培養基材。
［２］ 前記ナノファイバーは、前記ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法による架橋度が７５～８０％である、［１］に記載の基材。
［３］ 前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、［１］又は［２］に記載の基材。
［４］ 前記多能性幹細胞がヒト由来である、［１］～［３］のいずれかに記載の基材。
［５］ ［１］又は［２］に記載の基材上に多能性幹細胞を播種し、該細胞を静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法。
［６］ 酵素を含まない解離液を用いて基材から多能性幹細胞を解離させ、該細胞を［１］又は［２］に記載の基材上に播種し、該細胞をさらに静置培養することを特徴とする、［５］に記載の方法。
［７］ 継代時に、多能性幹細胞を単一細胞にまで分散させることを特徴とする、［６］に記載の方法。
［８］ 多能性幹細胞を無血清培地で培養することを特徴とする、［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 前記無血清培地がｘｅｎｏフリー培地である、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記無血清培地がタンパク質不含培地である、［８］に記載の方法。
［１１］ 前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、［５］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ 前記多能性幹細胞がヒト由来である、［５］～［１１］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0013】

発明者らは、ゼラチンナノファイバーの架橋処理における従来の問題を克服するべく、化学架橋法ではなく物理架橋法にてゼラチンナノファイバーに耐水性を付与することを考案した。本発明においてゼラチンナノファイバーの耐水化処理において化学架橋剤は一切使用しておらず、処理時間も従来の１／８（３０分）程度になることでゼラチンナノファイバーを利用した細胞培養基材を安価で提供することが可能となる。これにより、従来のゼラチンナノファイバーを利用した細胞培養基材の製造における実用上の課題を解決できる。また、化学架橋剤による細胞への毒性問題も解決できる。さらに本発明の細胞培養基材を用いてｉＰＳ細胞の１０継代までの未分化培養も確認することができ、実用に足る培養基材の開発に至っている。本発明の細胞培養基材を用いることにより、ｉＰＳ細胞を従来より安価で大量に供給することができるようになると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例に示す方法（エレクトロバブルスピニング法）によりゼラチンナノファイバーを作製する様子を示す写真

【図2】ゼラチンナノファイバーの電子顕微鏡写真

【図3】ゼラチンナノファイバーの繊維径分布を示す図

【図4】ゼラチンナノファイバーの加熱処理条件に対する架橋度を示す図

【図5】ゼラチンナノファイバー上で培養中のｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）示す図。ａ． １継代目、ｂ． １０継代目。

【図6】ゼラチンナノファイバー上で１０回継代培養したｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）における多能性幹細胞マーカーの発現を示す免疫細胞染色写真。ａ． Ｎａｎｏｇ、ｂ． ＯＣＴ３／４、ｃ． ＤＡＰＩ。

【図7】ゼラチンナノファイバー上で１０回継代したｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）における多能性幹細胞マーカーの発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す図

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、ゼラチン又はコラーゲンからなる、物理架橋されたナノファイバーを含有してなり、該ナノファイバーは、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基定量法による架橋度が５０～８５％である、多能性幹細胞の培養基材（以下、本発明の培養基材と略記する場合がある）を提供する。

【0016】

本発明の培養基材が適用可能な多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己増幅能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されず、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）１細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞、骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等が挙げられる。ＥＳ細胞は体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。

【0017】

架橋を大別すると、高分子化合物が化学反応による共有結合により連結された化学架橋と、高分子化合物が実質的に共有結合以外の分子間力（分子同士又は高分子化合物での離れた部位同士の間に働く力。例えば、水素結合、イオン結合、又は配位結合など。）により連結された物理架橋が挙げられる。このうち、本発明の培養基材は、後者の物理架橋されたナノファイバーを含有してなることを特徴とする。

【0018】

本発明の培養基材を構成するナノファイバーは、ゼラチン又はコラーゲンからなる。ゼラチンは、例えば、ブタ、及び、ウシ等の哺乳類に由来するもの；ニワトリ、及び、ダチョウ等の鳥類に由来するもの；サケ、タラ、及び、チョウザメ等の魚類に由来するもの；等が挙げられる。ゼラチンは、典型的にはコラーゲンを変性して可溶化させたものであるところ、コラーゲンは、上記動物の皮、骨、及び、鱗等のいずれの部位から取得されたものであってもよい。好ましくは、本発明の培養基材を構成するナノファイバーは、ゼラチンからなるゼラチンナノファイバーである。

【0019】

本発明の培養基材を構成するナノファイバーは、典型的には、エレクトロスピニング法にて作製できる。エレクトロスピニング法は従来公知の手法に従って実施することができる。エレクトロスピニング法の原理は、静電気力を高分子溶液に印加することでナノサイズの繊維にすることである。具体的には、例えば、ゼラチン、コラーゲン等のタンパク質を溶解した高分子溶液をシリンジに充てんし、先端に注射針のようなノズルを設置したものに、シリンジポンプを接続して流速を与えるようにする。ノズルから適当な距離の位置にナノファイバーが収集するコレクタを設置し、ノズル側に電源の＋極、コレクタ側に－極を接続する。シリンジポンプの電源を入れるとともに、電圧をかけることにより、コレクタ上に高分子溶液の溶質が噴射され、ナノファイバーが形成される。
ここで、電圧、ノズルからコレクタまでの距離、ノズルの内径などにより、繊維形態や繊維径が変動するが、当業者であれば、これらを適宜選択して所望の繊維径を有し、かつ均一なナノファイバーを作製することができる。
なお、上述のコレクタは、平板でもよいし、巻き取り式とすることもできる。また、平板状のコレクタ上に基板、例えばガラス等を設置して、基板上にナノファイバーが形成されたものを培養基材とすることもできる。

【0020】

さらに、エレクトロスピニング法としては上述のノズルを使用する態様に限定されず、例えば、後述の実施例で用いたノズルを使用しない態様など、各種条件を採用することもできる。
具体的には、ノズルを使用しない態様としては、特開２００８－０２５０５７に記載の方法を採用することができる。当該方法は、高分子溶液又は高分子融液に連続的に発生した泡に高電圧を印加することにより静電紡糸を行なうことを特徴としている。ここで、高分子溶液として、上述したゼラチン、コラーゲン等のタンパク質を溶解した高分子溶液を用いることで、任意の基材上にナノファイバーを堆積させることができる。なお、当該方法はノズルを使用せず、高分子溶液に発生させた泡（バブル）からナノファイバーを作製する手法であるため、本発明者らはこれを「エレクトロバブルスピニング法」とも称している。

【0021】

上記のようにして生成するナノファイバーは、１～１０００ｎｍ、好ましくは１０～８００ｎｍ、より好ましくは５０～３００ｎｍの繊維径（繊維直径）を有するものであればよい。

【0022】

本発明の培養基材では、ナノファイバーに耐水性を付与し、かつ継代時の細胞の解離を容易にするために、生成したナノファイバーは物理的な処理により架橋させ、耐水化させる。具体的には、生成したナノファイバーを、２００℃以上、好ましくは２２０℃の温度条件で加熱し、ナノファイバーを物理架橋させる。加熱時間としては特に制限されず、温度条件に応じて適宜設定することができる。例えば、加熱温度が２００℃の場合、加熱時間は１２０分以上とすることが好ましい。加熱温度が２２０℃の場合、加熱時間は３０分以上とすることが好ましい。

【0023】

本発明の培養基材の耐水性は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基定量法にて評価することができる。本発明の培養基材は、当該ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法による架橋度が５０～８５％であり、好ましくは７５～８０％である。これにより、本発明の培養基材は、多能性幹細胞の培養基材として使用するのに適した耐水性を有し、１０継代以上の長期培養が可能な培養基材となる。

【0024】

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例0025】

［ゼラチンナノファイバーの作製］
（１）材料
ゼラチン溶液
・ゼラチン（豚皮由来ＴｙｐｅＡ ゼラチン、ＡＰＨ １５０； 新田ゼラチン（株））
・ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）
・精製水
カルチャーカバーガラス
・Φ２５ｍｍ円形ガラス（Ｃ１２００、松浪硝子工業（株））

【0026】

（２）操作手順
２０ｗｔ％ゼラチン溶液の作製
２０ｇのゼラチン粉末を１６ｇの水に溶解させたのち、攪拌しながらＤＭＡＣを投入し混合させた。

【0027】

エレクトロスピニング法によるゼラチンナノファイバーの作製
上記にて作製したゼラチン溶液を径８０ｍｍステンレススチール製円筒容器に投入し底面から圧縮空気を供給しゼラチン溶液のバブルを発生させた。ゼラチンナノファイバーを吹き付けるガラスを固定したアルミ板をバブル表面から１５ｃｍの位置に設置した。ゼラチン溶液に５５ｋＶの直流高電圧を印加し、ガラス上にゼラチンナノファイバーを積層させた。図１は、本実施例で用いたエレクトロバブルスピニング法によりゼラチンナノファイバーを作製する様子を示す写真である。

【0028】

加熱処理によるゼラチンナノファイバーの耐水化
上記にて作製したゼラチンナノファイバーを２２０℃で加熱したオーブンに投入し３０分間加熱し耐水化した。
また、比較のために、加熱温度を１４０℃、１８０℃、２００℃、２６０℃に設定し、上記と同様の方法で作製したゼラチンナノファイバーの耐水化処理を行った。

【0029】

［ヒト多能性幹細胞のゼラチンナノファイバー上への継代方法］
（１）材料
・ｍＴｅＳＲ １ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ペリタス ＳＴ－０５８５０
・Ｙ－２７６３２ Ｗａｋｏ ２５７－００５１１（１ｍｇ） ２５３－００５１３（５ｍｇ）
・Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ｅｎｚｙｍｅ－ｆｒｅｅ， Ｈａｎｋｓ’－ｂａｓｅｄ ＧＩＢＣＯ １３１５０－０１６
・ヒト人工多能性幹細胞：２５３Ｇ１

【0030】

（２）操作手順
ナノファイバーの前処理
３５ｍｍディッシュ（６－ｗｅｌｌ プレート）にゼラチンナノファイバーをセットし、９９．５％エタノール １ｍＬで３回洗浄し滅菌処理した。３回目は丁寧に吸引し、クリーンベンチ内で乾燥した。ゼラチンナノファイバーを培地に浸し、３７℃でインキュベートした。２５ｍｍガラスに作製したナノファイバーにはｍＴｅＳＲ １を２５０μＬ、表面張力を利用してゼラチンナノファイバー上にのせた。

【0031】

ナノファイバーからナノファイバーへの継代
ＰＢＳで２回細胞をリンスした後、酵素不含細胞解離液Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、該解離液を吸引除去した。ｍＴｅＳＲ１（＋Ｙ２７６３２）２ｍＬで細胞を回収し（１ｍＬ×２回）、１０回ぐらいピペッティングし、シングルセルにした。１０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を吸引除去し、ｍＴｅＳＲ１（＋Ｙ２７６３２）で、必要な細胞濃度に再懸濁した。前処理していたナノファイバー上の培地を吸引除去し、２５ｍｍガラスに作製したナノファイバーには、上記細胞懸濁液を２５０μＬ（細胞密度は１．５～２Ｘ１０ｅ５ ｃｅｌｌｓ／ｓａｍｐｌｅ）を播種する。３０分後、細胞は接着したら、２ｍＬのｍＴｅＳＲ１（＋Ｙ２７６３２）を添加した。２日目からＹ－２７６３２を含まないｍＴｅＳＲ１で培養し、毎日培地交換を行った。

【0032】

（３）結果
ゼラチンナノファイバーの繊維形態、繊維径分布
Φ２５ｍｍの円形ガラスに吹き付けられたゼラチンナノファイバーの電子顕微鏡写真を図２に示す。図２中のスケールバーは、１μｍである。また、図３に電子顕微鏡写真から繊維径を測定した結果を示す。図２及び図３から平均繊維径約１００ｎｍ程度のゼラチンナノファイバーが得られ、繊維径分布も比較的均一であることが分かった（平均（ＡＶ）：１０６ｎｍ、標準偏差（ＳＤ）：１５、変動係数（ＣＶ）：１４％）。

【0033】

ゼラチンナノファイバーの加熱処理条件に対する架橋度
ゼラチンナノファイバーの架橋度を、ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法にて算出した。結果を図４に示す。図４に示す５つのグラフは、左側から右側の順に、加熱温度が２６０℃、２２０℃、２００℃、１８０℃、１４０℃の場合である。いずれの温度条件の場合でも、加熱時間が長くなるにつれゼラチンナノファイバーの架橋度が上昇していく。加熱温度が２６０℃の場合、１０分間の加熱で架橋度が約８０％になり耐水性が付与されるが、炭化して着色してしまう。加熱温度が２２０℃の場合は３０分間の加熱で架橋度が約８０％になる。２２０℃の加熱では炭化は起こらない。加熱温度が２００℃の場合は１２０分間の加熱で架橋度が約７５％となる。一方、加熱温度が１８０℃、１４０℃の場合、それぞれ２４時間、４８時間加熱しても架橋度は３０％以下となり、十分な耐水性が得られず、水中でナノファイバーが溶解して繊維構造が崩壊してしまう。以上の結果より、ゼラチンナノファイバーを物理架橋させる際の加熱処理条件としては、加熱温度が２００℃以上であることが好ましく、加熱温度が２２０℃以上であるとより短い時間で７５％以上、より具体的には８０％程度の架橋度で架橋されたゼラチンナノファイバーを得られることが分かった。なお、後述するｉＰＳ細胞の培養試験では、短時間の加熱でゼラチンナノファイバーの炭化が起こらない条件である２２０℃で３０分間の加熱処理を施したゼラチンナノファイバーを用いることとした。

【0034】

ゼラチンナノファイバー上でのｉＰＳ細胞の培養
上述の、２２０℃で３０分間、加熱処理を施したゼラチンナノファイバーを用いてｉＰＳ細胞の培養を行った。その結果、１０継代の継代培養が可能となった。１継代目と１０継代目のｉＰＳ細胞の顕微鏡写真を図５に示す。図５中のスケールバーは、５００μｍである。培養されたｉＰＳ細胞は綺麗なコロニー形成をしながら増殖していることが分かった。

【0035】

免疫染色法による多能性幹細胞マーカー発現
ゼラチンナノファイバー上で培養したｉＰＳ細胞（１０継代目）を免疫染色することにより、多能性幹細胞マーカーであるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ３／４及びＤＡＰＩの発現を調査した。結果を図６に示す。図６中のスケールバーは、１００μｍである。１０継代目にて多能性幹細胞マーカーが強く発現していることが分かった。

【0036】

フローサイトメトリーによる多能性幹細胞マーカーの定量解析
ゼラチンナノファイバー上で１０継代培養したｉＰＳ細胞における多能性幹細胞表面マーカーのＳＳＥＡ４の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図７に示す。ゼラチンナノファイバー上にて９３．２％でＳＳＥＡ４が発現していることが分かった。

【0037】

以上の結果から、ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法による架橋度が約８０％であるゼラチンナノファイバーを含有してなる培養基材が、ｉＰＳ細胞の培養基材として使用するのに好適であることが分かった。当該基材と同様に、ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法による架橋度が約７５％であるゼラチンナノファイバー（２００℃で１２０分間の加熱処理を施したゼラチンナノファイバー）を含有してなる培養基材も、水中で繊維構造を維持できるので、ｉＰＳ細胞の培養基材として使用できると考えられる。さらには、ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量法による架橋度が５０～８５％であるゼラチンナノファイバーを含有してなる培養基材は、水中で繊維構造を維持できる限りにおいて、ｉＰＳ細胞の培養基材として使用できると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0038】

従来のｉＰＳ細胞の培養方法では培養実験前にシャーレやカルチャーグラスにラミニンやマトリゲル等の基材をコーティングする作業を要するが、均一なコートが出来なかったり、速やかなコーティングをしないと基材がゲル化したりするなどの問題があった。これに対して、ゼラチン、コラーゲン等のタンパク質からなるナノファイバーから構成される本発明の培養基材では、そういった作業がなく実験作業者の負担が少ない。また、本発明の培養基材を構成するナノファイバーは非常に安定であり、室温保存半年以上でも品質は変わらない。そして、コスト面ではΦ２５ｍｍのカルチャーグラスを使用した場合、ラミニンは約６００円～１２００円、マトリゲルは約２００円、従来の化学架橋で得られるゼラチンナノファイバーは約４００円なのに対し、例えば上述の実施例で使用したエレクトロバブルスピニング法で得られるゼラチンナノファイバーは約１００円となり、価格面でも優位となる。

【0039】

さらに、近年ではｉＰＳ細胞の自動大量培養装置が開発され、全自動で大量のｉＰＳ細胞を作製する技術開発が行われている。その装置では培養基材を用いてｉＰＳ細胞を培養している。この様な装置の培養基材に本発明の培養基材を使用することで、安定的で安価なｉＰＳ細胞の供給に貢献できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】