特開 2023-23890 二本鎖ＰＮＡプローブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023023890

(43)【公開日】2023-02-16

(54)【発明の名称】二本鎖ＰＮＡプローブ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20230209BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20230209BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230209BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20230209BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z

C12Q1/6813 Z

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021129821

(22)【出願日】2021-08-06

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】590002389

【氏名又は名称】静岡県

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】北松 瑞生

(72)【発明者】

【氏名】重藤 元

(72)【発明者】

【氏名】山村 昌平

(72)【発明者】

【氏名】大槻 高史

(72)【発明者】

【氏名】秋山 靖人

(72)【発明者】

【氏名】飯塚 明

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】標的ＤＮＡとＰＮＡ部分がハイブリダイズした際に高い蛍光強度を得ることができる、クエンチャーとレポーターが分離するタイプのＰＮＡプローブを提供する。
【解決手段】消光基２２と、ＤＮＡ領域２６と、前記消光基と前記ＤＮＡ領域の間をつなぐクエンチャーリンカー２４を含むクエンチャーパーツ２０、ならびに発光基１２と、ＰＮＡ領域１６と、前記発光基と前記ＰＮＡ領域の間をつなぐレポーターリンカー１４を含むレポーターパーツ１０を有し、前記ＤＮＡ領域と前記ＰＮＡ領域が相補的に結合した際に、前記消光基と前記発光基が同じ側に配置される二本鎖ＰＮＡプローブ１であって、前記レポーターリンカーは、主鎖中に酸素を２元素以上含有しておらず、直鎖炭素結合換算で、前記レポーターリンカーより短いことを特徴とする二本鎖ＰＮＡプローブを使用する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

消光基と、
ＤＮＡ領域と、
前記消光基と前記ＤＮＡ領域の間をつなぐクエンチャーリンカーを含む
クエンチャーパーツと、
発光基と、
ＰＮＡ領域と、
前記発光基と前記ＰＮＡ領域の間をつなぐレポーターリンカーを含む
レポーターパーツを有し、
前記ＤＮＡ領域と前記ＰＮＡ領域が相補的に結合した際に、前記消光基と前記発光基が同じ側に配置される二本鎖ＰＮＡプローブであって、
前記レポーターリンカーは、主鎖中に酸素を２元素以上含有しておらず、直鎖炭素結合換算で、前記レポーターリンカーより短いことを特徴とする二本鎖ＰＮＡプローブ。

【請求項2】

前記クエンチャーリンカーが直鎖炭素結合換算値で１３であるときに、前記レポーターリンカーは直鎖炭素結合換算値で２～１１であることを特徴とする請求項１に記載された二本鎖ＰＮＡプローブ。

【請求項3】

前記ＰＮＡ領域が標的とするＤＮＡは一塩基多型であることを特徴とする請求項１または２の何れかに記載された二本鎖ＰＮＡプローブ。

【請求項4】

前記ＰＮＡ領域が標的とするＤＮＡはＴ７９０ＭもしくはＬ８５８Ｒの変異種であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された二本鎖ＰＮＡプローブ。

【請求項5】

前記レポーターリンカーが、Ｃ７、ｂＡｌａ、Ｃ１１、Ａｍｂｚのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４の何れか一の請求項に記載された二本鎖ＰＮＡプローブ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞内の変異遺伝子あるいは変異細胞の標的塩基配列を検出する際に利用できるペプチド核酸プローブに関するものであり、特にクエンチャーとレポーターが分離するタイプのＰＮＡプローブに関するものである。

【背景技術】

【0002】

リアルタイムＰＣＲや標的遺伝子の検出等のように、検出対象がＤＮＡ構造を持っている場合、その塩基配列を検出するプローブが開発されている。このプローブは、標的とする塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ配列に、発光基（レポーター）と消光基（クエンチャー）が連結される構造を有する。そして、プローブ中の塩基配列部分が標的の塩基配列と結合すると発光基と消光基が離れ離れになり、発光基が発光する。このようなプローブはＤＮＡプローブと呼ばれる。

【0003】

特許文献１には、ステム・ループ構造を有するＤＮＡプローブを用いて、核酸分子の多重検出を行う方法が開示されている。

【0004】

また、特許文献２には、オリゴヌクレオチドの両端に発光基と消光基を設けた、互いに相補的な部分を有する２本鎖ＤＮＡプローブを用いた核酸の蛍光検出が記載されている。

【0005】

一方、標的となるＤＮＡに結合する部分に、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を用いたＰＮＡプローブも提案されている。ＰＮＡプローブとは、ヌクレオシドをペプチドで結合することで、ＤＮＡに似せた人工ペプチドと、発光基および消光基を組み合わせて、標的となる塩基配列を検出するものである。

【0006】

ＰＮＡプローブには、発光基を結合させたＰＮＡと消光基を結合させたＤＮＡを結合させた二本鎖ＰＮＡプローブと、ＰＮＡの両端に発光基と消光基をそれぞれ結合させたＰＮＡ分子ビーコンのタイプが知られている。特許文献３には、Ｎ末端とＣ末端に発光基と消光基を連結させたＰＮＡ分子ビーコンタイプのＰＮＡプローブが開示されている。

【0007】

ＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブと比較し、ヌクレアーゼやプロテアーゼに耐性があり、また耐熱性も高い。また、ＤＮＡのようにリン酸結合でなく、ペプチド結合で連結されており、ｐＨが中性なので、標的の遺伝子などとハイブリダイズしやすい、といった特徴があり注目されている。

【0008】

非特許文献１には、二本鎖ＰＮＡプローブの紹介と、ＰＮＡ分子ビーコンと二本鎖ＰＮＡプローブとの比較がされている。非特許文献１では、二本鎖ＰＮＡプローブの方が発光強度を高くできることが報告されている。

【0009】

また、非特許文献２には、肺がん細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のｍＲＮＡ配列に特有な遺伝子変異（エクソン１９ｄｅｌのＥ７４６-Ａ７５０、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒの変異）を発見するために開発された二本鎖ＰＮＡ（ペプチド核酸（ＰＮＡ）－ＤＮＡ）プローブが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特表２０１９-５２８７７２号公報

【特許文献2】特表２０１０－５０５４４０号公報

【特許文献3】特表２０１７－５１０３０１号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Kathleen E. Mach, Aniruddha M. Kaushik, KuangwenHsieh, Pak Kin Wong, Tza-Huei Wangcand Joseph C. Liao：Analyst 2019,144,1565-1574

【非特許文献2】Hajime Shigeto, Takashi Ohtsuki, Akira Iizuka, Yasuto Akiyamac and Shohei Yamamura : Analyst 2019,144,4613-4621

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

ＰＮＡプローブは、標的ＤＮＡとハイブリダイズしやすいという特徴をもつ。しかし、ステム・ループ型で形成すると、プローブがＰＮＡだけで構成されるため、細胞内への導入がしにくいという課題があった。また、同一分子内に発光基と消光基が存在するので、標的ＤＮＡと結合しても蛍光強度は消光基の影響を受けて低くなるという課題もあった。

【0013】

一方、ＰＮＡプローブをＤＮＡの二本鎖型で形成すると、カチオン性を有するため細胞内に導入しやすい。また、二本鎖型であれば、ＰＮＡの部分が標的ＤＮＡとハイブリダイズした後は、ＤＮＡの部分は分離して離れ、同一分子内には消光基が存在せず、蛍光強度は高くできる。また、標的ＤＮＡとハイブリダイズしやすいという特徴も活かすことができる。

【0014】

しかし、二本鎖ＰＮＡプローブの蛍光強度（発光および消光間の輝度差）はまだ十分なものとは言えず、蛍光強度の向上の要請があった。

【課題を解決するための手段】

【0015】

蛍光強度を高くするためには、消光時に十分暗くなっており、発光時に暗くならないことが求められる。一般に消光時に蛍光を消すためには消光基を発光基に近づけることが必要であり、発光時に明るくするには、消光基を発光基から離すことが必要と考えられている。

【0016】

そのため二本鎖ＰＮＡプローブにおいては、互いの消光基と発光基が近接するように、標的ＤＮＡにハイブリダイズする部分と消光基、発光基の間に同じ構造のリンカーを配置させる（特許文献２）。

【0017】

しかしながら、本発明の発明者はレポーター側のリンカーとクエンチャー側のリンカーの長さを変えることで、むしろ蛍光強度が高くなることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0018】

より具体的に本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブは、
消光基と、
ＤＮＡ領域と、
前記消光基と前記ＤＮＡ領域の間をつなぐクエンチャーリンカーを含む
クエンチャーパーツと、
発光基と、
ＰＮＡ領域と、
前記発光基と前記ＰＮＡ領域の間をつなぐレポーターリンカーを含む
レポーターパーツを有し、
前記ＤＮＡ領域と前記ＰＮＡ領域が相補的に結合した際に、前記消光基と前記発光基が同じ側に配置される二本鎖ＰＮＡプローブであって、
前記レポーターリンカーは、主鎖中に酸素を２元素以上含有しておらず、直鎖炭素結合換算で、前記レポーターリンカーより短いことを特徴とする。

【発明の効果】

【0019】

本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブは、発光基とＰＮＡを繋ぐリンカーの部分の構造を消光基とＤＮＡを繋ぐリンカーの部分の構造と異なる構造を選択し、直鎖炭素結合換算で、短くすることとしたので、二つのリンカーの長さをそろえた場合よりも、蛍光強度（発光・消光間の輝度差）が高まった。

【0020】

また、このリンカーを用いた二本鎖ＰＮＡプローブに、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のＴ７９０ＭまたはＬ８５８Ｒの遺伝子変異を検出させたところ、従来より高い感度で検出することができた。すなわち、本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブは、標的となるｍＲＮＡの一塩基多型を検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブの構造を示す模式図である。

【図2】本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブの発光基と消光基の近傍の構造を表す図である。

【図3】直鎖炭素結合換算を例示する図である。

【図4】本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブでＴ７９０Ｍを検出した結果を示す図である。

【図5】本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブでＬ８５８Ｒを検出した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下に本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブについて図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

【0023】

図１に本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブの構成および原理について説明する。本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブ１は、レポーターパーツ１０と、クエンチャーパーツ２０で構成される。レポーターパーツ１０は発光基１２と、レポーターリンカー１４と、ＰＮＡ領域１６と、末端部１８で構成されている（図１（ａ）参照。）。なお、ここでは、レポーターリンカー１４は、ＰＮＡ領域１６のＮ末端側に結合するとして説明する。しかし、Ｃ末端側に結合することにしてもよい。

【0024】

クエンチャーパーツ２０は、消光基２２と、クエンチャーリンカー２４と、ＤＮＡ領域２６で構成されている。なお、クエンチャーパーツ２０にも末端部が接合されていてもよい。なお、ここでは、クエンチャーリンカー２４はＤＮＡ領域２６の３’末端側に結合するとして説明する。しかし、５’末端側に結合することにしてもよい。

【0025】

ＰＮＡ領域１６は、ヌクレオシド同士がペプチド結合した所謂核酸ペプチド構造でできた領域である。ＰＮＡ領域１６は、標的ＤＮＡ５２の塩基配列とハイブリダイズするように設計される。

【0026】

一方ＤＮＡ領域２６は、ポリヌクレオチド構造でできた領域である。ＤＮＡ領域２６は、ＰＮＡ領域１６とハイブリダイズするように設計される。

【0027】

発光基１２は蛍光発光する物質で、Ｆａｍ（６‐ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）が好適に利用できる。しかし、発光基１２には、その他の公知のものも使用することができる。例えば、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５、ＣＹ３等である。

【0028】

消光基２２は発光基１２の発光を消光する作用を有する物質で、ＤＡＢＣＹＬが好適に利用できる。しかし、消光基２２もその他の公知のものを使用することができる。例えば、ＴＡＭＲＡ（６‐ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２等である。

【0029】

ＰＮＡ領域１６と発光基１２を繋ぐのがレポーターリンカー１４である。また、ＤＮＡ領域２６と消光基２２を繋ぐのがクエンチャーリンカー２４である。

【0030】

末端部１８は発光基１２とＰＮＡ領域１６を挟んで反対側の末端に結合されるもので、二本鎖ＰＮＡプローブ１になんらかの機能を付与するために結合される部分である。ここで付与される機能とは、溶解性を向上させたり、標的ＤＮＡとのハイブリダイズが行われやすくするためのものであってもよい。また、標的ＤＮＡとのハイブリダイズ以外に、例えば、二本鎖ＰＮＡプローブ１が細胞内に取り込まれやすくする機能であってもよい。

【0031】

また、すでに説明したように、末端部１８はクエンチャーパーツ２０において消光基２２とＤＮＡ領域２６を挟んで反対側の末端に結合されていてもよい。また、レポーターパーツ１０とクエンチャーパーツ２０の末端部１８は、全く同じ構造であってもよいし、異なる構造にしてもよい。

【0032】

レポーターパーツ１０とクエンチャーパーツ２０は別々に合成され、混合される。混合されるとＰＮＡ領域１６とＤＮＡ領域２６は、予め設計されている構造に従ってハイブリダイズする（図１（ｂ）参照。）。このとき、発光基１２と消光基２２は接近し、消光される。少なくとも、二本鎖ＰＮＡプローブ１は使用される前にはこのように、レポーターパーツ１０とクエンチャーパーツ２０がハイブリダイズされ、消光した状態にされる。

【0033】

なお、ここでは、発光基１２はＰＮＡ領域１６のＮ末端側に、消光基２２はＤＮＡ領域２６の３’末端側に配置するように示したが、発光基１２をＰＮＡ領域１６のＣ末端側に、消光基２２をＤＮＡ領域２６の５’末端側に配置するようにしてもよい。また、ＰＮＡ領域１６とＤＮＡ領域２６がハイブリダイズした時に消光基２２と発光基１２が同じ側にある状態を、「消光基２２と発光基１２は同じ側に配置される」と言ってよい。

【0034】

次に標的塩基配列５２を含む被検査塩基配列５０に二本鎖ＰＮＡプローブ１が投入されると、二本鎖ＰＮＡプローブ１が分離し、レポーターパーツ１０のＰＮＡ領域１６が標的塩基配列５２とハイブリダイズする。この際、クエンチャーパーツ２０がレポーターパーツ１０と離れることで、発光基１２が発光する（図１（ｃ）参照。）。

【0035】

さて、二本鎖ＰＮＡプローブ１が、標的塩基配列５２を検出した際の蛍光強度を高くするには、レポーターパーツ１０とクエンチャーパーツ２０がハイブリダイズした際の蛍光発光（消光時の発光量）を低く抑えることが重要となる。消光における消光のメカニズムを考えると、通常、発光基１２と消光基２２をできるだけ接近させればよいと考えられている。

【0036】

発光基１２と消光基２２をできるだけ接近させるには、レポーターリンカー１４と、クエンチャーリンカー２４は同じものを使用するのがよいと考えられる。しかし、後述する実施例が示すように、実際はレポーターリンカー１４とクエンチャーリンカー２４を意図的に構造が異なる（長さの違う）ものを用いた方が消光時の発光量が低下し、標的塩基配列５２を検出した際の蛍光強度（消光時と発光時の差）は高くなった。

【0037】

図２は、実施例で用いた二本鎖ＰＮＡプローブ１のリンカー近傍を示す構造図である。レポーターパーツ１０では、発光基１２はＦａｍである。レポーターパーツ１０のＰＮＡ領域１６は、ペプチド結合が連なり、各ペプチド部分に塩基が結合している。レポーターリンカー１４は、Ｆａｍのアミノ基とＰＮＡ領域１６のＣ末端のカルボキシル基を繋ぐ。ここでは、炭素７つの直鎖構造体である。

【0038】

クエンチャーパーツ２０では、消光基２２はＤＡＢＣＹＬである。クエンチャーパーツ２０のＤＮＡ領域２６は、ヌクレオシド同士がリン酸で結合されている。クエンチャーパーツ２０のクエンチャーリンカー２４は、ＤＡＢＣＹＬのアミノ基とＤＮＡ領域２６の３’末端直前の塩基（図２では、５－メチルシトシン）のアミノ基に結合している。ここでは、ジエチレングリコールジプロピルエーテルの基本骨格の構造体である。

【0039】

なお、本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブ１では、クエンチャーパーツ２０の消光基２２が結合する側のＤＮＡ領域２６の最後の塩基に対応する核酸ペプチドはない。この意味で、ＤＮＡ領域２６は、レポーターパーツ１０と結合しない未使用の塩基があってもよい。ＤＮＡ領域２６とＰＮＡ領域１６は互いにハイブリダイズするように設計される。ここでは、レポーターパーツ１０とクエンチャーパーツ２０の連結部３０が、Ｔ－ＡとＣ－Ｇで構成されていることが示されている。

【0040】

次に本発明においてリンカー部分を評価する際に用いる「直鎖炭素結合換算値」という指標について説明する。直鎖炭素結合換算値とは、リンカーの構造で発光基１２（若しくは消光基２２）からＰＮＡ領域１６（若しくはＤＮＡ領域２６）までの間を直鎖炭素結合と見なして連結元素の数を数えた数とする。直鎖炭素結合換算値は符号「ｅｇＣ」で表す。

【0041】

例えば、図２ではレポーターリンカー１４は、炭素７の直鎖構造であるので、「ｅｇＣ７」若しくは「直鎖炭素結合換算値で７」と表記する。またクエンチャーリンカー２４は、直鎖炭素結合と、エーテル結合が３か所あるが、酸素の部分は炭素で置き換える。したがって、クエンチャーリンカー２４の直鎖炭素結合換算値は、１３（ｅｇＣ１３）である。

【0042】

なお、レポーターリンカー１４には、主鎖に酸素は２元素以上含まれない。また、リンカーの途中にベンゼン環があった場合は、連結端同士を最短に結ぶ元素を炭素に置き換えて直鎖炭素結合換算する。

【0043】

図３を参照する。例えば、リンカーが１，２－ジエチルベンゼン（図３（ａ））の場合は、エチル基同士を最短でつなぐのは（－Ｃ＝Ｃ－）であるので、直鎖炭素結合換算値は６（ｅｇＣ６）である。１，４－ジエチルベンゼン（図３（ｂ））であれば、エチル基同士をつなぐのは（－Ｃ＝Ｃ－Ｃ－）となるので、直鎖炭素結合換算値は８（ｅｇＣ８）である。）また、リンカーの途中に側鎖がある場合、側鎖は数えない。

【0044】

本発明の二本鎖ＰＮＡプローブ１においては、レポーターリンカー１４が、クエンチャーリンカー２４より直鎖炭素結合換算値で９０％以下１０％以上である。すなわち、レポーターリンカー１４の直鎖炭素結合換算値をクエンチャーリンカー２４の直鎖炭素結合換算値で除した場合、０．１以上０．９以下の値となる。また、２つの直鎖炭素結合換算値を比較した時には、小さい方を「直鎖炭素結合換算で短い」ということができる。

【実施例0045】

以下に本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブ１の効果を確認する実施例を示す。実施例は標的ＤＮＡを決め、その標的ＤＮＡを検出する二本鎖ＰＮＡプローブ１を製作し、その二本鎖ＰＮＡプローブ１で同じ濃度の標的ＤＮＡを検出した際の蛍光強度を測定することで行った。

【0046】

＜標的塩基配列＞
標的塩基配列としては、肺がん細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のｍＲＮＡ配列に特有な遺伝子変異のうち、Ｔ７９０ＭおよびＬ８５８Ｒの２種類とした。それぞれの標的塩基配列を表１に示す。各標的は野生種と変異種を作製した。なお、標的遺伝子は図１の符号５２の標的ＤＮＡに相当するものである。

【0047】

【表1】

【0048】

＜二本鎖ＰＮＡプローブ＞
二本鎖ＰＮＡプローブはレポーターパーツとクエンチャーパーツの２種の配列で構成される。なお、発光基および消光基が結合している方を「先頭」と呼ぶ。

【0049】

（１）レポーターパーツ
レポーターパーツの発光基１２としては、蛍光色素Ｆａｍを用いた。レポーターリンカー１４としてＳｐ２、Ｃ７、ｂＡｌａ、Ｃ１１およびＡｍｂｚの５種類を用意した。それぞれの組成式および直鎖炭素結合換算値（ｅｇＣ）を表２に示す。構造中に酸素を２つ以上有するものは「（２Ｏ）」を付加した。レポーターリンカーは表２中の括弧内の構造である。「Ｎ」は、発光基の末端（レポーターパーツの先頭）であり、「ＣＯ」はＰＮＡ領域の先頭（レポーターパーツの末尾）を示す。なお、後述する末端部に使われるＳｐ６の構造も示す。末端部１８に使用される構造には酸素が２つ以上含まれていてもよい。

【0050】

Ｓｐ６の場合は「Ｎ」はＳｐ６の先頭であり、「ＣＯ」はＳｐ６の末尾である。Ｓｐ６の末尾にはアミノ基が結合する。なお、Ｓｐ２は、非特許文献１で示された従来例のレポーターリンカーである。

【0051】

【表2】

【0052】

標的塩基配列（変異種）を検出するためのＰＮＡ領域はそれぞれ非特許文献２に記載されたものを用いた。このＰＮＡ領域は、野生種にはほとんど反応（ハイブリダイズ）せず、変異種にはよく反応する。表３と表４に、標的塩基配列毎のレポーターパーツの構成を示す。なお、「ＰＮＡ」の後ろの括弧内は核酸ペプチド（ＰＮＡ領域）であり、右から左に向けてＮ末端からＣ末端を表す。これらは、リン酸結合で構成されるポリペプチドではない。

【0053】

【表3】

【0054】

表３を参照して、「Ｆａｍ」は発光基１２であり、「Ｓｐ２、Ｃ７、ｂＡｌａ、Ｃ１１、Ａｍｂｚ」はレポーターリンカーであり、「ＰＮＡ（ＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧ）」は、Ｔ７９０Ｍ用のＰＮＡ領域であり、「ＫＫ－Ｓｐ６－ＮＨ２」は末端部１８である。

【0055】

【表4】

【0056】

表４を参照して、「Ｆａｍ」は発光基１２であり、「Ｓｐ２、Ｃ７、ｂＡｌａ、Ｃ１１、Ａｍｂｚ」はレポーターリンカーであり、「ＰＮＡ（ＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣ）」は、Ｌ８５８Ｒ用のＰＮＡ領域であり、「ＫＫ－Ｓｐ６－ＮＨ２」は末端部１８である。

【0057】

表３および表４より、標的ＤＮＡの先頭２文字の後に、レポーターリンカーの先頭２文字若しくは３文字をつけたものを配列の名称とした。全ての配列は、発光基（Ｆａｍ）に続いてレポーターリンカーが結合され、そのあとに、検出用のＰＮＡ領域が形成される。その後に、末端部として連続するリシン（Ｋ）とＳｐ６（表２参照）とアミノ基が結合されるようにした。表３および表４については左側が先頭となる。

【0058】

（２）クエンチャーパーツ
クエンチャーパーツは、消光基とクエンチャーリンカーとＤＮＡ領域で構成される。消光基はＤＡＢＣＹＬを用いた。またクエンチャーリンカー２４は図２で示したクエンチャーリンカー２４のものを用いた。この直鎖炭素結合換算値（ｅｇＣ）は１３である。クエンチャーパーツのＤＮＡ領域は、レポーターパーツのＰＮＡ領域に対応したものが利用される。したがって、レポーターパーツ毎に設計した。標的塩基配列毎のクエンチャーパーツの配列を表５に示す。消光基およびクエンチャーリンカーはＤＮＡ領域の３’末端に結合される。したがって、表５は、右側が先頭となる。

【0059】

【表5】

【0060】

表５を参照して、「ＤＡＢ」は消光基２２であり、「Ｌｉｎｋｅｒ」はクエンチャーリンカー２２である。ここでは、図２の符号２２の構造体である。「ＴＣＡＴＧＣＡＧ」は、Ｔ７９０Ｍ用のＤＮＡ領域であり、「ＧＣＧＧＧＣＣＡ」はＬ８５８Ｒ用のＤＮＡ領域である。クエンチャーパーツには末端部は付加しなかった。

【0061】

表５を参照して、クエンチャーパーツは、頭文字「Ｑ」の次に標的遺伝子の頭文字を続けて名称とした。

【0062】

＜検出手順＞
（１）二本鎖ＰＮＡプローブ溶液の作製
表３および表４のレポーターパーツと、表５のクエンチャーパーツを、表６の組成で混合し二本鎖ＰＮＡプローブ溶液を作製した。あらわに示すと、レポーターパーツＴ７Ｓｐ、Ｔ７Ｃ７、Ｔ７ｂＡｌ、Ｔ７Ｃ１１、Ｔ７ＡｍはクエンチャーパーツＱＴとそれぞれ混合し、レポーターパーツＬ８Ｓｐ、Ｌ８Ｃ７、Ｌ８ｂＡｌ、Ｌ８Ｃ１１、Ｌ８ＡｍにはクエンチャーパーツＱＬとそれぞれ混合した。

【0063】

【表6】

【0064】

具体的な手順としては、レポーターパーツとクエンチャーパーツを１：１の割合でＰＢＳバッファーにて融解した。次に、非特異的な結合を防ぐために９５℃で５ｍｉｎインキュベートした後、グラジエント－０．３℃／ｓｅｃで３０℃になるまで徐々に温度を低下した。

【0065】

（２）標的塩基配列との反応
作製した二本鎖ＰＮＡプローブ溶液（５μＭ）１０μＬと、表１の標的遺伝子配列（今回の場合はｍＲＮＡ）（５μＭ）１０μＬと、ＰＢＳ８０μＬを混合し（全量１００μＬ）、３７℃で２ｈインキュベートした後、蛍光スペクトロメーターで蛍光を測定した。

【0066】

（３）蛍光スペクトル測定
二本鎖ＰＮＡプローブと標的遺伝子配列との反応後、直ちに石英セルに全量を移し、分光蛍光光度計Ｆ－７０００（株式会社日立ハイテクサイエンス）を使用して蛍光スペクトル測定した。なお、測定機器と測定条件は以下の通りとした。

【0067】

【表7】

【0068】

（４）測定結果
図４および図５に測定結果を示す。図４は、被検査塩基配列（標的遺伝子配列）がＴ７９０Ｍであり、図５は被検査塩基配列（標的遺伝子配列）がＬ８５８Ｒである。いずれのグラフも横軸は標的塩基配列の種類とレポーターリンカーの種類を示し、縦軸は蛍光強度である。蛍光強度は「標的無」の発光量を１とし、標的ＤＮＡとハイブリダイズした時の発光量の比をとったものである。なお、コントロールはＳｐ２である。

【0069】

図４および図５を参照し、標的塩基配列は、「標的無」、「野生種」、「変異種」の３種がある。「標的無」は標的となるｍＲＮＡを入れなかった場合であり、標的ＲＮＡ（５μＭ）１０μＬを二本鎖ＰＮＡプローブ溶液と混合する代わりに、ＰＢＳを１０μＬを入れたものである。「野生種」および「変異種」は表１に示したものである。

【0070】

図４を参照する。被検査塩基配列がＴ７９０Ｍに対しては、表３のレポーターパーツとクエンチャーパーツＱＴ（表５参照）を用いた二本鎖ＰＮＡプローブが用いられた。レポーターリンカーがＣ７、ｂＡｌａ、Ｃ１１、Ａｍｂｚにおいて、蛍光強度は、変異種に対して非常に高くなった。これより、変異種の検出感度が非常に高いことがわかる。また、従来例（コントロール）であるＳｐ２と比較して発光・消光間の輝度差は桁違いに高くなった。

【0071】

この場合、直鎖炭素結合換算値はＳｐ２では７であり、Ｃ７やＣ１１と大きくは変わらない。しかし、レポーターリンカーのＳｐ２は、蛍光強度が他のリンカーよりも明らかに小さかった。これは、レポーターリンカーがＳｐ２の場合、消光時に十分発光が抑えられていなかったからである。これは、レポーターリンカーのＳｐ２には、主鎖に酸素が２つ入っていたためと考えられる。

【0072】

一方、直鎖炭素結合換算値が５であるＡｍｂｚも非常に高い蛍光強度を示した。これは一見発光基と消光基をより近づけることが十分な消光に寄与するという従来の知見に反する。

【0073】

図５を参照する。被検査塩基配列がＬ８５８Ｒに対しては、表４のレポーターパーツとクエンチャーパーツＱＬ（表５参照）を用いた二本鎖ＰＮＡプローブが用いられた。蛍光強度は、変異種に対して高くなり、変異種の検出感度が高いことがわかる。また、従来例（コントロール）であるＳｐ２と比較して発光・消光間の輝度差は桁違いに高くなった。

【0074】

ここでも、直鎖炭素結合換算値ｅｇＣが２から１１で高い蛍光強度を示した。また、Ｌ８５８Ｒの場合は、クエンチャーリンカー（ｅｇＣ＝１３）により近くなるＣ１１より、ｅｇＣ７やｅｇＣ２、５の方が蛍光強度は高かった。

【0075】

以上のように、二本鎖ＰＮＡプローブの場合は、レポーターリンカーとクエンチャーリンカーの構造を意図的に異ならせることで、標的ＤＮＡとハイブリダイズする際に蛍光強度が高くなることが分かった。

【0076】

また、本発明に係るＴ７９０ＭとＬ８５８Ｒに対する二本鎖ＰＮＡプローブは、レポーターリンカーの種類を従来用いていたＳｐ２から変更することで、標的塩基配列と反応した時の蛍光強度を消光時の強度より高めることができ、検出感度を向上させることができる。これは、一塩基多型の検出において、従来よりも高い感度で検出することができることを示している。

【産業上の利用可能性】

【0077】

本発明に係る二本鎖ＰＮＡプローブは、標的塩基配列の検出をする際に高い検出力を得ることができる。特に肺がん細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のｍＲＮＡ配列に特有な遺伝子変異（Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒの変異）の一塩基多型を検出する際には非常に有効である。

【符号の説明】

【0078】

１ 二本鎖ＰＮＡプローブ
１０ レポーターパーツ
１２ 発光基
１４ レポーターリンカー
１６ ＰＮＡ領域
１８ 末端部
２０ クエンチャーパーツ
２２ 消光基
２４ クエンチャーリンカー
２６ ＤＮＡ領域
５０ 被検査塩基配列
５２ 標的塩基配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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