特開 2023-32077 ペルオキシレドキシンに基づく人工ヘテロオリゴマータンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023032077

(43)【公開日】2023-03-09

(54)【発明の名称】ペルオキシレドキシンに基づく人工ヘテロオリゴマータンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20230302BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230302BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20230302BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20230302BHJP

【ＦＩ】

C07K14/195

C07K19/00

C12N15/10 200Z

C12N15/31 ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021137971

(22)【出願日】2021-08-26

【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】氷見山 幹基

(72)【発明者】

【氏名】中村 努

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA05

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA11

4H045EA50

4H045FA52

4H045FA74

4H045GA22

(57)【要約】

【課題】 複数の機能性分子を空間的に集積させるための足場として利用できる人工タンパク質を提供する。
【解決手段】 Ｐｒｘ由来の変異二量体を含んでなる人工ヘテロオリゴマータンパク質であって、第１の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘに基づく番号付けで４２位のＰｈｅ、７６位のＰｈｅおよび２０８位のＴｒｐのいずれか１つが親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体であり、第２の変異二量体が、前記３アミノ酸のうち、前記第１の変異二量体において置換されたアミノ酸とは異なるいずれか１つのアミノ酸が親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体である、人工ヘテロオリゴマータンパク質。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペルオキシレドキシン由来の第１の変異二量体および第２の変異二量体を含んでなる人工ヘテロオリゴマータンパク質であって、
前記第１の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン、７６位のフェニルアラニンおよび２０８位のトリプトファンのいずれか１つが親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体であり、
前記第２の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン、７６位のフェニルアラニンおよび２０８位のトリプトファンのうち、前記第１の変異二量体において置換されたアミノ酸とは異なるいずれか１つのアミノ酸が親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体である、
人工ヘテロオリゴマータンパク質。

【請求項2】

前記親水性アミノ酸がシステインである、請求項１に記載の人工ヘテロオリゴマータンパク質。

【請求項3】

前記第１の変異二量体および前記第２の変異二量体において、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４６位、２０５位および２１１位のシステインの少なくとも１つがセリンにより置換されている、請求項１または２に記載の人工ヘテロオリゴマータンパク質。

【請求項4】

前記疎水性修飾がフェニル基またはナフチル基による修飾である、請求項１～３のいずれか１項に記載の人工ヘテロオリゴマータンパク質。

【請求項5】

前記ペルオキシレドキシンが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の人工ヘテロオリゴマータンパク質。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の人工ヘテロオリゴマータンパク質により第１の機能性分子および第２の機能性分子の相互作用を促進する方法であって、
前記第１の変異二量体に結合された第１の機能性分子を提供するステップと、
前記第２の変異二量体に結合された第２の機能性分子を提供するステップと
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペルオキシレドキシンに基づく人工ヘテロオリゴマータンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

多くのタンパク質は、タンパク質間相互作用によって超分子的に集積し、チューブ、リング、球体など、様々な四次構造を形成する。この集合を改変することができれば、タンパク質集合体のレパートリーを拡張し、新たな機能性タンパク質を創出できる可能性がある。しかし、アミノ酸変異を導入する従来一般的なタンパク質の改変方法では、タンパク質の四次構造を自在に改変することは困難である。

【0003】

複数のタンパク質を相互作用させるための従来方法としては、例えば、タンパク質架橋による非特異的な結合を行う方法や、レクチンやストレプトアビジンのような分子認識可能なオリゴマータンパク質によって集積する方法が用いられてきた（非特許文献１、２）。しかし、これらの方法によれば、複数のタンパク質を集合させることはできても、その順番や配置を自在に制御することはできず、人工タンパク質の創出には依然として困難が存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Y. Zhang, Y. Yong, J. Ge, Z. Liu, ACS Catal., 2016, 6, 6, 3789-3795.

【非特許文献2】Y. Mori, K. Minamihata, H. Abe, M. Goto, N. Kamiya, Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 5641-5644.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、複数の機能性分子を空間的に集積させるための足場として利用できる人工タンパク質、およびそれを用いて複数の機能性分子を空間的に集積させる方法を提供することを目的としてなされたものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、二量体が複数集積して環状四次構造をとることが知られるペルオキシレドキシンに対してアミノ酸変異を導入し、環状四次構造を二量体に解離させることに成功している（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２９，１１３８－１１４７（２０２０））。本発明者らは、鋭意研究の結果、さらなる改変を加えることにより、同一種類の二量体同士では環状四次構造を構成できず、異なる種類の二量体同士でのみ環状四次構造を構成できる人工タンパク質を得ることに成功した。

【0007】

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、ペルオキシレドキシン由来の第１の変異二量体および第２の変異二量体を含んでなる人工ヘテロオリゴマータンパク質であって、前記第１の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン、７６位のフェニルアラニンおよび２０８位のトリプトファンのいずれか１つが親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体であり、前記第２の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン、７６位のフェニルアラニンおよび２０８位のトリプトファンのうち、前記第１の変異二量体において置換されたアミノ酸とは異なるいずれか１つのアミノ酸が親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体である、人工ヘテロオリゴマータンパク質を提供するものである。

【0008】

前記親水性アミノ酸は、システインであることが好ましい。

【0009】

前記第１の変異二量体および前記第２の変異二量体において、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４６位、２０５位および２１１位のシステインの少なくとも１つがセリンにより置換されていることが好ましい。

【0010】

前記疎水性修飾は、フェニル基またはナフチル基による修飾であることが好ましい。

【0011】

前記ペルオキシレドキシンは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のものであることが好ましい。

【0012】

また、本発明は、一実施形態によれば、上記の人工ヘテロオリゴマータンパク質により第１の機能性分子および第２の機能性分子の相互作用を促進する方法であって、前記第１の変異二量体に結合された第１の機能性分子を提供するステップと、前記第２の変異二量体に結合された第２の機能性分子を提供するステップとを含む、方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0013】

本発明に係る人工ヘテロオリゴマータンパク質は、異なる種類の変異二量体同士のみが隣接して会合でき、環状四次構造を構成できる。そのため、異なる変異二量体のそれぞれに機能性分子を結合させることにより、それらを空間的に集積させて相互作用させるための足場として有用である。また、本発明に係る人工ヘテロオリゴマータンパク質を用いた方法によれば、天然にはない機能性分子の相互作用を人為的に作り出すことができるため、新規な機能を有する人工タンパク質の作出が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ由来Ｐｒｘの環状四次構造および二量体界面の拡大図を示す図である。

【図2】図２は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘの環状四次構造および二量体界面の拡大図を示す図である。

【図3】図３は、Ｐｒｘ変異二量体を用いた人工ヘテロオリゴマータンパク質の調製手順の概略図である。

【図4】図４は、野生型ＴｋＰｒｘ、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ変異体、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ変異体が構成する四次構造をゲルろ過クロマトグラフィーにより評価した結果を示す図である。

【図5】図５は、野生型ＴｋＰｒｘ、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ変異体、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ変異体が構成する四次構造をゲルろ過クロマトグラフィーにより評価した結果を示す図である。

【図6】図６は、野生型ＴｋＰｒｘ、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ変異体、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ変異体が構成する四次構造をゲルろ過クロマトグラフィーにより評価した結果を示す図である。

【図7】図７は、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ変異体およびＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ変異体、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ変異体およびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ変異体が構成する四次構造をゲルろ過クロマトグラフィーにより評価した結果を示す図である。

【図8】図８は、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ変異体およびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ変異体を異なる比率で混合した場合に構成される十二量体をゲルろ過クロマトグラフィーにより評価し、そのピークの高さを比較した結果を示す図である。

【図9】図９は、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃの立体構造をＸ線結晶構造解析の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

【0016】

本発明は、第一の実施形態によれば、ペルオキシレドキシン由来の第１の変異二量体および第２の変異二量体を含んでなる人工ヘテロオリゴマータンパク質であって、前記第１の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン、７６位のフェニルアラニンおよび２０８位のトリプトファンのいずれか１つが親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体であり、前記第２の変異二量体が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン、７６位のフェニルアラニンおよび２０８位のトリプトファンのうち、前記第１の変異二量体において置換されたアミノ酸とは異なるいずれか１つのアミノ酸が親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体である、人工ヘテロオリゴマータンパク質である。

【0017】

本実施形態の「人工ヘテロオリゴマータンパク質」は、ペルオキシレドキシンを改変したタンパク質であって、天然には存在しないタンパク質である。

【0018】

「ペルオキシレドキシン」（以下、「Ｐｒｘ」とも記載する）は、細菌、古細菌、真菌、昆虫、植物、動物など、あらゆる生物種に広く存在するチオールペルオキシダーゼであり、５つまたは６つのホモ二量体が集合して環状構造を形成する。本実施形態におけるＰｒｘは、任意の生物種由来のものであってよいが、好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓとも表記される）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉなどの超好熱性古細菌由来であり、特に好ましくはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来である。

【0019】

本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質は、Ｐｒｘに由来する２種類の変異二量体を含むが、２種類の変異二量体は、両者が集合して環状構造を形成できる限り、同じ生物種由来のものであってもよいし、異なる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは同じ生物種由来である。なお、天然のＰｒｘは、過酸化水素などの活性酸素種を還元する抗酸化酵素活性を有するが、本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質は、当該酵素活性を有しても有しなくてもよく、好ましくは当該酵素活性を有しない。

【0020】

本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質における第１の変異二量体は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘ単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、７６位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）および２０８位のトリプトファン（Ｔｒｐ）のいずれか１つが親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体である。また、本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質における第２の変異二量体は、上記３つのアミノ酸であって、第１の変異二量体において置換されたアミノ酸とは異なるいずれか１つのアミノ酸が親水性アミノ酸により置換され、かつ当該親水性アミノ酸に疎水性修飾が導入された単量体のホモ二量体である。

【0021】

Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列を以下に示す。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のＰｈｅ、７６位のＰｈｅおよび２０８位のＴｒｐに対応するアミノ酸を太字で示す。

【0022】

Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘ単量体のアミノ酸配列（配列番号１）

【化1】

【0023】

Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ由来Ｐｒｘ単量体のアミノ酸配列（配列番号２）

【化2】

【0024】

Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来Ｐｒｘ単量体のアミノ酸配列（配列番号３）

【化3】

【0025】

また、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ由来Ｐｒｘ（ＡｐＰｒｘ）の環状四次構造および二量体界面の拡大図を図１に、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘ（ＴｋＰｒｘ）の環状四次構造および二量体界面の拡大図を図２に示す。ＴｋＰｒｘにおける４２位のＰｈｅ、７６位のＰｈｅおよび２０８位のＴｒｐに対応するアミノ酸は、ＡｐＰｒｘにおいてはそれぞれＦ４６、Ｆ８０およびＷ２１０であり、これらのアミノ酸がＡｐＰｒｘの環状四次構造の形成に関与するものであることがすでに明らかにされている（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２９，１１３８－１１４７（２０２０））。

【0026】

Ｐｒｘのアミノ酸配列ならびにそれらをコードする核酸配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ＰｒｘであればＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ５ＪＦ３０、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来ＰｒｘであればＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ５８９６６、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ由来ＰｒｘであればＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ９Ｌ０が利用可能である。

【0027】

また、本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質における第１および第２の変異二量体には、両者が集合してヘテロオリゴマータンパク質を形成できることを限度として、データベースに登録されているＰｒｘのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。

【0028】

本実施形態における第１および第２の変異二量体において、上記特定の位置のフェニルアラニンおよびトリプトファンのうち、いずれか１つのアミノ酸が親水性アミノ酸により置換される。本実施形態において「親水性アミノ酸」とは、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）およびアルギニン（Ａｒｇ）をいう。本実施形態における第１および第２の変異二量体において、上記特定の位置のフェニルアラニンまたはトリプトファンは、いずれの親水性アミノ酸により置換されてよく、また、第１および第２の変異二量体において同じ親水性アミノ酸を用いても置換してもよいし、異なる親水性アミノ酸を用いて置換してもよいが、好ましくはＣｙｓを用いて置換することができる。

【0029】

一方、天然のＰｒｘにもともと含まれるＣｙｓ、すなわち、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘ単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４６位、２０５位および２１１位のＣｙｓは、その少なくとも１つがＳｅｒにより置換されていることが好ましく、上記３つすべてのＣｙｓがＳｅｒにより置換されていることがより好ましい。

【0030】

本実施形態における第１および第２の変異二量体において、親水性アミノ酸に置換されるアミノ酸位置の組み合わせは任意であってよく、例えば、第１の変異二量体では４２位のＰｈｅ、第２の変異二量体では７６位のＰｈｅに対応する位置が置換されてよく；第１の変異二量体では４２位のＰｈｅ、第２の変異二量体では２０８位のＴｒｐに対応する位置が置換されてよく；第１の変異二量体では７６位のＰｈｅ、第２の変異二量体では２０８位のＴｒｐに対応する位置が置換されてよい。

【0031】

本実施形態における第１および第２の変異二量体において、上記置換された親水性アミノ酸に対しては、疎水性修飾が導入される。本実施形態における「疎水性修飾」には、任意の置換または非置換のＣ_５－２０アリール基を用いることができ、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントリル基、ピレニル基などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本実施形態における「疎水性修飾」には、フェニル基またはナフチル基を用いることができる。

【0032】

本実施形態における第１および第２の変異二量体は、従来公知の任意の遺伝子工学的方法により調製することができ、具体的には、例えば、上記にしたがって設計されたアミノ酸配列をコードする核酸を作製し、大腸菌などの宿主細胞に導入して発現させればよい。また、親水性アミノ酸への疎水性修飾の導入も、当分野において確立された任意のアミノ酸修飾方法により行うことができ、例えば、Ｃｙｓであればチオール基、Ｌｙｓであればアミノ基に対して、求核－求電子反応により修飾を導入することができる。

【0033】

本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質の概略図を図３に示す。天然のＰｒｘは、複数のホモ２量体から構成されるホモオリゴマー（図３においては、６つのホモ二量体から構成されるホモ十二量体）である。ここで、二量体同士の相互作用に関与する疎水性アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｐｒｘ単量体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づく番号付けで４２位のＰｈｅ、７６位のＰｈｅおよび２０８位のＴｒｐに対応するアミノ酸）を親水性アミノ酸により置換すると、二量体同士が解離する。しかし、この親水性アミノ酸に対して疎水性修飾を導入すると、再び二量体同士が集合できるようになる。したがって、この際、相互に異なる位置の疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸により置換し疎水性修飾を導入した第１および第２の変異二量体を調製することにより、第１の変異二量体同士または第２の変異二量体同士は集合せず、第１の変異二量体と第２の変異二量体とが交互に集積可能な人工ヘテロオリゴマータンパク質を構成させることが可能となる。

【0034】

本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質は、２種類の異なる変異二量体が交互に隣接するように集合して構成される。そのため、本実施形態の人工ヘテロオリゴマータンパク質は、複数の機能性分子を空間的に集積させるための足場として有用である。例えば、異なる変異二量体のそれぞれに対して異なる機能性分子を結合させることにより、機能性分子同士を空間的に近接させ、その結果、その機能を増強させたり、新たな機能を発揮させたりすることが可能となる。

【0035】

すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、上記人工ヘテロオリゴマータンパク質により第１の機能性分子および第２の機能性分子の相互作用を促進する方法であって、前記第１の変異二量体に結合された第１の機能性分子を提供するステップと、前記第２の変異二量体に結合された第２の機能性分子を提供するステップとを含む方法である。

【0036】

本実施形態における「人工ヘテロオリゴマータンパク質」、「第１の変異二量体」、「第２の変異二量体」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。

【0037】

本実施形態の方法では、第１の変異二量体に第１の機能性分子を、第２の変異二量体に第２の機能性分子を結合させたものを準備する。本実施形態において「機能性分子」とは、生理活性を有する任意の分子をいい、例えば、抗体およびその断片、サイトカインなどの生理活性ペプチド、酵素およびそのサブユニット、核酸、脂質、糖鎖、金属錯体、蛍光化合物、放射性標識化合物、低分子化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。また、本実施形態における機能性分子は、公知のものであってもよいし、新規のものであってもよい。

【0038】

機能性分子は、その種類に応じて、従来公知の任意の方法により変異二量体に結合されてよい。例えば、機能性分子がペプチドまたはタンパク質であれば、変異二量体を構成する変異Ｐｒｘ単量体のＮ末端および／またはＣ末端に、任意選択的にリンカーペプチドを介して、連結することができる。好ましくは、変異二量体を構成する変異Ｐｒｘ単量体のＣ末端に連結することにより、変異二量体が構成する環状構造の外側に機能性分子を配置することができる。

【0039】

第１の変異二量体に結合された第１の機能性分子および第２の変異二量体に結合された第２の機能性分子は、その機能性分子にとって適切な条件下で相互作用させればよい。例えば、機能性分子が抗体であれば、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸などのバッファーおよび／またはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２などの塩を含み、ｐＨ６．５～８．５の水性溶媒に、第１の変異二量体に結合された第１の機能性分子および第２の変異二量体に結合された第２の機能性分子を、例えばそれぞれ１ｎＭ～１００μＭの濃度で添加した反応溶液を調製し、適切な温度条件下で一定時間インキュベートすればよい。

【0040】

本実施形態の方法によれば、本来相互作用しないような異なる２種類の機能性分子を空間的に近接させることができる。そのため、天然には存在しない新規な機能を有する人工タンパク質の創製を可能とするものであり、有用である。例えば、ＶＨＨ（シングルドメイン）抗体の抗原結合部位を本実施形態の方法により集積させることにより、抗体様分子を作製することができる。また、例えば、グルコースオキシダーゼと西洋わさびペルオキシダーゼを本実施形態の方法により集積させることにより、グルコースの高感度検出が可能になるものと期待される。

【実施例0041】

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

【0042】

＜１．各変異体の四次構造解析＞
下記に示す溶液（ａ）～（ｇ）を、以下の（１）～（３）に示す方法により調製し、各ＴｋＰｒｘ変異体が構成する四次構造について解析した。
（ａ）野生型ＴｋＰｒｘのみ
（ｂ）ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃのみ
（ｃ）ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃのみ
（ｄ）Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃのみ
（ｅ）Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃのみ
（ｆ）ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ＋ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ
（ｇ）Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ＋Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ

【0043】

［調製および解析方法］
（１）アミノ酸変異の導入
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ペルオキシレドキシン単量体（以下、「ＴｋＰｒｘ」と記載する）において、４２位のフェニルアラニンをシステインに置換した変異体（以下、「Ｆ４２Ｃ」と記載する）、および７６位のフェニルアラニンをシステインに置換した変異体（以下、「Ｆ７６Ｃ」と記載する）の発現ベクターは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、付属のプロトコールに従って調製した。鋳型ＤＮＡには、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡ（理研バイオリソースセンターから入手）を用いた。発現ベクターには、ｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。得られた発現ベクターによりＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、常法に従って変異体タンパク質を発現させ、精製した。

【0044】

また、ＴｋＰｒｘに代えて、ＴｋＰｒｘに存在する３つのシステイン（４６位、２０５位および２１１位）をセリンに置換した変異体（以下、「ＴｋＰｒｘ＊」と記載する）に対してＦ４２ＣまたはＦ７６Ｃのアミノ酸置換を導入した変異体（以下、それぞれ「ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ」、「ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ」と記載する）を、上記と同様の手順により調製した。

【0045】

（２）システインの化学修飾
各変異体を１ｍＭのＤＴＴにより還元し、脱塩カラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア）を用いて過剰量のＤＴＴを除去した後、緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて２０μＭの濃度に調製した。１．０ｇ／Ｌのブロモアセチルナフタレン／ＤＭＳＯ溶液を、変異体に対してモル比で４倍量になるように添加し、２０分間インキュベートした。反応後の溶液を限外ろ過膜ユニット（Ａｍｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ－１５遠心式フィルターユニット（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ）、メルクミリポア）を用いて濃縮し、脱塩カラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア）により過剰量のブロモアセチルナフタレンを除去した。

【0046】

以下、システインがナフチル基により修飾された変異体には「Ｎａｐｈ＠」を付して表記する。すなわち、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃをナフチル基により修飾した変異体を「Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ」、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃをナフチル基により修飾した変異体を「Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ」とそれぞれ記載する。

【0047】

（３）ゲルろ過クロマトグラフィーによる四次構造解析
Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃ、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣおよびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃの混合溶液を、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中で４ｇ／Ｌの濃度で室温で調製した。１分間程度静置した後、各溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／２００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア）に供し、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターした。

【0048】

［結果］
図７に示すように、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣおよびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃの混合溶液（ｇ）は、図４に示す野生型ＴｋＰｒｘ（ａ）の十二量体と同様の単一ピークを示し、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣおよびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃは野生型ＴｋＰｒｘと同様の十二量体を形成するものであることが確認された。

【0049】

一方、（ｂ）ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃおよび（ｃ）ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃはいずれも（ａ）野生型ＴｋＰｒｘとは異なる単一ピークを示し、両者とも二量体であることが確認された（図４）。ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣおよびＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃを混合した場合（ｆ）にも十二量体は形成されなかった（図７）。（ｄ）Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃおよび（ｅ）Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃについては、単一のピークとして検出されず、２個、３個、４個または５個の二量体の会合が確認されたものの、十二量体はほとんど形成されていないことが確認された（図５、図６）。

【0050】

Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣおよびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃについて、両者の混合比率を変更した溶液を調製し、上記（ｇ）で確認された十二量体のピーク（１０．５ｍＬ）における吸光度を比較したグラフを図８に示す。混合比が偏ると十二量体の生成量が減少しており、このことから、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣおよびＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６Ｃは、両者が交互に３：３に会合して環状四次構造をとっていることが理解された。

【0051】

＜２．Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃの立体構造解析＞
以下の手順により、Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃの立体構造をＸ線結晶構造解析により観測した。Ｎａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃ溶液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）およびリザーバー液（０．２Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、ｐＨ４．６、３０％ｗ／ｖ ＰＥＧ４０００）の条件によるハンギングドロップ蒸気拡散法によりＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃを結晶化した。結晶を２０％グリセロール含有リザーバー液によりクライオ処理および凍結し、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８の放射光を用いて回折データを収集し、立体構造を計算した。

【0052】

結果を図９に示す。結晶中でのＮａｐｈ＠ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２Ｃの立体構造は、２つの二量体が連なった形状であった。２つの二量体は疎水性修飾により導入されたナフチル基を介して相互作用しており、野生型ＴｒＰｒｘ二量体同士の相互作用の場合とは異なる角度により会合していることが確認された。

【0053】

＜３．実施例＞
Ｐｒｘ由来の第１の変異二量体および第２の変異二量体により、第１の機能性分子および第２の機能性分子の相互作用を促進する方法について、上記結果に従い、以下にその実施例を示す。

【0054】

（３－１）グルコースオキシダーゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼ
グルコースオキシダーゼを、１～１０アミノ酸からなるペプチドリンカーを介して、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ４２ＣのＣ末端に連結したものを調製する。タンパク質Ｂを、１～１０アミノ酸からなるペプチドリンカーを介して、ＴｋＰｒｘ＊Ｆ７６ＣのＣ末端に連結したものを調製する。両者にナフチル基修飾を導入した後、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で、両者を１：１の比率で混合する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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