特開 2023-35138 標的核酸の検出方法及び検出キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023035138

(43)【公開日】2023-03-13

(54)【発明の名称】標的核酸の検出方法及び検出キット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6816 20180101AFI20230306BHJP

   C12Q 1/28 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230306BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6816 Z ZNA

C12Q1/28

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021141766

(22)【出願日】2021-08-31

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】舟橋 久景

(72)【発明者】

【氏名】黒田 章夫

(72)【発明者】

【氏名】波多野 浩也

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

(57)【要約】

【課題】固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できる方法を提供する。
【解決手段】標的核酸の検出方法であって、ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液を固体表面上の標的核酸を含有する標的部位に噴霧するステップと、ルミノール反応液を標的部位に噴霧するステップと、標的部位においてルミノール発光を検出するステップとを備えている。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的核酸の検出方法であって、
ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液を固体表面上の標的核酸を含有する標的部位に噴霧するステップと、
ルミノール反応液を前記標的部位に噴霧するステップと、
前記標的部位においてルミノール発光を検出するステップとを含み、
前記ＤＮＡナノピンセット構造体は、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドからなり、
前記第１オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の一端側の核酸配列と相補的な配列からなる第１標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第１結合部位とを含み、
前記第２オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の他端側の核酸配列と相補的な配列からなる第２標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第２結合部位とを含み、
前記第３オリゴヌクレオチドは、前記第１結合部位に相補的な配列からなる第３結合部位と、前記第２結合部位に相補的な配列からなる第４結合部位と、前記第３結合部位と前記第４結合部位との間に設けられた屈曲部位と、前記第３結合部位及び前記第４結合部位における前記屈曲部位と反対側にそれぞれ配置された分割グアニン四重鎖部位とを含むことを特徴とする方法。

【請求項2】

前記第１オリゴヌクレオチドは、５’－［第１標的認識部位］－ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号１）－３’の核酸配列を含み、
前記第２オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ（配列番号２）－［第２標的認識部位］－３’の核酸配列を含み、
前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－［第１分割グアニン四重鎖部位］－ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ（配列番号３）－［第２分割グアニン四重鎖部位］－３’の核酸配列を含む請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧ（配列番号６）－３’の核酸配列を含む請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ルミノール発光を検出するステップは、撮像装置により前記標的部位を撮影し、前記ルミノール発光を検出するステップである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記噴霧された前記標的部位における前記ＤＮＡナノピンセット構造体の量は０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２．０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下であり、前記噴霧された前記標的部位における前記ヘミンの量は１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

標的核酸の検出キットであって、
ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液と、
ルミノール反応液とを含み、
前記ＤＮＡナノピンセット構造体は、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドからなり、
前記第１オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の一端側の核酸配列と相補的な配列からなる第１標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第１結合部位とを含み、
前記第２オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の他端側の核酸配列と相補的な配列からなる第２標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第２結合部位とを含み、
前記第３オリゴヌクレオチドは、前記第１結合部位に相補的な配列からなる第３結合部位と、前記第２結合部位に相補的な配列からなる第４結合部位と、前記第３結合部位と前記第４結合部位との間に設けられた屈曲部位と、前記第３結合部位及び前記第４結合部位における前記屈曲部位と反対側にそれぞれ配置された分割グアニン四重鎖部位とを含み、
固体表面上の標的部位における標的核酸を検出することを特徴とするキット。

【請求項7】

前記第１オリゴヌクレオチドは、５’－［第１標的認識部位］－ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号１）－３’の核酸配列を含み、
前記第２オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ（配列番号２）－［第２標的認識部位］－３’の核酸配列を含み、
前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－［第１分割グアニン四重鎖部位］－ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ（配列番号３）－［第２分割グアニン四重鎖部位］－３’の核酸配列を含む請求項６に記載のキット。

【請求項8】

前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧ（配列番号６）－３’の核酸配列を含む請求項７に記載のキット。

【請求項9】

前記ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液を前記標的部位に噴霧したときの、前記標的部位上の前記ＤＮＡナノピンセット構造体の量は０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２．０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下であり、前記標的部位上の前記ヘミンの量は１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下である請求項６～８のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的核酸の検出方法及び検出キットに関し、特に固体表面上の標的核酸の検出方法及び検出キットに関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡ及びＲＮＡなどの標的核酸を特異的に検出する方法は、食品安全性又は環境汚染問題に対する調査目的として使用されるにとどまらず、細菌感染症又は昨今において世界中に感染が拡大しているコロナウイルスを始めとするウイルス感染症を患った患者における診断目的として使用されることもあるため重要な技術とされている。とりわけ、細菌又はウイルスは、皮膚又は被服などの固体表面上に付着することが多いため、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できる方法を開発することができれば、短時間で標的核酸の有無を検査できることから大変有用な技術となり得る。しかしながら、以下で詳述するように、従来においては、固体表面の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出する専用の方法はほとんど開発されてこなかった。また、固体表面上の標的核酸の直接的な検出方法の開発についての思想もほとんど存在していなかった。

【0003】

従来において、固体表面の標的核酸を検出する方法としては、固体表面から標的核酸を含む試料を採取し、採取した試料を水溶液中に溶解させた後にＰＣＲ法などによって標的核酸を増幅させ、核酸クロマト法により標的核酸を検出する方法が一般に行われていた。

【0004】

例えば特許文献１には、標的核酸含有試料中の標的核酸を特異的に検出又は定量するための方法が記載されており、標的核酸含有試料中より任意に抽出された標的核酸を１本鎖核酸として増幅する工程、該増幅産物をクロマトグラフィーにより検出する工程及び該検出像を目視判定により評価する工程を含む核酸の検出又は定量方法が記載されている。また、増幅する工程では、例えばＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が好適であることが記載されている。

【0005】

特許文献１において開示されている標的核酸の検出方法は、標的核酸の検出までの時間が早く、標的核酸を検出キットに滴下してから１０～２０分程度で検出が完了する点で非常に有用である。一方、特許文献１に係る標的核酸の検出方法では、固体表面上に存在する標的核酸を含む試料を水溶液中に採取して溶解させた標的核酸含有試料を一度作製し、抽出などの操作を行う必要がある。特に、特許文献１に係る標的核酸の検出方法では、ＮＡＳＢＡ法により標的核酸を水溶液中で増幅させる工程が必要であり、増幅した標的核酸をクロマトグラフィーにより検出する工程も必要であるため、標的核酸を検出するためには一定のステップ数が必要とされていた。また、上記検出方法を実施するためには、標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドプローブと着色高分子担体で標識した、標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプローブを別途調製してメンブレン上に固定した検出キットを事前に作製する必要があることから事前準備において手間とコストがかかり、まだ改善の余地が残されていた。

【0006】

一方、非特許文献１、２には、ＤＮＡナノピンセット構造体を利用した標的核酸の検出方法が開示されている。非特許文献１において、該ＤＮＡナノピンセット構造体は、標的核酸の３’側の配列に相補的な配列（第１標的認識部位）を含む第１オリゴヌクレオチドと、標的核酸の５’側の配列に相補的な配列（第２標的認識部位）を含む第２オリゴヌクレオチドと、分割グアニン四重鎖部位を含む第３オリゴヌクレオチドとが自己集積してなる構造体である。該構造体は、屈曲部を中央に含む略Ｖ字形状の第３オリゴヌクレオチドに対して、屈曲部を挟んでそれぞれ反対側の領域に第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが結合されており、平常時は上記の通り略Ｖ字状に拡がった構造（オープン状態）となっている。非特許文献１には、このＤＮＡナノピンセット構造体が、第１標的認識部位及び第２標的認識部位の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する標的核酸を認識した場合に、上記オープン状態から略Ｖ字状構造の両端が互いに近接して閉じた状態（クローズド状態）となることが開示されている。また、クローズド状態になることにより、該ＤＮＡナノピンセット構造体における分割グアニン四重鎖部位が近接し、この分割グアニン四重鎖部位にヘミンが結合することでペルオキシダーゼ活性を示すようになること、及びこのペルオキシダーゼ活性を２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いた比色分析により確認されたことなどが非特許文献１、２において本発明者らにより報告されている。なお、非特許文献２では、上記非特許文献１に記載されている引用文献情報の修正が行われている。

【0007】

また、非特許文献３には、分割グアニン四重鎖を組み込んだＤＮＡナノピンセット構造体であるグアニン四重鎖ピンセット構造体であって、分割ＤＮＡアプタマーを第１標的認識部位及び第２標的認識部位に組み込んだグアニン四重鎖ピンセット構造体が開示されている。非特許文献３では、マラリアのバイオマーカーである乳酸脱水素酵素（ＰｆＬＤＨ）の存在下で該ピンセット構造体が閉じることが開示されている。さらに非特許文献３において、該ピンセット構造体が閉じたものはグアニン四重鎖ヘミンを介してペルオキシダーゼ活性が発現し、このペルオキシダーゼ活性は比色分析により観察されたことが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特許第４２６８９４４号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋｅｉｓｕｋｅ Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｈａｊｉｍｅ Ｓｈｉｇｅｔｏ，Ａｋｉｏ Ｋｕｒｏｄａ，Ｈｉｓａｋａｇｅ Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，“Ａ ｓｐｌｉｔ Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ－ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｎａｎｏ－ｔｗｅｅｚｅｒｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓ ａ ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”，Ｂｉｏｓｅｎｓ． Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，７４，２２２－２２６（２０１５）．

【非特許文献2】Ｋｅｉｓｕｋｅ Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｈａｊｉｍｅ Ｓｈｉｇｅｔｏ，Ａｋｉｏ Ｋｕｒｏｄａ，Ｈｉｓａｋａｇｅ Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，“Ｃｏｒｒｉｇｅｎｄｕｍ ｔｏ “Ａ ｓｐｌｉｔ Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ－ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｎａｎｏ－ｔｗｅｅｚｅｒｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓ ａ ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ” ［Ｂｉｏｓｅｎｓ． Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ． ７４ （２０１５） ２２２－２２６］”，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ． ２０１７ Ａｕｇ １５；９４：７２９． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｓ．２０１７．０３．０１９．

【非特許文献3】Ｓｈｉｕ，Ｓ．Ｃ．Ｃ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｄｉｒｋｚｗａｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｌｉａｎｇ，Ｓ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ａ．Ｂ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｔａｎｇ，Ｍ．Ｓ．Ｌ．，Ｔａｎｎｅｒ，Ｊ．Ａ．，“Ａｐｔａｍｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｒｉｖｉｎｇ ａ ＤＮＡ ｔｗｅｅｚｅｒ ｎａｎｏｍａｃｈｉｎｅ．”，Ａｄｖ． Ｂｉｏｓｙｓｔ． ２０１７，１，１６００００６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従来行われている特許文献１などの標的核酸の検出方法では、上述の通り、固体表面上に存在する標的核酸を含む試料を水溶液中に採取して溶解させた標的核酸含有試料を一度作製し、抽出などの操作を行う必要があるため、水溶液中において様々な反応又は操作を行う必要がある。このため、固体表面において標的核酸を直接的に検出することはできないという課題があった。また、固体表面上の標的核酸を検出するまでに一定のステップ数が必要となり、検出キットを事前に作製する必要もあることから事前準備において手間とコストがかかり、改善の余地が残されていた。そのため、固体表面上の標的核酸を一度採取して水溶液に溶解させるステップ及び水溶液中の標的核酸を増幅させるステップを経ることなく、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できる方法の開発が強く望まれていた。

【0011】

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できる方法を提供することにある。とりわけ、従来技術において課題とされていた、標的核酸を含む水溶液中において様々な反応又は操作を行うステップの必要性を取り除いて、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できる方法を提供することにある。これにより、わざわざ標的核酸を含む水溶液中において反応又は操作を行う必要がなくなり、標的核酸の検出完了までに要する時間を格段に短くすることができる。加えて、より簡易に標的核酸の検出が可能となるため、検出に要する手間とコストを大幅に削減することができる。また、標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できることから、例えば手すりや机のどの部分に標的核酸が付着しているかといったような、標的核酸が存在する場所についての情報も得やすいため、従来の検出方法と比較して、利便性が非常に高い標的核酸の検出方法を提供することができる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、ＤＮＡナノピンセット構造体が標的核酸を認識してクローズド状態となった後にヘミンが結合することにより発現するペルオキシダーゼ活性とルミノール反応を組み合わせることにより、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できることを見出して本発明を完成した。

【0013】

具体的に、本発明に係る標的核酸の検出方法は、ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液を固体表面上の標的核酸を含有する標的部位に噴霧するステップと、ルミノール反応液を前記標的部位に噴霧するステップと、前記標的部位においてルミノール発光を検出するステップとを含み、前記ＤＮＡナノピンセット構造体は、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドからなり、前記第１オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の一端側の核酸配列と相補的な配列からなる第１標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第１結合部位とを含み、前記第２オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の他端側の核酸配列と相補的な配列からなる第２標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第２結合部位とを含み、前記第３オリゴヌクレオチドは、前記第１結合部位に相補的な配列からなる第３結合部位と、前記第２結合部位に相補的な配列からなる第４結合部位と、前記第３結合部位と前記第４結合部位との間に設けられた屈曲部位と、前記第３結合部位及び前記第４結合部位における前記屈曲部位と反対側にそれぞれ配置された分割グアニン四重鎖部位とを含むことを特徴とする。

【0014】

本発明に係る標的核酸の検出方法によると、ＤＮＡナノピンセット構造体における第１標的認識部位及び第２標的認識部位が固体表面上の標的核酸を認識してクローズド状態となった場合、該構造体にさらにヘミンが結合してペルオキシダーゼ活性を示すようになる。そうすると、ルミノール反応が進行するため、ルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出された場合に標的核酸を検出できたと判定することができる。本発明に係る標的核酸の検出方法では、ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液並びにルミノール反応液を、標的核酸を含む標的部位にそれぞれ噴霧してルミノール発光を検出するだけで固体表面上の標的核酸を直接検出することができる。このため、従来の検出方法において必要とされていた、固体表面から標的核酸を含む試料を採取して水溶液に溶解させるステップ及び水溶液中の標的核酸を増幅させるステップを経ることなく、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出することができる。また、標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できることから、例えば手すりや机のどの部分に標的核酸が付着しているかといったような、標的核酸が存在する場所についての情報も得やすいため、利便性が高い標的核酸の検出方法を提供することができる。

【0015】

本発明に係る標的核酸の検出方法において、前記第１オリゴヌクレオチドは、５’－［第１標的認識部位］－ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号１）－３’の核酸配列であり、前記第２オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ（配列番号２）－［第２標的認識部位］－３’の核酸配列であり、前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－［第１分割グアニン四重鎖部位］－ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ（配列番号３）－［第２分割グアニン四重鎖部位］－３’の核酸配列とすることができる。また、前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧ（配列番号６）－３’の核酸配列とすることができる。

【0016】

本発明に係る標的核酸の検出方法において、前記ルミノール発光を検出するステップは、撮像装置により前記標的部位を撮影し、前記ルミノール発光を検出するステップとすることができる。

【0017】

ルミノール発光の検出をデジタルカメラ又はスマートフォンなどの撮像装置による撮影で行うことにより標的核酸の検出を簡易に行うことができ、ルミノール発光の検出記録を鮮明な画像データとして残すことができる。

【0018】

本発明に係る標的核酸の検出方法において、前記噴霧された前記標的部位における前記ＤＮＡナノピンセット構造体の量は０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２．０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下であり、前記噴霧された前記標的部位における前記ヘミンの量は１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下とすることができる。

【0019】

噴霧された標的部位におけるＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンの量を上記範囲内とすることにより、ＤＮＡナノピンセット構造体、標的核酸、及びヘミンが結合したものによるルミノール発光の強度を十分にすることができる。また、上記範囲内ではヘミン単体によるルミノール発光の強度を抑え、標的核酸を含有しない標的部位におけるヘミン単体でのルミノール発光の検出による標的核酸の誤検出を防ぐことができる。そのため、固体表面上の標的核酸の検出を精度良く行うことができる。

【0020】

本発明に係る標的核酸の検出キットにおいて、ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液と、ルミノール反応液とを含み、前記ＤＮＡナノピンセット構造体は、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドからなり、前記第１オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の一端側の核酸配列と相補的な配列からなる第１標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第１結合部位とを含み、前記第２オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の他端側の核酸配列と相補的な配列からなる第２標的認識部位と、前記第３オリゴヌクレオチドと結合するための第２結合部位とを含み、前記第３オリゴヌクレオチドは、前記第１結合部位に相補的な配列からなる第３結合部位と、前記第２結合部位に相補的な配列からなる第４結合部位と、前記第３結合部位と前記第４結合部位との間に設けられた屈曲部位と、前記第３結合部位及び前記第４結合部位における前記屈曲部位と反対側にそれぞれ配置された分割グアニン四重鎖部位とを含み、固体表面上の標的部位における標的核酸を検出することを特徴とする。

【0021】

本発明に係る標的核酸の検出キットによると、ＤＮＡナノピンセット構造体における第１標的認識部位及び第２標的認識部位が固体表面上の標的核酸を認識してクローズド状態となった場合、該構造体にさらにヘミンが結合してペルオキシダーゼ活性を示すようになる。そうすると、ルミノール反応が進行するため、ルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出された場合に標的核酸を検出できたと判定することができる。また、本発明に係る標的核酸の検出キットによると、該キットに含まれているＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液並びにルミノール反応液を、標的核酸を含む標的部位にそれぞれ噴霧してルミノール発光を検出するだけで固体表面上の標的核酸を直接検出することができる。このため、従来の検出方法において必要とされていた、固体表面から標的核酸を含む試料を採取して水溶液に溶解させるステップ及び水溶液中の標的核酸を増幅させるステップを経ることなく、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出することができる。また、標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できることから、例えば手すりや机のどの部分に標的核酸が付着しているかといったような、標的核酸が存在する場所についての情報も得やすいため、利便性が高い標的核酸の検出キットを提供することができる。

【0022】

本発明に係る標的核酸の検出キットにおいて、前記第１オリゴヌクレオチドは、５’－［第１標的認識部位］－ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号１）－３’の核酸配列であり、前記第２オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ（配列番号２）－［第２標的認識部位］－３’の核酸配列であり、前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－［第１分割グアニン四重鎖部位］－ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ（配列番号３）－［第２分割グアニン四重鎖部位］－３’の核酸配列とすることができる。また、前記第３オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧ（配列番号６）－３’の核酸配列とすることができる。

【0023】

本発明に係る標的核酸の検出キットにおいて、前記ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液を前記標的部位に噴霧したときの、前記標的部位上の前記ＤＮＡナノピンセット構造体の量は０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２．０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下であり、前記標的部位上の前記ヘミンの量は１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下とすることができる。

【0024】

噴霧された標的部位上のＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンの量を上記範囲内とすることにより、ＤＮＡナノピンセット構造体、標的核酸、及びヘミンが結合したものによるルミノール発光の強度を十分にすることができる。また、上記範囲内では、ヘミン単体によるルミノール発光の強度を抑え、ヘミン単体によるルミノール発光の検出による標的核酸の誤検出を防ぐことができる。そのため、固体表面上の標的核酸の検出を精度良く行うことができる。

【発明の効果】

【0025】

本発明に係る標的核酸の検出方法及びキットによると、ＤＮＡナノピンセット構造体における第１標的認識部位及び第２標的認識部位が固体表面上の標的核酸を認識してクローズド状態となった場合、該構造体にさらにヘミンが結合してペルオキシダーゼ活性を示すようになる。そうすると、ルミノール反応が進行するため、ルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出された場合に標的核酸を検出できたと判定することができる。本発明に係る標的核酸の検出方法及びキットでは、ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液並びにルミノール反応液を、標的核酸を含む標的部位にそれぞれ噴霧してルミノール発光を検出するだけで固体表面上の標的核酸を直接検出することができる。このため、従来の検出方法において必要とされていた、固体表面から標的核酸を含む試料を採取して水溶液に溶解させるステップ及び水溶液中の標的核酸を増幅させるステップを経ることなく、固体表面上の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出することができる。また、標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できることから、例えば手すりや机のどの部分に標的核酸が付着しているかといったような、標的核酸が存在する場所についての情報も得やすいため、利便性が高い標的核酸の検出方法及びキットを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明の一実施形態に係る標的核酸の検出方法におけるＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液を標的部位に噴霧するステップを説明するための概要図である。

【図2】本発明の一実施形態に係る標的核酸の検出方法におけるルミノール反応液を標的部位に噴霧するステップを説明するための概要図である。

【図3】本実施形態で用いるＤＮＡナノピンセット構造体の自己形成を説明する概要図である。

【図4】本実施形態で用いるＤＮＡナノピンセット構造体の基本動作原理を説明する概要図である。

【図5】実施例１において作製した固体表面を示す写真である。

【図6】実施例１に係る標的核酸の検出方法を行ったときの固体表面上のルミノール発光を示す写真である。（Ａ）はデジタルカメラでルミノール発光を撮影した写真であり、（Ｂ）は図６Ａに各スポットの位置を表した写真である。

【図7】実施例１に係る標的核酸の検出方法において用いたＤＮＡナノピンセット構造体と標的核酸の構造を示す概要図である。

【図8】実施例２において作製した固体表面を示す写真である。

【図9】実施例２に係る標的核酸の検出方法を行ったときの固体表面上のルミノール発光を示す写真である。（Ａ）はデジタルカメラでルミノール発光を撮影した写真であり、（Ｂ）は図９Ａに各スポットの位置を表した写真である。

【図10】参考例１における固体表面上のルミノール発光を撮影した写真である。

【図11】参考例２において作製した固体表面を示す写真である。

【図12】参考例２における固体表面上のルミノール発光を撮影した写真である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0028】

本発明の一実施形態に係る標的核酸の検出方法は、図１に示すように、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８を固体表面１９上の標的核酸１３を含有する標的部位２０に、噴霧器１７などを用いて噴霧するステップを備えている。また、図２に示すように、ルミノール反応液２１を標的部位２０に噴霧するステップを備えており、図示しないが、標的部位２０においてルミノール発光を検出するステップを備えている。

【0029】

図３に示すように、本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１は、第１オリゴヌクレオチド２、第２オリゴヌクレオチド３及び第３オリゴヌクレオチド４が自己集積してなる構造体である。

【0030】

図３、４に示すように、本実施形態において、第１オリゴヌクレオチド２は、標的核酸１３の一端側（例えば３’側）の核酸配列１４と相補的な配列からなる第１標的認識部位５と、第３オリゴヌクレオチド４の第３結合部位９と結合するための第１結合部位６とを備えるオリゴヌクレオチドである。例えば、第１オリゴヌクレオチド２は、５’－［第１標的認識部位］－ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ－３’の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。ここで、「５’－［第１標的認識部位］－ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ－３’」は、ＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号１）の５’側に第１標的認識部位５となる配列が配置された核酸配列を意味する。当該配列において、第１標的認識部位５となる配列と配列番号１の配列とは、それらの間にヌクレオチドは含まれずに連続していてもよく、また、それらの間には数塩基、例えば５塩基以下、好ましくは２塩基以下、最も好ましくは１塩基含まれていてもよい。また、第１標的認識部位５は、標的核酸１３の一端側の核酸配列１４と結合するために、上述の通り、標的核酸１３の一端側の核酸配列１４と相補的な配列からなるが、本実施形態において、当該相補的な配列は、標的核酸１３の一端側の核酸配列１４と結合できる限り、相補的な配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する配列を含む。また、当該相補的な配列とのＴｍ値が３０℃以上、好ましくは３８℃以上、最も好ましくは４４℃以上の配列を含む。

【0031】

図３、４に示すように、本実施形態において、第２オリゴヌクレオチド３は、標的核酸１３の他端側（例えば５’側）の核酸配列１５と相補的な配列からなる第２標的認識部位７と、第３オリゴヌクレオチド４の第４結合部位１０と結合するための第２結合部位８とを備えるオリゴヌクレオチドである。例えば、第２オリゴヌクレオチド３は、５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ－［第２標的認識部位］－３’の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。ここで、「５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ－［第２標的認識部位］－３’」は、ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡ（配列番号２）の３’側に第２標的認識部位７となる配列が配置された核酸配列を意味する。当該配列において、第２標的認識部位７となる配列と配列番号２の配列とは、それらの間にヌクレオチドは含まれずに連続していてもよく、また、それらの間には数塩基、例えば５塩基以下、好ましくは２塩基以下、最も好ましくは１塩基含まれていてもよい。また、第２標的認識部位７は、標的核酸１３の他端側の核酸配列１５と結合するために、上述の通り、標的核酸１３の他端側の核酸配列１５と相補的な配列からなるが、本実施形態において、当該相補的な配列は、標的核酸１３の他端側の核酸配列１５と結合できる限り、相補的な配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する配列を含む。また、当該相補的な配列とのＴｍ値が３０℃以上、好ましくは３８℃以上、最も好ましくは４４℃以上の配列を含む。

【0032】

本実施形態において、第１オリゴヌクレオチド２の第１標的認識部位５及び第２オリゴヌクレオチド３の第２標的認識部位７の核酸配列を適宜変更することにより、様々な種類の標的核酸１３を検出できる。そのため、検出目的としている標的核酸１３の核酸配列に合わせて、第１標的認識部位５及び第２標的認識部位７の核酸配列を設計することが好ましい。

【0033】

図３、４に示すように、本実施形態において、第３オリゴヌクレオチド４は、第１結合部位６に相補的な配列からなる第３結合部位９と、第２結合部位８に相補的な配列からなる第４結合部位１０と、第３結合部位９と第４結合部位１０との間に設けられた屈曲部位１１と、第３結合部位９及び第４結合部位１０における屈曲部位１１と反対側にそれぞれ配置された分割グアニン四重鎖部位１２とを備えるオリゴヌクレオチドである。

【0034】

屈曲部位１１は１つ以上の核酸塩基からなり、ＤＮＡナノピンセット構造体１を略Ｖ字状構造にさせるための部位である。屈曲部位１１の塩基数は、好ましくは５塩基以下、より好ましくは２塩基以下、最も好ましくは１塩基含まれていてもよい。本実施形態において、屈曲部位１１は、例えばアデニン（Ａ）、ビオチン化チミン（Ｔ）又はアミノ基を修飾したチミン（Ｔ）を用いることができる。また、屈曲部位１１はアデニン（Ａ）であることが好ましい。本実施形態に係る標的核酸の検出方法では、略Ｖ字状構造であるＤＮＡナノピンセット構造体１のオープン状態とクローズド状態間の構造変化を利用して標的核酸１３を検出するため、屈曲部位１１の存在は重要である。

【0035】

分割グアニン四重鎖部位１２は、グアニン四重鎖を２つに分割した部位を指す。本実施形態において、グアニン四重鎖を２つに分割した部位をそれぞれ第１分割グアニン四重鎖部位及び第２分割グアニン四重鎖部位とする。なお、本明細書において「グアニン四重鎖」とは、４つのグアニンにより形成する平面構造が重なり合ってできる核酸の特殊構造のことを指す。分割グアニン四重鎖部位１２は、例えばＧＧＧの塩基配列を２つずつ有する核酸配列とすることができる。この場合には分割グアニン四重鎖部位１２は全体としてＧＧＧの塩基配列を４つ有することになる。具体的には、分割グアニン四重鎖部位１２は、５’－ＧＧＧＸＸＧＧＧ－３’の核酸配列を２つ有するものとすることができ、ここでＸはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）からなる群から選択することができる。より具体的には、分割グアニン四重鎖部位１２は、５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’及び５’－ＧＧＧＴＡＧＧＧ－３’の核酸配列とすることができる。また、本実施形態において、分割グアニン四重鎖部位１２は、５’－ＧＧＧＸＸＧＧＧ－３’の３’側と第４結合部位１０との間、及び５’－ＧＧＧＸＸＧＧＧ－３’の５’側と第３結合部位９との間にヌクレオチドは含まれずに連続していてもよく、また、それらの間には数塩基、例えば５塩基以下、好ましくは１塩基以上、最も好ましくは３塩基のＸ（「ＸＸＸ」の配列）が含まれていてもよい。このようなヌクレオチドは、例えばリンカーとしての機能を有する。

【0036】

本実施形態において、分割グアニン四重鎖部位１２は、例えばＧＧＧの塩基配列を３つ有する核酸配列とＧＧＧの塩基配列を１つ有する核酸配列とすることもできる。この場合にも分割グアニン四重鎖部位１２は全体としてＧＧＧの塩基配列を４つ有することになる。具体的には、分割グアニン四重鎖部位１２は、５’－ＧＧＧＸＸＧＧＧＸＸＧＧＧ－３’及び５’－ＧＧＧ－３’の核酸配列を有するものとすることができ、ここで、Ｘはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）からなる群から選択することができる。また、５’－ＧＧＧＸＸＧＧＧＸＸＧＧＧ－３’及び５’－ＧＧＧ－３’の核酸配列は、いずれの核酸配列を第３オリゴヌクレオチド４の５’末端側に配置してもよい。なお、第３オリゴヌクレオチド４の５’末端側に配置されなかった、もう片方の核酸配列が、第３オリゴヌクレオチド４の３’末端側に配置されることになる。本実施形態において、分割グアニン四重鎖部位１２と第３結合部位９との間にヌクレオチドは含まれずに連続していてもよく、また、それらの間には数塩基、例えば５塩基以下、好ましくは１塩基以上、最も好ましくは３塩基のＸ（「ＸＸＸ」の配列）が含まれていてもよい。また、分割グアニン四重鎖部位１２と第４結合部位１０との間も同様であり、ヌクレオチドは含まれずに連続していてもよく、また、それらの間には数塩基、例えば５塩基以下、好ましくは１塩基以上、最も好ましくは３塩基のＸ（「ＸＸＸ」の配列）が含まれていてもよい。

【0037】

例えば、第３オリゴヌクレオチド４は、５’－［第１分割グアニン四重鎖部位］－ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ－［第２分割グアニン四重鎖部位］－３’の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。ここで、「５’－［第１分割グアニン四重鎖部位］－ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ－［第２分割グアニン四重鎖部位］－３’」は、ＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡ（配列番号３）の５’側に第１分割グアニン四重鎖部位となる配列が配置され、且つ３’側に第２分割グアニン四重鎖部位となる配列が配置された核酸配列を意味する。当該配列において、第１分割グアニン四重鎖部位又は第２分割グアニン四重鎖部位となる配列と配列番号３の配列とは、それらの間にヌクレオチドは含まれずに連続していてもよく、また、それらの間には数塩基、例えば５塩基以下、好ましくは２塩基以下、最も好ましくは１塩基含まれていてもよい。

【0038】

本実施形態で用いるＤＮＡナノピンセット構造体１の自己形成の概要を図３に示す。図３に示すように、第１オリゴヌクレオチド２、第２オリゴヌクレオチド３及び第３オリゴヌクレオチド４を１つの容器内で混合させた場合、それらは自己集積する。具体的には、第１オリゴヌクレオチド２の第１結合部位６と第３オリゴヌクレオチド４の第３結合部位９が互いに結合し、第２オリゴヌクレオチド３の第２結合部位８と第３オリゴヌクレオチド４の第４結合部位１０が互いに結合するため、オープン状態のＤＮＡナノピンセット構造体１が自己形成される。なお、ＤＮＡナノピンセット構造体１を自己形成させるためには、塩水溶液中で第１オリゴヌクレオチド２、第２オリゴヌクレオチド３及び第３オリゴヌクレオチド４を混合させることが好ましい。塩水溶液は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。

【0039】

本実施形態で用いるＤＮＡナノピンセット構造体１の基本動作原理の概要を図４に示す。図４に示すように、ＤＮＡナノピンセット構造体１は、通常時はピンセット構造の両端が離れたオープン状態をとっており、このオープン状態にある該構造体はヘミン１６との結合能を有していない（図４左側）。そのため、オープン状態にあるＤＮＡナノピンセット構造体１はペルオキシダーゼ活性を示さない。一方、ＤＮＡナノピンセット構造体１が標的核酸１３を認識した場合、該構造体はクローズド状態へと構造変化を起こす（図４右側）。その結果、ピンセット構造の両端に位置する分割グアニン四重鎖部位１２が互いに近接する。この構造変化により、ＤＮＡナノピンセット構造体１におけるヘミン１６への結合能が回復してペルオキシダーゼ活性を示すようになる。

【0040】

本実施形態で用いるヘミンは、下記の化学構造を有する化合物であり、塩素イオンが１個配位したポルフィリンの３価鉄錯体である。

【0041】

【化1】

【0042】

本実施形態では、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８として調製することが好ましい。これにより、ＤＮＡナノピンセット構造体１を含む溶液とヘミン１６を含む溶液を標的部位２０に対してそれぞれ噴霧する必要がなくなり簡便である。一方、ＤＮＡナノピンセット構造体１を含む溶液とヘミン１６を含む溶液を別々の溶液として調製してもよい。ＤＮＡナノピンセット構造体１とヘミン１６を１つの溶液内で共存させることが難しい場合に好適である。なお、これらの溶液の調製方法は特に限定されない。

【0043】

本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１とヘミン１６を含む溶液１８の主な溶媒としては塩水溶液を用いることができ、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１は塩水溶液中において自己形成されることから、ＤＮＡナノピンセット構造体１とヘミン１６を含む溶液１８の溶媒としては少なくとも塩水溶液を含むことが好ましい。塩水溶液に用いる水は、純水であることが好ましく、超純水を用いることがより好ましい。超純水は、例えばＭｉｌｌｉＱ水などを用いることができる。なお、本明細書において「ＭｉｌｌｉＱ水」とは、ＭＥＲＣＫ株式会社製の超純水装置Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）を用いて得られた超純水のことを指す。また、本明細書において「超純水」とは、比抵抗値が１８ＭΩ・ｃｍ以上の水を意味する。また、塩水溶液に加えて、他の溶媒をさらに含むものであってもよい。他の溶媒は特に限定されないが、例えば、他の溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はエタノールなどのアルコール溶媒といった有機溶媒を含んでいても構わない。なお、他の溶媒は１種類に限定されず、有機溶媒を２種類以上含むものであってもよい。また、ヘミン１６は、水への溶解度が低いため、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解させ、ヘミン溶液をあらかじめ調製し、貯蔵しておくことが好ましい。ＤＮＡナノピンセット構造体とヘミンを含む溶液１８を調製する際には、このヘミン溶液を適宜希釈して使用することができる。また、本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１を含む溶液とヘミン１６を含む溶液を別々に調製しておき、これらの溶液を混合させることでＤＮＡナノピンセット構造体１とヘミン１６を含む溶液１８を調製するものであってもよい。これらの溶液を混合する際には、適宜希釈して混合させることができる。

【0044】

本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８は、緩衝剤、塩及び界面活性剤の少なくとも１つをさらに含むものであってもよい。緩衝剤はトリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）などを含み、塩は塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）及び塩化カリウム（ＫＣｌ）などを含み、並びに界面活性剤はポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）などを含む。また、本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８は、塩として塩化カリウム（ＫＣｌ）をさらに含むことが好ましい。ＤＮＡナノピンセット構造体１の分割グアニン四重鎖部位１２がペルオキシダーゼ活性を十分に発揮することができるため好適である。これにより、ＤＮＡナノピンセット構造体１によるルミノール発光の強度がより十分となり、ヘミン１６単体によるルミノール発光との区別をつけやすくなるため好ましい。

【0045】

本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８の濃度は特に限定されず適宜変更することができる。好ましくは、ＤＮＡナノピンセット構造体１の濃度が５０ｎＭ以上１μＭ以下であり、ヘミン１６の濃度が１００ｎＭ以上２μＭ以下である。

【0046】

本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８を噴霧する際に用いる噴霧器１７は、市販されている噴霧器などを使用できる。なお、溶液を入れる前に噴霧器１７の中身を洗浄しておくことが好ましい。また、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８を標的部位２０に噴霧する直前に該溶液を含む噴霧器１７を十分に振っておくことが好ましい。これにより、該溶液中のヘミン１６の濃度が均一となり、標的核酸１３を誤検出してしまうことを防ぐことができる。

【0047】

本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８の噴霧量は特に限定されないが、５０ｍｍ×５０ｍｍの正方形範囲に対して０．５ｍＬ以上１ｍＬ以下とすることが好ましい。ＤＮＡナノピンセット構造体１、標的核酸１３及びヘミン１６が結合した構造体によるルミノール発光の強度が十分となり、他方でヘミン１６単体でのルミノール発光の強度は低くなるため、標的核酸１３を誤検出する可能性が低くなり好適である。図示しないが、噴霧量の調節は、噴霧器１７のサイズ又は噴霧器１７に備えられる噴霧量調節器などによって行うことができる。

【0048】

本実施形態において、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８を固体表面１９上の標的部位２０に噴霧したときの、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１とヘミン１６の量は適宜変更することができる。また、ルミノール反応液２１の噴霧量及び撮影条件を適宜変更し、ＤＮＡナノピンセット構造体１、標的核酸１３及びヘミン１６が結合した構造体のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光の区別をつけることができる限り、上記の量の上限値及び下限値は特に限定されない。例えば、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１の量は、０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２．０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下とすることができる。但し、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１の量が０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２未満であっても、上述したように、標的部位２０上のヘミン１６の量を少なくし、撮影条件を高感度化することで該結合した構造体のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光との区別をつけることができるため、下限値を限定するものではない。上限値も同様であり、特に限定されない。一方、標的部位２０上のヘミンの量は、例えば１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下とすることができる。しかし、標的部位２０上のヘミン１６の量はルミノール反応液２１の噴霧量ならびに撮影条件を適宜変更し、ＤＮＡナノピンセット構造体１、標的核酸１３及びヘミン１６が結合した構造体のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光の区別をつけることができる限り、上限値、下限値は特に限定されない。例えば、ヘミンの量が２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２を超える場合、ヘミン１６単体によるルミノール発光が比較的強く検出されるためバックグラウンドとして使用しにくいところではある。しかし、ルミノール反応液２１の噴霧量を少なくすることでヘミン１６単体のルミノール発光の強度を下げることができるため、ヘミンの量が２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２を超える場合でもバックグラウンドとして使用することは十分に可能である。

【0049】

本実施形態において、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１と標的部位２０上のヘミン１６とのモル比は、ＤＮＡナノピンセット構造体１、標的核酸１３及びヘミン１６が結合した構造体のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光の区別をつけることができる限り、適宜変更することができ、特に限定されない。例えば、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１と標的部位２０上のヘミン１６とのモル比は、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０とすることができる。但し、標的部位２０上のヘミン１６の量が標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１の量よりも少ない場合（例えば標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１と標的部位２０上のヘミン１６とのモル比が１：０．５の場合）、標的核酸１３を認識してクローズド状態となったＤＮＡナノピンセット構造体１が存在しても、十分量のヘミン１６と結合できないため好ましくない。そのため、標的部位２０上のヘミン１６の量は、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１の量以上であることが好ましい。

【0050】

本実施形態では、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８を固体表面１９上の標的部位２０に噴霧したときの、標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１の量を０．１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２．０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下とし、標的部位２０上のヘミン１６の量を１ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以上２０ｐｍｏｌ／３．１４ｍｍ^２以下とすることが好ましい。上記範囲量とすることにより、ＤＮＡナノピンセット構造体１、標的核酸１３、及びヘミン１６が結合したものによるルミノール発光の強度が十分となる。その一方で、本来であればヘミン１６単体でもペルオキシダーゼ活性を示すため、ルミノール反応が進行し、青白い発光が検出されるところである。しかし、上記範囲量とすることによりヘミン１６単体のルミノール発光がほとんど検出されない程度にその発光強度を低くしている。そのため、ヘミン１６単体によるルミノール発光の検出による標的核酸１３の誤検出を防ぐことができる。

【0051】

本実施形態において、上述したような標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６の量は、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８の濃度、該溶液の噴霧量及び噴霧操作などによって異なるため、これらを適宜変更して目的の量が標的部位２０上に噴霧されるよう調整することができる。

【0052】

本実施形態において、固体表面１９は、例えば被服の表面、布地の表面及び紙の表面などの様々な固体表面を含むものであり、特に限定されない。一方、固体表面１９として例えば皮膚の表面などを適用する場合、血液由来のヘミンなどが存在する場合があるため、血液由来ヘミンによるルミノール発光と目的のルミノール発光との間で区別をつけられなくなる可能性がある。そのため、固体表面１９は、ルミノール反応液２１と独自に反応してしまう物質をできるだけ含まないものを使用することが好ましい。

【0053】

本実施形態において、標的部位２０は、固体表面１９上の標的核酸１３を少なくとも含有する部位のことを指す。標的部位２０は、固体表面１９上における標的核酸１３を含む部位として任意に選択することができる。

【0054】

本実施形態において、標的核酸１３は特に限定されず、核酸として存在するものであれば、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその他の核酸の全て含む。また、標的核酸１３を検出するために、該標的核酸の核酸配列を明らかにしておくことが好ましい。但し、標的核酸１３の核酸配列として、グアニン四重鎖構造をとるような配列が含まれるものは好ましくない。この場合においては標的核酸１３がヘミン１６と結合し、ペルオキシダーゼ活性を示すため、本実施形態に係る標的核酸の検出方法を適用できない可能性が高くなる。また、「ＣＣＣ」（シトシンの３回繰り返し）配列が複数存在するものも好適ではない。この場合においてはＤＮＡナノピンセット構造体１における第１オリゴヌクレオチド２の第１標的認識部位５及び第２オリゴヌクレオチド３の第２標的認識部位７に「ＧＧＧ」配列を導入する必要が生じてくる。そうすると、第１標的認識部位５と分割グアニン四重鎖構造部位１２との間、又は第２標的認識部位７と分割グアニン四重鎖構造部位１２との間でヘミンが結合してしまう可能性があるため、本実施形態に係る標的核酸の検出方法を適用できない可能性が高くなる。

【0055】

図２に示すように、本実施形態に係る標的核酸の検出方法では、ルミノール反応液２１を標的部位２０に噴霧するステップを備えている。ルミノールは下記の化学構造を有する化合物であり、塩基性水溶液中において、ヘモグロビンが有するヘム鉄などのペルオキシダーゼ活性を有する物質による触媒作用によって該溶液中の過酸化水素と反応して青白い発光を生ずる。

【0056】

【化2】

【0057】

ルミノール反応液２１は、例えばルミノール、過酸化ナトリウム及び水を含む溶液を用いることができる。なお、過酸化ナトリウムは水と反応することにより、水酸化ナトリウムと過酸化水素を生成する。このようなルミノール反応液２１を調製する方法としては、例えば富士フィルム和光純薬株式会社製のルミノール反応用試薬セット（３ｇ×５包）を用いて、以下の調液方法により調製できる。初めに、ビーカー又は広口のポリ容器に蒸留水５００ｍＬを用意し、ルミノールと過酸化ナトリウムが分包されたアルミパックを黒色ラインの切り取り線に沿ってカットして開封する。続いて、２つの試薬を蒸留水が入ったビーカー又は広口ポリ容器に同時に加えてよく攪拌し、２つの試薬を溶解させ、ルミノール反応液２１を調製する。しかし、ルミノール反応液２１はこれらの成分に限定されず、例えばルミノール、水酸化ナトリウム、過酸化水素及び水を含む溶液などを用いることもできる。なお、ルミノール反応液２１の溶媒として用いる水は蒸留水、ＭｉｌｌｉＱ水又は滅菌精製水のいずれかであることが好ましい。また、ルミノール反応液２１の調製方法も特に限定されない。

【0058】

本実施形態において、ルミノール反応液２１を噴霧する際に用いる噴霧器１７は、市販されている噴霧器などを使用できる。なお、溶液を入れる前に噴霧器１７の中身を洗浄しておくことが好ましい。

【0059】

本実施形態において、ルミノール反応液２１の噴霧量は特に限定されないが、５０ｍｍ×５０ｍｍの正方形範囲に対して０．５ｍＬ以上１ｍＬ以下とすることが好ましい。また、全噴霧量のうち３分の１以上２分の１以下の噴霧量が、５０ｍｍ×５０ｍｍの正方形範囲に対して添加されるように噴霧することが好ましい。これにより、ルミノール発光を十分に検出できるため好適である。但し、ＤＮＡナノピンセット構造体１、標的核酸１３及びヘミン１６が結合した構造体のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光の区別をつけることができる限り、ルミノール反応液２１の噴霧量を適宜変更することができる。なお、図示しないが、噴霧量の調節は、噴霧器１７のサイズ又は噴霧器１７に備えられる噴霧量調節器などによって行うことができる。

【0060】

本実施形態において、図２の右側に示すように、クローズド状態にあるＤＮＡナノピンセット構造体１を含む標的部位２０にルミノール反応液２１を噴霧した場合、該構造体とヘミン１６が結合したもののペルオキシダーゼ触媒作用によってルミノール反応が進行し、青白い発光が強く検出される。一方、図２左側に示すように、オープン状態にあるＤＮＡナノピンセット構造体１を含む標的部位２０にルミノール反応液２１を噴霧した場合、該構造体はヘミン１６と結合することはできないことからペルオキシダーゼ活性を示さず、ルミノール反応が進行しないため、青白い発光は検出されない。なお、ヘミン１６単体でもルミノール反応は進行するが、この場合は弱い発光として検出されるため、上記構造体とヘミン１６が結合したものによる強いルミノール発光と区別をつけることができる。また、上述したように、ＤＮＡナノピンセット構造体１がクローズド状態をとるのは標的核酸１３が存在する場合であり、オープン状態をとるのは標的核酸１３が存在しない場合である。そのため、ルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出された場合に標的核酸１３が検出できたものと判定することができ、ルミノール発光が検出されなかった又はルミノール発光が弱く検出された場合に標的核酸１３が検出されなかったものと判定することができる。

【0061】

本実施形態に係る標的核酸の検出方法では、標的部位においてルミノール発光を検出するステップを備えている。本実施形態において、ルミノール発光を検出する際には、目視による検出又は撮像装置による撮影での検出により行うことができる。撮像装置は、例えばデジタルカメラ又はスマートフォンのカメラを使用することができる。ルミノール発光の検出記録を鮮明な画像データとして記録できるため好適である。また、ルミノール発光を撮影する際の撮像装置の設定は適宜変更することができ、その設定値は特に限定されない。例えば、ＩＳＯ感度、絞り値（Ｆ値）及び露出時間などの設定を適宜変更することができる。また、撮像装置の設定は、標的核酸１３を認識してクローズド状態となったＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６が結合した構造体によるルミノール発光と、ヘミン１６単体のルミノール発光とを区別できるように調節することが好ましい。例えば、後述する実施例では、ＩＳＯ感度を１２８００（ＥＶシフト量＋７）、絞り値（Ｆ値）を３．５（ＡＶ値＋３．６）、露出時間を１秒（ＴＶ値０）とし、結果ＥＶ値＋３．６（ＥＶシフト量＋７）として設定している。これにより、目的のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光とを区別して撮影できるため好ましい。また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法では、ＥＶ値が等価となるように撮像装置の設定値を適宜設定することもできるため、好ましいＩＳＯ感度、絞り値（Ｆ値）及び露出時間は上記数値に限定されない。また、ＥＶ値が＋３．６（ＥＶシフト量＋７）に限定されるものでもない。また、標的核酸１３を認識してクローズド状態となったＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６が結合した構造体のルミノール発光とヘミン１６単体のルミノール発光とを区別して撮影できる限り、ＥＶ値を含む撮像装置の設定値は適宜変更することができる。そのため、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８の噴霧量、並びにルミノール反応液２１の噴霧量などの条件にあわせて、設定するＥＶ値を適宜変更し、該結合した構造体によるルミノール発光と、ヘミン１６単体のルミノール発光とを区別できるように調節すればよい。また、撮影された画像を例えば一般的な２値化処理してもよい。この場合、該結合した構造体によるルミノール発光レベルと、ヘミン１６単体のルミノール発光レベルの間に閾値を持たせることで必要な発光の観察が容易となる。

【0062】

本発明の一実施形態に係る標的核酸の検出キットは、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８と、ルミノール反応液２１とを備え、固体表面１９上の標的核酸１３を検出することを特徴とする（図示せず）。

【0063】

本実施形態に係る標的核酸の検出キットは、標的核酸の検出方法に係る実施形態において詳述したものと同様の、ＤＮＡナノピンセット構造体１、第１オリゴヌクレオチド２、第２オリゴヌクレオチド３、第３オリゴヌクレオチド４、標的核酸１３、ヘミン１６、噴霧器１７、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８、固体表面１９、ルミノール反応液２１、標的部位２０、緩衝剤、塩、界面活性剤及び撮像装置などを用いることができる。また、ＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８の濃度、並びに噴霧された標的部位２０上のＤＮＡナノピンセット構造体１とヘミン１６の量及びモル比は、上述したものと同様にすることができる。

【0064】

本実施形態に係る標的核酸の検出キットでは、ＤＮＡナノピンセット構造体１を含む溶液とヘミン１６を含む溶液を別々の溶液として調製し、これらの溶液をＤＮＡナノピンセット構造体１及びヘミン１６を含む溶液１８のかわりに使用してもよい。各種溶液の調製方法は、上述したものと同様の方法を用いることができる。

【0065】

本実施形態に係る検出キットを用いる固体表面１９上の標的部位２０における標的核酸１３の検出は、上記実施形態において詳述したような方法により行うことができる。

【実施例0066】

以下に、本発明に係る標的核酸の検出方法について詳細に説明するための実施例を示す。

【0067】

実施例１
（ＤＮＡナノピンセット構造体の作製）
第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを終濃度５μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて混合した。ＰＣＲ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを使用し、９５℃で５分間熱処理した後１０℃までゆっくり冷却（－３℃／１分）した。さらに１０℃で４分間インキュベートすることによってＤＮＡナノピンセット構造体を作製し、その後は４℃で保存した。以下に、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドの核酸配列を示す。なお、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社から購入した。
第１オリゴヌクレオチド：
５’－ＣＴＴＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ－３’（配列番号４）
第２オリゴヌクレオチド：
５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡ－３’（配列番号５）
第３オリゴヌクレオチド：
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧ－３’（配列番号６）

【0068】

（固体表面上の標的部位の準備）
図５に示すように、ヘミン（Ｈｅｍｉｎ）を２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔとなるように濾紙上の四隅に滴下し、乾燥させた。また、標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ）を１．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（一番左の列、真ん中３箇所）、５．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から２列目、５箇所）及び１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から３列目、５箇所）となるように濾紙上に滴下し、乾燥させた。さらに、非標的核酸（Ｎｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）を１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から４列目、５箇所）となるように濾紙上に滴下し、乾燥させた。また、バッファー領域として水（Ｗａｔｅｒ；左から５列目、真ん中３箇所）を濾紙上に滴下し、乾燥させた。このようにして作製した濾紙の写真を図５に示している。なお、１スポットは、半径約１ｍｍの円状のスポット（ｓｐｏｔ）であり、１スポットの面積値は約３．１４ｍｍ^２である。また、以下に、標的核酸及び非標的核酸の核酸配列を示す。標的核酸及び非標的核酸は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社から購入した。
標的核酸：
５’－ＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＴＴＡＡＧＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＡＡＧ－３’（配列番号７）
非標的核酸：
５’－ＴＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＴＴ－３’（配列番号８）

【0069】

（スプレー溶液の作製）
スプレー溶液（ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液）を以下の様に調製した。初めに、各終濃度がＴｒｉｓ－ＨＣｌ：２００ｍＭ、ＮＨ_４Ｃｌ：６００ｍＭ、ＫＣｌ：８０ｍＭ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００：０．１２％となるように、並びにｐＨ＝７．５となるように４倍濃縮ｗｏｒｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（４× Ｗ．Ｂ．）を作製した。次に、４× Ｗ．Ｂ．２５０μＬ、５μＭ ＤＮＡナノピンセット構造体の溶液２００μＬ、１００μＭ ヘミン（ｉｎ ＤＭＳＯ）２０μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水５３０μＬを混合し（終濃度はＤＮＡナノピンセット構造体：１μＭ、ヘミン：２μＭ）、１ｍＬのスプレー溶液を作製した。

【0070】

（標的核酸の検出）
作製したスプレー溶液を市販の簡易噴霧器（５０ｍＬナフコアルコール除菌スプレーの中身を取り出し、洗浄したもの）を用い、上記した濾紙に１ｍＬ全量噴霧し、５０ｍｍ×５０ｍｍ程度の正方形範囲に浸透させた。なお、１スポット（半径約１ｍｍの円状、面積値約３．１４ｍｍ^２）あたりのＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンの推定量は、ＤＮＡナノピンセット構造体で約１．３ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ、ヘミンで約２．６ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔである。３０分後、濾紙から３００ｍｍ程度の距離より、メーカー指定の方法によって調製したルミノール反応液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を同型の簡易噴霧器を用いて約１ｍＬ噴霧した。ルミノール反応液噴霧後、５秒以内程度に濾紙を暗箱にいれ、デジタルカメラＳＯＮＹ ＤＳＣ－ＴＸ３０（ソニー株式会社製）を用いて、ＩＳＯ－１２８００、絞り値（Ｆ値）３．５、露出時間１秒の条件で撮影した。撮影した写真を図６Ａに示した。また、図６Ａに各スポットの位置を表した写真を図６Ｂに示した。

【0071】

図６Ａ、６Ｂに示すように、標的核酸５．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から２列目、５箇所）及び１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から３列目、５箇所）の箇所ではルミノール発光が強く検出されたのに対して、標的核酸１．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（一番左の列、真ん中３箇所）の箇所ではルミノール発光が弱く検出されている。また、非標的核酸１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から４列目、５箇所）の箇所ではルミノール発光が検出されておらず、バッファー領域として水（左から５列目、真ん中３箇所）を滴下した箇所でもルミノール発光は検出されなかった。したがって、本実施例１では、第１オリゴヌクレオチド（配列番号４）、第２オリゴヌクレオチド（配列番号５）及び第３オリゴヌクレオチド（配列番号６）からなるＤＮＡナノピンセット構造体並びにヘミンを含む溶液を固体表面上の標的核酸（配列番号７）を含有する標的部位に噴霧し、次いでルミノール反応液を標的部位に噴霧し、その標的部位においてルミノール発光を検出することで固体表面上の標的核酸（配列番号７）を直接的に且つ簡便に検出できることが分かった。一方で、標的核酸の量が１．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ程度の場合、ルミノール発光の強度が低かったため、標的核酸の検出が明確にできたと判断することは難しかった。しかし、スプレー溶液のＤＮＡナノピンセット構造体とヘミンの濃度及びルミノール反応液の噴霧量を調整することで該ルミノール発光を検出できる可能性はあるため、本実施例１の結果は検出限界を定めるものではない。なお、図６Ａ、６Ｂではあまり観測されていないが、標的核酸のスポット位置以外においてもルミノール発光が細かなスポットとして検出されることがある。これはヘミンの濃度の高い部分が噴霧された結果若しくはルミノール反応液が多量に噴霧された結果、又はその両方によりヘミン単体でのルミノール反応が進行し、そのルミノール発光が弱く検出されたものであると考えられる。しかし、標的核酸をスポットした箇所でのルミノール発光強度の方がヘミン単体の場合と比較してはっきりと高くなるため、標的核酸の誤検出は起きにくいことが分かっている。また、濾紙の四隅の結果より、ヘミンの量が２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔである場合には、ヘミン単体によるルミノール発光が一定量検出されることも確認された。そのため、スプレー溶液のヘミンの濃度を高く設定しすぎた場合には、バックグラウンドにてルミノール発光が検出されることが示唆され、本実施例に係る標的核酸の検出方法を実施できなくなる可能性が示唆された。そのため、スプレー溶液中のＤＮＡナノピンセット構造体とヘミンの濃度設定が重要であることが分かった。また、濾紙の四隅のヘミン２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔのスポットでは、理論上、均一の強度でルミノール発光が観測されるものと推測されるところである。しかし、実際には図６Ａに示すように、四隅のヘミンのルミノール発光の強度は均一でないことが分かった。とりわけ、図６Ａの右下のヘミンの箇所でのルミノール発光強度は明確に高いことが分かった。これは、ルミノール反応液の噴霧にムラがあったためと考えられる。このことは、上記にてルミノール反応液が多量に噴霧された結果として標的核酸のスポット位置以外においてもルミノール発光が細かなスポットとして検出されることがあることを説明したが、その根拠の一つであると考えられる。

【0072】

実施例１に係る標的核酸の検出原理について簡単に説明する。実施例１で用いたＤＮＡナノピンセット構造体（配列番号４の第１オリゴヌクレオチド、配列番号５の第２オリゴヌクレオチド及び配列番号６の第３オリゴヌクレオチドからなる）と標的核酸（配列番号７）の構造を表す概要図を図７に示す。図７に示されるように、実施例１において、ＤＮＡナノピンセット構造体の第１標的認識部位の核酸配列「ＣＴＴＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣ」は、該標的核酸の一端側の核酸配列「ＧＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＡＡＧ」と相補的であるため互いに結合する。また、ＤＮＡナノピンセット構造体の第２標的認識部位の核酸配列「ＴＴＡＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡ」は、該標的核酸の他端側の核酸配列「ＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＴＴＡＡ」と相補的であるため互いに結合する。これにより、該ＤＮＡナノピンセット構造体はクローズド状態へと構造変化を起こす。その結果、ピンセット構造の両端に位置する分割グアニン四重鎖部位が互いに近接し、該構造体におけるヘミンへの結合能が回復してペルオキシダーゼ活性を示すようになる。そうすると、ルミノール反応が進行するため、ルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出され、標的核酸を検出できたと判定することができる。一方、実施例１で用いたＤＮＡナノピンセット構造体は、非標的核酸（配列番号８）と相補的な配列を有していない。そのため、該ＤＮＡナノピンセット構造体はクローズド状態へと構造変化することができず、ペルオキシダーゼ活性を示さない。そうすると、ルミノール反応が進行しないため、ルミノール発光が検出されない又はルミノール発光が弱く検出され、標的核酸は検出されなかったものと判定することができる。

【0073】

実施例２
本実施例２では、実施例１において用いた非標的核酸を標的核酸とし、実施例１において用いた標的核酸を非標的核酸とした。そして、実施例２に係る標的核酸を検出できるＤＮＡナノピンセット構造体を使用し、該標的核酸の検出を実施した。それ以外の点は実施例１と同様であるため説明を省略する。

【0074】

以下に、実施例２で用いた第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、第３オリゴヌクレオチド、標的核酸及び非標的核酸の核酸配列を示す。なお、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社から購入した。第３オリゴヌクレオチド、標的核酸及び非標的核酸は実施例１と同様のものを用いた。
第１オリゴヌクレオチド：
５’－ＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ－３’（配列番号９）
第２オリゴヌクレオチド：
５’－ＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＡＴ－３’（配列番号１０）
第３オリゴヌクレオチド：
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧ－３’（配列番号６）
標的核酸：
５’－ＴＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＴＴ－３’（配列番号８）
非標的核酸：
５’－ＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＴＴＡＡＧＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＡＡＧ－３’（配列番号７）

【0075】

（固体表面上の標的部位の準備）
図８に示すように、ヘミン（Ｈｅｍｉｎ）を２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔとなるように濾紙上の四隅に滴下し、乾燥させた。また、標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ）を１．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（一番左の列、真ん中３箇所）、５．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から２列目、５箇所）及び１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から３列目、５箇所）となるように濾紙上に滴下し、乾燥させた。さらに、非標的核酸（Ｎｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）を１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から４列目、５箇所）となるように濾紙上に滴下し、乾燥させた。また、バッファー領域として水（Ｗａｔｅｒ；左から５列目、真ん中３箇所）を濾紙上に滴下し、乾燥させた。このようにして作製した濾紙の写真を図８に示している。

【0076】

実施例１と同様の方法で標的核酸の検出を行った。ルミノール反応液噴霧後、濾紙を暗箱に入れて撮影した写真を図９Ａに示した。また、図９Ａに各スポットの位置を示した写真を図９Ｂに示した。なお、１スポット（半径約１ｍｍの円状、面積値約３．１４ｍｍ^２）あたりのＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンの推定量は実施例１と同様であり、ＤＮＡナノピンセット構造体で約１．３ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ、ヘミンで約２．６ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔである。

【0077】

図９Ａ、９Ｂに示すように、本実施例２の標的核酸（配列番号８）においてルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出されたのに対して、非標的核酸（配列番号７）においてはルミノール発光が検出されなかった。その他の点は実施例１の結果と同様の傾向にあることが分かった。すなわち、標的核酸５．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から２列目、５箇所）及び１０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（左から３列目、５箇所）の箇所ではルミノール発光が強く検出されたのに対して、標的核酸１．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ（一番左の列、真ん中３箇所）の箇所ではルミノール発光が弱く検出された。また、バッファー領域として水（左から５列目、真ん中３箇所）を滴下した箇所でもルミノール発光は検出されなかった。

【0078】

したがって、本実施例２では、第１オリゴヌクレオチド（配列番号９）、第２オリゴヌクレオチド（配列番号１０）及び第３オリゴヌクレオチド（配列番号６）からなるＤＮＡナノピンセット構造体並びにヘミンを含む溶液を固体表面上の標的核酸（配列番号８）を含有する標的部位に噴霧し、次いでルミノール反応液を標的部位に噴霧し、その標的部位においてルミノール発光を検出することで固体表面上の標的核酸（配列番号８）を直接的に且つ簡便に検出できることが分かった。

【0079】

実施例２の結果において特筆すべき点として、標的核酸（配列番号８）の核酸配列の全てを認識するＤＮＡナノピンセット構造体を用いることなく、該標的核酸の検出に成功したことが挙げられる。より具体的には、実施例２では標的核酸の核酸配列の７０％を認識するＤＮＡナノピンセット構造体を用いて、該標的核酸の検出に成功している。

【0080】

なお、標的核酸のスポット位置以外においてもルミノール発光が細かなスポットとして検出されることがあることを実施例１にて説明した。これに関して、実施例２では図９Ａの右下のヘミン２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔのルミノール発光の周りにおいて、ルミノール発光による細かなスポットが検出された。この理由としては、上述したように、ヘミンの濃度の高い部分が噴霧された結果若しくはルミノール反応液が多量に噴霧された結果、又はその両方によりヘミン単体でのルミノール反応が進行し、そのルミノール発光が弱く検出されたものであると考えられる。しかし、標的核酸をスポットした箇所でのルミノール発光の強度は、上記ルミノール発光の細かなスポットのルミノール発光の強度よりもはっきりと高いため、標的核酸の誤検出は起きにくいことが分かる。

【0081】

本実施例２のＤＮＡナノピンセット構造体を用いた標的核酸の検出方法の原理は実施例１と同様である。すなわち、図示しないが、実施例２に係るＤＮＡナノピンセット構造体の第１標的認識部位の核酸配列「ＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡ」が、標的核酸（配列番号８）の一端側の核酸配列「ＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧ」と相補的であるため互いに結合する。また、ＤＮＡナノピンセット構造体の第２標的認識部位の核酸配列「ＧＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＡＴ」が、該標的核酸の他端側の核酸配列「ＡＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＣＣ」と相補的であるため互いに結合する。これにより、該ＤＮＡナノピンセット構造体はクローズド状態へと構造変化を起こす。その結果、ピンセット構造の両端に位置する分割グアニン四重鎖部位が互いに近接し、該構造体におけるヘミンへの結合能が回復してペルオキシダーゼ活性を示すようになる。そうすると、ルミノール反応が進行するため、ルミノール発光がヘミン単体の場合よりも強く検出され、標的核酸を検出できたと判定することができる。一方、実施例２で用いたＤＮＡナノピンセット構造体は、非標的核酸（配列番号７）と相補的な配列を有していない。そのため、該ＤＮＡナノピンセット構造体はクローズド状態へと構造変化することができず、ペルオキシダーゼ活性を示さない。そうすると、ルミノール反応が進行しないため、ルミノール発光が検出されない又はルミノール発光が弱く検出され、標的核酸は検出されなかったものと判定することができる。

【0082】

以上の通り、本発明によると、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを自己集積させることによりＤＮＡナノピンセット構造体を作製でき、該構造体、ヘミン及びルミノール反応液を用いて様々な種類の標的核酸を直接的に且つ簡便に検出できることが示された。また、標的核酸の核酸配列を認識できるようにＤＮＡナノピンセット構造体を設計して作製することで、様々な種類の標的核酸を特異的に検出可能であることが示された。

【0083】

なお、以下に詳述する参考例１、２の実験を行うことにより、実施例１、２における、スプレー溶液を噴霧したときの濾紙上の１スポットにおけるＤＮＡナノピンセット構造体とヘミンの量を設定するに至った。

【0084】

参考例１
（ＤＮＡナノピンセット構造体の好適な量の検討）
参考例１では、濾紙上のヘミンの量を２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔに固定し、スプレー溶液を噴霧したときの濾紙上のＤＮＡナノピンセット構造体の好適な量を検討するべく、以下の実験を行った。また、参考例１では、ルミノール反応液の噴霧量を７５０μＬに固定して検討している。本実施例に係る標的核酸の検出方法では、ルミノール反応液の噴霧量にあわせてルミノール発光の強度も変わるため、該ルミノール反応液の噴霧量を固定することが好ましいためである。まず、第１オリゴヌクレオチド（配列番号４）、第２オリゴヌクレオチド（配列番号５）及び第３オリゴヌクレオチド（配列番号６）を用いて、実施例１と同様の方法により、ＤＮＡナノピンセット構造体溶液を作製した。また、標的核酸（配列番号７）を使用して標的核酸溶液を作製し、上記ＤＮＡナノピンセット構造体溶液と混合させ、２００ｎＭ ＤＮＡナノピンセット構造体と標的核酸の混合溶液を作製した。また、２μＭ ヘミン溶液（ｉｎ ＤＭＳＯ）を作製した。上記混合溶液と上記ヘミン溶液を以下の表１に示す割合で混合させ、下記サンプル１～６の溶液を作製した。

【0085】

【表1】

【0086】

サンプル１～６の溶液をそれぞれ室温で３０分間攪拌し、約１０μＬの各サンプル溶液１～６を複数回に分けて、濾紙上の各スポット位置に滴下、乾燥を繰り返し、固体表面を作製した。なお、各サンプルにつき縦５箇所に滴下しており、サンプル１を一番左列の縦５箇所、サンプル２を左から２列目の縦５箇所、サンプル３を左から３列目の縦５箇所、サンプル４を左から４列目の縦５箇所、サンプル５を左から５列目の縦５箇所及びサンプル６を左から６列目の縦５箇所に滴下した。続いて、濾紙から３００ｍｍ程度の距離より、メーカー指定の方法によって調製したルミノール反応液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を同型の簡易噴霧器を用いて約７５０μＬ程度噴霧した。ルミノール反応液噴霧後、５秒以内程度に濾紙を暗箱にいれ、デジタルカメラＳＯＮＹ ＤＳＣ－ＴＸ３０（ソニー株式会社製）を用いて、ＩＳＯ－１２８００、絞り値（Ｆ値）３．５、露出時間１秒の条件で濾紙から１１０ｍｍ程度の距離から撮影した。撮影した写真を図１０に示した。なお、各スポット（半径１ｍｍの円状、面積値約３．１４ｍｍ^２）上のＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンの推定量を表２に示した。

【0087】

【表2】

【0088】

図１０の結果より、ヘミンのみを含むサンプル１において、ルミノール発光が検出されていない又はルミノール発光が非常に弱く検出された。一方、サンプル２～６についての検討結果より、ＤＮＡナノピンセット構造体の量を０．１ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ、０．５ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ、１．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ、１．５ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ及び２．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔとした場合のいずれにおいても、ヘミン単体のルミノール発光（サンプル１、バックグラウンド）よりもルミノール発光が強く検出されることが確認された。したがって、ＤＮＡナノピンセット構造体の量を０．１ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ以上とすることにより、ヘミン単体のルミノール発光（サンプル１、バックグラウンド）と明確に区別できることが分かった。また、標的を認識しているＤＮＡピンセット構造体の量が０．１ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ以上２．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ以下の範囲内であれば、標的核酸の認識の程度によって発光量に差が生じることが示された。

【0089】

参考例２
（ヘミンの好適な量の検討）
参考例２では、スプレー溶液を噴霧したときの濾紙上のヘミンの好適な量を検討するべく、以下の実験を行った。また、参考例２では、参考例１の図１０の結果において全体的にルミノール発光の強度が低かったことを踏まえ、ある程度十分な発光量を得るためにルミノール反応液の噴霧量を７５０μＬから１ｍＬに増やしたときのヘミンの好適な量について検討した。図１１に示すように、濾紙上にヘミン（Ｈｅｍｉｎ）４ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ又はヘミン（Ｈｅｍｉｎ）２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔとなるように、ヘミン溶液を濾紙に４箇所ずつ滴下し、乾燥させた（合計８箇所作製）。乾燥後の濾紙の写真を図１１に示している。続いて、メーカー指定の方法によって調製したルミノール反応液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を同型の簡易噴霧器を用いて１ｍＬ程度噴霧した。ルミノール反応液噴霧後、５秒以内程度に濾紙を暗箱にいれ、デジタルカメラＳＯＮＹ ＤＳＣ－ＴＸ３０（ソニー株式会社製）を用いて、ＩＳＯ－１２８００、絞り値（Ｆ値）３．５、露出時間１秒の条件で撮影した。撮影した写真を図１２に示した。

【0090】

図１１、１２の結果より、ヘミン４ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔの箇所ではルミノール発光が検出されていない又はルミノール発光が非常に弱く検出されたため、ルミノール反応液の噴霧量を１ｍＬとしたときのバックグラウンドとして有用であることが確認できた。なお、スプレー溶液でいうと、ヘミンの濃度を２μＭとすることで標的部位にヘミン４ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ程度を均一に噴霧できる。そのため、ヘミンの濃度を２μＭ以下にすることが好適であることが分かった。一方、ヘミン２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔの箇所では、ルミノール発光が比較的強く検出されているため、ルミノール反応液の噴霧量を１ｍＬとしたときのバックグラウンドとしては使用しにくいことが分かった。そのかわりに、ヘミン２０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔとすることにより、標準物質として使用できることも分かった。以上の結果より、ある程度十分の発光量を得るためにルミノール反応液の量を増やしてもバックグラウンドが十分低いヘミンの量は４．０ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ以下であると決定した。

【0091】

参考例１、２の結果より、実施例１、２における、スプレー溶液を噴霧したときの濾紙上の１スポットにおけるＤＮＡナノピンセット構造体とヘミンの量の設定を行っている。なお、ルミノール反応液の噴霧量を１ｍＬとしたときの条件で設定を行った。具体的には、スプレー溶液を噴霧したときの濾紙上の量を、ＤＮＡナノピンセット構造体において１．３ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔ及びヘミンにおいて２．６ｐｍｏｌ／ｓｐｏｔとなるように設定した。また、これらの量を濾紙に噴霧するために、該スプレー溶液中のＤＮＡナノピンセット構造体の濃度を１μＭ、ヘミンの濃度を２μＭとして設定した。

【符号の説明】

【0092】

１ ＤＮＡナノピンセット構造体
２ 第１オリゴヌクレオチド
３ 第２オリゴヌクレオチド
４ 第３オリゴヌクレオチド
５ 第１標的認識部位
６ 第１結合部位
７ 第２標的認識部位
８ 第２結合部位
９ 第３結合部位
１０ 第４結合部位
１１ 屈曲部位
１２ 分割グアニン四重鎖部位
１３ 標的核酸
１４ 一端側の核酸配列
１５ 他端側の核酸配列
１６ ヘミン
１７ 噴霧器
１８ ＤＮＡナノピンセット構造体及びヘミンを含む溶液
１９ 固体表面
２０ 標的部位
２１ ルミノール反応液

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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