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特開2023-47344人工三次元組織の製造方法、人工三次元組織の計測方法および人工三次元組織
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023047344
(43)【公開日】2023-04-05
(54)【発明の名称】人工三次元組織の製造方法、人工三次元組織の計測方法および人工三次元組織
(51)【国際特許分類】
C12N 5/079 20100101AFI20230329BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230329BHJP
【ＦＩ】
C12N5/079
C12M3/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022151816
(22)【出願日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】63/248,294
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100194250
【弁理士】
【氏名又は名称】福原 直志
(72)【発明者】
【氏名】竹内 昌治
(72)【発明者】
【氏名】榎本 和生
(72)【発明者】
【氏名】森本 雄矢
(72)【発明者】
【氏名】稲垣 智之
(72)【発明者】
【氏名】三浦 重徳
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029BB11
4B029CC13
4B029GA03
4B029GB01
4B065AA90X
4B065BC41
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】感覚神経細胞の観察を容易に行える人工三次元組織の製造方法を提供する。
【解決手段】側壁に囲まれた培養空間と、対向する側壁に設けられたアンカー部と、を有する培養槽を準備することと、培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、を含む。
【選択図】図８
【解決手段】側壁に囲まれた培養空間と、対向する側壁に設けられたアンカー部と、を有する培養槽を準備することと、培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、を含む。
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
側壁に囲まれた培養空間と、対向する前記側壁に設けられたアンカー部と、を有する培養槽を準備することと、
前記培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、
前記ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、
を含む、人工三次元組織の製造方法。
前記培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、
前記ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、
を含む、人工三次元組織の製造方法。
【請求項2】
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含む予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体の第１面に配置した前記スフェロイドを培養して、前記第１面に前記第２培養体を有する前記予ゲル体を得ることと、
前記第２培養体を有する前記予ゲル体における前記第１面と逆側の第２面に配置した前記表皮細胞を培養することと、
を含む、
請求項１に記載の人工三次元組織の製造方法。
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含む予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体の第１面に配置した前記スフェロイドを培養して、前記第１面に前記第２培養体を有する前記予ゲル体を得ることと、
前記第２培養体を有する前記予ゲル体における前記第１面と逆側の第２面に配置した前記表皮細胞を培養することと、
を含む、
請求項１に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項3】
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞および前記スフェロイドを培養して、前記第１培養体および前記第２培養体を内部に含む前記ゲル体を得ることである、
請求項１に記載の人工三次元組織の製造方法。
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞および前記スフェロイドを培養して、前記第１培養体および前記第２培養体を内部に含む前記ゲル体を得ることである、
請求項１に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項4】
前記培養槽を準備することは、対向する前記アンカー部の間に対向方向に沿って線状の保持部材を設置することを含む、
請求項３に記載の人工三次元組織の製造方法。
請求項３に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項5】
前記培養槽を準備することは、対向する前記アンカー部の間に対向方向に沿って線状部材を設置することを含み、
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含み、前記線状部材が前記対向方向に貫く予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体から前記線状部材を抜去して、前記予ゲル体を前記対向方向に貫く空洞を形成することと、
前記空洞に配置した前記スフェロイドを培養して前記第２培養体を得ることと、
を含む、
請求項１に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含み、前記線状部材が前記対向方向に貫く予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体から前記線状部材を抜去して、前記予ゲル体を前記対向方向に貫く空洞を形成することと、
前記空洞に配置した前記スフェロイドを培養して前記第２培養体を得ることと、
を含む、
請求項１に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項6】
前記スフェロイドとシュワン細胞とを培養して前記第２培養体を得る、
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項7】
前記感覚神経細胞の数と前記シュワン細胞の数とを、３：１から１：３の割合の範囲で混合して培養する、
請求項６に記載の人工三次元組織の製造方法。
請求項６に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項8】
前記培養槽を準備することは、複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を設置することを含み、
前記ゲル体を得ることと、前記表皮細胞を培養することと、を前記電極上で行う、
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記ゲル体を得ることと、前記表皮細胞を培養することと、を前記電極上で行う、
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項9】
複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を準備することと、
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法で製造された前記人工三次元組織を前記電極上に載せることと、
を含む、人工三次元組織の計測方法。
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法で製造された前記人工三次元組織を前記電極上に載せることと、
を含む、人工三次元組織の計測方法。
【請求項10】
前記電極上に載せた前記人工三次元組織を前記電極に向けて押し付けることを含む、
請求項９に記載の人工三次元組織の計測方法。
請求項９に記載の人工三次元組織の計測方法。
【請求項11】
前記人工三次元組織に薬剤を接触させることと、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を計測して前記薬剤を評価することと、
を含む、
請求項９に記載の人工三次元組織の計測方法。
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を計測して前記薬剤を評価することと、
を含む、
請求項９に記載の人工三次元組織の計測方法。
【請求項12】
真皮細胞を含む真皮組織層と、
表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層と、
前記真皮組織層に含まれ、神経突起を有する感覚神経細胞が密集したスフェロイドと、
を有する、人工三次元組織。
表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層と、
前記真皮組織層に含まれ、神経突起を有する感覚神経細胞が密集したスフェロイドと、
を有する、人工三次元組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、人工三次元組織の製造方法、人工三次元組織の計測方法および人工三次元組織に関するものである。
【背景技術】
【0002】
ヒトの皮膚には感覚神経が通っており，様々な感覚を受容している。皮膚感覚については様々な研究がなされてきたが、解明されていない点も多く残されている。そこで、皮膚モデル内部で感覚神経細胞を培養する方法が行われている。
【0003】
例えば非特許文献１には、スポンジコラーゲンを用いた共培養系を用いて皮膚組織と、感覚神経細胞を培養し、創傷治癒モデルを作製することが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】M. Blais, L. Mottier, M. A. Germain, S. Bellenfant, S. Cadau, and F. Berthod, “Sensory neurons accelerate skin reepithelialization via substance P in an innervated tissue-engineered wound healing model,” Tissue Engineering - Part A, vol. 20, no. 15-16, pp. 2180-2188, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
非特許文献１に開示された方法では、感覚神経細胞が皮膚組織内に散在しているため、観察および機能解析を行うことが難しいという問題がある。
【0006】
本発明は、以上のような点を考慮してなされたもので、感覚神経細胞の観察を容易に行える人工三次元組織の製造方法、および人工三次元組織を提供することを目的とする。
【0007】
本発明の別の目的は、感覚神経細胞の機能解析を容易に行える人工三次元組織の計測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第１の態様は、側壁に囲まれた培養空間と、対向する前記側壁に設けられたアンカー部と、を有する培養槽を準備することと、前記培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、前記ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、を含む、人工三次元組織の製造方法である。
【0009】
本発明の第２の態様は、複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を準備することと、本発明の第１の態様の人工三次元組織の製造方法で製造された前記人工三次元組織を前記電極上に載せることと、を含む、人工三次元組織の計測方法である。
【0010】
本発明の第３の態様は、真皮細胞を含む真皮組織層と、表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層と、前記真皮組織層に含まれ、前記真皮組織層から前記表皮組織層に向けて伸展する神経突起を有する感覚神経細胞が密集したスフェロイドと、を有する、人工三次元組織である。
【発明の効果】
【0011】
本発明では、感覚神経細胞の観察を容易に行える人工三次元組織の製造方法および人工三次元組織を提供することができる。
【0012】
また、本発明では、感覚神経細胞の機能解析を容易に行える人工三次元組織の計測方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明の実施の形態に係る人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。
【図2】人工皮膚組織製造装置３０を構成する培養槽４０の概略的な平面図である。
【図3】第１実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図4】第１実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図5】第１実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図6】第１実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図7】第１実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図8】第１実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図9】培養中の感覚神経細胞１４を観察した写真図である。
【図10】予ゲル体ＧＰに固定後の感覚神経細胞および神経突起を示す組織染色画像を示す図である。
【図11】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図12】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図13】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図14】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図15】スフェロイド１５のみの第１サンプルを用いて第２実施形態の製造方法で製造された神経突起の断面染色像である。
【図16】第１サンプルを用いて第２実施形態の製造方法で製造された人工皮膚組織の切片の染色像である。
【図17】スフェロイドの染色像である。
【図18】感覚神経細胞とシュワン細胞との混合比を変えたスフェロイドを培養したときの免疫染色像である。
【図19】第３実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図20】第３実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図21】第４実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図22】第４実施形態に係る人工皮膚組織１の製造方法を示す断面図である。
【図23】本発明の人工皮膚組織１の計測方法を示す断面図である。
【図24】アレイチップ６１における電極マップ、電極の位置およびアドレスを模式的に示した拡大図である。
【図25】各アドレスの電極において計測された時間と電圧との関係を示す図である。
【図26】各アドレスの電極において計測された時間と振幅との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の人工三次元組織の製造方法、人工三次元組織の計測方法および人工三次元組織の実施の形態を、図１から図２６を参照して説明する。人工三次元組織は、人工皮膚組織である。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
【0015】
（人工皮膚組織）
まず、本発明に係る人工皮膚組織について、図１を参照して説明する。
図１は、人工三次元組織である人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。
人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮組織層２０とを含む。人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮組織層２０とが積層された方向（図１における上下方向、以下、積層方向と称する）と直交する平面に沿った所定方向（図１における左右方向）に延びて形成されている。
まず、本発明に係る人工皮膚組織について、図１を参照して説明する。
図１は、人工三次元組織である人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。
人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮組織層２０とを含む。人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮組織層２０とが積層された方向（図１における上下方向、以下、積層方向と称する）と直交する平面に沿った所定方向（図１における左右方向）に延びて形成されている。
【0016】
表皮組織層２０は、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を播種して培養することにより形成されたものである。表皮細胞２１としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。
【0017】
表皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来表皮細胞が好ましい。ヒト由来表皮細胞としては、表皮角化細胞、表皮メラノサイトが挙げられ、表皮角化細胞が好ましい。表皮角化細胞としては、正常ヒト表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes：NHEK） が挙げられる。表皮メラノサイトとしては、正常ヒト表皮メラノサイト（Normal Human Epidermal Melanocytes：NHEM）が挙げられる。
【0018】
真皮組織層１０は、細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２を培養することにより形成されたものであり、真皮細胞１２が培養された第１培養体１２Ａを含む。細胞外マトリックス成分１１としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。真皮細胞１２としては、例えば、線維芽細胞を用いることができる。
【0019】
線維芽細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来線維芽細胞が好ましい。ヒト由来線維芽細胞としては、ヒト皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF）、ヒト肺線維芽細胞：Human Pulmonary Fibroblasts (HPF)、ヒト心臓線維芽細胞：Human Cardiac Fibroblasts (HCF)、ヒト大動脈外膜線維芽細胞：Human Aortic Adventitial Fibroblasts (HAoAF)、ヒト子宮線維芽細胞：Human Uterine Fibroblasts (HUF)、ヒト絨毛間葉系線維芽細胞：Human Villous Mesenchymal Fibroblasts (HVMF)等が挙げられ、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）が好ましい。
【0020】
真皮組織層１０は、感覚神経細胞１４が密集したスフェロイド１５と神経突起１６とを含む。
感覚神経細胞１４としては、特に限定されないが、ヒト、マウスおよびラットの脊髄神経節由来、ヒト、マウスおよびラットの脳（皮質・海馬・中脳/後脳）由来、ヒトｉＰＳ細胞由来等を用いることができる。本実施形態では、Ｅ１５マウス由来である。
感覚神経細胞１４としては、特に限定されないが、ヒト、マウスおよびラットの脊髄神経節由来、ヒト、マウスおよびラットの脳（皮質・海馬・中脳/後脳）由来、ヒトｉＰＳ細胞由来等を用いることができる。本実施形態では、Ｅ１５マウス由来である。
【0021】
神経突起１６は、真皮組織層１０内から表皮組織層２０にかけて伸展する。神経突起１６は、スフェロイド１５が含まれる真皮組織層１０から表皮組織層２０に向けて伸展する。すなわち、真皮組織層１０は、スフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａとして、感覚神経細胞１４および神経突起１６を含む。
【0022】
（人工皮膚組織製造装置）
次に、上記の人工皮膚組織１を製造する人工皮膚組織製造装置について、図２および図３を参照して説明する。
図２は、人工皮膚組織製造装置３０を構成する培養槽４０の概略的な平面図である。図３は、人工皮膚組織製造装置３０の縦断面図である。
図２および図３に示すように、人工皮膚組織製造装置３０は、培養槽４０および培養皿５０を有する。
次に、上記の人工皮膚組織１を製造する人工皮膚組織製造装置について、図２および図３を参照して説明する。
図２は、人工皮膚組織製造装置３０を構成する培養槽４０の概略的な平面図である。図３は、人工皮膚組織製造装置３０の縦断面図である。
図２および図３に示すように、人工皮膚組織製造装置３０は、培養槽４０および培養皿５０を有する。
【0023】
培養槽４０は、平面視矩形の四角筒状に形成されている。培養槽４０は、側壁４１と、培養空間４２と、アンカー部４３とを有する。側壁４１は、矩形枠状である。培養空間４２は、側壁４１に囲まれて培養槽４０を上下方向に貫通している。アンカー部４３は、側壁４１の内壁面４１ａから培養空間４２に突出して設けられている。アンカー部４３は、矩形枠の各辺を構成する側壁４１毎に、側壁４１の長さ方向に間隔をあけて複数（図２では３つ）設けられている。対向する側壁４１に設けられたアンカー部４３は、互いに対向して配置されている。図３に示すように、アンカー部４３は、側壁４１における高さ方向の中間位置から内壁面４１ａの法線方向に沿って培養空間４２に突出する。内壁面４１ａの法線方向と平行で培養空間４２を挟んでアンカー部４３が対向する方向を対向方向と呼ぶ。
【0024】
アンカー部４３は、第１部分４３Ａと第２部分４３Ｂとを有する。第１部分４３Ａは、基端が内壁面４１ａに位置し、対向方向に沿って培養空間４２に突出する円柱形状である。第２部分４３Ｂは、第１部分４３Ａの先端に設けられる。第２部分４３Ｂは、第１部分４３Ａの先端から対向方向に沿って培養空間４２に突出する円柱（円盤）形状である。第２部分４３Ｂの外径寸法は、第１部分４３Ａの外径寸法よりも大きい。第２部分４３Ｂは、内壁面４１ａと対向する係合面４４を有する。培養空間４２において、内壁面４１ａと第１部分４３Ａの外周面と係合面４４とで囲まれた領域は、アンカー空間となる。アンカー空間に位置する培養体（詳細は後述する）は、収縮時に係合面４４に係合することによって、対向方向の収縮が抑制される。
【0025】
培養槽４０は、一例として、３Ｄプリンタでアクリル樹脂を印刷し、紫外線照射で硬化させることにより製作される。製作された培養槽４０は、化学物質や紫外線に耐性があり、生体適合性も高いパリレン等でコーティングすることが好ましい。
【0026】
培養皿５０には、培養槽４０が載置される。培養空間４２は、側壁４１と培養皿５０に囲まれて形成される。培養皿５０には、保持部５１が設けられている。保持部５１は、側壁４１の外壁面４１ｂを外側から保持する。保持部５１が外壁面４１ｂを外側から保持することによって、培養空間４２からゾルが漏出することを抑制できる。保持部５１は、一例として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を培養槽４０の周囲に流し込み所定時間焼き固めることで製作される。
【0027】
（人工皮膚組織１の製造方法）
次に、人工三次元組織の製造方法としての人工皮膚組織１の製造方法について、図３から図８を参照して説明する。
本発明に係る人工皮膚組織（人工三次元組織）１の製造方法は、側壁４１に囲まれた培養空間４２と、対向する側壁４１に設けられたアンカー部４３と、を有する培養槽４０を準備することと、培養槽４０で培養を行って、真皮細胞１２が培養された第１培養体１２Ａと、感覚神経細胞１４が密集したスフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａとを有するゲル体Ｇを得ることと、ゲル体Ｇ上に配置した表皮細胞２１を培養することと、を含む。
次に、人工三次元組織の製造方法としての人工皮膚組織１の製造方法について、図３から図８を参照して説明する。
本発明に係る人工皮膚組織（人工三次元組織）１の製造方法は、側壁４１に囲まれた培養空間４２と、対向する側壁４１に設けられたアンカー部４３と、を有する培養槽４０を準備することと、培養槽４０で培養を行って、真皮細胞１２が培養された第１培養体１２Ａと、感覚神経細胞１４が密集したスフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａとを有するゲル体Ｇを得ることと、ゲル体Ｇ上に配置した表皮細胞２１を培養することと、を含む。
【0028】
以下、人工皮膚組織１の製造方法について詳細に説明する。
［人工皮膚組織１の製造方法の第１実施形態］
まず、人工皮膚組織１の製造方法の第１実施形態について説明する。
（培養槽４０の準備）
培養槽４０の準備としては、側壁４１にアンカー部４３が設けられた培養槽４０を培養皿５０に載置するとともに、保持部５１に外壁面４１ｂを保持させることによって、培養槽４０を培養皿５０に保持させる。
［人工皮膚組織１の製造方法の第１実施形態］
まず、人工皮膚組織１の製造方法の第１実施形態について説明する。
（培養槽４０の準備）
培養槽４０の準備としては、側壁４１にアンカー部４３が設けられた培養槽４０を培養皿５０に載置するとともに、保持部５１に外壁面４１ｂを保持させることによって、培養槽４０を培養皿５０に保持させる。
【0029】
（ゲル体Ｇの取得）
第１実施形態におけるゲル体Ｇの取得においては、まず、図３に示すように、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２（例えば、正常ヒト真皮線維芽細胞）との混合物を培養槽４０の培養空間４２に注ぎ込む。混合物は、アンカー部４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。本実施形態では、細胞外マトリックス成分１１としてコラーゲンが用いられている。
第１実施形態におけるゲル体Ｇの取得においては、まず、図３に示すように、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２（例えば、正常ヒト真皮線維芽細胞）との混合物を培養槽４０の培養空間４２に注ぎ込む。混合物は、アンカー部４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。本実施形態では、細胞外マトリックス成分１１としてコラーゲンが用いられている。
【0030】
細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物が培養槽４０に注ぎ込まれると、混合物を所定条件で培養（インキュベーション）する。培養条件としては、真皮組織層１０の密度がヒトの真皮相当となる条件で行う。培養条件は、一例として、３７℃の温度下で２日間（４８時間）行う。
【0031】
培養によって細胞外マトリックス成分１１は収縮する。上述したアンカー空間に位置する細胞外マトリックス成分１１は、収縮時に係合面４４に係合するため、図４に示すように、積層方向の収縮は拘束されないが、対向方向の収縮は拘束される。これにより、真皮細胞１２が培養された細胞体の第１培養体１２Ａを含む予ゲル体ＧＰ（真皮組織層１０）を得ることができる。なお、図示は省略しているが、予ゲル体ＧＰは培地に浸漬されている。
【0032】
次に、図５に示すように、予ゲル体ＧＰの上面となっている第１面ＧａにウェルＷを配置するとともに、ウェルＷの内部に感覚神経細胞１４のスフェロイド１５を培地Ｍとともに播種して配置し培養する。なお、図５から図８においては、培養皿５０および保持部５１の図示を省略しているが、予ゲル体ＧＰにおける第１面Ｇａとは逆側の第２面Ｇｂは培地に浸漬されている。
【0033】
予ゲル体ＧＰの第１面Ｇａにおいてスフェロイド１５を培養することにより、図６に示すように、第１面Ｇａ上あるいは一部が予ゲル体ＧＰの内部に位置するスフェロイド１５を含む第２培養体１５Ａが設けられる。
これにより、真皮細胞１２が培養された細胞体の第１培養体１２Ａを有する真皮組織層１０と、感覚神経細胞１４のスフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａとを含むゲル体Ｇを得ることができる。
これにより、真皮細胞１２が培養された細胞体の第１培養体１２Ａを有する真皮組織層１０と、感覚神経細胞１４のスフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａとを含むゲル体Ｇを得ることができる。
【0034】
次に、表皮組織層２０を形成する。まず、培養槽４０の上下を反転させて、図７に示すように、第２面Ｇｂを上面とし、第１面Ｇａを下面とする。続いて、予ゲル体ＧＰの上面となっている第２面ＧｂにウェルＷを配置するとともに、ウェルＷの内部に表皮細胞２１（例えば、正常ヒト表皮角化細胞）を培地Ｍとともに播種して配置し培養する。これにより、表皮細胞２１が分化誘導されて、図８に示すように、表皮組織層２０を形成することができる。表皮組織層２０を形成する際の培養条件は、一例として、３７℃の温度下で９日間行う。
【0035】
以上の製造方法により、第１培養体１２Ａを含む真皮組織層１０のゲル体Ｇの第１面Ｇａに第２培養体１５Ａを有し、第２面Ｇｂに表皮組織層２０を有する人工皮膚組織１が得られる。
【0036】
図９は、培養中の感覚神経細胞を観察した写真図である。図９における（ａ）は明視野観察像であり、（ｂ）は蛍光観察像である。図９における（ａ）および（ｂ）に示されるように、スフェロイド周囲の細胞の広がりから，人工皮膚組織の表面においても神経突起が伸展していることを観察できた。赤色蛍光タンパク質を導入したスフェロイドを用いて観察したところ、（ｂ）に示されるように、赤い蛍光が確認されたことから観察した組織が感覚神経細胞のスフェロイドであることが確認できた。
【0037】
上記の製造方法において、表皮組織層２０を形成する際に培養槽４０の上下を反転させるため、スフェロイド１５が予ゲル体ＧＰにぶら下がる状態となっていたが、重力の影響でスフェロイド１５が予ゲル体ＧＰから剥離することはなかった。
上記の製造方法を用いることによって、培養しながら人工皮膚組織１上での感覚神経細胞１４の様子を観察することができることが確認できた。
上記の製造方法を用いることによって、培養しながら人工皮膚組織１上での感覚神経細胞１４の様子を観察することができることが確認できた。
【0038】
図１０は、ゲル体Ｇに固定後の感覚神経細胞および神経突起を示し、（ｃ）は切片の染色像、（ｄ）は組織染色像を示す図である。
図１０に示されるように、予ゲル体ＧＰにスフェロイド１５を播種した場合には、神経突起１６は主に真皮組織層１０の表面で伸展していることが観察された。これは、予ゲル体ＧＰが対向方向に収縮するため、収縮時に真皮細胞１２が対向方向に配向するからだと考えられる。
図１０に示されるように、予ゲル体ＧＰにスフェロイド１５を播種した場合には、神経突起１６は主に真皮組織層１０の表面で伸展していることが観察された。これは、予ゲル体ＧＰが対向方向に収縮するため、収縮時に真皮細胞１２が対向方向に配向するからだと考えられる。
【0039】
［人工皮膚組織１の製造方法の第２実施形態］
続いて、人工皮膚組織１の製造方法の第２実施形態について、図１１から図１８を参照して説明する。これらの図において、図１から図８に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
続いて、人工皮膚組織１の製造方法の第２実施形態について、図１１から図１８を参照して説明する。これらの図において、図１から図８に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
【0040】
（ゲル体Ｇの取得）
第２実施形態におけるゲル体Ｇの取得においては、細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２と、感覚神経細胞１４のスフェロイド１５とを培養して、第１培養体１２Ａおよび第２培養体１５Ａを内部に含むゲル体を得る。
第２実施形態におけるゲル体Ｇの取得においては、細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２と、感覚神経細胞１４のスフェロイド１５とを培養して、第１培養体１２Ａおよび第２培養体１５Ａを内部に含むゲル体を得る。
【0041】
具体的には、図１１に示すように、細胞外マトリックス成分１１と、真皮細胞１２（例えば、正常ヒト真皮線維芽細胞）と、感覚神経細胞１４のスフェロイド１５との混合物を培養槽４０の培養空間４２に注ぎ込む。混合物は、アンカー部４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。
【0042】
本実施形態におけるスフェロイド１５は、感覚神経細胞１４を凝集させるとともに単独で培養した第１サンプルと、株化したシュワン細胞を混合して培養した第２サンプルとを用いる。細胞外マトリックス成分１１と、真皮細胞１２と混合されるスフェロイド１５は、第１サンプルを用いる場合と、第２サンプルを行う場合とで個別に選択されて培養される。
【0043】
細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２とスフェロイド１５との混合物が培養槽４０に注ぎ込まれると、混合物を所定条件で培養（インキュベーション）する。
【0044】
培養によって細胞外マトリックス成分１１は収縮する。上述したアンカー空間に位置する細胞外マトリックス成分１１は、収縮時にアンカー部４３に係合するため、図１２に示すように、積層方向の収縮は拘束されないが、対向方向の収縮は拘束される。これにより、真皮細胞１２が培養された細胞体の第１培養体１２Ａと、感覚神経細胞１４のスフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａを含むゲル体Ｇ（真皮組織層１０）を得ることができる。なお、図示は省略しているが、ゲル体Ｇの下面は培地に浸漬されている。
【0045】
次に、図１３に示すように、ゲル体Ｇの上面となっている第１面ＧａにウェルＷを配置するとともに、ウェルＷの内部に表皮細胞２１（例えば、正常ヒト表皮角化細胞）を培地Ｍとともに播種して配置し培養する。これにより、表皮細胞２１が分化誘導されて、図１４に示すように、表皮組織層２０を形成することができる。表皮組織層２０を形成する際の培養条件は、一例として、３７℃の温度下で９日間行う。
【0046】
以上の製造方法により、第１培養体１２Ａおよび第２培養体１５Ａを含む真皮組織層１０のゲル体Ｇの第１面Ｇａに表皮組織層２０を有する人工皮膚組織１が得られる。
【0047】
図１５は、スフェロイド１５のみの第１サンプルを用いて第２実施形態の製造方法で製造された人工皮膚組織の断面染色像である。図１５において、像（ｅ’）は、像（ｅ）の拡大図である。図１６は、第１サンプルを用いて第２実施形態の製造方法で製造された人工皮膚組織の切片の染色像である。
図１５および図１６に示されるように、真皮組織層１０のゲル体Ｇの内部にスフェロイド１５を配置した場合は、真皮組織層１０の厚さの半分程度まで神経突起の伸展が観察された。
図１５および図１６に示されるように、真皮組織層１０のゲル体Ｇの内部にスフェロイド１５を配置した場合は、真皮組織層１０の厚さの半分程度まで神経突起の伸展が観察された。
【0048】
図１７は、スフェロイドの染色像であり、（ｆ）はスフェロイドのみで培養した第１サンプルの染色像、（ｇ）はスフェロイドと、株化したシュワン細胞を混合して培養した第２サンプルの染色像である。
図１７に示されるように、株化したシュワン細胞をスフェロイドに組み込んだ場合の方が、神経突起の伸展が大きいことが確認できた。
従って、株化したシュワン細胞が組み込まれたスフェロイドの第２サンプルを用いて、第２実施形態の製造方法で人工皮膚組織を製造することによって、神経細胞が真皮組織層から表皮組織層に達するまで伸展すると考えられる。
図１７に示されるように、株化したシュワン細胞をスフェロイドに組み込んだ場合の方が、神経突起の伸展が大きいことが確認できた。
従って、株化したシュワン細胞が組み込まれたスフェロイドの第２サンプルを用いて、第２実施形態の製造方法で人工皮膚組織を製造することによって、神経細胞が真皮組織層から表皮組織層に達するまで伸展すると考えられる。
【0049】
図１８は、感覚神経細胞とシュワン細胞との混合比を変えたスフェロイドを培養したときの免疫染色像である。感覚神経細胞とシュワン細胞との混合比としては、［感覚神経細胞の数：シュワン細胞の数］が３：１から１：３の範囲であることが好ましく、１：１から１：３の範囲であることがより好ましい。
図１８には、感覚神経細胞のみを用いた染色像、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：１（１００００個：１００００個）としたときの染色像、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：２（６７００個：１３３００個）としたときの染色像、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：３（５０００個：１５０００個）としたときの染色像および感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：４（２５００個：１７５００個）としたときの染色像が示されている。
図１８に示されるように、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：１から１：３の範囲で混合して培養することによって神経突起の伸展が大きく、株化したシュワン細胞を組み込む効果が高いことを確認できた。
図１８には、感覚神経細胞のみを用いた染色像、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：１（１００００個：１００００個）としたときの染色像、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：２（６７００個：１３３００個）としたときの染色像、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：３（５０００個：１５０００個）としたときの染色像および感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：４（２５００個：１７５００個）としたときの染色像が示されている。
図１８に示されるように、感覚神経細胞数とシュワン細胞数を１：１から１：３の範囲で混合して培養することによって神経突起の伸展が大きく、株化したシュワン細胞を組み込む効果が高いことを確認できた。
【0050】
［人工皮膚組織１の製造方法の第３実施形態］
続いて、人工皮膚組織１の製造方法の第３実施形態について、図１９から図２０を参照して説明する。これらの図において、図１１から図１８に示す第２実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
続いて、人工皮膚組織１の製造方法の第３実施形態について、図１９から図２０を参照して説明する。これらの図において、図１１から図１８に示す第２実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
【0051】
図１９に示すように、本実施形態の製造方法では、対向するアンカー部４３の間に対向方向に沿って線状の保持部材４５を設置することが培養槽４０の準備に含まれる。
保持部材４５の素材としては、人工皮膚組織１の培養に悪影響を与えなければ、特に限定されないが、細胞外マトリックス成分１１中での培養時にスフェロイド１５が付着しやすい素材であることが好ましい。
保持部材４５の素材としては、人工皮膚組織１の培養に悪影響を与えなければ、特に限定されないが、細胞外マトリックス成分１１中での培養時にスフェロイド１５が付着しやすい素材であることが好ましい。
【0052】
上記第２実施形態の製造方法において、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２とスフェロイド１５との混合物を培養する際に、スフェロイド１５は自重により沈降する。そのため、人工皮膚組織１においてスフェロイド１５と表皮組織層２０との距離が長くなり、スフェロイド１５から伸展した神経突起が表皮組織層２０に達しづらくなると考えられる。
【0053】
本実施形態では、アンカー部４３の間に対向方向に沿って線状の保持部材４５を設置しているため、混合物を培養する際に沈降するスフェロイド１５の少なくとも一部は、保持部材４５に付着して保持される。保持されスフェロイド１５は、図２０に示すように、真皮組織層１０における高さ方向の中央近傍に位置するため、スフェロイド１５から伸展した神経突起は、表皮組織層２０および真皮組織層１０の下面の双方に達しやすくなる。
【0054】
［人工皮膚組織１の製造方法の第４実施形態］
続いて、人工皮膚組織１の製造方法の第４実施形態について、図２１から図２２を参照して説明する。これらの図において、図３から図８に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
続いて、人工皮膚組織１の製造方法の第４実施形態について、図２１から図２２を参照して説明する。これらの図において、図３から図８に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
【0055】
本実施形態の製造方法では、スフェロイド１５の最大径よりも大きく、アンカー部４３における第１部分４３Ａの外径よりも小さい直径を有する線状部材４６を用いる。線状部材４６は、アンカー部４３と同軸でアンカー部４３および側壁４１を貫通し、且つ、抜き差し可能に設ける。
【0056】
予ゲル体ＧＰ（真皮組織層１０）の取得は、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物を培養槽４０に注ぎ込み、培養することにより行われる。これにより、線状部材４６が対向方向に貫く予ゲル体ＧＰが得られる。
予ゲル体ＧＰが得られた後には、線状部材４６を抜去して、図２２に示すように、予ゲル体ＧＰを対向方向に貫く空洞４６Ａを形成する。空洞４６Ａは、真皮組織層１０における高さ方向の中央近傍に位置する。
予ゲル体ＧＰが得られた後には、線状部材４６を抜去して、図２２に示すように、予ゲル体ＧＰを対向方向に貫く空洞４６Ａを形成する。空洞４６Ａは、真皮組織層１０における高さ方向の中央近傍に位置する。
【0057】
次に、予ゲル体ＧＰの空洞４６Ａにスフェロイド１５を培地とともに播種して配置し培養する。空洞４６Ａにスフェロイド１５を培地とともに配置した後には、栓体４３Ｃを埋め込んでスフェロイド１５および培地の漏出を防ぐ。そして、スフェロイド１５を培養することによって、スフェロイド１５を含む第２培養体１５Ａが設けられる。
【0058】
本実施形態では、真皮組織層１０における高さ方向の中央近傍に位置する空洞４６Ａにおいて、スフェロイド１５を培養するため、上記第３実施形態と同様に、真皮組織層１０における高さ方向の中央近傍に位置する。
従って、本実施形態の製造方法を用いることによって、スフェロイド１５から伸展した神経突起は、表皮組織層２０および真皮組織層１０の下面の双方に達しやすくなる。
従って、本実施形態の製造方法を用いることによって、スフェロイド１５から伸展した神経突起は、表皮組織層２０および真皮組織層１０の下面の双方に達しやすくなる。
【0059】
［人工皮膚組織１の計測方法］
人工皮膚組織１の計測方法においては、上述した製造方法で得られた人工皮膚組織１の細胞外電位の計測を行う。図２３は、人工皮膚組織１の計測方法を示す断面図である。細胞外電位の計測は、図２３に示すように、計測器６０を用いて行われる。計測器６０は、上面に複数の微小電極がアレイ状に配列されたアレイチップ６１を有する。アレイチップ６１における微小電極で計測された電位は、図示しない制御部に出力される。
人工皮膚組織１の計測方法においては、上述した製造方法で得られた人工皮膚組織１の細胞外電位の計測を行う。図２３は、人工皮膚組織１の計測方法を示す断面図である。細胞外電位の計測は、図２３に示すように、計測器６０を用いて行われる。計測器６０は、上面に複数の微小電極がアレイ状に配列されたアレイチップ６１を有する。アレイチップ６１における微小電極で計測された電位は、図示しない制御部に出力される。
【0060】
人工皮膚組織１の計測方法は、上記計測器６０を準備することと、上述した製造方法で製造された人工皮膚組織１をアレイチップ６１（微小電極）上に載せることと、を含む。人工皮膚組織１の計測方法は、アレイチップ６１上に載せ人工皮膚組織１をアレイチップ６１に向けて押し付けることをさらに含む。人工皮膚組織１をアレイチップ６１に向けて押し付けることは、人工皮膚組織１の上側に載せたホルダ６２を下側に駆動することで行われる。ホルダ６２を下側に駆動することによって、アレイチップ６１と人工皮膚組織１におけるスフェロイド１５との密着性が高まり、細胞外電位の計測精度を高めることができる。
【0061】
図２４は、アレイチップ６１における電極マップ、電極の位置およびアドレスを模式的に示した拡大図である。図２４においては、アドレス８４３４－８４３６、８６５４－８６５６の電極で電位が計測された状態が示されている。
【0062】
図２５は、各アドレスの電極において計測された時間と電圧との関係を示す図である。
図２６は、各アドレスの電極において計測された時間と振幅との関係を示す図である。
図２５に示されるように、スパイク様シグナルが電極に供給されていることを確認できた。上記の結果から、特定の電極周辺で同期的なスパイク用波形が計測されたことから、感覚神経の活動を計測できたと考えられ、人工皮膚組織１における感覚神経細胞の機能が計測できたことが示唆される。
従って、本実施形態の人工皮膚組織１の計測方法を用いることによって、感覚神経細胞の機能解析を容易に行うことができる。
図２６は、各アドレスの電極において計測された時間と振幅との関係を示す図である。
図２５に示されるように、スパイク様シグナルが電極に供給されていることを確認できた。上記の結果から、特定の電極周辺で同期的なスパイク用波形が計測されたことから、感覚神経の活動を計測できたと考えられ、人工皮膚組織１における感覚神経細胞の機能が計測できたことが示唆される。
従って、本実施形態の人工皮膚組織１の計測方法を用いることによって、感覚神経細胞の機能解析を容易に行うことができる。
【0063】
（薬剤の評価）
本発明は、さらにその他の態様として、薬剤の人工皮膚組織１に対する刺激性を評価することができる。薬剤の評価は、例えば、薬剤を人工皮膚組織１と接触させること、及び、薬剤の接触による刺激に対する応答を、上記の計測方法を用いて計測することにより行うことができる。
本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の人工皮膚組織１に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及び有機化合物等が挙げられる。
本発明は、さらにその他の態様として、薬剤の人工皮膚組織１に対する刺激性を評価することができる。薬剤の評価は、例えば、薬剤を人工皮膚組織１と接触させること、及び、薬剤の接触による刺激に対する応答を、上記の計測方法を用いて計測することにより行うことができる。
本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の人工皮膚組織１に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及び有機化合物等が挙げられる。
【0064】
以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
【0065】
例えば、人工皮膚組織１の計測方法においては、上述した製造方法で製造された人工皮膚組織１をアレイチップ６１上に載せる手順を例示したが、この構成に限定されない。例えば、上述した製造方法において、培養槽４０を準備することは、計測器６０を準備することと、当該培養槽４０をアレイチップ６１（微小電極）上に設置することと、を含んでもよい。この場合、培養槽４０で培養を行って、真皮細胞１２が培養された第１培養体１２Ａと、感覚神経細胞１４が密集したスフェロイド１５が培養された第２培養体１５Ａとを有するゲル体Ｇを得ることと、ゲル体Ｇ上に配置した表皮細胞２１を培養することをアレイチップ６１（微小電極）上で行ってもよい。
この製造方法を用いることで、人工皮膚組織１をアレイチップ６１上に載せる手順を行うことなく、人工皮膚組織１の製造過程において感覚神経細胞の機能解析を容易に行うことが可能になる。
この製造方法を用いることで、人工皮膚組織１をアレイチップ６１上に載せる手順を行うことなく、人工皮膚組織１の製造過程において感覚神経細胞の機能解析を容易に行うことが可能になる。
【0066】
また、上記実施形態で示した保持部材４５は、人工皮膚組織１の培養に悪影響を与えな線状の部材を例示したが、この構成に限定されない。例えば、ゲル材またはポリマーで作製したスフェロイド１５付きあるいはスフェロイド１５入りのファイバーを用いる構成であってもよい。
この構成を採ることにより、培養中に沈降して保持部材４５に付着したスフェロイド１５に加えて、保持部材４５に設けられたスフェロイド１５から伸展した神経突起が表皮組織層２０および真皮組織層１０の下面の双方に達しやすくなる。
この構成を採ることにより、培養中に沈降して保持部材４５に付着したスフェロイド１５に加えて、保持部材４５に設けられたスフェロイド１５から伸展した神経突起が表皮組織層２０および真皮組織層１０の下面の双方に達しやすくなる。
【0067】
なお、以上の実施形態において説明された発明を整理して、付記として開示する。
（付記１）
側壁に囲まれた培養空間と、対向する前記側壁に設けられたアンカー部と、を有する培養槽を準備することと、前記培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、前記ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、を含む、人工三次元組織の製造方法。
（付記１）
側壁に囲まれた培養空間と、対向する前記側壁に設けられたアンカー部と、を有する培養槽を準備することと、前記培養槽で培養を行って、真皮細胞が培養された第１培養体と、感覚神経細胞が密集したスフェロイドが培養された第２培養体とを有するゲル体を得ることと、前記ゲル体上に配置した表皮細胞を培養することと、を含む、人工三次元組織の製造方法。
【0068】
（付記２）
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含む予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体の第１面に配置した前記スフェロイドを培養して、前記第１面に前記第２培養体を有する前記予ゲル体を得ることと、
前記第２培養体を有する前記予ゲル体における前記第１面と逆側の第２面に配置した前記表皮細胞を培養することと、
を含む、
付記１に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含む予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体の第１面に配置した前記スフェロイドを培養して、前記第１面に前記第２培養体を有する前記予ゲル体を得ることと、
前記第２培養体を有する前記予ゲル体における前記第１面と逆側の第２面に配置した前記表皮細胞を培養することと、
を含む、
付記１に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0069】
（付記３）
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞および前記スフェロイドを培養して、前記第１培養体および前記第２培養体を内部に含む前記ゲル体を得ることである、
付記１に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞および前記スフェロイドを培養して、前記第１培養体および前記第２培養体を内部に含む前記ゲル体を得ることである、
付記１に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0070】
（付記４）
前記培養槽を準備することは、対向する前記アンカー部の間に対向方向に沿って線状の保持部材を設置することを含む、
付記３に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記培養槽を準備することは、対向する前記アンカー部の間に対向方向に沿って線状の保持部材を設置することを含む、
付記３に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0071】
（付記５）
前記培養槽を準備することは、対向する前記アンカー部の間に対向方向に沿って線状部材を設置することを含み、
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含み、前記線状部材が前記対向方向に貫く予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体から前記線状部材を抜去して、前記予ゲル体を前記対向方向に貫く空洞を形成することと、
前記空洞に配置した前記スフェロイドを培養して前記第２培養体を得ることと、
を含む、
付記１に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記培養槽を準備することは、対向する前記アンカー部の間に対向方向に沿って線状部材を設置することを含み、
前記第１培養体および前記第２培養体を有する前記ゲル体を得ることは、
細胞外マトリックス成分中の前記真皮細胞を培養し前記第１培養体を含み、前記線状部材が前記対向方向に貫く予ゲル体を得ることと、
前記予ゲル体から前記線状部材を抜去して、前記予ゲル体を前記対向方向に貫く空洞を形成することと、
前記空洞に配置した前記スフェロイドを培養して前記第２培養体を得ることと、
を含む、
付記１に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0072】
（付記６）
前記スフェロイドとシュワン細胞とを培養して前記第２培養体を得る、
付記１から付記５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記スフェロイドとシュワン細胞とを培養して前記第２培養体を得る、
付記１から付記５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0073】
（付記７）
前記感覚神経細胞数と前記シュワン細胞数とを、３：１から１：３の割合の範囲で混合して培養する、
付記６に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記感覚神経細胞数と前記シュワン細胞数とを、３：１から１：３の割合の範囲で混合して培養する、
付記６に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0074】
（付記８）
前記培養槽を準備することは、複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を設置することを含み、
前記ゲル体を得ることと、前記表皮細胞を培養することと、を前記電極上で行う、
付記１から付記７のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
前記培養槽を準備することは、複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を設置することを含み、
前記ゲル体を得ることと、前記表皮細胞を培養することと、を前記電極上で行う、
付記１から付記７のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
【0075】
（付記９）
複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を準備することと、
付記１から付記８のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法で製造された前記人工三次元組織を前記電極上に載せることと、
を含む、人工三次元組織の計測方法。
複数の電極がアレイ状に配列され、前記電極で細胞外電位の計測を行う計測器を準備することと、
付記１から付記８のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法で製造された前記人工三次元組織を前記電極上に載せることと、
を含む、人工三次元組織の計測方法。
【0076】
（付記１０）
前記電極上に載せた前記人工三次元組織を前記電極に向けて押し付けることを含む、
付記９に記載の人工三次元組織の計測方法。
前記電極上に載せた前記人工三次元組織を前記電極に向けて押し付けることを含む、
付記９に記載の人工三次元組織の計測方法。
【0077】
（付記１１）
前記人工三次元組織に薬剤を接触させることと、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を計測して前記薬剤を評価することと、
を含む、
付記９または付記１０に記載の人工三次元組織の計測方法。
前記人工三次元組織に薬剤を接触させることと、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を計測して前記薬剤を評価することと、
を含む、
付記９または付記１０に記載の人工三次元組織の計測方法。
【0078】
（付記１２）
真皮細胞を含む真皮組織層と、
表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層と、
前記真皮組織層に含まれ、神経突起を有する感覚神経細胞が密集したスフェロイドと、
を有する、人工三次元組織。
真皮細胞を含む真皮組織層と、
表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層と、
前記真皮組織層に含まれ、神経突起を有する感覚神経細胞が密集したスフェロイドと、
を有する、人工三次元組織。
【符号の説明】
【0079】
１…人工皮膚組織（人工三次元組織）、 １０…真皮組織層、 １１…細胞外マトリックス成分、 １２…真皮細胞、 １２Ａ…第１培養体、 １４…感覚神経細胞、 １５…スフェロイド、 １５Ａ…第２培養体、 １６…神経突起、 ２０…表皮組織層、 ２１…表皮細胞、 ４０…培養槽、 ４１…側壁、 ４２…培養空間、 ４３…アンカー部、 ４５…保持部材、 ４６…線状部材、 ６０…計測器、 Ｇ…ゲル体、 Ｇａ…第１面、 Ｇｂ…第２面、 ＧＰ…予ゲル体
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】