(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023048189
(43)【公開日】2023-04-07
(54)【発明の名称】試料観察方法、試料観察装置、及び顕微鏡
(51)【国際特許分類】
G01N 21/49 20060101AFI20230331BHJP
G01N 21/17 20060101ALI20230331BHJP
【ＦＩ】
G01N21/49 Z
G01N21/17 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021157354
(22)【出願日】2021-09-28
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】504202472
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100119677
【弁理士】
【氏名又は名称】岡田 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100115794
【弁理士】
【氏名又は名称】今下 勝博
(72)【発明者】
【氏名】島野 美保子
(72)【発明者】
【氏名】浅野 祐太
(72)【発明者】
【氏名】石原 慎
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 いまり
(72)【発明者】
【氏名】備瀬 竜馬
【テーマコード（参考）】
2G059
【Ｆターム（参考）】
2G059AA05
2G059BB12
2G059BB14
2G059EE02
2G059FF01
2G059FF03
2G059GG02
2G059KK04
2G059MM01
2G059PP04
(57)【要約】
【課題】空間的に不均質な物体の散乱特性を測定することを可能とする試料観察方法、試料観察装置、及び顕微鏡を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る試料観察方法及び試料観察装置は、市松模様のように光透過部（明部）と光遮断部（暗部）で構成される２値の照明パターンの周波数（すなわち、明部と暗部の領域の大きさ）によって、散乱角度の範囲を制御できることを特徴とする。換言すれば、本試料観察方法は、光センサが、明部のサイズが大きいとき（低周波）には散乱角度の広い光線を受光し、明部のサイズが小さいとき（高周波）には散乱角度が狭い光線を受光することを利用して空間的に不均質な物体の散乱特性を測定する。
【選択図】図６
【解決手段】本発明に係る試料観察方法及び試料観察装置は、市松模様のように光透過部（明部）と光遮断部（暗部）で構成される２値の照明パターンの周波数（すなわち、明部と暗部の領域の大きさ）によって、散乱角度の範囲を制御できることを特徴とする。換言すれば、本試料観察方法は、光センサが、明部のサイズが大きいとき（低周波）には散乱角度の広い光線を受光し、明部のサイズが小さいとき（高周波）には散乱角度が狭い光線を受光することを利用して空間的に不均質な物体の散乱特性を測定する。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｚ方向において、光センサの焦点、及び光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス手順と、
前記フォーカス手順を行った後、前記照明パターンの前記明部を透過した光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手順と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離する分離手順と、
前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて前記光強度取得手順と前記分離手順とを繰り返し行う繰り返し手順と、
前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算手順と、
を行う試料観察方法。
前記フォーカス手順を行った後、前記照明パターンの前記明部を透過した光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手順と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離する分離手順と、
前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて前記光強度取得手順と前記分離手順とを繰り返し行う繰り返し手順と、
前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算手順と、
を行う試料観察方法。
【請求項2】
前記散乱角度毎の光強度から、前記観測点における散乱モデルのパラメータを推定する推定手順と、
前記観測点ごとの前記パラメータを前記観測点の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成するマップ生成手順と、
をさらに行う請求項１に記載の試料観察方法。
前記観測点ごとの前記パラメータを前記観測点の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成するマップ生成手順と、
をさらに行う請求項１に記載の試料観察方法。
【請求項3】
前記散乱特性マップが、前記パラメータに基づいて可視化されることを特徴とする請求項２に記載の試料観察方法。
【請求項4】
前記照明パターンが市松模様であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の試料観察方法。
【請求項5】
光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンと、
Ｚ方向において光センサ及び前記照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス機構と、
前記フォーカス機構で前記光センサと前記照明パターンの双方の焦点を前記観測点に合わせた状態で、前記照明パターンの光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手段と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離することを前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて行い、前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算器と、
を備える試料観察装置。
Ｚ方向において光センサ及び前記照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス機構と、
前記フォーカス機構で前記光センサと前記照明パターンの双方の焦点を前記観測点に合わせた状態で、前記照明パターンの光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手段と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離することを前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて行い、前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算器と、
を備える試料観察装置。
【請求項6】
前記演算器は、
前記散乱角度毎の光強度から、前記観測点における散乱モデルのパラメータを推定すること、及び
前記観測点ごとの前記パラメータを前記観測点の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成すること
をさらに行う請求項５に記載の試料観察装置。
前記散乱角度毎の光強度から、前記観測点における散乱モデルのパラメータを推定すること、及び
前記観測点ごとの前記パラメータを前記観測点の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成すること
をさらに行う請求項５に記載の試料観察装置。
【請求項7】
前記演算器は、前記散乱特性マップを前記パラメータに基づいて可視化することを特徴とする請求項６に記載の試料観察装置。
【請求項8】
前記照明パターンが市松模様であることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の試料観察装置。
【請求項9】
請求項５から８のいずれかに記載の試料観察装置を備える顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、試料の散乱特性を計測する試料観察方法及びその装置とそれを搭載する顕微鏡に関する。
【背景技術】
【0002】
散乱は、直接反射や吸収に加えて、本質的な光学特性の一つである。近年、散乱の角度分布を含む散乱特性は、細胞の検出、癌過程の分析、異形成や癌の診断など、光学的イメージングや診断用途に使用されている（例えば、非特許文献１～３を参照。）。このため、従来の顕微鏡法では不可能だった散乱特性の可視化は、バイオメディカル画像解析等への適用が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】ＬＤｒｅｚｅｋ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．： Ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ， ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｔｅｘｔｕｒｅ． Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｏｐｔ． ８（１）， ７－１６ （２００３）．
【非特許文献2】Ｌｉｎ， Ｘ．， Ｗａｎ， Ｎ．， Ｗｅｎｇ， Ｌ．， Ｚｈｏｕ， Ｙ．： Ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ａｐｐｌ． Ｏｐｔ． ５６， ３６０８ （２０１７）．
【非特許文献3】Ｌｏｖａｔ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．： ４９１９ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｐｔｉｃａｌ ｂｉｏｐｓｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ｅｌａｓｔｉｃ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｄｙｓｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ． Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ． Ｅｎｄｏｓｃ．５１， ＡＮ２２７ （２０００）．
【非特許文献4】Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ， Ｓ．， Ｇｕｐｔａ， Ｍ．， Ｄｏｎｎｅｒ， Ｃ．， Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｉ， Ｒ．， Ｎａｙａｒ， Ｓ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｈ．Ｗ．： Ａｃｑｕｉｒｉｎｇ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ ｂｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ． ＡＣＭ Ｔｒａｎｓ． Ｇｒａｐｈ． ２５（３）， １００３－１０１２ （２００６）
【非特許文献5】Ｎａｙａｒ， Ｓ．Ｋ．， Ｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｇ．， Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ， Ｍ．Ｄ．， Ｒａｓｋａｒ， Ｒ．： Ｆａｓｔ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ａ Ｓｃｅｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ． ＡＣＭ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ２５（３）， ｐｐ． ９３５－９４４ （２００６）
【非特許文献6】Ｔａｎａｋａ， Ｋ．， Ｍｕｋａｉｇａｗａ， Ｙ．， Ｋｕｂｏ， Ｈ．， Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ， Ｙ．， Ｙａｇｉ， Ｙ．： Ｄｅｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｖｅ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｉｎ： ＩＥＥＥ Ｃｏｎ－ｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ， （２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
図１は、散乱特性を説明する強度分布の例である。散乱とは、図１に示すように、組織中の粒子３１が入射光３２を受けて、異なる方向に異なる強度で光３３を再放出する現象である。本明細書では、異なる角度（散乱角度）における散乱光線の強度分布を「散乱特性」と呼ぶ。図１（ｂ）の分布は前方散乱の例であり、散乱角度が小さい部分（例えば、θ１）の光強度が高く、散乱角度が大きくなる（例えば、θ２、θ３）と光強度が急激に低下している。これに対し、図１（ａ）は当方散乱の例であり、いずれの散乱角度においても光強度が等しい。
【0005】
このような散乱特性を測定するためには、複数の散乱角度における光線の強度分布を測定する必要がある。例えば、非特許文献４は、均質な液体中で散乱した光の角度分布を観察することで散乱特性を測定する手法を開示する。
【0006】
しかし、非特許文献４の手法は液体の散乱特性を測定する手法であって、空間的に不均質な物体の散乱特性を測定することはできない。このため、現在、空間的に不均質な物体の散乱特性を測定することが必要な、上述したような細胞の検出、癌過程の分析、異形成や癌を診断することが困難という課題がある。
【0007】
そこで、本発明は、上記課題を解決すべく、空間的に不均質な物体の散乱特性を測定することを可能とする試料観察方法、試料観察装置、及び顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記目的を達成するために、本発明に係る試料観察方法及び試料観察装置は、散乱角度の範囲を制御できる照明パターンの空間周波数を変化させることで、撮影された光を角度ごとの直接散乱光に分解することとした。
【0009】
具体的には、本発明に係る試料観察方法は、
Ｚ方向において、光センサの焦点、及び光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス手順と、
前記フォーカス手順を行った後、前記照明パターンの前記明部を透過した光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手順と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離する分離手順と、
前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて前記光強度取得手順と前記分離手順とを繰り返し行う繰り返し手順と、
前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算手順と、
を行う。
Ｚ方向において、光センサの焦点、及び光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス手順と、
前記フォーカス手順を行った後、前記照明パターンの前記明部を透過した光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手順と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離する分離手順と、
前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて前記光強度取得手順と前記分離手順とを繰り返し行う繰り返し手順と、
前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算手順と、
を行う。
【0010】
また、本発明に係る試料観察装置は、
光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンと、
Ｚ方向において光センサ及び前記照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス機構と、
前記フォーカス機構で前記光センサと前記照明パターンの双方の焦点を前記観測点に合わせた状態で、前記照明パターンの光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手段と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離することを前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて行い、前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算器と、
を備える。
光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンと、
Ｚ方向において光センサ及び前記照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス機構と、
前記フォーカス機構で前記光センサと前記照明パターンの双方の焦点を前記観測点に合わせた状態で、前記照明パターンの光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手段と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分及び前記直接成分以外の大域成分と、前記第２光強度に含まれる前記大域成分と、を利用し、前記第１光強度から前記直接成分と前記大域成分とを分離することを前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて行い、前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算器と、
を備える。
【0011】
観測した試料を可視化するために、前記演算器は、
前記散乱角度毎の光強度から、前記観測点における散乱モデルのパラメータを推定すること、及び
前記観測点ごとの前記パラメータを前記観測点の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成すること
をさらに行う。
前記散乱角度毎の光強度から、前記観測点における散乱モデルのパラメータを推定すること、及び
前記観測点ごとの前記パラメータを前記観測点の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成すること
をさらに行う。
【0012】
前記散乱特性マップが、前記パラメータに基づいて可視化されることが好ましい。
【0013】
ここで、前記照明パターンが市松模様であることが好ましい。
【0014】
さらに、前記試料観察装置は、光透過型の顕微鏡に搭載することができる。
【0015】
本発明は、顕微鏡下の高周波照明投影による散乱の拡がり角度の分布情報を抽出する手法である。空間的に高周波な照明パターンのサイズと散乱角度の関係性を導き、これに基づき、複数の高周波照明パターンのサイズを投影することによって、試料中の各位置での散乱の拡がり角度の分布を推定する。
【0016】
従って、本発明は、空間的に不均質な物体の散乱特性を測定することを可能とする試料観察方法、試料観察装置、及び顕微鏡を提供することができる。
【発明の効果】
【0017】
本発明は、空間的に不均質な物体の散乱特性を測定することを可能とする試料観察方法、試料観察装置、及び顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】散乱特性を説明する図である。
【図2】透過光と散乱光を説明する図である。
【図3】本発明に関連する観察方法を説明する図である。
【図4】本発明に関連する観察方法を説明する図である。
【図5】本発明に係る顕微鏡を説明する図である。
【図6】本発明に係る顕微鏡を説明する図である。
【図7】本発明に係る試料観察装置の測定原理を説明する図である。
【図8】本発明に係る試料観察装置の測定原理を説明する図である。
【図9】本発明に係る試料観察方法を説明する図である。
【図10】本発明に係る試料観察装置の測定原理を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
添付の図面を参照して本発明の実施形態を説明する。以下に説明する実施形態は本発明の実施例であり、本発明は、以下の実施形態に制限されるものではない。なお、本明細書及び図面において符号が同じ構成要素は、相互に同一のものを示すものとする。
【0020】
（実施形態１）
透過型光学顕微鏡は、生物医学、食品安全、および他の多くの用途に広く使用されている。顕微鏡で標本を観察する場合、光は画像センサに達する前に標本中の小さな粒子に当たり方向を変える。その結果、画像センサは、異なる経路を通る散乱光線の合計を捕捉することになる。この光の散乱は、観察される画像を不明瞭にする。
透過型光学顕微鏡は、生物医学、食品安全、および他の多くの用途に広く使用されている。顕微鏡で標本を観察する場合、光は画像センサに達する前に標本中の小さな粒子に当たり方向を変える。その結果、画像センサは、異なる経路を通る散乱光線の合計を捕捉することになる。この光の散乱は、観察される画像を不明瞭にする。
【0021】
散乱による画像の不明瞭化は、生物医学的画像形成において大きな課題となっている。例えば、生体組織の空間スペクトル解析において、吸収係数は特定点で正確に測定できなければならない。しかし、測定された信号は、特定点と異なる点からの散乱光を含み、その散乱光は組織内の異なる点の情報を含む。生体組織の特定点で正確に測定するには、特定からの直接的な光と他の点からの散乱光を分離することが不可欠である。
【0022】
しかし、焦点調節可能な光学系を設けた顕微鏡の場合、試料の厚み方向の情報が加わるため、非特許文献５のような反射型の手法や非特許文献６のような平行光の高周波照明を利用する透過型の手法では、試料で反射した光や試料を透過した光を直接成分と大域成分とに分離することができず、画像の鮮明化や空間スペクトル解析が困難という課題があった。
【0023】
そこで、本実施形態では、上記課題を解決すべく、焦点調節可能な光学系を有する（平行光ではない）場合であっても、試料の画像の鮮明化や空間スペクトル解析を可能とする試料観察方法について説明する。
【0024】
［１］透過光と散乱光の重畳
前述のように、透過光顕微鏡で観察される不明瞭な画像の理由の一つは、測定された光が、所望の観測点を通過した光に異なる点からの散乱光が重なり、試料内の異なる点で光吸収されているためである。本セクションでは、透過型顕微鏡で試料を通過するこれらの光を調べ、どのような光が重なり合ってカメラ（イメージセンサ）に到達するかを説明する。
前述のように、透過光顕微鏡で観察される不明瞭な画像の理由の一つは、測定された光が、所望の観測点を通過した光に異なる点からの散乱光が重なり、試料内の異なる点で光吸収されているためである。本セクションでは、透過型顕微鏡で試料を通過するこれらの光を調べ、どのような光が重なり合ってカメラ（イメージセンサ）に到達するかを説明する。
【0025】
重なり合うすべての光を説明するために、透過型顕微鏡で観測点における光強度を測定する場合を考える。光センサに到達する光は、観測点のみで散乱する観測点単一散乱光（直接透過光）、観測点とは異なる深さにある他点で一度だけ散乱した他点単一散乱光、および多重散乱光の3種類が考えられる。図2は各光の経路の説明図であり、観測点は白丸である。図２（ｂ）の黒実線矢印は、観測点でのみ散乱された後、散乱されずに光センサに到達する観測点単一散乱光（直接透過光）である。この光が観察対象の直接成分である。図２（ｃ）の破線矢印は、試料内で観測点と異なる深さに位置する観測点以外の点で１回だけ散乱した他点単一散乱光と、試料内で複数回散乱した多重散乱光であり、大域成分である。大域成分の散乱光は観測点単一散乱光（直接透過光）と重なり、同じ光センサに到達する（図２（ａ））。大域成分は、光センサにおいて直接成分の比率を低下させ画像を不明瞭にする。したがって、光センサに到達するこれらの重なり合う光を直接成分と大域成分に分離する必要がある。
【0026】
［２］直接成分と大域成分の分離
図３（ａ）は、直接成分と大域成分を分離する本実施形態の透過型顕微鏡を説明する図である。本実施形態の透過型顕微鏡は、照明１３、光センサ１５、光センサ側レンズ１２、及び照明側レンズ１４を備える顕微鏡であって、透過型試料観察装置１００が組み込まれることで試料５０内の観測点３１のみで散乱する単一散乱光を観察可能となることを特徴とする。図５は、本実施形態の透過型顕微鏡の説明にあたり、Ｘ，Ｙ及びＺの方向、試料５０内の観測点３１、並びに観測点３１を含むＸＹ平面（スライス）を説明する図である。
図３（ａ）は、直接成分と大域成分を分離する本実施形態の透過型顕微鏡を説明する図である。本実施形態の透過型顕微鏡は、照明１３、光センサ１５、光センサ側レンズ１２、及び照明側レンズ１４を備える顕微鏡であって、透過型試料観察装置１００が組み込まれることで試料５０内の観測点３１のみで散乱する単一散乱光を観察可能となることを特徴とする。図５は、本実施形態の透過型顕微鏡の説明にあたり、Ｘ，Ｙ及びＺの方向、試料５０内の観測点３１、並びに観測点３１を含むＸＹ平面（スライス）を説明する図である。
【0027】
ここで、透過型試料観察装置１００は、
試料５０の厚みより薄い焦点深度を有し、光センサ１５と試料５０との間にある光センサ側レンズ１２の焦点を試料５０内の観測点３１に合わせる工程、及び試料５０の厚みより薄い焦点深度を有し、試料５０に対して光センサ１５の反対側の照明１３と試料５０との間にある照明側レンズ１４の焦点を観測点３１に合わせる工程の少なくとも一方を行うフォーカス機構１８と、
照明１３の光を観測点３１に照射したときの第１光強度と観測点３１以外に照射したときの第２光強度とを光センサ１５で取得する光強度取得手段１９と、
前記第１光強度から前記第２光強度を減算した光強度を観測点３１の透過光の成分とする演算器１７と、
を備える。
試料５０の厚みより薄い焦点深度を有し、光センサ１５と試料５０との間にある光センサ側レンズ１２の焦点を試料５０内の観測点３１に合わせる工程、及び試料５０の厚みより薄い焦点深度を有し、試料５０に対して光センサ１５の反対側の照明１３と試料５０との間にある照明側レンズ１４の焦点を観測点３１に合わせる工程の少なくとも一方を行うフォーカス機構１８と、
照明１３の光を観測点３１に照射したときの第１光強度と観測点３１以外に照射したときの第２光強度とを光センサ１５で取得する光強度取得手段１９と、
前記第１光強度から前記第２光強度を減算した光強度を観測点３１の透過光の成分とする演算器１７と、
を備える。
【0028】
演算器１７は、後述する図３（ｂ）と（ｃ）それぞれの状態での透過画像（光センサ１５による画像）を得るように、フォーカス機構１８及び光強度取得手段１９を制御する。
フォーカス機構１８は、演算器１７の演算に基づいて焦点調節を行うものであり、例えばステッピングモータによるピント調整機構等を用いて実現することができる。また、操作者が手でピント調節つまみ等の所定の操作部を操作することによりピント調節してもよい。また、フォーカス機構１８は、光軸方向（Ｚ方向）にセンサ側レンズ１２と照明側レンズ１４の双方の焦点を移動させることができる。この機能により、スライスをＺ方向に移動させる、すなわち、試料５０内の任意の深さにある観測点３１に焦点を合わせることができる。
フォーカス機構１８は、演算器１７の演算に基づいて焦点調節を行うものであり、例えばステッピングモータによるピント調整機構等を用いて実現することができる。また、操作者が手でピント調節つまみ等の所定の操作部を操作することによりピント調節してもよい。また、フォーカス機構１８は、光軸方向（Ｚ方向）にセンサ側レンズ１２と照明側レンズ１４の双方の焦点を移動させることができる。この機能により、スライスをＺ方向に移動させる、すなわち、試料５０内の任意の深さにある観測点３１に焦点を合わせることができる。
【0029】
光強度取得手段１９の駆動機構は、演算器１７の演算に基づいて後述する図３（ｂ）と（ｃ）の状態を入れ替えるよう移動させるものであり、例えばステッピングモータによる移動テーブル又はフォトマスクの駆動機構であってもよい。また、操作者が、試料５０を移動させるための操作部、又はフォトマスクを移動させるための操作部を操作することにより、図３（ｂ）と（ｃ）の状態を入れ替えてもよい。
【0030】
本実施形態の場合、照明１３は、光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさるフォトマスクで形成された高周波照明である。また、光強度取得手段は、光センサ１５と照明１３の焦点を維持したまま試料５０をＸ方向やＹ方向に任意に移動させる、もしくはフォトマスクを任意に移動（明部と暗部をＸ方向やＹ方向に任意の移動）させる駆動機構である。
【0031】
本実施形態の透過型顕微鏡は、高周波照明の明部と暗部（高周波照明の像３５）を利用し、さらに光センサ１５と高周波照明１３の合焦状態と非合焦状態との間の光情報の違いを利用し、直接成分と大域成分を分離する。ここで、高周波照明の像３５が形成される面に平行な試料内の面（ＸＹ平面）を「スライス」と呼ぶ（図８参照）。例えば、試料５０の厚みが１０μｍで、焦点の合っているスライスの厚みは３μｍとする（試料やレンズ性能により数値は変わる）。図４は、焦点が合っているスライスと焦点が合っていないスライスを説明する図である。光センサも高周波照明も焦点が合っていないスライスがαとγであり、焦点が合っているスライスがβである。光センサの焦点が合っている場合、その画像は図４（ａ）のようになり、光センサの焦点が合っていない場合、その画像は図４（ｂ）のようになる。一方、高周波照明の焦点が合っている場合、その画像は図４（ｃ）のようになり、高周波照明のフォーカスが合っていない場合、その画像は図４（ｄ）のようになる。つまり、光センサと高周波照明のいずれか一方の焦点が合っていない場合、パターンがぼやけた画像（図４（ｂ）（ｄ））となる。このようにパターンがぼやけたスライスでは、光強度が均一になると仮定する。つまり、光センサ側と高周波照明側の両方の焦点が合っている状態で直接成分が含まれるとみなし、光センサ側と高周波照明側のいずれか一方の焦点が合っていない状態では大域成分のみとみなす。
【0032】
まず、高周波照明のパターンが無く、カメラと照明の両方に焦点が合っている場合と、カメラと照明のいずれかの焦点が合っておらず光強度が一様である場合とを考える。観測点３１に対応する光センサ１５のピクセルｐで捕捉された光強度Ｌ［ｐ］は、直接成分Ｄ［ｐ］と大域成分Ｇ［ｐ］との和である。
（式１）
Ｌ［ｐ］＝Ｄ［ｐ］＋Ｇ［ｐ］
（式１）
Ｌ［ｐ］＝Ｄ［ｐ］＋Ｇ［ｐ］
【0033】
図３（ｂ）と図３（ｃ）は、光を透過する明部と光を遮断する暗部が市松模様状であるフォトマスクを介する高周波照明１３を用いて試料５０に照射したときの様子を模式的に示した図である。なお、説明明瞭化のため、図３（ｂ）と図３（ｃ）では、透過型試料観察装置１００の記載を省略している。
【0034】
［分離演算の説明］
ここで、演算器１７が行う演算内容について説明する。
観測点３１が含まれるターゲットスライスに、光センサ１５と高周波照明１３の焦点が合っている。図３（ｂ）は、光強度取得手段１９でフォトマスク又は試料５０を動かして観察点Ｘに光を照射した（フォトマスクの明部を位置させる）ときの模式図である。観察点Ｘに光が照射すると、光センサ１５は観察点Ｘからの直接的な光（直接成分（Ａ））と他の部分からの光（非合焦での観測点以外からの他点単一散乱光の成分である大域成分（Ｂ）及び多重散乱光の成分である大域成分（Ｃ））の双方を含む情報を取得する。一方、図３（ｃ）は、フォトマスク又は試料５０を動かして観察点Ｘに光を照射しない（フォトマスクの暗部を位置させる）ときの模式図である。観察点Ｘに光が照射しないと観察点Ｘからの直接的な光（直接成分（Ａ））がなく、光センサ１５は他の部分からの光（大域成分（Ｂ）と（Ｃ））のみの情報を取得する。
なお、「合焦での観測点以外からの他点単一散乱光による成分（Ｄ）」はカメラの光学系で異なるピクセルに結像されるため、成分（Ｄ）は検討中のピクセルにおいて考慮不要である。
ここで、演算器１７が行う演算内容について説明する。
観測点３１が含まれるターゲットスライスに、光センサ１５と高周波照明１３の焦点が合っている。図３（ｂ）は、光強度取得手段１９でフォトマスク又は試料５０を動かして観察点Ｘに光を照射した（フォトマスクの明部を位置させる）ときの模式図である。観察点Ｘに光が照射すると、光センサ１５は観察点Ｘからの直接的な光（直接成分（Ａ））と他の部分からの光（非合焦での観測点以外からの他点単一散乱光の成分である大域成分（Ｂ）及び多重散乱光の成分である大域成分（Ｃ））の双方を含む情報を取得する。一方、図３（ｃ）は、フォトマスク又は試料５０を動かして観察点Ｘに光を照射しない（フォトマスクの暗部を位置させる）ときの模式図である。観察点Ｘに光が照射しないと観察点Ｘからの直接的な光（直接成分（Ａ））がなく、光センサ１５は他の部分からの光（大域成分（Ｂ）と（Ｃ））のみの情報を取得する。
なお、「合焦での観測点以外からの他点単一散乱光による成分（Ｄ）」はカメラの光学系で異なるピクセルに結像されるため、成分（Ｄ）は検討中のピクセルにおいて考慮不要である。
【0035】
前述のように焦点が合っていないスライス（図４（ｄ））において照明光が均一であると仮定すると、フォトマスクの明部と暗部の比率が１：１である場合、焦点が合っていないスライス（α、γ）内の光強度は、焦点が合っているスライスβの明部の光強度の半分の光強度となる。つまり、スライスβ以外の部分からの多重散乱光や単一散乱光の光強度は観測点３１で反射あるいは透過した光の強度の半分となる。
【0036】
このことを利用して、観測点３１に光を照射している場合の観測点３１に対応する光センサのピクセルｐにおける輝度Ｌ＋［ｐ］と、観測点３１に光を照射していない場合の輝度Ｌ－［ｐ］とを以下のように算出することができる。
ここで、Ｓ［ｐ、ｘ］は点ｘ＝［ｘ、ｙ、ｚ］ｔにおける単一散乱光の光強度である。Ｍ［ｐ、ｘ］は最後の散乱点がｘである多重散乱光の光強度である。
【数2】
【数3】
【0037】
焦点深度ｄは範囲を有するのでピクセルｐは点ｘの集合に対応する。Ω（ｐ、ｄ）はピクセルｐと焦点深度ｄに対応する領域であり、Ψ（ｐ）は試料５０内のピクセルｐに対応するすべての点ｘを示すとする。
【0038】
図３（ｂ）に示すように、式（２）の第１項は、ターゲットスライス（β；ｚ＝ｄ）における観測点３１を照射した直接透過光である。第２項は焦点から外れた異なるスライス（α、γ）での単一散乱光であり、第３項は大域成分における散乱光の多重である。従って、ターゲットスライスからの光Ｄ［ｐ］および他のスライスからの光Ｇ［ｐ］は、次式で表される。
【数4】
【0039】
光センサ１５の全てのピクセルで直接成分および大域成分を得るためには、高周波照明パターンを動かし、それぞれのピクセルで光強度が最大のＬｍａｘと最小のＬｍｉｎを取得する。Ｌ＋＝Ｌｍａｘであり、Ｌ－＝Ｌｍｉｎであるので式（４）を用いて各ピクセルのＤ［ｐ］とＧ［ｐ］を求めれば、試料５０の透過光と散乱光を分離することができる。
なお、高周波照明パターンの動かし方は、例えば、高周波照明の明部と暗部をそれぞれ含むように予め設定した移動経路で動かす方法がある。また、高周波パターンフィルタの動かし方として、高周波パターンフィルタをＸＹＺ軸電動ステージ上でＸＹ方向にランダムに移動させる方法でもよい。この方法の場合、明部ですべての点を捕捉するために十分量の当該ターゲットスライスの観察画像を取得する必要がある。
以上、演算器１７の演算について説明した。
なお、高周波照明パターンの動かし方は、例えば、高周波照明の明部と暗部をそれぞれ含むように予め設定した移動経路で動かす方法がある。また、高周波パターンフィルタの動かし方として、高周波パターンフィルタをＸＹＺ軸電動ステージ上でＸＹ方向にランダムに移動させる方法でもよい。この方法の場合、明部ですべての点を捕捉するために十分量の当該ターゲットスライスの観察画像を取得する必要がある。
以上、演算器１７の演算について説明した。
【0040】
なお、高周波照明を形成するフォトマスクの明部と暗部との大きさに注意する必要がある。フォトマスクの明部が大きい場合、観察点で散乱された直接透過光が、同一の照明領域内で数回散乱することになる。本実施形態の透過型顕微鏡では、このような同一の照明領域内で数回散乱してしまった光も、直接成分であると判断することになる。同一の照明領域内で散乱回数は、試料の特性および高周波照明の周波数に依存するので、試料の特性に応じて高周波照明の周波数を適宜調整する必要がある。
【0041】
例えば、上記実施形態では高周波照明のパターンを明部と暗部が１：１の市松模様で説明したが、試料の特性によって明部と暗部が１：１ではないパターンの高周波照明を利用してもよいし、明部と暗部とが規則的に配列されていない不規則パターンの照明を利用してもよい。
照明パターンとして、既に記載した市松模様以外に次のような照明パターンも可能である。
（ａ）明部と暗部として、各々透過率が１００％と０％という市松模様ではなく、複数の透過率の領域から成る照明パターン
（ｂ）市松模様ではなく、ストライプ状の明部と暗部の縞模様から成る照明パターン
（ｃ）明暗の縞模様ではなく、透過率がなめらかに変化する（例えば、サインカーブの値を持つ）ような照明パターン
（ｄ）縞模様、明部と暗部の境界、透過率の異なる領域同士の境界が、直線ではなく曲線である照明パターン
照明パターンとして、既に記載した市松模様以外に次のような照明パターンも可能である。
（ａ）明部と暗部として、各々透過率が１００％と０％という市松模様ではなく、複数の透過率の領域から成る照明パターン
（ｂ）市松模様ではなく、ストライプ状の明部と暗部の縞模様から成る照明パターン
（ｃ）明暗の縞模様ではなく、透過率がなめらかに変化する（例えば、サインカーブの値を持つ）ような照明パターン
（ｄ）縞模様、明部と暗部の境界、透過率の異なる領域同士の境界が、直線ではなく曲線である照明パターン
【0042】
この場合、明部と暗部の比率に応じて式（２）の第２項と第３項の係数、及び式（３）の各項の係数を変更する。具体的には、高周波照明のパターンを明部と暗部が明部と暗部が１：１の市松模様の場合、式（２）と式（３）の各係数が“１／２”であるが、明部と暗部の比率に応じ当該係数を変更する（ただし、係数の合計は１である。）。例えば、
明部の割合＝ａ、
暗部の割合＝１－ａ、
ｂ：明部の透過率を１とするときの暗部の透過率（０．０≦ｂ＜１）
とすると、上述した式（２）、式（３）、式（４）は、それぞれ式（２ａ）、式（３ａ）、式（４ａ）となる。
式（２ａ）、式（３ａ）、式（４ａ）において、ａ＝１／２、ｂ＝０の場合が式（２）、式（３）、式（４）となる。
明部の割合＝ａ、
暗部の割合＝１－ａ、
ｂ：明部の透過率を１とするときの暗部の透過率（０．０≦ｂ＜１）
とすると、上述した式（２）、式（３）、式（４）は、それぞれ式（２ａ）、式（３ａ）、式（４ａ）となる。
【数2a】
【数3a】
【数4a】
【0043】
また、上記実施形態では高周波照明をフォトマスクで構成することを説明したが、フォトマスクを使用せずに複数のＬＥＤ等の微小光源を配列して高周波照明を構成してもよい。すなわち、前記照明は、光源を発光させる明部と光源を消灯させる暗部とを任意の比率で組み合わせたパターンの照明であり、前記光強度取得手段は、前記比率を維持したまま前記明部と前記暗部を任意に移動させる光源制御部であることを特徴とする。
もちろん、ＬＥＤは、高周波照明だけでなく不規則パターンの照明も実現することができる。
もちろん、ＬＥＤは、高周波照明だけでなく不規則パターンの照明も実現することができる。
【0044】
（具体的な操作方法）
本透過顕微鏡システムは、顕微鏡、光源、高周波パターンフィルタ（フォトマスク）、カメラ（光センサ）及びＸＹＺ軸電動ステージからなる。高周波パターンフィルタとして、図３及び図４に示すように、照明領域（明部）と非照明領域（暗部）の比が１：１である様々な市松模様（高周波照明）のフォトマスクを用意した。具体的に、パターンの大きさは１×１μｍから１６×１６μｍまでを用意した。パターンの大きさは、例えば生体中の部位などにより、検体中に散乱体がどのくらい含まれるかに応じて決定される。イルミネーションレンズはフィルタの上に設置され、照明のフォーカス位置を変えることができる。
本透過顕微鏡システムは、顕微鏡、光源、高周波パターンフィルタ（フォトマスク）、カメラ（光センサ）及びＸＹＺ軸電動ステージからなる。高周波パターンフィルタとして、図３及び図４に示すように、照明領域（明部）と非照明領域（暗部）の比が１：１である様々な市松模様（高周波照明）のフォトマスクを用意した。具体的に、パターンの大きさは１×１μｍから１６×１６μｍまでを用意した。パターンの大きさは、例えば生体中の部位などにより、検体中に散乱体がどのくらい含まれるかに応じて決定される。イルミネーションレンズはフィルタの上に設置され、照明のフォーカス位置を変えることができる。
【0045】
まず、試料の深さ方向（Ｚ方向）について、ある深さのターゲットスライスに、光センサ１５と高周波照明１３の焦点を合わせる。どちらの焦点を先に合わせてもよいが、両方の焦点を合わせる必要がある。例えば、顕微鏡の資料ステージを動かして、試料５０を観察できるように光センサ１５の焦点を所望のターゲットスライスに合わせておく。その後、高周波照明１３の焦点を当該ターゲットスライスに合わせる。その焦点合わせには、照明側レンズ１４をＺ方向に移動させ、且つＸＹＺ軸電動ステージで高周波照明パターンフィルタ１３をＺ方向に移動させ調整する。
【0046】
そして、明部ですべての点を捕捉するために、高周波パターンフィルタ１３をＸＹＺ軸電動ステージ上で動かし、当該ターゲットスライスの観察画像を取得する。高周波パターンフィルタの動かし方は上述の通りである。そして、前述の「分離演算の説明」のように観察画像を処理し、カメラの各光センサ（ピクセル）における直接成分Ｄ［ｐ］と大域成分Ｇ［ｐ］を取得する。ここまでの作業で、現在のターゲットスライスに対して透過光と散乱光を分離することができる。
【0047】
次に、高周波パターンフィルタ１３をＸＹＺ軸電動ステージをＺ軸方向に移動することにより、上記とは別の深さのターゲットスライスに、光センサ１５と高周波照明１３の焦点を合わせる。そして、当該ターゲットスライスにおいて、高周波パターンフィルタ１３をＸＹＺ軸電動ステージで同様に動かして観察画像を取得する。上記と同様に「分離演算の説明」のように観察画像を処理し、当該ターゲットスライスに対して透過光と散乱光を分離することができる。
【0048】
（本実施例の効果）
非特許文献５や６に記載される手法では、光路上の重なりも含む、全ての深さ情報の重ね合わせで観測され、それらから特定の深さ（ターゲットスライス）の透過光と散乱光の情報あるいは深さ方向（Ｚ方向）に対する透過光と散乱光の情報を取得することが困難である。一方、本透過顕微鏡システムは、特定の深さ（ターゲットスライス）の透過光と散乱光の情報を取得することができ、さらにターゲットスライスをＺ方向に順次移動させて上記の処理を繰り返すことで、複数の深さのターゲットスライスに対する透過光と散乱光を分離して情報を得ることができる。本透過顕微鏡システムは、Ｚ方向の移動をあるステップ幅で連続的に行い、連続的に深さごとのターゲットスライスにおける透過光と散乱光の情報を取得できることから、分離された透過光と散乱光の３次元情報、あるいは３次元画像情報を観察することができる。前記３次元情報は、直接成分や大域成分の３次元波長情報、それらより演算して抽出される各種情報ないし作成される画像、およびそれらより解析される結果を含む。
非特許文献５や６に記載される手法では、光路上の重なりも含む、全ての深さ情報の重ね合わせで観測され、それらから特定の深さ（ターゲットスライス）の透過光と散乱光の情報あるいは深さ方向（Ｚ方向）に対する透過光と散乱光の情報を取得することが困難である。一方、本透過顕微鏡システムは、特定の深さ（ターゲットスライス）の透過光と散乱光の情報を取得することができ、さらにターゲットスライスをＺ方向に順次移動させて上記の処理を繰り返すことで、複数の深さのターゲットスライスに対する透過光と散乱光を分離して情報を得ることができる。本透過顕微鏡システムは、Ｚ方向の移動をあるステップ幅で連続的に行い、連続的に深さごとのターゲットスライスにおける透過光と散乱光の情報を取得できることから、分離された透過光と散乱光の３次元情報、あるいは３次元画像情報を観察することができる。前記３次元情報は、直接成分や大域成分の３次元波長情報、それらより演算して抽出される各種情報ないし作成される画像、およびそれらより解析される結果を含む。
【0049】
（実施形態２）
本実施形態では、試料の散乱特性を計測する試料観察方法及びその装置とそれを搭載する顕微鏡を説明する。本実施形態の試料観察方法等は、実施形態１で説明した試料観察方法等に加え、空間周波数（前述した明部と暗部との周期）が異なる複数の照明パターンを用いることが特徴である。本実施形態では、照明パターンの明部と暗部との面積比率ａが１／２の場合を説明するが、面積比率ａは１／２に限定されない。
本実施形態では、試料の散乱特性を計測する試料観察方法及びその装置とそれを搭載する顕微鏡を説明する。本実施形態の試料観察方法等は、実施形態１で説明した試料観察方法等に加え、空間周波数（前述した明部と暗部との周期）が異なる複数の照明パターンを用いることが特徴である。本実施形態では、照明パターンの明部と暗部との面積比率ａが１／２の場合を説明するが、面積比率ａは１／２に限定されない。
【0050】
図６は、本実施形態の顕微鏡を説明する図である。本顕微鏡は、光センサ１５、光センサ側レンズ１２、照明側レンズ１４、及び試料観察装置１０１を備える。
【0051】
試料観察装置１０１は、
光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターン１３と、
Ｚ方向において光センサ１５及び照明パターン１３の焦点を試料５０内の観測点３１を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス機構１８と、
フォーカス機構１８で光センサ１５と照明パターン１３の双方の焦点を観測点３１に合わせた状態で、照明パターン１３の光を観測点３１に照射したときの第１光強度と観測点３１以外に照射したときの第２光強度とを光センサ１５で取得する光強度取得手段１９と、
前記第１光強度に含まれる、観測点３１での単一散乱光による直接成分（Ａ）、前記観測点以外での単一散乱光による大域成分（Ｂ）、及び試料５０内での多重散乱光による大域成分（Ｃ）と、前記第２光強度に含まれる、大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）と、を利用し、前記第１光強度から直接成分（Ａ）と大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）とを分離することを照明パターン１３の前記明部と前記暗部との周期を変えて行い、照明パターン１３の前記周期毎に取得した前記直接成分（Ａ）を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算器１７と、
を備える。
なお、本実施形態の試料観察装置１０１では、大域成分（Ｂ）と大域成分（Ｃ）を区別する必要はない。
光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターン１３と、
Ｚ方向において光センサ１５及び照明パターン１３の焦点を試料５０内の観測点３１を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス機構１８と、
フォーカス機構１８で光センサ１５と照明パターン１３の双方の焦点を観測点３１に合わせた状態で、照明パターン１３の光を観測点３１に照射したときの第１光強度と観測点３１以外に照射したときの第２光強度とを光センサ１５で取得する光強度取得手段１９と、
前記第１光強度に含まれる、観測点３１での単一散乱光による直接成分（Ａ）、前記観測点以外での単一散乱光による大域成分（Ｂ）、及び試料５０内での多重散乱光による大域成分（Ｃ）と、前記第２光強度に含まれる、大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）と、を利用し、前記第１光強度から直接成分（Ａ）と大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）とを分離することを照明パターン１３の前記明部と前記暗部との周期を変えて行い、照明パターン１３の前記周期毎に取得した前記直接成分（Ａ）を比較することで、前記観測点における散乱角度毎の光強度を演算する演算器１７と、
を備える。
なお、本実施形態の試料観察装置１０１では、大域成分（Ｂ）と大域成分（Ｃ）を区別する必要はない。
【0052】
本実施形態では、照明パターン１３が市松模様である場合（明部と暗部の比率は１：１である）を説明する。試料観察装置１０１は、例えば、４種類の照明パターン（１３－１～１３－４）を有する。そして、それぞれの照明パターンは空間周波数（前述した明部と暗部との周期）が異なる。実施形態１で説明したように、高周波照明の像３５の明部と暗部が観測点３１にあるように照明パターン１３を動かす（図６（ｂ）及び（ｃ））。これは照明パターン（１３－１～１３－４）毎に行う。
【0053】
図７は、図６（ｂ）及び（ｃ）をより詳細に説明する図である。図７（ａ）は観測点３１が高周波照明の像３５の明部にある場合、図７（ｂ）は観測点３１が高周波照明の像３５の暗部にある場合、図７（ｃ）は（ａ）と（ｂ）の差分である。光センサ１５のあるピクセルｐに到達する各光線は、図７のように４種類に分類できる。
（二重線矢印）散乱のない直接透過光Ｔ（ｐ）、
（実線矢印）観測点３１のみで散乱された単一散乱光ＳＲ（ｐ，Ｋ）、
（矩形点線矢印）観測点３１とは異なる深さにある粒子Ｋ１のみで散乱された単一散乱光ＭＳＲ（ｐ，Ｋ）、
（丸点線矢印）他の粒子で複数回散乱され、最終的に上記３種類の光線に重なる多重散乱光ＭＭＲ（ｐ、Ｋ）。
なお、単一散乱光ＳＲ（ｐ，Ｋ）が直接成分（Ａ）、単一散乱光ＭＳＲ（ｐ，Ｋ）が大域成分（Ｂ）、多重散乱光ＭＭＲ（ｐ、Ｋ）が大域成分（Ｃ）である。
（二重線矢印）散乱のない直接透過光Ｔ（ｐ）、
（実線矢印）観測点３１のみで散乱された単一散乱光ＳＲ（ｐ，Ｋ）、
（矩形点線矢印）観測点３１とは異なる深さにある粒子Ｋ１のみで散乱された単一散乱光ＭＳＲ（ｐ，Ｋ）、
（丸点線矢印）他の粒子で複数回散乱され、最終的に上記３種類の光線に重なる多重散乱光ＭＭＲ（ｐ、Ｋ）。
なお、単一散乱光ＳＲ（ｐ，Ｋ）が直接成分（Ａ）、単一散乱光ＭＳＲ（ｐ，Ｋ）が大域成分（Ｂ）、多重散乱光ＭＭＲ（ｐ、Ｋ）が大域成分（Ｃ）である。
【0054】
図７（ａ）の観測点３１が高周波照明の像３５の明部にある場合、光センサ１５のあるピクセルｐで撮像された画像強度Ｌ＋（ｐ）は、これら４種類の光線の総和として以下のように定義される。
ここで、Ｒは１つの光線、Ｒ（ｐ）はピクセルｐでとらえた単一散乱光ＳＲ（ｐ，Ｋ）の光線Ｒの集合、αＲは光線Ｒが通る照明パターンの明部の比率である。図１０でαＲについての詳説をする。図１０（ａ）は照明パターンの空間周波数が高い場合、図１０（ｂ）は照明パターンの空間周波数が低い場合である。図１０において、符号３６は明部及び暗部に関わらず観測点３１を通る光線Ｒが存在しうる領域、符号３７は観測点３１についての合焦領域であり、光センサ１５の１ピクセルに相当する。光線Ｒについて、合焦領域３７のうち照明パターンの明部が占める体積比率がαＲである。
具体的には、合焦領域３７に含まれる光線Ｒについて、
観測点３１が明部のとき、αＲに比例する光強度が光センサ１５に届き、
観測点３１が暗部のとき、明と暗が反転するため、（１－αＲ）に比例する光強度が光センサ１５に届く。
実際には、αＲの値は、投影された照明パターンサイズやレンズの焦点距離などからシミュレーションにて、光線を散乱角度ごと追い、明部と暗部の差や、パターンサイズの差から算出する。
【数5】
具体的には、合焦領域３７に含まれる光線Ｒについて、
観測点３１が明部のとき、αＲに比例する光強度が光センサ１５に届き、
観測点３１が暗部のとき、明と暗が反転するため、（１－αＲ）に比例する光強度が光センサ１５に届く。
実際には、αＲの値は、投影された照明パターンサイズやレンズの焦点距離などからシミュレーションにて、光線を散乱角度ごと追い、明部と暗部の差や、パターンサイズの差から算出する。
【0055】
図７（ｂ）の観測点３１が高周波照明の像３５の暗部にある場合、光センサ１５のあるピクセルｐで撮像された画像強度Ｌ－（ｐ）は、単一散乱光ＭＳＲ（ｐ，Ｋ）と多重散乱光ＭＭＲ（ｐ、Ｋ）の光線の総和として以下のように定義される。
【数6】
【0056】
そして、Ｌ＋（ｐ）とＬー（ｐ）との差分が図７（ｃ）のように直接透過光Ｔ（ｐ）と単一散乱光ＳＲ（ｐ，Ｋ）の総和の光強度（本実施形態では「所望光強度」と記載する。）となる。ここまでは、実施形態１の説明と同じである。
【0057】
本実施形態では、さらに照明パターンの空間周波数を変えて（図６の照明パターン１３－１～１３－４を切り替えて）上記所望光強度を取得する。図８は、本発明に係る試料観察装置の原理を説明する図である。図８（ａ）と図８（ｂ）で、照明パターンの空間周波数が変わると散乱光がどのように変化するかを説明する。なお、図８では、フォーカス面に対して垂直方向（Ｚ方向であり図の縦方向）を０°、平行方向（ＸＹ平面）を９０°と定義している。
【0058】
図８（ａ）は空間周波数が高い（市松模様のパターンが小さい）照明パターン１３－１を使用して、図７で説明した所望光強度を観察するときのイメージ図である。観測点３１を通る直接透過光Ｔと観測点３１のみで散乱された単一散乱光Ｓ１は、Ａｒ１の範囲で放出される。散乱角度θ１は、範囲Ａｒ１を観測点３１を頂点とする円錐と考えたときのその頂角の１／２の角度である。
【0059】
図８（ｂ）は空間周波数が低い（市松模様のパターンが大きい）照明パターン１３－２を使用して、図７で説明した所望光強度を観察するときのイメージ図である。観測点３１を通る直接透過光Ｔと観測点３１のみで散乱された単一散乱光Ｓ１とＳ２は、Ａｒ１とＡｒ２の範囲で放出される。散乱角度θ２は、範囲Ａｒ１とＡｒ２を含む範囲を観測点３１を頂点とする円錐と考えたときのその頂角の１／２の角度である。
【0060】
図８（ａ）の所望光強度と図８（ｂ）の所望光強度との差分が範囲Ａｒ２に含まれる単一散乱光Ｓ２の光強度が得られる（図８（ｃ）を参照。）。このように、空間周波数の異なる照明パターンで取得した所望光強度を比較することで、観測点３１の散乱特性を測定することができる。
【0061】
つまり、試料観察装置１０１の試料観察方法は、空間周波数（前述した明部と暗部との周期）が異なる複数の照明パターンを用いて、散乱光の散乱角度毎の光強度分布を取得する新しい方法である。図９は、本試料観察方法を説明するフローチャートである。本試料観察方法は、
Ｚ方向において、光センサの焦点、及び光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス手順（ステップＭ０１）と、
前記フォーカス手順を行った後、前記照明パターンの前記明部を透過した光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手順（ステップＭ０２）と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分（Ａ）、前記観測点以外での単一散乱光による大域成分（Ｂ）、及び前記試料内での多重散乱光による大域成分（Ｃ）と、前記第２光強度に含まれる、大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）と、を利用し、前記第１光強度から直接成分（Ａ）と大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）とを分離する分離手順（ステップＭ０３）と、
繰り返し回数が所定回数に達していない場合（ステップＭ０４にて“Ｎｏ”）、前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて前記光強度取得手順と前記分離手順とを繰り返し行う繰り返し手順（ステップＭ０５）と、
繰り返し回数が所定回数に達した場合（ステップＭ０４にて“Ｙｅｓ”）、前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分（Ａ）を比較することで、散乱角度毎の光強度を演算する演算手順（ステップＭ０６）と、
を行う。
Ｚ方向において、光センサの焦点、及び光を透過させる明部と光を遮断する暗部とが任意の比率で組み合わさる照明パターンの焦点を試料内の観測点を含むＸＹ平面に合わせるフォーカス手順（ステップＭ０１）と、
前記フォーカス手順を行った後、前記照明パターンの前記明部を透過した光を前記観測点に照射したときの第１光強度と前記観測点以外に照射したときの第２光強度とを前記光センサで取得する光強度取得手順（ステップＭ０２）と、
前記第１光強度に含まれる、前記観測点での単一散乱光による直接成分（Ａ）、前記観測点以外での単一散乱光による大域成分（Ｂ）、及び前記試料内での多重散乱光による大域成分（Ｃ）と、前記第２光強度に含まれる、大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）と、を利用し、前記第１光強度から直接成分（Ａ）と大域成分（Ｂ）及び大域成分（Ｃ）とを分離する分離手順（ステップＭ０３）と、
繰り返し回数が所定回数に達していない場合（ステップＭ０４にて“Ｎｏ”）、前記照明パターンの前記明部と前記暗部との周期を変えて前記光強度取得手順と前記分離手順とを繰り返し行う繰り返し手順（ステップＭ０５）と、
繰り返し回数が所定回数に達した場合（ステップＭ０４にて“Ｙｅｓ”）、前記照明パターンの前記周期毎に取得した前記直接成分（Ａ）を比較することで、散乱角度毎の光強度を演算する演算手順（ステップＭ０６）と、
を行う。
【0062】
本試料観察方法は、市松模様のように光透過部（明部）と光遮断部（暗部）で構成される２値の照明パターンの周波数（すなわち、明部と暗部の領域の大きさ）によって、散乱角度の範囲を制御できることを特徴とする。換言すれば、本試料観察方法は、光センサが、明部のサイズが大きいとき（低周波）には散乱角度の広い光線を受光し、明部のサイズが小さいとき（高周波）には散乱角度が狭い光線を受光することを利用して空間的に不均質な物体の散乱特性を測定する。
【0063】
演算器１７は、この現象を利用し、各散乱角度の範囲の画像を推定する。例えば、演算器１７は、
（α）最も高周波の照明パターンを使用した時、図１の散乱角度０～θ１の範囲Ａｒ１に含まれる光線の光強度（直接成分）Ｓ１を得（図８（ａ）も参照）、
（β）次に高周波の照明パターンを使用した時、図１の散乱角度０～θ２の範囲Ａｒ１と範囲Ａｒ２に含まれる光線の光強度（直接成分）Ｓ２を得（図８（ｂ）も参照）、
（γ）最も低周波の照明パターンを使用した時、図１の散乱角度０～θ３の範囲Ａｒ１から範囲Ａｒ３に含まれる光線の光強度（直接成分）Ｓ３を得る。
演算器１７は、これらの光強度を比較し、その差分から各範囲（Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３）の画像を推定する。例えば、（γ）の光強度から（β）の光強度を減算すれば、範囲Ａｒ３の光強度Ｓ３が得られる。
（α）最も高周波の照明パターンを使用した時、図１の散乱角度０～θ１の範囲Ａｒ１に含まれる光線の光強度（直接成分）Ｓ１を得（図８（ａ）も参照）、
（β）次に高周波の照明パターンを使用した時、図１の散乱角度０～θ２の範囲Ａｒ１と範囲Ａｒ２に含まれる光線の光強度（直接成分）Ｓ２を得（図８（ｂ）も参照）、
（γ）最も低周波の照明パターンを使用した時、図１の散乱角度０～θ３の範囲Ａｒ１から範囲Ａｒ３に含まれる光線の光強度（直接成分）Ｓ３を得る。
演算器１７は、これらの光強度を比較し、その差分から各範囲（Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３）の画像を推定する。例えば、（γ）の光強度から（β）の光強度を減算すれば、範囲Ａｒ３の光強度Ｓ３が得られる。
【0064】
上記は、演算器１７での演算の原理を理解しやすくするための説明である。実際は、複数の照明パターン毎の光強度（式（５）と式（６）のセット）の行列を得ておき、次式で散乱角度を計算する。
ここで、ｋは照明パターンの番号（１≦ｋ≦Ｋ）である。Ｋ個の照明パターンを用いて、散乱角度が０度から光学レンズの特性に依存する最大角度まで、Ｋ個のグループに分ける。
【数7】
ここで、ｋは照明パターンの番号（１≦ｋ≦Ｋ）である。Ｋ個の照明パターンを用いて、散乱角度が０度から光学レンズの特性に依存する最大角度まで、Ｋ個のグループに分ける。
【0065】
照明パターンｋのｉ番目の散乱角度（例えばθ２）の領域（例えば、Ｓ１とＳ２の領域）における明部と暗部の比率をａｋｉ及びａ’ｋｉと定義する（ａｋｉ＋ａ’ｋｉ＝１）。これらの比率は、顕微鏡の仕様と照明パターンに基づいて計算することができる。行列Ａは、これらの既知の情報から成る行列である。
【0066】
また、ｋ番目の散乱角度（照明パターンｋの散乱角度θｋと照明パターンｋ－１の散乱角度θｋ－１に挟まれる範囲Ａｒｋ）での光強度をＳｋ｛Ｓｋ｜ｋ＝１、・・・、Ｋ｝とする。行列Ｘ（ｐ）は、ｋ番目の散乱角度を持つ単一散乱光の行ベクトルである。Ｇ（ｐ）は大域成分である。Ｔ（ｐ）は、その方向が入射照明と平行なので、Ｘ（ｐ）の第１要素にＴ（ｐ）＋Ｓ１（ｐ）として含まれる。
【0067】
行列Ｌ（ｐ）は、Ｋ個の照明パターンそれぞれの明部（Ｌ＋）と暗部（Ｌ－）の光強度からなるベクトルである。演算器１７は、測定で得た行列Ｌ（ｐ）と既知データである行列Ａを用いて、行列Ｘ（ｐ）を演算する。
【0068】
実際の測定では、ｋ番目の照明パターンをシフトして各点の最大および最小の光強度をそれぞれＬｋ
ｍａｘ（ｐ）およびＬｋ
ｍｉｎ（ｐ）とし、各ピクセルにおける光強度のセットを取得する。ここで、ピクセルの光強度が最大／最小の値をとるとき、そのピクセルが明部／暗部の中心にあると考えることができる。そこで、
Ｌｋ ＋（ｐ）＝Ｌｋ ｍａｘ（ｐ）、
Ｌｋ －（ｐ）＝Ｌｋ ｍｉｎ（ｐ）
とする。行列Ｌ（ｐ）と行列Ａが与えられれば、平均二乗誤差
を最小化することで、Ｘ（ｐ）を推定することができる。この推定は、すべてのピクセルに適用できる。
Ｌｋ ＋（ｐ）＝Ｌｋ ｍａｘ（ｐ）、
Ｌｋ －（ｐ）＝Ｌｋ ｍｉｎ（ｐ）
とする。行列Ｌ（ｐ）と行列Ａが与えられれば、平均二乗誤差
【数8】
【0069】
このようにして得られた光強度（すなわち、画像）の集合は、図１の粒子３１における散乱特性（異なる角度における光強度の分布）を表している。これを利用して共通の散乱モデル（例えば、式（９）のＨｅｎｙｅｙ－Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ位相関数）で角度分布を表す非対称パラメータ（散乱パラメータ）ｇの散乱特性マップ（ｇマップ）を生成し、可視化することもできる。
ここで、θは上述した散乱角度θｋ、Ｐ（θ）は散乱角度θｋにおける光強度Ｓｋである。
【数9】
【0070】
以下、ｇマップの生成手順について説明する。
前述のようにピクセルｐ（観測点３１）毎に散乱角度θｋ毎の光強度Ｓｋを取得する。そして、散乱角度θｋ毎の光強度Ｓｋから、観測点３１におけるＨｅｎｙｅｙ－Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ位相関数を満たす散乱パラメータｇを推定する推定手順と、
観測点３１ごとの散乱パラメータｇを観測点３１の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成するマップ生成手順と、
をさらに行う。
前述のようにピクセルｐ（観測点３１）毎に散乱角度θｋ毎の光強度Ｓｋを取得する。そして、散乱角度θｋ毎の光強度Ｓｋから、観測点３１におけるＨｅｎｙｅｙ－Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ位相関数を満たす散乱パラメータｇを推定する推定手順と、
観測点３１ごとの散乱パラメータｇを観測点３１の前記ＸＹ平面上の座標に応じて並べ、散乱特性マップを生成するマップ生成手順と、
をさらに行う。
【0071】
式（９）の位相関数はθ方向に積分すると１になる。散乱角度θごとの散乱情報、例えば得られている光強度の分布が、式（９）を満たすようなｇを最適化手法等で求める。ここで、光強度については当該分布について積分したときに１になるように規格化する。また、ｇを最適化手法で求めるとは、光強度の分布を式（９）で表したときに最適になるｇを求めるという意味である。
【0072】
例えば、あるピクセル（観測点３１）について前述までの手法により、規格化された光強度Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、・・・、Ｓｋ、・・・ＳＫ、が得られたとする。これらが式（９）のＰ（θ）に代入し、観測点３１における散乱パラメータｇを推定する。実際には、上述した実施例のように、光強度Ｓｋが散乱角度がθｋ～θｋ－１といったある範囲の光強度である場合、光線を散乱角度ごと追った情報が得られる場合、あるいは散乱角度ごとの光線状況をシミュレーションにて求める場合などがあり、それぞれの場合の条件に合わせて位相関数と一致する最適なパラメータｇを推定する。
【0073】
他のピクセル（観測点３１）についても同様にパラメータｇを推定する。これらのパラメータｇをピクセルに応じて二次元に配置し、パラメータｇのマップ（散乱特性マップ）を生成する。ここで、パラメータｇの値をカラーや輝度で表示（ｇの大小を色又は輝度で表現）して可視化することが好ましい。
なお、本実施形態では、散乱モデルとしてＨｅｎｙｅｙ－Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ位相関数のモデルを例に挙げて説明したが、等方散乱モデルや、その他の散乱モデル（位相関数）でも同様に、各散乱モデルのパラメータを推定することができる。
なお、本実施形態では、散乱モデルとしてＨｅｎｙｅｙ－Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ位相関数のモデルを例に挙げて説明したが、等方散乱モデルや、その他の散乱モデル（位相関数）でも同様に、各散乱モデルのパラメータを推定することができる。
【0074】
図６（ａ）のように、試料観察装置１０１を一般的な透過型顕微鏡に搭載すれば、その顕微鏡で撮影した光を角度ごとの直接散乱光に分解し、散乱特性の空間分布を可視化することができる。
【産業上の利用可能性】
【0075】
本発明に係る試料観察方法、試料観察装置、及び顕微鏡は、癌検査などの病理診断、細胞観察などのバイオサイエンス、医療分野、欠陥検査などの物体の内部構造検査、空洞検出など食品検査にも適用することができる。
【符号の説明】
【0076】
１２：光センサ側レンズ
１３、１３－１～１３－４：高周波照明（照明パターン）
１４：照明側レンズ
１５：光センサ
１７：演算器
１８：フォーカス機構
１９：光強度取得手段
２１：積分球
２２：分光光度計
２３：試料
２４：光
３５：高周波照明の像
５０：試料
１００、１０１：透過型試料観察装置
１３、１３－１～１３－４：高周波照明（照明パターン）
１４：照明側レンズ
１５：光センサ
１７：演算器
１８：フォーカス機構
１９：光強度取得手段
２１：積分球
２２：分光光度計
２３：試料
２４：光
３５：高周波照明の像
５０：試料
１００、１０１：透過型試料観察装置
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】