ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人岩手大学
▶ 国立大学法人岩手大学の特許一覧 ▶ 国立大学法人島根大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023058203
(43)【公開日】2023-04-25
(54)【発明の名称】土壌中の放射性セシウムの除染に必要な成分の特定
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20230418BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20230418BHJP
A01H 6/20 20180101ALI20230418BHJP
A01H 6/14 20180101ALI20230418BHJP
A01G 7/00 20060101ALI20230418BHJP
C09K 3/00 20060101ALI20230418BHJP
C09K 17/14 20060101ALI20230418BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20230418BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230418BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 A ZNA
A01H5/00 A
A01H6/20
A01H6/14
A01G7/00 601Z
C09K3/00 S
C09K17/14 H
C07K14/415
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021168047
(22)【出願日】2021-10-13
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ２０２１年２月１２日 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｐｌａｎｔ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／Ｓ１６７４－２０５２（２１）０００４８－４？＿ｒｅｔｕｒｎＵＲＬ＝ｈｔｔｐｓ％３Ａ％２Ｆ％２Ｆｌｉｎｋｉｎｇｈｕｂ．ｅｌｓｅｖｉｅｒ．ｃｏｍ％２Ｆｒｅｔｒｉｅｖｅ％２Ｆｐｉｉ％２ＦＳ１６７４２０５２２１０００４８４％３Ｆｓｈｏｗａｌｌ％３Ｄｔｒｕｅ＃ｒｅｌａｔｅｄＡｒｔｉｃｌｅｓを通じて発表 ２０２１年２月１６日 岩手大学のウェッブサイト ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｗａｔｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｃａｔ－ｒｅｓｅａｒｃｈ／２０２１／０２／００３９１７．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｗａｔｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｕｐｌｏａｄ／ｉｍａｇｅｓ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ０２１５．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｗａｔｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｉｎｆｏ／ｎｅｗｓ／２０２１／０２／００３９１８．ｈｔｍｌを通じて発表 ２０２１年２月１７日 島根大学のウェッブサイト ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｍａｎｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｄｏｃｓ／２０２１０２１７０００１２／ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｍａｎｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｄｏｃｓ／２０２１０２１７０００１２／ｆｉｌｅ＿ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｋｅｎｋｙｕ－ｓｙｏｕｓａｉ－ａｋｉ．ｐｄｆを通じて発表
(71)【出願人】
【識別番号】504165591
【氏名又は名称】国立大学法人岩手大学
(71)【出願人】
【識別番号】504155293
【氏名又は名称】国立大学法人島根大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】アビドゥール ラーマン
(72)【発明者】
【氏名】秋廣 高志
(72)【発明者】
【氏名】田野井 慶太朗
【テーマコード（参考）】
2B022
2B030
4H026
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B022DA19
2B030AA02
2B030AA03
2B030AD08
2B030CA17
4H026AA10
4H026AB04
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA30
4H045EA60
(57)【要約】
【課題】本発明は、セシウム特異的輸送体を特定して、これを利用してセシウム汚染土壌を浄化する方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、植物のセシウム吸収を抑制する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明によれば、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法が提供される。さらに本発明によれば、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物に提供される。加えて、本発明によれば、セシウム取り込みタンパク質をコードする遺伝子の機能が抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法、およびセシウム取り込みタンパク質をコードする遺伝子の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】本発明によれば、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法が提供される。さらに本発明によれば、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物に提供される。加えて、本発明によれば、セシウム取り込みタンパク質をコードする遺伝子の機能が抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法、およびセシウム取り込みタンパク質をコードする遺伝子の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法。
【請求項2】
カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質が、以下のａ）からｄ）から選択される何れかである、請求項１に記載の方法。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項3】
請求項２に記載のカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質のいずれかを過剰発現する植物。
【請求項4】
遺伝子組換え植物またはトランスジェニック植物である、請求項３に記載の植物。
【請求項5】
ヒマワリ(Helianthus)、アブラナ（Brassica）、ポプラ（Populus）、またはヤナギ（Saliｘ）である、請求項４に記載の植物。
【請求項6】
以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能を抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項7】
以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法に関する。さらに本発明は、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物に関する。加えて、本発明は、セシウム取り込みタンパク質の機能を抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法、およびセシウム取り込みタンパク質の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部に関する。
【背景技術】
【0002】
原子力発電所の事故で発生した放射性セシウム（セシウム134およびセシウム137）は、拡散して土壌に蓄積し、環境への深刻な脅威となっている。セシウムはカリウム輸送体を利用して植物に吸収されることが知られており、放射性セシウムによる土壌汚染は農作業や作物生産を制限する。
【0003】
セシウム汚染された土壌を浄化方法する方法として、植物を用いた環境修復であるファイトレメディエーションが行われている。例えば、特許文献１は、土壌にシバ類を植栽して土壌中のセシウムをシバ類に吸収させることをこと含むセシウム汚染土壌浄化方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１２－２２３６９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
自然界の植物は、セシウムを吸収する際にカリウムも吸収する、即ち、カリウム依存性を有している。そのため、放射性セシウムに対して、ファイトレメディエーションを実現しようとすると、土壌中のセシウムを多く吸収しようとするほどにカリウムも多く吸収されてしまい、土壌中のカリウムが枯渇して農業ができない土壌になってしまうということが問題となっていた。
【0006】
セシウムとカリウムは、共にアルカリ金属元素であり、類似の化学的性質を有するため、セシウム（Ｃｓ+）とカリウム（Ｋ+）の輸送と密接に結びついている。これまでＣｓ+輸送体として特徴づけられてきた輸送体のほとんどは、Ｋ+の輸送に直接的または間接的に関連する。カリウムは必須元素である。カリウム輸送体の過剰発現は、カリウムが枯渇した土壌に帰着する。したがって、カリウム輸送体を過剰に発現させて土壌から十分なセシウムを吸収させることは現実的ではない。
【0007】
そのため、カリウムに依存しないセシウム輸送体を同定し、セシウムに汚染された土壌を浄化して、再び農業に利用できるような新しい技術を開発する必要があった。よって、本発明は、セシウム特異的輸送体を特定して、これを利用してセシウム汚染土壌を浄化する方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、植物のセシウム吸収を抑制する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法。
［２］ カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質が、以下のａ）からｄ）から選択される何れかである、［１］に記載の方法。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
［３］ ［２］に記載のカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質のいずれかを過剰発現する植物。
［４］ 遺伝子組換え植物またはトランスジェニック植物である、［３］に記載の植物。
［５］ ヒマワリ(Helianthus)、アブラナ（Brassica）、ポプラ（Populus）、またはヤナギ（Saliｘ）である、［４］に記載の植物。
［６］ 以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能を抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
［７］ 以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
［１］ カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法。
［２］ カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質が、以下のａ）からｄ）から選択される何れかである、［１］に記載の方法。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
［３］ ［２］に記載のカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質のいずれかを過剰発現する植物。
［４］ 遺伝子組換え植物またはトランスジェニック植物である、［３］に記載の植物。
［５］ ヒマワリ(Helianthus)、アブラナ（Brassica）、ポプラ（Populus）、またはヤナギ（Saliｘ）である、［４］に記載の植物。
［６］ 以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能を抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
［７］ 以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、セシウム汚染土壌からセシウムを特異的に除去する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３のアミノ酸配列を示す(配列番号１)。
【図1B】シロイヌナズナのＡＢＣＧ３７のアミノ酸配列を示す(配列番号２)。
【図1C】ヒマワリのＰＤＲ５のアミノ酸配列(配列番号３)を示す。
【図1D】ヒマワリのＰＩＳ１のアミノ酸配列(配列番号４)を示す。
【図1E】シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３、シロイヌナズナのＡＢＣＧ３７、ヒマワリのＰＤＲ５およびヒマワリのＰＩＳ１がクラスターを形成することを示す系統樹である。外群には、シロイヌナズナのＡＢＣＧ１１、ＡＢＣＧ３１、ＡＢＣＧ３２、ＡＢＣＧ３４、ＡＢＣＧ３５、ＡＢＣＧ３６およびＡＢＣＧ３８を用いた。系統解析は、ｃｌｕｓｔａｌｗ（Larkin MA et al., 2007, Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948.）を用いて行った。
【0011】
【図2】（Ａ）本研究で用いたＡＢＣＧ３７変異体の代表的な図である。黒い実線と分断された黒線はそれぞれエキソンとイントロンを示す。（Ｂ）１．５ｍＭのＣｓ+の存在下でのＣｏｌ－０、ａｂｃｂ３７－１、ａｂｃｇ３７－２、ａｂｃｇ３７－３、およびａｂｃｇ３７－４の一次根伸長を示す。３日齢の照明育成実生を１．５ｍＭ Ｃｓ+含有または無しの新しい寒天プレートに移し、２３℃で３日間インキュベートした。エラーバーは、３回の独立した実験から得られた±ＳＥで、１回の実験につき８本の実生を観察した。星印は、スチューデントのｔ検定で判断した処理間の統計的有意性を表す：＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）対照区（control）および１．５ｍＭ Ｃｓ+プレートでの３日間のインキュベーション後の野生型（Ｃｏｌ－０）およびａｂｃｇ３７変異体の根の表現型を示す。画像は、１回の実験につき８本の実生を観察し、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。バーは１０ｍｍである。（Ｄ）対照区（control）および１．５ｍＭ Ｃｓ+プレートでの３日間のインキュベーション後の野生型（Ｃｏｌ－０）およびａｂｃｇ３７変異体の根の表現型を示す。画像は、１回の実験につき８本の実生を観察し、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。バーは１０ｍｍである。（Ｅ）１、１．５、および２ｍＭ Ｃｓ+の存在下でのＣｏｌ－０、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｂ３７－２－１１」、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｂ３７－２－２１」、および「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｂ３７－２－２３」の一次根伸長である。３日齢の照明育成実生を新しい寒天プレートに移し、２３℃で３日間インキュベートした。エラーバーは、３回の独立した実験から得られた±ＳＥで、１回の実験につき８本の実生が観察された。星印は、スチューデントのｔ検定で判断した処理間の統計的有意性を表す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0012】
【図3】３日齢の照明育成ＡＢＣＧ３７‐ＧＦＰおよびＡＢＣＧ３３‐ＧＦＰ実生を対照区（control）および１．５ｍＭのＣｓ+含有プレートに移した。（Ａ）ＡＢＣＧ３７－ＧＦＰおよびＡＢＣＧ３３－ＧＦＰのＧＦＰ蛍光が２４、４８、７２時間の時点で観察された。画像は、３つの独立した実験を代表する単一の共焦点切片であり、各実験について処理ごとに５つの実生が観察される。バー、５０ｍｍ。（Ｂ）２４、４８、７２時間時点での対照区（control）および１．５ｍＭのＣｓ+含有プレートのＡＢＣＧ３７－ＧＦＰ、ＡＢＣＧ３３－ＧＦＰ、ＰＩＮ２－ＧＦＰ、およびＥＧＦＰ－ＬＴＩ６ｂにおけるＧＦＰシグナルの定量化。各実験の処理ごとに５個の実生を観察し、３つの独立した実験から定量を行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ－Ｆ）タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）およびユビキチンプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２のＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７発現のＣｓ+誘導変更に対する効果。５日齢のＡＢＣＧ３７‐ＧＦＰおよびＡＢＣＧ３３‐ＧＦＰ実生を液体増殖培地に移し、５０ｍＭのＭＧ１３２または５０ｍＭのＣＨＸの存在下または非存在下で１時間処理した後、１．５または１５ｍＭのＣｓ+の存在下または非存在下で３時間処理した。インキュベーション後、同じレーザ設定を用いて共焦点レーザ走査顕微鏡でＧＦＰ蛍光を可視化した。画像は、各実験について処理ごとに５または６個の実生を観察した、少なくとも４回の独立した実験を代表する単一共焦点切片である。（ＣおよびＥ）バー、１００ｍｍ。（ＤおよびＦ）４回または５回の独立した実験から得られた２０～３０の実生からのＧＦＰシグナルの定量化。垂直棒は±ＳＥである。（Ｂ、Ｄ、Ｆ）複数の処理間の比較は分散分析に続いてＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定を行った。同じレベル／アルファベット文字は、差がないことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【0013】
【図4】（Ａ－Ｃ）Ｃｏｌ－０、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－１１」、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２１」、および「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２３」の根端における137Ｃｓ+の短期取り込み試験を示す。４日齢の照明育成Ｃｏｌ－０および単一および二重変異体実生を、Ｋ+の存在下（６ｍＭ）または非存在下、１０μＭ（Ａ）、１．５ｍＭ（Ｂ）、１５ｍＭ（Ｃ）の137Ｃｓ+で２時間インキュベートした。培養後、実生を３回洗浄し、各試料につき１０本の根から１０ｍｍの根端を切除し、シンチレーションカウンターを用いて放射能を計数した。データは、少なくとも３回の独立した実験からの平均であり、ミリメートルの根端当たりで表す。エラーバーは±ＳＥであり、星印はスチューデントのｔ検定で判断した遺伝子型間の統計的有意性を表す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）Ｃｏｌ－０およびａｂｃｇ二重変異体中のセシウム含量を示す。３日齢の照明育成Ｃｏｌ－０および二重変異体実生を、種々のＫ+濃度の存在下で１．５ｍＭ Ｃｓ+プレートに移し、３日間インキュベートした。実生全体のＣｓ+量をＩＣＰ－ＭＳで測定した。データは３つの独立した実験から得た。エラーバーは±ＳＥであり、星印はスチューデントのｔ検定で判断した処理間の統計的有意性を表す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0014】
【図5】（Ａ）Ｃｏｌ－０およびａｂｃｇ二重突然変異体実生におけるカリウム含量を示す。３日齢の照明育成のＣｏｌ０と二重変異体の実生を種々濃度のＫ+を含む新鮮なプレートに移し、３日間インキュベートした。実生全体のＫ+量をＩＣＰ－ＭＳで測定した。（Ｂ）１００ｍＭ塩化カリウム存在下でのＣｏｌ－０、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－１１」、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２１」、および「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２３」の一次根伸長反応を示す。３日齢の照明育成のＣｏｌ－０と二重変異体実生を１００ｍＭの塩化カリウム含有プレートに移し、３日間インキュベートした。（Ｃ）Ｋ+制限およびＫ+十分条件でのＣｏｌ－０と「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２１」の実生表現型を示す。３日齢の照明育成Ｃｏｌ－０と二重変異体実生をカリウム欠乏または６ｍＭカリウム含有プレートに移し、さらに３日間成長させた。プレート裏面のティックマークは、移植時間を示す。写真は３回の独立した実験の代表である。二重変異体はＫ+の有無にかかわらず野生型様の表現型を示すことに注意されたい。バー、５ｍｍ。（Ｄ）Ｋ+制限およびＫ+十分条件のへの移行後のＣｏｌ－０と「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２１」の根伸長の定量化。（Ａ）および（Ｂ）および（Ｄ）のエラーバーについては、３回の独立した実験からの±ＳＥである。二重変異体におけるＫ+含量と根伸長率は、スチューデントｔ検定で判断し、野生型と比較して統計学的に有意ではなかった。
【0015】
【図6】（Ａ）Ａｔ ＡＢＣＧ３３およびＡｔ ＡＢＣＧ３７を発現する出芽酵母Ｗ３０３－１Ａ細胞におけるＣｓ+耐性アッセイを示す。空のｐＹＥＳ２プラスミド、ＡＢＣＧ３３、ＡＢＣＧ３７、およびＯｓＨＡＫ５（通性Ｃｓ+輸送体）を持つ酵母形質転換体を、０および３０ｍＭのＣｓＣｌを添加したＳＤ－Ｇａｌ固体培地上で培養し、７２時間後に写真をとった。各スポットを左から右に１０倍希釈した。写真は、３回の独立した実験の代表的な画像である。（Ｂ－Ｆ）１３７Ｃｓ取り込み実験を示す。ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を発現する出芽酵母Ｗ３０３－１Ａ細胞を用いて、Ａｔ ＡＢＣＧ３３とＡｔ ＡＢＣＧ３７のＣｓ+取り込み能を調べた。プラスミドを持つ酵母形質転換体（１×１０7細胞）を０．４（Ｂ），１．４（Ｃ），１０（Ｄ），１００μＭ（Ｅ）および１０ｍＭ（Ｆ）133ＣｓＣｌ含有137ＣｓＣｌ（３９０Ｂｑ（１００μｌ）-1）で１時間培養した。培養後、細胞を１０ｍＭ 133ＣｓＣｌで５回洗浄し、細胞の137ＣｓＣｌ含量をＮａＩシンチレーションオートガンマカウンターで測定した。実験は３回繰り返し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝１２）を表した。星印は、スチューデントのｔ検定で判断した空ベクターと形質転換体の間の統計的有意性を表す：＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｇ）ＡＢＣＧ３３またはＡＢＣＧ３７を発現する出芽酵母ＢＹＴ１２（ｔｒｋ１Δ ｔｒｋ２Δ）細胞の増殖表現型を示す。空のｐＹＥＳ２プラスミド、ＡＢＣＧ３３、ＡＢＣＧ３７、およびＡｔＡＫＴ１（カリウム輸送体）を持つ形質転換体を、０～１００ｍＭのＫＣｌを添加したＳＤ－Ｇａｌ固体培地上で培養し、９６時間後に写真をとった。各スポットを左から右に１０倍希釈した。写真は、３回の独立した実験の代表的な画像である。（Ｈ）１．０ｍＭのＲｂＣｌの存在下でのＡｔＡＢＣＧ３３、ＡｔＡＢＣＧ３７、またはＡｔＡＫＴ１を発現する酵母におけるＲｂ+の取り込みを示す。ＣＹ１９２（Δｔｒｋ１ｔｒｋ２）酵母細胞を空ベクターｐＹＥＳ２またはＡｔＡＢＣＧ３３、ＡｔＡＢＣＧ３７、またはＡｔＡＫＴ１ ｃＤＮＡを含むベクターで形質転換した。プラスミドを持つ酵母形質転換体（１×１０7細胞）を１ｍＭ ＲｂＣｌの存在下で２時間培養した。細胞のＲｂ+含量をＮａＩシンチレーションオートガンマカウンターで測定した。実験は３回繰り返し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝６）を表した。星印は、スチューデントのｔ検定で判断した空ベクターと形質転換体の間の統計的有意性を表す：＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【0017】
（セシウム取り込みタンパク質の過剰発現）
本発明者らは、カリウム（Ｋ+）輸送に影響しないセシウム（Ｃｓ+）取り込み植物タンパク質を世界で初めて発見した。カリウムの輸送に影響しないセシウム取り込み植物タンパク質を過剰発現させた植物は、放射性セシウム汚染土壌のファイトレメディエーション法の実現に有用である。ファイトレメディエーションは、セシウム、カドミウムやヒ素などによって汚染された土壌を、特定の植物を用いて、汚染物質を根から吸収させ、植物体内に蓄積させながら成長させることにより、浄化する手法である。従来の方法とは異なり、植物を用いることで土壌環境を大きく変化させることなく汚染土壌を浄化することが出来るため、コスト面にも優れる。
本発明者らは、カリウム（Ｋ+）輸送に影響しないセシウム（Ｃｓ+）取り込み植物タンパク質を世界で初めて発見した。カリウムの輸送に影響しないセシウム取り込み植物タンパク質を過剰発現させた植物は、放射性セシウム汚染土壌のファイトレメディエーション法の実現に有用である。ファイトレメディエーションは、セシウム、カドミウムやヒ素などによって汚染された土壌を、特定の植物を用いて、汚染物質を根から吸収させ、植物体内に蓄積させながら成長させることにより、浄化する手法である。従来の方法とは異なり、植物を用いることで土壌環境を大きく変化させることなく汚染土壌を浄化することが出来るため、コスト面にも優れる。
【0018】
本発明によれば、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を利用することを含む、セシウム汚染土壌を浄化する方法が提供される。より具体的には、セシウム汚染土壌を浄化する方法は、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を作製する工程、作製したカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物をセシウム汚染土壌に植え付けて成長させる工程、および成長した作製したカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物を収穫する工程を含むことができる。植物の植え付けは、種子の播種や幼植物の植え付けにより行うことができる。植え付けた植物は、一定期間成長させることにより、セシウム（Ｃｓ+）を根から吸収させ、植物体内に蓄積させることができる。植物は、根を含む植物全体を収穫することが好ましい。根を含む植物全体に放射性セシウムが蓄積されている可能性があるためである。収穫した植物は、吸収された放射性セシウムが再分散しない手段で、保存され、処分される。本発明のセシウム汚染土壌を浄化する方法によれば、カリウム（Ｋ+）を過度に除去することなく、セシウム汚染土壌を浄化することができる。
【0019】
本明細書における過剰発現とは、形質転換されていない植物細胞または植物における産生レベルを超える、形質転換された植物細胞または植物における遺伝子産物の産生をいう。「過剰発現された」カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質は、形質転換されていない植物の細胞内で産生される量より多い量が産生される。例えば、形質転換遺伝子（カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質をコードする遺伝子）を適切な構成的プロモーターと結合させて、その形質転換遺伝子を持続的に発現させることによって過剰発現させることができる。必要な場合のみに選択的に過剰発現され得るようにするためには、形質転換遺伝子を強力な誘導性プロモーターに連結するようにすることができる。本発明の実施に使用することができるプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーター、ＡＰＸ、ＰＧＤ１、Ｒ１Ｇ１Ｂプロモーター等が含まれるがこれらに限定されない。
【0020】
カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物は、公知の遺伝子改変技術を用いて作出することができる。例えば、遺伝子組換え植物を作製するための技術として、組織培養法やｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換法を用いることができるがこれらに限定されない。外来遺伝子を導入する手法として、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法、パーティクルボンバードメント法やエレクトロポレーション法を用いることができるが、これらに限定されない。
【0021】
具体的には、カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質をコードする遺伝子に特異的なクローニング用プライマーを用いて核酸増幅法によりｃＤＮＡを得る。シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７をコードする遺伝子の塩基配列は、以下のＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯに基づき取得することができる。シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３：ＮＭ＿００１３３６６４６、シロイヌナズナのＡＢＣＧ３７：ＮＭ＿１１５２０８。ヒマワリのＰＤＲ５およびＰＩＳ１をコードする遺伝子の塩基配列はEnsembleplant （https://plants.ensembl.org/index.html）の遺伝子IDから得ることができる。PDR5- HannXRQ_Chr11g0339671 (https://plants.ensembl.org/Helianthus_annuus/Search/Results?species=Helianthus_annuus;idx=;q=PDR5;site=ensemblunit)、PIS1-HannXRQ_Chr11g0339701 (https://plants.ensembl.org/Helianthus_annuus/Gene/Summary?g=HannXRQ_Chr11g0339701;r=11:105945644-105958600;t=OTG08261;db=core)。ｃＤＮＡはプロモーター、ターミネーター等の必要なすべての調節配列を有する適切なベクターに導入される。ベクターは、例えば、pENTR-D/TOPO（Invitrogen, USA）である。これをバイナリーベクター（例えば、pK7WGF）に導入するには、メーカーの指示に従って、構成的プロモーターを用いたゲートウェイ・クローニング手法を用いる。挿入された遺伝子をシークエンスで確認した後、アグロバクテリウムを用いた形質転換法により、植物に目的の遺伝子を導入する。抗生物質のスクリーニングを行った後、陽性の植物を育てる。過剰発現株は、定量的ＰＣＲによる転写レベルとウェスタンブロットによる翻訳レベルの両方で確認される。
【0022】
カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物ではセシウム吸収が増加しており、放射性セシウム汚染土壌で生育させると、植物に蓄積される放射性セシウムの量が、同種の野生型植物に比較して増加する。カリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物のセシウム吸収が増加していることは、例えば対象となるカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質を過剰発現する植物と、適切なコントロールである植物を、一定量のセシウムが含まれる培地で栽培し、得られた植物またはその一部に含まれるセシウム量を比較することにより、判断することができる。
【0023】
本発明者らは、アラビドプシスにおいて、ＡＢＣタンパク質のＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７がセシウム取り込みタンパク質であることを見出した。後記する実施例には、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の二重欠損変異体では、普通のシロイヌナズナに比べて、植物体内の放射性セシウム量が有意に減少することが示されている。出芽酵母を用いた実験では、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７を発現させた株では、放射性セシウム吸収量が有意に増加すること、およびこれらのタンパク質が、カリウム輸送には関与していないことが示されている。
【0024】
本発明の一実施態様において、植物が過剰発現するカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質が、シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７およびそのホモログのいずれかであってもよい。シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７およびそのホモログは、例えば、以下のａ）からｄ）から選択される何れかであってもよい。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【0025】
シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７は、それぞれ配列番号１および２に記載のアミノ酸配列を有する。シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７のヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）のホモログは、ＰＤＲ５（配列番号３）およびＰＩＳ１（配列番号４）である。系統解析において、ヒマワリのＰＤＲ５およびＰＩＳ１は、シロイヌナズナのＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７と共に系統樹中でクラスターを形成した。ＡＢＣＧ３３とＰＤＲ５のアミノ酸配列同一性は６５％である。ＡＢＣＧ３７とＰＩＳ１のアミノ酸配列同一性は６５％である。「ホモログ」とは、共通の祖先をもち、実質的に同じ機能を有するタンパク質またはそれをコードするＤＮＡを意味し、特定の場合には、オルソログ（種分岐相同）を意味する。
【0026】
本発明の一実施態様において、植物が過剰発現するカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質は、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【0027】
本発明の一実施態様において、植物が過剰発現するカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質は、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の何れか１つであってよいし、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の任意の組合せであってよい。さらには、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の何れか１つであってよいし、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の任意の組合せであってよい。
【0028】
本発明の一実施態様において、植物が過剰発現するカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の両方であってもよいし、さらには配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の両方であってもよい。あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の両方であってもよいし、さらには配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の両方であってもよい。
【0029】
本発明の一実施態様において、植物が過剰発現するカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質は、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、または少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つセシウム取り込み活性を有する、タンパク質であってもよい。
【0030】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸 残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアライ ンメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。
【0031】
さらには、本発明の一実施態様において、植物が過剰発現するカリウム非依存性セシウム取り込みタンパク質は、配列番号１、２、３または４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、且つセシウム取り込み活性を有するポリペプチドであってもよい。本明細書で言う「１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１もしく数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【0032】
本発明によれば、上記のカリウム非依存性セシウム取り込み機能を有するタンパク質を過剰発現する植物およびその一部が提供される。本発明の一実施態様では、植物は、遺伝子組換え植物またはトランスジェニック植物である。植物は、ファイトレメディエーションに利用できる植物であればよいが、例えば面積に対してたくさんの植物を植えることができ、大きく育つ植物が好ましく、例えば、これらに限定されないが、ヒマワリ(Helianthus)、アブラナ（Brassica）、ポプラ（Populus）、およびヤナギ（Saliｘ）を利用することができる。さらに本発明によれば、上記のカリウム非依存性セシウム取り込み機能を有するタンパク質を過剰発現する植物またその一部を含む、セシウム吸収材を提供することができる。本明細書において、植物に関する「その一部」は、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官またはその部分（葉、根、茎、花、おしべ、めしべ、萼などを含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
【0033】
本発明の一実施態様では、ヒマワリの植物体にアラビドプシスのセシウム取り込みタンパク質、ＡＢＣＧ３３および／またはＡＢＣＧ３７の遺伝子を遺伝子導入して、このタンパク質を過剰発現する植物を作製することができる。別の実施態様では、ヒマワリの植物体において、ヒマワリのセシウム取り込みタンパク質、ＰＤＲ５および／またはＰＩＳ１を遺伝子導入して過剰発現する植物を作製してもよい。
【0034】
本明細書において「トランスジェニック植物」は、別の植物種または非植物種由来の遺伝子を有する植物である。本明細書において「遺伝子組換え植物」は、１つ以上の遺伝的改変、例えば、１つ以上の設計された変異を含む遺伝子を有する植物のことをいう。設計された変異は、天然のものと異なる活性を有するタンパク質をもたらし得、天然のものと異なる活性には、発現レベルの増加が含まれ得る。本明細書において使用する場合、「トランスジェニック植物」は、「遺伝子組換え植物」の一種である。
【0035】
本発明は、植物細胞または植物体に対して、カリウム非依存性セシウム取り込みの増加した活性を付与するタンパク質を提供することができ、ここで本発明のタンパク質は、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７およびそのホモログを含む。より具体的には、これらのタンパク質は、以下のａ）からｄ）から選択される何れかであってもよい。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【0036】
さらに、本発明は、植物細胞または植物体に対して、カリウム非依存性セシウム取り込みの増加した活性を付与するタンパク質をコードする核酸を提供することができ、ここで、カリウム非依存性セシウム取り込みの増加した活性を付与するタンパク質は上記のａ）～ｄ）のタンパク質の何れかである。
【0037】
本発明は、上記のａ）～ｄ）のタンパク質の何れかをコードする核酸を含むベクターを提供することができる。本発明において使用することができるベクターは、植物宿主細胞中で複製可能なものであればよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどを使用することができる。プラスミドＤＮＡとしては、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えば、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミドなど）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２など）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＡＭα１など）、酵母由来のプラスミド（例えばｐＧＩＬＤＡ、ＹＡＣなど）などを使用することができ、ファージＤＮＡとしては、λファージ（λＥＭＢＬ、λＺＡＰ、λｇｔ１０など）などを使用することができる。
【0038】
（セシウム取り込みタンパク質の発現抑制）
本発明の別の局面では、植物のセシウム吸収を抑制する方法が提供される。上記のとおり、本発明者らは、ＡＢＣタンパク質のＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７がセシウム取り込みタンパク質であることを見出した。後記する実施例には、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の二重欠損変異体では、普通のシロイヌナズナに比べて、植物体内の放射性セシウム量が有意に減少することが示されている。植物のセシウム吸収を抑制する方法は、セシウム取り込みタンパク質ＡＢＣＧ３３および／またはＡＢＣＧ３７またはそのホモログの活性を抑制または喪失させることにより実施することができる。
本発明の別の局面では、植物のセシウム吸収を抑制する方法が提供される。上記のとおり、本発明者らは、ＡＢＣタンパク質のＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７がセシウム取り込みタンパク質であることを見出した。後記する実施例には、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の二重欠損変異体では、普通のシロイヌナズナに比べて、植物体内の放射性セシウム量が有意に減少することが示されている。植物のセシウム吸収を抑制する方法は、セシウム取り込みタンパク質ＡＢＣＧ３３および／またはＡＢＣＧ３７またはそのホモログの活性を抑制または喪失させることにより実施することができる。
【0039】
植物のセシウム吸収を抑制するとは、特に記載した場合を除き、植物の根からのセシウム吸収を抑制することである。セシウム吸収が抑制されていることは、例えば対象となるセシウム吸収が抑制されているであろう植物と、適切なコントロールである植物を、一定量のセシウムが含まれる培地で栽培し、得られた植物またはその一部に含まれるセシウム量を比較することにより、判断することができる。セシウム吸収が抑制された植物を、「セシウム低吸収性」ということができる。上記のとおり、ＡＢＣＧ３３および／またはＡＢＣＧ３７は、カリウム輸送には関与していないので、本発明の方法によれば、植物の成長に必要なカリウムの吸収を阻害せずに、植物のセシウム吸収を抑制することができる。
【0040】
具体的には、本発明は、以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能を抑制または喪失させることを含む、植物のセシウム吸収を抑制する方法に関する。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【0041】
上記タンパク質の機能を抑制または喪失は、上記ａ）からｄ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子のエキソン部分に少なくとも１カ所の変異を生じさせることにより行うことができるが、これに限定されない。変異は、遺伝子が転写される際に重要な配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域）に少なくとも１カ所の変異を生じさせることにより行ってもよい。これらの領域に変異がある場合、発現量が減るか、またはその遺伝子が発現しなくなる等の影響が生じる可能性がある。変異は、例えば、フレームシフトが起こす塩基の挿入または欠損等があるが、これに限定されない。変異を生じさせる手法は限定されず、人為的に、例えば化学物質（例えば、アジ化ナトリウム、ＭＮＵ）、ＵＶ照射、放射線照射、イオンビーム照射等により生じさせたものであってもよく、天然に存在するものであってもよい。
【0042】
上記タンパク質の機能の抑制または喪失は、また、アンチセンス法による遺伝子ノックダウンや、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介して遺伝子のノックダウンを行うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を利用して行うこともできる。また、人工制限酵素（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を用いるゲノム編集により、ノックアウト株を作製することもできる。
【0043】
さらに、本発明は、以下のａ）からｄ）から選択される何れかのタンパク質の機能が抑制または喪失されている、セシウム低吸収性植物またはその一部を提供する。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【0044】
セシウム吸収を抑制する対象となる植物は、その植物種におけるＡＢＣＧ３３および／またはＡＢＣＧ３７のホモログを抑制または喪失することにより、セシウム吸収を抑制することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは被子植物であり、双子葉植物、単子葉植物である。具体的には、ダイコン、カブ、ハクサイ、キャベツ、ハナヤサイ、シロナ、ミズナ、 ミブナ、コマツナ、ブロッコリー、カリフラワー、シュンギク、ゴボウ、レタス、フキ、ピーマン、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、シシトウ、エンドウ、ソラマメ、エダマメ、インゲン、ラッカセイとして食用にされている植物などであるがこれらに限定されない。
【実施例0045】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」等は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
【0046】
方法
植物原料
用いたすべての株はArabidopsis thalianaのコロンビア系統にある。abcb1/mdr2、abcb3/mdr4、abcb5/mdr5、abcb6/mdr6、abcb7/mdr9、abcb10/mdr10、abcb11/mdr8、abcb13/mdr15、abcb15/mdr13、abcb17/mdr19、abcb19/mdr11、abcb20/mdr14、abcb22/mdr21は、Edgar Spalding博士（Department of Botany, University of Wisconsin Madison）から、abcg37-1/pdr9-1はWillian M. Gray博士（Department of Plant Biology, University of Minnesota）から提供された。他のトランスファーDNA挿入変異体はABRC (シロイヌナズナ生物資源センター)から入手した。以下の変異体は、文献に記載されている：35S::ABCG37-GFP (Ruzicka et al., 2010. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 107:10749-10753.)、35S:ABCG33-GFP(Schuetz et al., 2014. Plant Physiol. 166:798-807.)、PIN2-GFP (Xu and Scheres, 2005. Plant Cell 17:525-536.)、EGFP-LTI6b (Kurup et al., 2005. Plant J. 42:444-453.)、pCyclinB1;1-GUS(Colon-Carmona et al., 1999. Plant J. 20:503-508.)。
植物原料
用いたすべての株はArabidopsis thalianaのコロンビア系統にある。abcb1/mdr2、abcb3/mdr4、abcb5/mdr5、abcb6/mdr6、abcb7/mdr9、abcb10/mdr10、abcb11/mdr8、abcb13/mdr15、abcb15/mdr13、abcb17/mdr19、abcb19/mdr11、abcb20/mdr14、abcb22/mdr21は、Edgar Spalding博士（Department of Botany, University of Wisconsin Madison）から、abcg37-1/pdr9-1はWillian M. Gray博士（Department of Plant Biology, University of Minnesota）から提供された。他のトランスファーDNA挿入変異体はABRC (シロイヌナズナ生物資源センター)から入手した。以下の変異体は、文献に記載されている：35S::ABCG37-GFP (Ruzicka et al., 2010. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 107:10749-10753.)、35S:ABCG33-GFP(Schuetz et al., 2014. Plant Physiol. 166:798-807.)、PIN2-GFP (Xu and Scheres, 2005. Plant Cell 17:525-536.)、EGFP-LTI6b (Kurup et al., 2005. Plant J. 42:444-453.)、pCyclinB1;1-GUS(Colon-Carmona et al., 1999. Plant J. 20:503-508.)。
【0047】
３つの独立した二重欠損変異体（ａｂｇｃ３７‐２ ａｂｃｇ３３‐１）は、交配により作製し、遺伝子型タイピングによりホモ接合系統を選択した。遺伝子型タイピングに使用したプライマーを表１に示す。
【表1】
【0048】
生育条件
表面滅菌した種子を円形９ｃｍのペトリ平板に入れ、１％（ｗ／ｖ）ショ糖と０．８％（ｗ／ｖ）寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ寒天；ＢＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む改良ホアグランド培地（４ｍＭ ＫＮＯ3、１ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、０．３ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８９μＭ クエン酸鉄、４６．３μＭ Ｈ3ＢＯ3、９．１μＭ ＭｎＣｌ2、０．７７μＭ ＺｎＳＯ4、０．３１μＭ ＣｕＳＯ4、および０．１１μＭ ＭｏＯ3、 Baskin and Wilson, 1997. Plant Physiol. 113:493-502.）を用いた。暗所での４℃での層化の２日後に、プレートを２３℃の育成チャンバー（ＮＫシステム； ＬＨ‐７０ＣＣＦＬ‐ＣＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈｏｎｉｋａ．ｃｏ．ｊｐ）の連続白色光（約１００μｍｏｌ ｍ-2 Ｓ-1の放射光）下に移した。実生は３日間垂直に成長した。塩化セシウム処理のために、3日齢実生を種々の濃度の塩化セシウム含有プレートに移し、種々の時間インキュベートした。根の伸長データは、対応する培地に移した後、記載した濃度での根の伸長を表している。根の伸長を測定するために、デジタルカメラ(パワーショットA640、キャノン)を用いてプレートの写真を撮影し、画像解析ソフトImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/)により解析した。
表面滅菌した種子を円形９ｃｍのペトリ平板に入れ、１％（ｗ／ｖ）ショ糖と０．８％（ｗ／ｖ）寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ寒天；ＢＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む改良ホアグランド培地（４ｍＭ ＫＮＯ3、１ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、０．３ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８９μＭ クエン酸鉄、４６．３μＭ Ｈ3ＢＯ3、９．１μＭ ＭｎＣｌ2、０．７７μＭ ＺｎＳＯ4、０．３１μＭ ＣｕＳＯ4、および０．１１μＭ ＭｏＯ3、 Baskin and Wilson, 1997. Plant Physiol. 113:493-502.）を用いた。暗所での４℃での層化の２日後に、プレートを２３℃の育成チャンバー（ＮＫシステム； ＬＨ‐７０ＣＣＦＬ‐ＣＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈｏｎｉｋａ．ｃｏ．ｊｐ）の連続白色光（約１００μｍｏｌ ｍ-2 Ｓ-1の放射光）下に移した。実生は３日間垂直に成長した。塩化セシウム処理のために、3日齢実生を種々の濃度の塩化セシウム含有プレートに移し、種々の時間インキュベートした。根の伸長データは、対応する培地に移した後、記載した濃度での根の伸長を表している。根の伸長を測定するために、デジタルカメラ(パワーショットA640、キャノン)を用いてプレートの写真を撮影し、画像解析ソフトImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/)により解析した。
【0049】
塩化セシウムはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から購入した。キャリアフリーの137Ｃｓ溶液（３．７ＭＢｑ ｍｌ-1）は、Ｅｃｋｅｒｔ＆Ｚｉｅｇｌｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｚａｇ．ｃｏｍ）から購入した。その他の化学物質は、富士フィルム和光純薬株式会社から購入した。運動学的分析はRahman et al., 2007 （Plant J. 50:514-528. )に記載の通り行った。
【0050】
根におけるセシウム輸送アッセイ
４日齢の照明育成実生を１０μＭ、１．５ｍＭ、および１５ｍＭの137Ｃｓ+含有液体ホアグランド溶液にカリウム存在下（６ｍＭ Ｋ+）またはカリウム非存在下で２時間インキュベートし、ナイロンメッシュ上に移し、液体ホアグランド溶液で短時間３回洗浄した。１０個の実生から１０ミリメートルの根端を各試料ごとに集め、５００μｌのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ ４０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）とともにシンチレーションバイアルに入れた。137Ｃｓ+の取り込みは、ＮａＩシンチレーションカウンター（ＡＲＣ‐３００，Ａｌｏｋａ，Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｈｉｔａｃｈｉ‐ａｌｏｋａ．ｃｏ．ｊｐ）で測定した。実験は３回繰り返した。
４日齢の照明育成実生を１０μＭ、１．５ｍＭ、および１５ｍＭの137Ｃｓ+含有液体ホアグランド溶液にカリウム存在下（６ｍＭ Ｋ+）またはカリウム非存在下で２時間インキュベートし、ナイロンメッシュ上に移し、液体ホアグランド溶液で短時間３回洗浄した。１０個の実生から１０ミリメートルの根端を各試料ごとに集め、５００μｌのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ ４０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）とともにシンチレーションバイアルに入れた。137Ｃｓ+の取り込みは、ＮａＩシンチレーションカウンター（ＡＲＣ‐３００，Ａｌｏｋａ，Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｈｉｔａｃｈｉ‐ａｌｏｋａ．ｃｏ．ｊｐ）で測定した。実験は３回繰り返した。
【0051】
イオン含有量の測定
３日齢のＣｏｌ‐０および二重欠損変異体実生を、様々なＫ+濃度の対照区および１．５ｍＭの塩化セシウム含有プレートに移し、連続白色光下で２３℃で３日間インキュベートした。実生全体を回収し、超純水で３回洗浄し、ペーパータオルに浸し、新鮮重量を測定した。試料を６５℃で乾燥し、９５℃で超高純度硝酸（関東化学、日本）を用いて１０時間消化した。イオン含有量は、誘導結合プラズマ質量分析計（ＮｅｘＩＯＮ３５０Ｓ、パーキンエルマー、日本）を用いて決定した。
３日齢のＣｏｌ‐０および二重欠損変異体実生を、様々なＫ+濃度の対照区および１．５ｍＭの塩化セシウム含有プレートに移し、連続白色光下で２３℃で３日間インキュベートした。実生全体を回収し、超純水で３回洗浄し、ペーパータオルに浸し、新鮮重量を測定した。試料を６５℃で乾燥し、９５℃で超高純度硝酸（関東化学、日本）を用いて１０時間消化した。イオン含有量は、誘導結合プラズマ質量分析計（ＮｅｘＩＯＮ３５０Ｓ、パーキンエルマー、日本）を用いて決定した。
【0052】
出芽酵母を用いたセシウム輸送・育成試験
酵母ベクターにおけるＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７のクローニング
Ａｔ ＡＢＣＧ３３およびＡｔ ＡＢＣＧ３７のｃＤＮＡは、製造業者の指示に従って、ｐＥＮＴＲ-Ｄ／ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）中でクローン化した。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７ ｃＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＱ５-Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いて増幅し（米国ニューイングランド・バイオラボ）、クローニング前に配列決定した。続いて、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を、酵母発現ベクター（ｐＹＥＳ２）中のＧＡＬ１プロモーターの下流でサブクローニングした。クローニングは、ギャップ修復クローニングアプローチを利用する相同組換えベースのクローニング法を用いて達成された（Ma et al.,1987, Gene 58:201-216.）。ｐＹＥＳ２でクローニングするために、以下のプライマーを用いた。
酵母ベクターにおけるＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７のクローニング
Ａｔ ＡＢＣＧ３３およびＡｔ ＡＢＣＧ３７のｃＤＮＡは、製造業者の指示に従って、ｐＥＮＴＲ-Ｄ／ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）中でクローン化した。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７ ｃＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＱ５-Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いて増幅し（米国ニューイングランド・バイオラボ）、クローニング前に配列決定した。続いて、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を、酵母発現ベクター（ｐＹＥＳ２）中のＧＡＬ１プロモーターの下流でサブクローニングした。クローニングは、ギャップ修復クローニングアプローチを利用する相同組換えベースのクローニング法を用いて達成された（Ma et al.,1987, Gene 58:201-216.）。ｐＹＥＳ２でクローニングするために、以下のプライマーを用いた。
【0053】
ＡＢＣＧ３３
フォワードプライマー（配列番号１９）
5'-GCTGTAAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTTATGGGATCCAGTTTTAGGAGC-3'
リバースプライマー（配列番号２０）
5'-GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGAATGGATATCTGTCATCGTTTTTGAAAGTTG-3'
フォワードプライマー（配列番号１９）
5'-GCTGTAAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTTATGGGATCCAGTTTTAGGAGC-3'
リバースプライマー（配列番号２０）
5'-GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGAATGGATATCTGTCATCGTTTTTGAAAGTTG-3'
【0054】
ＡＢＣＧ３７
フォワードプライマー（配列番号２１）
5'-GCTGTAAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTTATGGCTCATATGGTTGGAGC-3'
リバースプライマー（配列番号２２）
5'-GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGAATGGATATCTGTCAACTTCCAACGAAGATGA-3'
フォワードプライマー（配列番号２１）
5'-GCTGTAAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTTATGGCTCATATGGTTGGAGC-3'
リバースプライマー（配列番号２２）
5'-GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGAATGGATATCTGTCAACTTCCAACGAAGATGA-3'
【0055】
校正ＰＣＲは、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｊａｐａｎ）を用い、メーカーのプロトコールに従って行った。ｐＹＥＳ２ベクターをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、消化した断片を１．０％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動したＤＮＡのクリーンアップはＭａｇ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ-ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ ｃｌｅａｎｕｐキット（東洋紡、大阪、日本）を用いて行った。出芽酵母Ｗ３０３－１Ａ (MATa leu 2-3/112 ura3-1 trp1-1his3-11/15 ade2-1 can1-100) (Thomas and Rothstein 1969. Cell 56:619-630.)を、増幅断片３ｍｌおよび改良した酢酸リチウム形質転換法（Hill et al.,1991. Nucleic Acids Res. 19:5791.）を用いてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＹＥＳ２（クローンあたり０．５ｎｇ）ベクターで形質転換した。原法では、３０℃で４５分間インキュベート後にＤＭＳＯを添加する。改良法では、インキュベーション前に１０％ ＤＭＳＯを酢酸リチウム（ＬｉＯＡｃ）溶液および５０％ポリエチレングリコール溶液に添加した。
【0056】
ＡＢＣＧ３３またはＡＢＣＧ３７を発現する出芽酵母Ｗ３０３－１ＡおよびＢＹＴ１２（ｔｒｋ１Δ ｔｒｋ２Δ）の増殖表現型
ＡＢＣＧ３３、ＡＢＣＧ３７、およびＯｓＨＡＫ５で形質転換した前培養した出芽酵母Ｗ３０３‐１Ａ細胞をＳＤ‐Ｇｌｃ液体培地（ｐＨ ８．５）に移し、３０℃で一晩培養した。細胞計数器（ＣＤＡ‐１０００、シスメックス社）を用いて細胞数を得た。次に、細胞を、１０7、１０6、１０5、１０4、および１０3に、蒸留水で希釈した。培養細胞を、Ｂｅｌｌ Ｂｌｏｔｔｅｒ ９６ウェルレプリケーター（Ｔｅｃｈ Ｊａｍ Ｃｏ．、大阪、日本）を用いて、０または３０ｍＭ ＣｓＣｌのいずれかを含むＳＤ‐Ｇａｌ（２％ガラクトース）固体培地上にスポットした。この細胞を３０℃で３日間培養し、陽性対照として通性Ｃｓ+輸送体であるＯｓＨＡＫ５（Yamaki et al., 2017. Physiol. Plant 160:425-436.）を用いた。
ＡＢＣＧ３３、ＡＢＣＧ３７、およびＯｓＨＡＫ５で形質転換した前培養した出芽酵母Ｗ３０３‐１Ａ細胞をＳＤ‐Ｇｌｃ液体培地（ｐＨ ８．５）に移し、３０℃で一晩培養した。細胞計数器（ＣＤＡ‐１０００、シスメックス社）を用いて細胞数を得た。次に、細胞を、１０7、１０6、１０5、１０4、および１０3に、蒸留水で希釈した。培養細胞を、Ｂｅｌｌ Ｂｌｏｔｔｅｒ ９６ウェルレプリケーター（Ｔｅｃｈ Ｊａｍ Ｃｏ．、大阪、日本）を用いて、０または３０ｍＭ ＣｓＣｌのいずれかを含むＳＤ‐Ｇａｌ（２％ガラクトース）固体培地上にスポットした。この細胞を３０℃で３日間培養し、陽性対照として通性Ｃｓ+輸送体であるＯｓＨＡＫ５（Yamaki et al., 2017. Physiol. Plant 160:425-436.）を用いた。
【0057】
高親和性Ｋ+輸送体を欠損した出芽酵母ＢＹＴ１２（ｔｒｋ１Δ ｔｒｋ２Δ）細胞を用いて、Ｋ+に対する増殖反応を調べた。培養のＯＤ６００ｎｍはプレートリーダー（イマーク、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ヘラクルス、カリフォルニア州）を用いて測定した。細胞を、蒸留水で０．０１のＯＤ６００ｎｍ値に希釈した。続いて、Ａｔ ＡＢＣＧ３３、Ａｔ ＡＢＣＧ３７、およびＡｔ ＡＫＴ１を発現する培養細胞１０ｍｌを、様々な濃度のＫＣｌを含むＳＤ‐Ｇａｌ（２％ガラクトース）固体培地上に、ＳＤ‐Ｇａｌ培地中の３０℃で４日間スポットした。カリウム輸送体であるＡｔ ＡＫＴ１を陽性対照として用いた（Gaymard et al., 1996J. Biol. Chem. 271:22863-22870.）。実験は少なくとも３回繰り返した。
【0058】
Ｃｓ+取り込み実験
ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７を発現する出芽酵母Ｗ３０３‐１Ａ細胞を用いて、Ａｔ ＡＢＣＧ３３およびＡｔ ＡＢＣＧ３７のＣｓ+取り込み能を調べた。酵母形質転換体を１０ｍｌのＳＤ‐Ｇａｌ培地で一晩培養した。その後、３０℃（ＰｌａｔｅＳｐｉｎ ＩＩ、クボタ）で２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に計５ｍｌのＳＤ-Ｇａｌを加え、３０℃で３時間培養した。５０ｍＭの５-フルオロウラシルを５マイクロリットル加え、３０℃Ｃでさらに１時間培養した。その後、細胞計数装置（ＣＤＡ-１０００、シスメックス社、兵庫）を用いて細胞数を測定した。それぞれの培養物を、５０ｍＭの５-フルオロウラシルを含むＳＤ-Ｇａｌ培地で希釈して、１×１０7細胞（１００μｌ）-1の細胞密度を得た。次に、希釈細胞を３０℃で１時間振とう（２０００ｒｐｍ）で培養した（マイクロプレートミクサーＮ‐７０４、日伸理化）。次に細胞を３５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ（ｐＨ ８．５）、２％ブドウ糖、０～１０ｍＭ 133ＣｓＣｌ、３．９ｋＢｑ／ｍｌ 137ＣｓＣｌ（担体として０．４ｍＭの133ＣｓＣｌを含む）、および５０ｍＭ ５-フルオロウラシルを含む１００μｌ溶液中で３０℃で１時間振とう（２０００ｒｐｍ）で培養した。Ｃｓ+でインキュベーション後、培養細胞を２０００ｇで遠心分離し、上清を捨て、細胞を１０ｍＭ氷冷133ＣｓＣｌで５回洗浄した。媒体から分離した細胞の137ＣｓＣｌ含量を、自動ガンマカウンター（２４７０ ＷＩＺＡＲＤ2，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で測定した。実験は３回繰り返した。
ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７を発現する出芽酵母Ｗ３０３‐１Ａ細胞を用いて、Ａｔ ＡＢＣＧ３３およびＡｔ ＡＢＣＧ３７のＣｓ+取り込み能を調べた。酵母形質転換体を１０ｍｌのＳＤ‐Ｇａｌ培地で一晩培養した。その後、３０℃（ＰｌａｔｅＳｐｉｎ ＩＩ、クボタ）で２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に計５ｍｌのＳＤ-Ｇａｌを加え、３０℃で３時間培養した。５０ｍＭの５-フルオロウラシルを５マイクロリットル加え、３０℃Ｃでさらに１時間培養した。その後、細胞計数装置（ＣＤＡ-１０００、シスメックス社、兵庫）を用いて細胞数を測定した。それぞれの培養物を、５０ｍＭの５-フルオロウラシルを含むＳＤ-Ｇａｌ培地で希釈して、１×１０7細胞（１００μｌ）-1の細胞密度を得た。次に、希釈細胞を３０℃で１時間振とう（２０００ｒｐｍ）で培養した（マイクロプレートミクサーＮ‐７０４、日伸理化）。次に細胞を３５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ（ｐＨ ８．５）、２％ブドウ糖、０～１０ｍＭ 133ＣｓＣｌ、３．９ｋＢｑ／ｍｌ 137ＣｓＣｌ（担体として０．４ｍＭの133ＣｓＣｌを含む）、および５０ｍＭ ５-フルオロウラシルを含む１００μｌ溶液中で３０℃で１時間振とう（２０００ｒｐｍ）で培養した。Ｃｓ+でインキュベーション後、培養細胞を２０００ｇで遠心分離し、上清を捨て、細胞を１０ｍＭ氷冷133ＣｓＣｌで５回洗浄した。媒体から分離した細胞の137ＣｓＣｌ含量を、自動ガンマカウンター（２４７０ ＷＩＺＡＲＤ2，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で測定した。実験は３回繰り返した。
【0059】
Ｒｂ+取り込み実験
実験はTakahashi et al., 2007（J. Exp. Bot. 58:4387-4395.）の方法を若干改変して行った。形質転換酵母細胞をＳＤ培地（ウラシル無添加Ｄｒｏｐｏｕｔ培地）で増殖させた。Ｒｂ+取り込み実験のために、細胞を取り込み緩衝液（２．０％ガラクトース、１０ｍＭ ＭＥＳ［ｐＨ ８．０］）に懸濁し、１ｍＭ ＲｂＣｌ中で２時間インキュベートした。細胞を蒸留水中で２回洗浄し、０．１Ｍ ＨＣｌ中で一晩、酸抽出した。細胞試料を５０００ｇで５分間遠心分離して採取し、上清中のＲｂ+を測定した。Ｒｂ+含量はＩＣＰ‐ＭＳ（8800 Triple Quadrupole ICP-MS; Agilent）により測定した。挿入断片のないプラスミドｐＹＥＳ２で形質転換した酵母ＣＹ１９２（Δｔｒｋ１Δｔｒｋ２）を用いて、対照実験を行った。
実験はTakahashi et al., 2007（J. Exp. Bot. 58:4387-4395.）の方法を若干改変して行った。形質転換酵母細胞をＳＤ培地（ウラシル無添加Ｄｒｏｐｏｕｔ培地）で増殖させた。Ｒｂ+取り込み実験のために、細胞を取り込み緩衝液（２．０％ガラクトース、１０ｍＭ ＭＥＳ［ｐＨ ８．０］）に懸濁し、１ｍＭ ＲｂＣｌ中で２時間インキュベートした。細胞を蒸留水中で２回洗浄し、０．１Ｍ ＨＣｌ中で一晩、酸抽出した。細胞試料を５０００ｇで５分間遠心分離して採取し、上清中のＲｂ+を測定した。Ｒｂ+含量はＩＣＰ‐ＭＳ（8800 Triple Quadrupole ICP-MS; Agilent）により測定した。挿入断片のないプラスミドｐＹＥＳ２で形質転換した酵母ＣＹ１９２（Δｔｒｋ１Δｔｒｋ２）を用いて、対照実験を行った。
【0060】
バイオインフォマティクス解析
ＡＢＣＧ３７突然変異体の突然変異情報を、ＳＡＬＫトランスファーＤＮＡレポジトリーから収集した（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔｄｎａｅｘｐｒｅｓｓ）および図２Ａの概略図は、エクソン－イントロングラフィックマーカー（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｍｗｅｂ．ｏｒｇ／ｅｘｏｎｉｎｔｒｏｎ）に基づいて描いた。
ＡＢＣＧ輸送体のタンパク質配列をＴＡＩＲデータベースから収集し（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）およびオンラインクラスターオメガ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）ツールを用いて系統樹を構築した。
ＡＢＣＧ３７突然変異体の突然変異情報を、ＳＡＬＫトランスファーＤＮＡレポジトリーから収集した（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔｄｎａｅｘｐｒｅｓｓ）および図２Ａの概略図は、エクソン－イントロングラフィックマーカー（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｍｗｅｂ．ｏｒｇ／ｅｘｏｎｉｎｔｒｏｎ）に基づいて描いた。
ＡＢＣＧ輸送体のタンパク質配列をＴＡＩＲデータベースから収集し（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）およびオンラインクラスターオメガ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）ツールを用いて系統樹を構築した。
【0061】
実施例１
１）機能獲得変異体ａｂｃｇ３７－１はセシウムに対する感受性の増加を示す
Ｃｓ+の新たな輸送体を見出すための探索では、ＡＢＣ輸送体に着目した。Ｃｓ+輸送におけるＡＢＣタンパク質の役割を解明するために、ＡＢＣタンパク質の原形質膜局在性サブファミリーＡＢＣＢとＡＢＣＧに焦点を当て、１．５ｍＭ セシウムに対する根の成長反応について利用可能な２０のＡＢＣＢ変異体と１７のＡＢＣＧ変異体をスクリーニングした。１．５ｍＭ セシウムは、野生型で根の生長を約５０％阻害する。
１）機能獲得変異体ａｂｃｇ３７－１はセシウムに対する感受性の増加を示す
Ｃｓ+の新たな輸送体を見出すための探索では、ＡＢＣ輸送体に着目した。Ｃｓ+輸送におけるＡＢＣタンパク質の役割を解明するために、ＡＢＣタンパク質の原形質膜局在性サブファミリーＡＢＣＢとＡＢＣＧに焦点を当て、１．５ｍＭ セシウムに対する根の成長反応について利用可能な２０のＡＢＣＢ変異体と１７のＡＢＣＧ変異体をスクリーニングした。１．５ｍＭ セシウムは、野生型で根の生長を約５０％阻害する。
【0062】
スクリーニングにより、Ｃｓ+に対する応答の変化を示す４つの変異体（ａｂｃｂ１５－１、ａｂｃｇ３６－１、ａｂｃｇ３７－１、ａｂｃｇ４２）が明らかになった。土壌からのＣｓ+取り込みに興味があるため、ＰＤＲ９／ＡＢＣＧ３７量の増加をもたらし（Ito, H., and Gray, W.M. (2006), Plant Physiol. 142:63-74）、Ｃｓ+に対する感受性の増加を示した機能獲得変異体であることから、さらに研究を進めるためにａｂｃｇ３７－１を選択した。経時的および用量－反応分析により、ａｂｃｇ３７－１は、試験したすべての濃度およびすべてのインキュベーション期間において根の生長に対する感受性の増加を示すことが明らかになった。機能獲得変異体におけるＣｓ+の感受性は、ＡＢＣＧ３７がＣｓ+の取り込みを促進し、根の増殖阻害および葉のクロロシスの増加をもたらす可能性があることを示唆している（図２ＢおよびＣ）。もしそうであれば、機能喪失型変異体が逆の反応を示すことが予想される。これを検証するために、ＡＢＣＧ３７の機能欠損変異体（ａｂｃｇ３７－２、ａｂｃｇ３７－３、およびａｂｃｇ３７－４）のいくつかのアリルを用いた。これらの変異体は、対照条件では目に見える根の表現型を示さない（図２ＡおよびＣ）。機能欠損変異体はＣｓ+抵抗性の表現型を示さなかった。
【0063】
２）ＡＢＣＧ３７およびＡＢＣＧ３３は、根におけるセシウム応答を調節するために重複的に機能する
Ｃｓ+に対する機能喪失型ＡＢＣＧ３７変異体の野生型様反応（図２Ｂ）によって、ＡＢＣＧ３７の喪失が別のＡＢＣタンパク質によって代償されているのではないかという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の４３のＡＢＣＧタンパク質の系統解析に基づいて、ＡＢＣＧ３７と近縁なホモログを探索した。ＡＢＣＧ３３はＡＢＣＧ３７の最も近いホモログであり、同じクレードに存在することがわかった。これらはタンパク質レベルで～８０％の相同性を示した。
Ｃｓ+に対する機能喪失型ＡＢＣＧ３７変異体の野生型様反応（図２Ｂ）によって、ＡＢＣＧ３７の喪失が別のＡＢＣタンパク質によって代償されているのではないかという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の４３のＡＢＣＧタンパク質の系統解析に基づいて、ＡＢＣＧ３７と近縁なホモログを探索した。ＡＢＣＧ３３はＡＢＣＧ３７の最も近いホモログであり、同じクレードに存在することがわかった。これらはタンパク質レベルで～８０％の相同性を示した。
【0064】
二重欠損ホモ接合型「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」変異体を作製し、重複機能仮説を検証した。交配に先立ち、遺伝子発現解析を用いて、ａｂｃｇ３３－１とａｂｃｇ３７－２の両変異体がヌル変異体であることを確認した。仮説と一致して、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－１１」、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２１」、および「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－２３」（ａｂｃｇ３７－２とａｂｃｇ３３－１の間の３つの独立した交配から得られた３つの独立した植物）が、根の生育抑制と葉のクロロシスの両方についてＣｓ+に対する抵抗性を示すことを見出した（図２ＤおよびＥ）。具体的には、対照区と比較して、１．５ｍＭセシウム添加培地で育成した野生型（Ｃｏｌ－２）では葉が白く枯れているが、二重欠損変異体（ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２－１１）では葉が白く枯れていない（図２Ｄ）。すなわち、二重欠損変異体は、培地からセシウムを吸収することができず、セシウム抵抗性の表現型を示し、セシウム添加培地でも生育可能であるといえる。
【0065】
時間経過および用量反応アッセイから、二重変異体は、全てのインキュベーション期間において、より低い濃度のＣｓ+誘導根の生長阻害に対して強い耐性を示すことが明らかになった。抵抗性の表現型は、Ｃｓ+の濃度が次第に高くなるにつれて弱くなる。しかし、初期インキュベーション時点（Ｃｓ+で２日間インキュベーションなど）では、二重変異体は濃度にかかわらずＣｓ+に対して強い抵抗性を示した。ＡＢＣＧ３７は、ＩＢＡ（インドール－３－酪酸）排出担体として機能することが示されている（Ruzicka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 107:10749-10753, 2010）。ＩＢＡの大部分はインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）への転換を介して植物発生において機能するため、ａｂｃｇ３７、ａｂｃｇ３３、および「ａｂｃｇ３３ ａｂｃｇ３７」変異体が外因性ＩＡＡに対する根－成長反応の変化を示すかどうかを調べた。これらの変異体はすべてＩＡＡ誘導根成長阻害に対して野生型様反応を示し、これらの変異体のＣｓ+に対する反応の変化はオーキシンの主要な内因性型、ＩＡＡとは結びついていないことを示している。これらの結果は、まとめて、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣ３７は、根におけるＣｓ+応答を調節するために重複的に作用することを確認している。
【0066】
３）セシウムはＡＢＣＧ３７とＡＢＣＧ３３タンパク質の発現を翻訳レベルで調節する
多くの金属（Ｃｄ2+、Ｐｂ2+）は、それらに対応するＡＢＣ輸送体（ＡｔＡＢＣＧ３６、ＡｔＡＢＣＢ２５、およびＡｔＡＢＣＧ４０）の遺伝子発現を調節することが知られている。さらに、ＡＢＣタンパク質を含むシロイヌナズナ遺伝子群の差次的発現がＣｓ+中毒植物で観察された（Hampton, C.R. et al., (2004) Plant Physiol. 136:3824-3837.）。Ｃｓ+がＡＢＣＧ３７とＡＢＣＧ３３の発現を調節するかどうかを試験するために、定量的リアルタイムＰＣＲを用いたが、野生型と比較して、Ｃｓ+処理植物におけるＡＢＣＧ３７およびＡＢＣＧ３３の転写物に有意な変化は観察されなかった。この観察結果は矛盾するものではなく、輸送体の転写が基質の適用によって影響を受けないことが示されている場合も少なくない。
多くの金属（Ｃｄ2+、Ｐｂ2+）は、それらに対応するＡＢＣ輸送体（ＡｔＡＢＣＧ３６、ＡｔＡＢＣＢ２５、およびＡｔＡＢＣＧ４０）の遺伝子発現を調節することが知られている。さらに、ＡＢＣタンパク質を含むシロイヌナズナ遺伝子群の差次的発現がＣｓ+中毒植物で観察された（Hampton, C.R. et al., (2004) Plant Physiol. 136:3824-3837.）。Ｃｓ+がＡＢＣＧ３７とＡＢＣＧ３３の発現を調節するかどうかを試験するために、定量的リアルタイムＰＣＲを用いたが、野生型と比較して、Ｃｓ+処理植物におけるＡＢＣＧ３７およびＡＢＣＧ３３の転写物に有意な変化は観察されなかった。この観察結果は矛盾するものではなく、輸送体の転写が基質の適用によって影響を受けないことが示されている場合も少なくない。
【0067】
ＡＢＣＧ３７とＡＢＣＧ３３の定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、ＡＢＣＧ３７とＡＢＣＧ３３がセシウムの直接的転写調節下にないことを示した。Ｃｓ+が翻訳レベルでＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を調節するかどうかを理解するために、ＧＦＰ標識株を用いてこれらのタンパク質の細胞発現をモニターした。以前に、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の両方が細胞膜に局在することが報告されている（Ruzicka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 107:10749-10753, 2010；Schuetz et al., 2014, Plant Physiol. 166:798-807.）。また、ＰＩとの共局在化試験により、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の膜局在を確認した。興味深いことに、ＡＢＣＧ３７‐ＧＦＰとＡＢＣＧ３３‐ＧＦＰ細胞内シグナルの両方が１．５ｍＭ Ｃｓ+処理により時間依存性で激減することを見出した。ＧＦＰシグナルの減少は３日目に最大となるが、これらのタンパク質に対するＣｓ+の効果は２日目から明らかである（図３Ａおよび３Ｂ）。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７タンパク質に対するＣｓ+効果の特異性を明らかにするため、２種類の根特異的膜タンパク質、ＰＩＮ２－ＧＦＰ（Xu, J., and Scheres, B. (2005). Plant Cell 17:525-536.）およびＥＧＦＰ－ＬＴＩ６ｂ（Kurup, S. et al. 2005, Plant J. 42:444-453.）を用いた。Ｃｓ+はＰＩＮ２－ＧＦＰシグナルをわずかに低下させたが、ＬＴＩ６ｂ発現には影響しなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、Ｃｓ+誘導性のＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７発現の抑制が毒性によるものである可能性を否定するものであり、むしろ、Ｃｓ+が膜タンパク質のサブセットを選択的に阻害することを示唆している。
【0068】
ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７タンパク質の長期Ｃｓ+処理下での蓄積の減少は、タンパク質合成またはタンパク質分解の抑制、または両者の組合せのいずれかによる可能性があった。この点を明らかにするために、短期実験的手法をとり、一般的なタンパク質生合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）とユビキチンプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を用いた。初期の研究では、５０ｍＭのＣＨＸまたはＭＧ１３２とのプレインキュベーションにより、それぞれタンパク質の合成とタンパク質の分解をうまく阻止できることが示されていた（Geldner, N. et al., (2001) Nature 413:425-428; Takahashi, M. et al., 2017, Plant J. 89:940-956.）。この短期アッセイのために、５日齢のＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７実生を、モック溶液、５０ｍＭのＣＨＸ、またはＭＧ１３２で１時間前処理した後、１．５ｍＭまたは１５ｍＭのＣｓ+で３時間インキュベートし、その後撮像に供した。興味深いことに、長期処理とは対照的に、短期Ｃｓ+はＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７発現の有意な上昇をもたらした（図３Ｃ～Ｆ）。このタンパク質発現の誘導は、ＣＨＸで前処理することによって完全に阻止できたが、ＭＧ１３２では阻止できなかった（図３Ｃ～Ｆ）。このことは、Ｃｓ+がタンパク質合成装置を標的として、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７発現を阻害することを示唆している。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７タンパク質発現に対するＣｓ+の対照的な効果は、取り込み担体としてのそれらの効果と一致している。最初は、植物がＣｓ+を感知すると、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を使用してＣｓ+を取り込むが、Ｃｓ+が成長に悪影響を及ぼすと植物が感じたらすぐに（それは１．５ｍＭ Ｃｓ+でのインキュベーション約２日目から開始する（図３Ａ～Ｂ））、Ｃｓ+の長期毒性から保護するための防御機構として輸送体活性を遮断する。このプロセスは、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の特異的タンパク質合成経路の標的化を介して行われる。
【0069】
４）ＡＢＣＧ３７およびＡＢＣＧ３３は機能的に重複したセシウム流入担体である
Ｃｓ+取り込みにおけるＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７の潜在的役割を確認するために、まず、放射性標識セシウム（137Ｃｓ）を用いてシロイヌナズナの根における短期取り込みアッセイを行った。野生型および二重変異体のＣｓ+取り込み能を放射性137Ｃｓ+を用いた直接取り込み試験により測定した。Ｃｓ+取り込みは、低濃度から高濃度の様々なＣｓ+濃度で、Ｋ+存在下または非存在下で、２時間観測された（図３）。短期アッセイ系は輸送に対する非特異的効果の可能性を排除する。Ｋ+の有無にかかわらず、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」二重変異体は、試験したすべてのセシウム濃度において、野生型と比較してセシウム取り込み能の低下を示した（図４Ａ～Ｃ）。二重変異体株がＣｓ+取り込み能を真に欠いていることを確認するため、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を用いて、３日間Ｃｓ+培養後の野生型と「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」変異体の根のＣｓ+含量を比較した。野生型と比較して、Ｃｓ+含量は、すべての試験したＫ+濃度で「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」変異体株で有意に減少した（図４Ｄ）。ＩＣＰ－ＭＳデータとともに短期間の取り込みデータは、ＡＢＣＧ３７およびＡＢＣＧ３３がＣｓ+流入担体として機能することを示唆している。
Ｃｓ+取り込みにおけるＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７の潜在的役割を確認するために、まず、放射性標識セシウム（137Ｃｓ）を用いてシロイヌナズナの根における短期取り込みアッセイを行った。野生型および二重変異体のＣｓ+取り込み能を放射性137Ｃｓ+を用いた直接取り込み試験により測定した。Ｃｓ+取り込みは、低濃度から高濃度の様々なＣｓ+濃度で、Ｋ+存在下または非存在下で、２時間観測された（図３）。短期アッセイ系は輸送に対する非特異的効果の可能性を排除する。Ｋ+の有無にかかわらず、「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」二重変異体は、試験したすべてのセシウム濃度において、野生型と比較してセシウム取り込み能の低下を示した（図４Ａ～Ｃ）。二重変異体株がＣｓ+取り込み能を真に欠いていることを確認するため、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を用いて、３日間Ｃｓ+培養後の野生型と「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」変異体の根のＣｓ+含量を比較した。野生型と比較して、Ｃｓ+含量は、すべての試験したＫ+濃度で「ａｂｃｇ３３－１ ａｂｃｇ３７－２」変異体株で有意に減少した（図４Ｄ）。ＩＣＰ－ＭＳデータとともに短期間の取り込みデータは、ＡＢＣＧ３７およびＡＢＣＧ３３がＣｓ+流入担体として機能することを示唆している。
【0070】
５）「ａｂｃｇ３３ ａｂｃｇ３７」二重変異体ではカリウム応答は変化しない
Ｃｓ+とＫ+は構造的に類似しているため、分かっているほとんどのＣｓ+輸送体がＫ+を輸送している。本研究では、シロイヌナズナの根のＣｓ+流入を調節する２つのＡＢＣＧタンパク質を同定した。これらのタンパク質がＣｓ+のみを取り込み、Ｋ+は取り込まないことを検証するために、ＩＣＰ－ＭＳを用いて、野生型および二重変異体における内在Ｋ+含量を測定し、さらに、野生型で根成長を５０％抑制するＫ+濃度に対する根成長反応を比較した。ＩＣＰ－ＭＳデータでは、さまざまなＫ+濃度で成長した野生型と二重変異体のＫ+含量に有意差は認められなかった（図５Ａ）。この二重変異体は野生型のように根の生長のための外因性Ｋ+に応答する（図５Ｂ）。さらに、Ｋ+不足やＫ+十分条件に対する二重変異体の応答もテストした。両条件下で、二重変異体実生の表現型と根の成長反応は、正確に野生型のものと似ていることがわかった（図５ＣとＤ）。これらの結果は、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７がＫ+独立型Ｃｓ+取り込み担体であるという仮説を支持する証拠を提供する。
Ｃｓ+とＫ+は構造的に類似しているため、分かっているほとんどのＣｓ+輸送体がＫ+を輸送している。本研究では、シロイヌナズナの根のＣｓ+流入を調節する２つのＡＢＣＧタンパク質を同定した。これらのタンパク質がＣｓ+のみを取り込み、Ｋ+は取り込まないことを検証するために、ＩＣＰ－ＭＳを用いて、野生型および二重変異体における内在Ｋ+含量を測定し、さらに、野生型で根成長を５０％抑制するＫ+濃度に対する根成長反応を比較した。ＩＣＰ－ＭＳデータでは、さまざまなＫ+濃度で成長した野生型と二重変異体のＫ+含量に有意差は認められなかった（図５Ａ）。この二重変異体は野生型のように根の生長のための外因性Ｋ+に応答する（図５Ｂ）。さらに、Ｋ+不足やＫ+十分条件に対する二重変異体の応答もテストした。両条件下で、二重変異体実生の表現型と根の成長反応は、正確に野生型のものと似ていることがわかった（図５ＣとＤ）。これらの結果は、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７がＫ+独立型Ｃｓ+取り込み担体であるという仮説を支持する証拠を提供する。
【0071】
６）ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７は酵母細胞でＣｓ
+
取り込み活性を示す
異種発現系でＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の活性によるＣｓ+の取り込みを評価するため、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７をＧＡＬ１プロモーターで、出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＷ３０３－１Ａ（Thomas and Rothstein, 1969. Cell 56:619-630.）とＢＹＴ１２（Rodriguez-Navarro and Ramos 1984. J. Bacteriol. 159:940-945.）株で発現させた。増殖アッセイは、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を発現させた酵母細胞が、ベクターコントロールと比較してＣｓ+に対する感受性が向上したことを示した。通性Ｃｓ+輸送体のＯｓＨＡＫ５（Yamaki et al., 2017. Physiol. Plant 160:425-436.）をポジティブコントロールとして使用した場合も同様の感受性を示した（図６Ａ）。137Ｃｓを用いた短期取り込みアッセイでは、ＡＢＣＧ３３またはＡＢＣＧ３７を発現する酵母細胞は、すべての濃度において、空のベクターを保有する細胞よりも２倍多くのＣｓ+を取り込むことができることがわかった（図６Ｂ～Ｆ）。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７を発現する酵母細胞は、高濃度および低濃度のＣｓ+で同様の取り込みパターンを示したことは、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７が高親和性Ｃｓ+輸送体として機能していることを示している。増殖アッセイと取り込みアッセイの両方でＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７が真のＣｓ+輸送体であることを示している。
異種発現系でＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７の活性によるＣｓ+の取り込みを評価するため、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７をＧＡＬ１プロモーターで、出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＷ３０３－１Ａ（Thomas and Rothstein, 1969. Cell 56:619-630.）とＢＹＴ１２（Rodriguez-Navarro and Ramos 1984. J. Bacteriol. 159:940-945.）株で発現させた。増殖アッセイは、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７を発現させた酵母細胞が、ベクターコントロールと比較してＣｓ+に対する感受性が向上したことを示した。通性Ｃｓ+輸送体のＯｓＨＡＫ５（Yamaki et al., 2017. Physiol. Plant 160:425-436.）をポジティブコントロールとして使用した場合も同様の感受性を示した（図６Ａ）。137Ｃｓを用いた短期取り込みアッセイでは、ＡＢＣＧ３３またはＡＢＣＧ３７を発現する酵母細胞は、すべての濃度において、空のベクターを保有する細胞よりも２倍多くのＣｓ+を取り込むことができることがわかった（図６Ｂ～Ｆ）。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７を発現する酵母細胞は、高濃度および低濃度のＣｓ+で同様の取り込みパターンを示したことは、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７が高親和性Ｃｓ+輸送体として機能していることを示している。増殖アッセイと取り込みアッセイの両方でＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７が真のＣｓ+輸送体であることを示している。
【0072】
カリウム応答と含量の植物アッセイでは、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７がＫ+とリンクしたＣｓ+取り込み担体ではないことが明らかになった。高親和性カリウム輸送体ＴＲＫ１およびＴＲＫ２を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹＴ１２（ｔｒｋ１Δ ｔｒｋ２Δ）細胞を使用して、この仮説を検証した。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７で形質転換されたＢＹＴ１２細胞は、低濃度のＫ+で増殖できず、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７にはＫ+を流入させる能力がないことを示唆す（図６Ｇ）。ＢＹＴ１２細胞をカリウム輸送体ＡｔＡＫＴ１（Gaymard et al., 1996J. Biol. Chem. 271:22863-22870.）で形質転換すると、低濃度のＫ+でも増殖でき、増殖遅延はＫ+の取り込み不足によるものであることが確認された。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７のＣｓ+担体としての特異性をさらに確認するために、Ｋ+アナログであるＲｂ+を使用した。ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７を発現する酵母細胞は、空のベクターを発現する細胞と比較して、Ｒｂ+取り込み能力の変化を何ら示さなかったが、Ｋ+輸送体ＡＫＴ１を発現する細胞は２倍のＲｂ+取り込みを示し（図６Ｈ）、ＡＢＣＧ３３およびＡＢＣＧ３７がＣｓ+特異的担体であることを示している。まとめると、異種発現系データは、植物内のデータを完全に補完し、ＡＢＣＧ３３とＡＢＣＧ３７がカリウムに依存しないセシウム輸送体であることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【0073】
配列番号１：ＡＢＣＧ３３のアミノ酸配列
配列番号２：ＡＢＣＧ３７のアミノ酸配列
配列番号３：ＰＤＲ５のアミノ酸配列
配列番号４：ＰＩＳ１のアミノ酸配列
配列番号５～２２：プライマー
配列番号２：ＡＢＣＧ３７のアミノ酸配列
配列番号３：ＰＤＲ５のアミノ酸配列
配列番号４：ＰＩＳ１のアミノ酸配列
配列番号５～２２：プライマー
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】