知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 大陽日酸株式会社の特許一覧 ▶ 独立行政法人理化学研究所の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023060701
(43)【公開日】2023-04-28
(54)【発明の名称】タンパク質の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20230421BHJP
C07K 1/02 20060101ALI20230421BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20230421BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230421BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230421BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 A ZNA
C07K1/02
C07K14/435
C12N15/54
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021170433
(22)【出願日】2021-10-18
(71)【出願人】
【識別番号】320011650
【氏名又は名称】大陽日酸株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001634
【氏名又は名称】弁理士法人志賀国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】矢吹 孝
(72)【発明者】
【氏名】木川 隆則
(72)【発明者】
【氏名】樋口 佳恵
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA21
4B064CC24
4B064CE12
4H045AA20
4H045BA41
4H045FA70
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質合成におけるタンパク質の可溶性を改善できるタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する。また、無細胞タンパク質合成系の反応液でグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する方法において、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を最適化する。
【選択図】なし
【解決手段】コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する。また、無細胞タンパク質合成系の反応液でグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する方法において、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を最適化する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する、タンパク質の製造方法。
【請求項2】
前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列が、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項3】
合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号３～１１のいずれかで表される塩基配列である、請求項１又は２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項4】
合成に用いる鋳型核酸における前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグをコードする領域の塩基配列が、ＲＮＡの二次構造を回避するアルゴリズム、及びコドンとＧＣ含有率を発現生物種に合わせて最適化するアルゴリズムを含むソフトウェアによって最適化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項5】
前記コールドショックタンパク質が大腸菌由来のＣｓｐＡであり、かつ、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号７～９のいずれかで表される塩基配列である、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項6】
反応温度を４～３０℃とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項7】
無細胞タンパク質合成系の反応液でグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する方法であって、
合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列である、タンパク質の製造方法。
合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列である、タンパク質の製造方法。
【請求項8】
前記反応液が、細胞抽出液を含む溶液である、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項9】
前記細胞抽出液が、大腸菌由来の細胞抽出液である、請求項８に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の製造方法としては、タンパク質の翻訳に必要な因子を細胞抽出液として取り出し、細胞内の反応系を試験管内で再構成した無細胞タンパク質合成系を用いる方法が知られている（特許文献１、２）。細胞抽出液としては、大腸菌、昆虫細胞、コムギ胚芽、タバコ細胞及び動物細胞由来の細胞抽出液が知られており、キット化されたものが市販されている。
【0003】
無細胞タンパク質合成系は、迅速にタンパク質を合成できる、標識タンパク質や細胞毒性タンパク質を合成できる、反応液組成を自由に変更できる、ＰＣＲ産物を鋳型として使用できる、遺伝子組換え実験に該当しない、といった利点がある。しかし、無細胞タンパク質合成系は、得られるタンパク質の可溶性が不十分となることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特公平７－１１０２３６号公報
【特許文献2】特開平４－２００３９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質合成におけるタンパク質の可溶性を改善できるタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する、タンパク質の製造方法。
［２］前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列が、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列である、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［３］合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号３～１１のいずれかで表される塩基配列である、［１］又は［２］に記載のタンパク質の製造方法。
［４］合成に用いる鋳型核酸における前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグをコードする領域の塩基配列が、ＲＮＡの二次構造を回避するアルゴリズム、及びコドンとＧＣ含有率を発現生物種に合わせて最適化するアルゴリズムを含むソフトウェアによって最適化されている、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［５］前記コールドショックタンパク質が大腸菌由来のＣｓｐＡであり、かつ、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号７～９のいずれかで表される塩基配列である、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［６］反応温度を４～３０℃とする、［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［７］無細胞タンパク質合成系の反応液でグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する方法であって、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列である、タンパク質の製造方法。
［８］前記反応液が、細胞抽出液を含む溶液である、［１］～［６］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［９］前記細胞抽出液が、大腸菌由来の細胞抽出液である、［７］に記載のタンパク質の製造方法。
［１］コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する、タンパク質の製造方法。
［２］前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列が、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列である、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［３］合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号３～１１のいずれかで表される塩基配列である、［１］又は［２］に記載のタンパク質の製造方法。
［４］合成に用いる鋳型核酸における前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグをコードする領域の塩基配列が、ＲＮＡの二次構造を回避するアルゴリズム、及びコドンとＧＣ含有率を発現生物種に合わせて最適化するアルゴリズムを含むソフトウェアによって最適化されている、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［５］前記コールドショックタンパク質が大腸菌由来のＣｓｐＡであり、かつ、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号７～９のいずれかで表される塩基配列である、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［６］反応温度を４～３０℃とする、［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［７］無細胞タンパク質合成系の反応液でグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグを有するタンパク質を合成する方法であって、合成に用いる鋳型核酸における、前記グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列が、配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列である、タンパク質の製造方法。
［８］前記反応液が、細胞抽出液を含む溶液である、［１］～［６］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［９］前記細胞抽出液が、大腸菌由来の細胞抽出液である、［７］に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質合成におけるタンパク質の可溶性を改善できるタンパク質の製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】例１におけるＧＳＴの合成の電気泳動結果である。
【図3】例３におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果である。
【図6】例６におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果である。
【図7】例７におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果である。
【図8】例８におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果である。
【図9】例９におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果である。
【図10】例１０におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果である。
【図11】例１１におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果であって、Ｈｉｓタグ、Ｓｑ１２、Ｓｑ１３、Ｓｑ１５の結果である。
【図12】例１１におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果であって、Ｈｉｓタグ、Ｓｑ１８、Ｓｑ１９、Ｓｑ２０の結果である。
【図13】例１２におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果であって、Ｈｉｓタグ、Ｓｑ１２、Ｓｑ１３、Ｓｑ１５の結果である。
【図14】例１２におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果であって、Ｈｉｓタグ、Ｓｑ１８、Ｓｑ１９、Ｓｑ２０の結果である。
【図15】例１３におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果であって、Ｈｉｓタグ、Ｓｑ１２、Ｓｑ１３、Ｓｑ１５の結果である。
【図16】例１３におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成の電気泳動結果であって、Ｈｉｓタグ、Ｓｑ１８、Ｓｑ１９、Ｓｑ２０の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本明細書及び特許請求の範囲における以下の用語は、以下の意味を示す。
「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、細胞内の反応系を試験管内で再構成することで目的とするタンパク質を合成する系である。無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系、及びｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系を含む無細胞転写翻訳系と、無細胞翻訳系との両方が包含される。
「コールドショックタンパク質」とは、Ｐｆａｍデータベース（バージョン３２．０）のＣＳＤファミリー（ＰＦ００３１３）に対してスコア値１００以上で適合するアミノ酸配列を有するタンパク質ないしはタンパク質ドメインである。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。
「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、細胞内の反応系を試験管内で再構成することで目的とするタンパク質を合成する系である。無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系、及びｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系を含む無細胞転写翻訳系と、無細胞翻訳系との両方が包含される。
「コールドショックタンパク質」とは、Ｐｆａｍデータベース（バージョン３２．０）のＣＳＤファミリー（ＰＦ００３１３）に対してスコア値１００以上で適合するアミノ酸配列を有するタンパク質ないしはタンパク質ドメインである。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。
【0010】
［第１実施形態］
第１実施形態に係るタンパク質の製造方法は、コールドショックタンパク質（以下、「Ｃｓｐ」ともいう。）、及びＣｓｐをコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系（以下、「ＣＦ系」ともいう。）の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」ともいう。）タグを有するタンパク質を合成する方法である。すなわち、Ｃｓｐの存在下のＣＦ系の反応液でタンパク質合成を行い、目的タンパク質にＧＳＴタグが付加されたＧＳＴ融合タンパク質を得る方法である。
第１実施形態は、とりわけ低温でのタンパク質合成において、得られるタンパク質の可溶性を改善できる点で有効である。
第１実施形態に係るタンパク質の製造方法は、コールドショックタンパク質（以下、「Ｃｓｐ」ともいう。）、及びＣｓｐをコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系（以下、「ＣＦ系」ともいう。）の反応液で、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」ともいう。）タグを有するタンパク質を合成する方法である。すなわち、Ｃｓｐの存在下のＣＦ系の反応液でタンパク質合成を行い、目的タンパク質にＧＳＴタグが付加されたＧＳＴ融合タンパク質を得る方法である。
第１実施形態は、とりわけ低温でのタンパク質合成において、得られるタンパク質の可溶性を改善できる点で有効である。
【0011】
ＣＦ系には、ＣＦ系に必要な成分を含む細胞から抽出した細胞抽出液、あるいはタンパク質合成に必要な因子を個別に精製して混合した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を用いることができる。タンパク質合成に必要な因子としては、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ、翻訳終結因子等が挙げられる。
反応液としては、細胞抽出液を含む溶液が好ましい。
反応液としては、細胞抽出液を含む溶液が好ましい。
【0012】
細胞抽出液としては、例えば、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に関与する翻訳系に必要な成分、又は、転写系及び翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞から抽出した細胞抽出液が挙げられる。具体的には、例えば、大腸菌、小麦胚芽、タバコ細胞、ウサギ網赤血球、マウスＬ－細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等からの細胞抽出液が挙げられる。
【0013】
細胞抽出液としては、抽出液調製の安定性とスケーラビリティの点から、大腸菌由来の細胞抽出液が好ましい。大腸菌由来の細胞抽出液としては、例えば、大腸菌（ＢＬ２１等）細胞からのＳ３０抽出液（以下、「大腸菌Ｓ３０抽出液」ともいう。）、Ｓ１２抽出液等が挙げられる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。
【0014】
細胞抽出液の調製方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液は、Zubay G., Ann Rev Genet, (1973) 7, 267-287、Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., and Kigawa, T. (2008), Anal. Biochem.等に記載の方法で調製できる。
細胞抽出液の調製方法としては、具体的には、まず大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体を洗浄した後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は分解されるが、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して、液体窒素中、又は－８０℃にて保存する。
なお、細胞抽出液は、市販品を使用してもよい。
細胞抽出液の調製方法としては、具体的には、まず大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体を洗浄した後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は分解されるが、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して、液体窒素中、又は－８０℃にて保存する。
なお、細胞抽出液は、市販品を使用してもよい。
【0015】
反応液中の細胞抽出液の含有量は、反応液中の終濃度（細胞抽出液の２６０ｎｍの吸光度Ａ２６０換算量）として４０～２００であることが好ましく、５０～１５０がより好ましい。細胞抽出液の含有量が前記範囲内であれば、目的タンパク質を高効率に合成しやすい。
【0016】
細胞抽出液には、転写及び翻訳に必要な全ての酵素と因子が含まれているが、タンパク質合成の反応液に用いる際に、さらに補充的な成分を添加してもよい。
補充的な成分としては、例えば、基質となるＬ－アミノ酸、エネルギー源、塩、各種イオン、緩衝液、エネルギー再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、抗菌剤が挙げられる。
補充的な成分としては、例えば、基質となるＬ－アミノ酸、エネルギー源、塩、各種イオン、緩衝液、エネルギー再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、抗菌剤が挙げられる。
【0017】
Ｌ－アミノ酸としては、例えば、天然の２０種類のアミノ酸、又はそれらの誘導体が挙げられる。目的タンパク質として、同位体標識された標識タンパク質を製造する場合は、安定同位元素もしくは、放射性同位元素で標識された標識アミノ酸を用いる。
エネルギー源としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）（以下、この４つを総称してＮＴＰと呼ぶ。）、クレアチンホスフェート（ＣＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、グルコースが挙げられる。また、ＮＴＰの代わりにアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、及びウリジン一リン酸（ＵＭＰ）（以下、この４つを総称してＮＭＰと呼ぶ。）を反応液に添加し、代謝酵素を利用することによってＮＴＰを系内で合成させてもよい（Calhoun KA and Swartz JR, Biotechnol. Prog., 2005, 21, 1146-1153）。
塩としては、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムが挙げられる。
緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－酢酸、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨが挙げられる。
エネルギー源としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）（以下、この４つを総称してＮＴＰと呼ぶ。）、クレアチンホスフェート（ＣＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、グルコースが挙げられる。また、ＮＴＰの代わりにアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、及びウリジン一リン酸（ＵＭＰ）（以下、この４つを総称してＮＭＰと呼ぶ。）を反応液に添加し、代謝酵素を利用することによってＮＴＰを系内で合成させてもよい（Calhoun KA and Swartz JR, Biotechnol. Prog., 2005, 21, 1146-1153）。
塩としては、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムが挙げられる。
緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－酢酸、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨが挙げられる。
【0018】
エネルギー再生系としては、ＡＴＰ再生系が好ましい。ＡＴＰ再生系としては、例えば、１０～１００ｍＭのＣＰと０．０２～５μｇ／μＬのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）との組み合わせや、１～２０ｍＭのＰＥＰと０．０１～１μｇ／μＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）との組み合わせ等が挙げられる。ＰＫ及びＣＫは、いずれもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれＰＥＰ及びＣＰを基質として必要とする。
【0019】
核酸分解酵素阻害剤としては、例えば、ＲＮａｓｅインヒビターが挙げられる。
還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。
抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリンが挙げられる。
還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。
抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリンが挙げられる。
【0020】
タンパク質合成活性を増強させる目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ等を添加してもよい。また、目的タンパク質の鋳型としてＤＮＡを用いる場合には、ＲＮＡ合成の基質であるＮＴＰかその前駆体（ＮＭＰ、ヌクレオシド等）、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ等）等を含むことができる。タンパク質が三次元構造を形成するのを助ける働きを持つシャペロンタンパク質類（例えば、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ及びＨＳＰ７０等）や、ジスルフィド結合異性化酵素（ＤｓｂＣ等）を添加してもよい。
補充的な成分は、１種でもよく、２種以上でもよい。
補充的な成分は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0021】
大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる場合、反応液は、大腸菌Ｓ３０抽出液、Ｌ－アミノ酸、緩衝液、塩、ＮＴＰ、及びエネルギー源を含むことが好ましい。例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ＤＴＴ、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）、ＣＰ、ＣＫ、少なくとも１種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸、又はそれらの誘導体）を含む反応液が挙げられる。
【0022】
補充的な成分は、細胞抽出液とは別に保存しておき、使用直前に混合することが好ましい。補充的な成分を細胞抽出液に予め混合して凍結融解を行い、ＲＮＡ分解酵素複合体を除去することもできる（国際公開第２０００／１８３８０５号）。
【0023】
本実施形態では、ＣＦ系の反応液に、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸のいずれか一方、又は両方が含まれる。本発明では、Ｃｓｐを用いることが好ましい。
Ｃｓｐは、低温環境下への適応に関与すると考えられており、細菌から高等動植物に至るまで多く見出されている。Ｃｓｐとしては、例えば、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ及びＣｓｐＩ、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢが挙げられる。大腸菌由来のＣｓｐＡは、低温環境下で最も顕著に発現されるＣｓｐである。反応液に含まれるＣｓｐは、１種でもよく、２種以上でもよい。
Ｃｓｐは、低温環境下への適応に関与すると考えられており、細菌から高等動植物に至るまで多く見出されている。Ｃｓｐとしては、例えば、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ及びＣｓｐＩ、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢが挙げられる。大腸菌由来のＣｓｐＡは、低温環境下で最も顕著に発現されるＣｓｐである。反応液に含まれるＣｓｐは、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0024】
Ｃｓｐを用いる場合、反応液中のＣｓｐの含有量は、０．５～１．５μｇ／μＬが好ましく、反応温度が１６～２３℃の場合には０．８～１．２μｇ／μＬ、１６℃よりも低温の場合には１．２～１．５μｇ／μＬがより好ましい。Ｃｓｐの含有量が前記範囲内であれば、目的タンパク質を高効率に合成しやすい。
【0025】
Ｃｓｐ鋳型核酸は、ＣＦ系において、Ｃｓｐを合成するための鋳型となる核酸である。ＣＦ系の反応液中にＣｓｐ鋳型核酸が含まれることで、反応中にＣｓｐが合成されて、Ｃｓｐを含む反応液となる。Ｃｓｐは低温環境においても速やかに合成されるため、Ｃｓｐ鋳型核酸を用いる場合でもＣｓｐの存在下で目的タンパク質が合成される。反応液に含まれるＣｓｐ鋳型核酸は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0026】
Ｃｓｐ鋳型核酸を用いる場合、反応液中のＣｓｐ鋳型核酸の含有量は、０．１～１．０ｎｇ／μＬが好ましく、０．２～０．８ｎｇ／μＬがより好ましく、０．２～０．４ｎｇ／μＬがさらに好ましい。Ｃｓｐ鋳型核酸の含有量が前記範囲内であれば、目的タンパク質を高効率に合成しやすい。
【0027】
本実施形態では、鋳型核酸として、鋳型ＤＮＡを用いてもよく、鋳型ＲＮＡを用いてもよい。すなわち、鋳型ＤＮＡを無細胞転写翻訳系に加えてＧＳＴ融合タンパク質を合成してもよく、鋳型ＲＮＡを無細胞翻訳系に加えてＧＳＴ融合タンパク質を合成してもよい。
鋳型ＤＮＡを用いる場合、ＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡの形態は、特に限定されず、組換えＤＮＡ技術により作製されたプラスミドＤＮＡ等の環状二本鎖ＤＮＡ、あるいはＰＣＲによって調製した直鎖状ＤＮＡのいずれでもよい。本発明では、直鎖状鋳型ＤＮＡを用いても安定かつ高効率にＧＳＴ融合タンパク質を合成できる。
鋳型ＤＮＡを用いる場合、ＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡの形態は、特に限定されず、組換えＤＮＡ技術により作製されたプラスミドＤＮＡ等の環状二本鎖ＤＮＡ、あるいはＰＣＲによって調製した直鎖状ＤＮＡのいずれでもよい。本発明では、直鎖状鋳型ＤＮＡを用いても安定かつ高効率にＧＳＴ融合タンパク質を合成できる。
【0028】
本実施形態におけるＧＳＴタグとしては、日本住血吸虫（Shistosoma japonicum）由来遺伝子から発現するＧＳＴ（分子量：２６ｋＤａ）を利用することができる。また、野生型ＧＳＴに加えて、ＧＳＴタグの発現量を高め得る変異を含む変異型ＧＳＴを用いることもできる。
合成するＧＳＴ融合タンパク質において、ＧＳＴタグは目的タンパク質のＮ末端側に付加されていることが好ましい。
合成するＧＳＴ融合タンパク質において、ＧＳＴタグは目的タンパク質のＮ末端側に付加されていることが好ましい。
【0029】
目的タンパクに付加するＧＳＴタグとしては、例えば、Ｎ末端から連続する１１個のアミノ酸の領域が、野生型と同じである配列番号１で表されるアミノ酸配列になっているＧＳＴタグ、及び、Ｎ末端から２番目にリジンが挿入されている、Ｎ末端から連続する１２個のアミノ酸の領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列になっているＧＳＴタグを例示できる。配列番号２で表されるアミノ酸配列のように、ＧＳＴタグのＮ末端から２番目にリジンを挿入すると、可溶性が改善されたタンパク質が発現しやすくなる。
以下、ＧＳＴタグにおいて、配列番号１で表されるＮ末端から１１番目のアミノ酸（リジン）までの領域と、配列番号２で表されるＮ末端から１２番目のアミノ酸（リジン）までの領域とをまとめて「領域Ａ」ともいう。
以下、ＧＳＴタグにおいて、配列番号１で表されるＮ末端から１１番目のアミノ酸（リジン）までの領域と、配列番号２で表されるＮ末端から１２番目のアミノ酸（リジン）までの領域とをまとめて「領域Ａ」ともいう。
【0030】
また、鋳型核酸においては、可溶性が改善されたタンパク質が発現しやすい点から、ＧＳＴタグの開始コドンの周辺にサイレントミューテーションが導入されていることが好ましい。より具体的には、鋳型核酸のＧＳＴタグの領域Ａをコードする領域にサイレントミューテーションが導入されていることが好ましい。
【0031】
鋳型核酸のＧＳＴタグの領域Ａをコードする領域の塩基配列としては、例えば、配列番号３～１１で表される塩基配列を例示できる。なかでも、可溶性が改善されたタンパク質が発現しやすい点から、配列番号４～１１で表される塩基配列が好ましく、配列番号４、６～１１で表される塩基配列がより好ましい。
なお、鋳型核酸のＧＳＴタグの領域Ａをコードする領域の塩基配列が配列番号４、６、８、１０、１１で表される配列の場合、Ｎ末端から連続する１２個のアミノ酸の領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列になっているＧＳＴタグが発現する。
なお、鋳型核酸のＧＳＴタグの領域Ａをコードする領域の塩基配列が配列番号４、６、８、１０、１１で表される配列の場合、Ｎ末端から連続する１２個のアミノ酸の領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列になっているＧＳＴタグが発現する。
【0032】
鋳型核酸におけるＧＳＴタグをコードする領域の塩基配列は、ＧＳＴタグにおける領域Ａ以降のＣ末端までの領域（以下、「領域Ｂ」ともいう。）も含めて、以下の（ａ）及び（ｂ）のアルゴリズムを含むソフトウェアによって最適化されていることが好ましい。これにより、可溶性が改善されたタンパク質がさらに発現されやすくなる。前記ソフトウェアは、さらに以下の（ｃ）～（ｅ）の少なくとも１つのアルゴリズムをさらに含んでもよい。
（ａ）ＲＮＡの二次構造を回避する。
（ｂ）コドンとＧＣ含有率を発現生物種に合わせて最適化する。
（ｃ）潜在的なスプライス部位やＲＮＡを不安定化する配列を除去する。
（ｄ）ｍＲＮＡを安定化する配列を追加する。
（ｅ）イントロンを除去する。
（ａ）ＲＮＡの二次構造を回避する。
（ｂ）コドンとＧＣ含有率を発現生物種に合わせて最適化する。
（ｃ）潜在的なスプライス部位やＲＮＡを不安定化する配列を除去する。
（ｄ）ｍＲＮＡを安定化する配列を追加する。
（ｅ）イントロンを除去する。
【0033】
前記ソフトウェアとしては、生物種に合わせた遺伝子配列の最適化が可能なソフトウェアを使用でき、具体的には、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）、GENEius（ＥＵＲＯＦＩＮＳ）を例示できる。
【0034】
本実施形態では、１種の鋳型核酸のみを用いてもよく、ＧＳＴタグをコードする領域の塩基配列が異なる鋳型核酸を２種以上併用してもよい。
ＣｓｐとしてＣｓｐＡを用いる場合、可溶性が改善されたタンパク質が発現しやすい点から、合成に用いる鋳型核酸におけるＧＳＴタグの領域Ａをコードする領域の塩基配列は、配列番号７～９のいずれかで表される塩基配列であることが好ましい。
ＣｓｐとしてＣｓｐＡを用いる場合、可溶性が改善されたタンパク質が発現しやすい点から、合成に用いる鋳型核酸におけるＧＳＴタグの領域Ａをコードする領域の塩基配列は、配列番号７～９のいずれかで表される塩基配列であることが好ましい。
【0035】
反応液中の鋳型核酸の含有量は、細胞抽出液のタンパク質合成活性、目的タンパク質の種類等によって適宜設定でき、例えば、０．５～１０ｎｇ／μＬ程度とすることができる。
【0036】
本実施形態におけるタンパク質の合成方法としては、透析法、バッチ法、及び重層法（Sawasaki, T., Hasegawa, Y., Tsuchimochi, M., Kamura, N., Ogasawara, T., Kuroita, T.and Endo, Y. (2002) FEBS Lett. 514, 102-105）を適用でき、透析法が好ましい。
透析法は、反応液である内液と反応基質を含む外液とを透析膜（限外ろ過膜）によって隔離し、振盪又は撹拌可能な閉鎖系で合成する方法である。透析法では、透析膜を介して、合成に必要な基質が外液から反応液に供給されるとともに、反応液中の余計な副産物を外液中に拡散させることで、より長時間反応を持続させることができる。そのため、より高いタンパク質合成量を得ることが可能となる。
透析法は、反応液である内液と反応基質を含む外液とを透析膜（限外ろ過膜）によって隔離し、振盪又は撹拌可能な閉鎖系で合成する方法である。透析法では、透析膜を介して、合成に必要な基質が外液から反応液に供給されるとともに、反応液中の余計な副産物を外液中に拡散させることで、より長時間反応を持続させることができる。そのため、より高いタンパク質合成量を得ることが可能となる。
【0037】
反応温度は、４～３０℃が好ましく、１６～２３℃がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、２～６時間が好ましく、１６℃以下の反応においては４～６時間がより好ましい。透析法の場合、１～４０時間が好ましく、５～４０時間がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、２～６時間が好ましく、１６℃以下の反応においては４～６時間がより好ましい。透析法の場合、１～４０時間が好ましく、５～４０時間がより好ましい。
【0038】
透析内液と透析外液を隔てる透析膜の分画分子量は、３，５００～１００，０００が好ましく、１０，０００～５０，０００がより好ましい。
振盪速度又は撹拌速度は、例えば、１００～３００ｒｐｍとすることができる。
振盪速度又は撹拌速度は、例えば、１００～３００ｒｐｍとすることができる。
【0039】
ＧＳＴ融合タンパク質を合成した後は、ＧＳＴ融合タンパク質を精製することが好ましい。ＧＳＴ融合タンパク質の精製方法としては、公知のタンパク質の精製方法を採用でき、例えば、硫酸アンモニウム又はアセトン沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、等電点クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等が挙げられる。これらの精製方法は、単独で行ってもよく、２つ以上を組み合わせて行ってもよい。ＧＳＴタグを特異的に認識する吸着材を利用したアフィニティー精製法を使用してもよい。
ＧＳＴ融合タンパク質の同定及び定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析等により、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
ＧＳＴ融合タンパク質の同定及び定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析等により、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
【0040】
［第２実施形態］
第２実施形態に係るタンパク質の製造方法は、ＣＦ系の反応液でＧＳＴタグを有するタンパク質を合成する方法であって、合成に用いる鋳型核酸における、ＧＳＴタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を、配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列とする。すなわち、第２実施形態のタンパク質の製造方法は、ＣＦ系のタンパク質合成において、鋳型核酸のＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列を配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列とする方法である。これにより、ＣＦ系で合成されるタンパク質の可溶性が改善される。
第２実施形態に係るタンパク質の製造方法は、ＣＦ系の反応液でＧＳＴタグを有するタンパク質を合成する方法であって、合成に用いる鋳型核酸における、ＧＳＴタグのＮ末端から連続する１１個又は１２個のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を、配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列とする。すなわち、第２実施形態のタンパク質の製造方法は、ＣＦ系のタンパク質合成において、鋳型核酸のＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列を配列番号４、６～１１のいずれかで表される塩基配列とする方法である。これにより、ＣＦ系で合成されるタンパク質の可溶性が改善される。
【0041】
第１実施形態の説明においてＣＦ系の反応液について述べたことは、Ｃｓｐを含むこと以外は第２実施形態のＣＦ系にも該当する。
第２実施形態で用いる鋳型核酸は、第１実施形態で用いる鋳型核酸と同様に、領域Ｂも含めて、前記したソフトウェア、例えばＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）、GENEius（ＥＵＲＯＦＩＮＳ）等によって最適化されていることが好ましい。
第２実施形態で用いる鋳型核酸は、第１実施形態で用いる鋳型核酸と同様に、領域Ｂも含めて、前記したソフトウェア、例えばＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）、GENEius（ＥＵＲＯＦＩＮＳ）等によって最適化されていることが好ましい。
【0042】
本実施形態でも、１種の鋳型核酸のみを用いてもよく、ＧＳＴタグをコードする領域の塩基配列が異なる鋳型核酸を２種以上併用してもよい。
反応液中の鋳型核酸の含有量は、細胞抽出液のタンパク質合成活性、目的タンパク質の種類等によって適宜設定でき、例えば、０．５～１０ｎｇ／μＬ程度とすることができる。
反応液中の鋳型核酸の含有量は、細胞抽出液のタンパク質合成活性、目的タンパク質の種類等によって適宜設定でき、例えば、０．５～１０ｎｇ／μＬ程度とすることができる。
【0043】
本実施形態におけるタンパク質の合成方法としては、第１実施形態と同様の方法を例示でき、透析法が好ましい。
反応温度は、４～３０℃が好ましく、２３～３０℃がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、２～６時間が好ましく、１６℃以下の反応においては４～６時間がより好ましい。透析法の場合、１～４０時間が好ましく、５～４０時間がより好ましい。
反応温度は、４～３０℃が好ましく、２３～３０℃がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、２～６時間が好ましく、１６℃以下の反応においては４～６時間がより好ましい。透析法の場合、１～４０時間が好ましく、５～４０時間がより好ましい。
【0044】
本実施形態においても、ＧＳＴ融合タンパク質を合成した後は、ＧＳＴ融合タンパク質を精製することが好ましい。ＧＳＴ融合タンパク質の精製方法としては、第１実施形態で例示した方法と同じ方法を例示できる。
【0045】
本発明のタンパク質の製造方法で製造したタンパク質の用途は、特に限定されない。例えば、Ｘ線結晶解析やＮＭＲ測定による立体構造の解析、酵素による物質生産等に用いることができる。本発明では、可溶性が改善されたタンパク質を高効率に製造できる。そのため、例えば多量のタンパク質が必要な立体構造の解析や酵素による物質生産に好適である。
【実施例0046】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
【0047】
［例１］
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有するＧＳＴを合成するための鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１４、１６、１８、２０で表される塩基配列のいずれか、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。また、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するＧＳＴ（Ｎ末端から２番目にリジンを挿入したＧＳＴ）を合成するための鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１３、１５、１７、１９で表される塩基配列のいずれか、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。これら配列番号１２～２０で表される塩基配列を含む直鎖状ＤＮＡを鋳型として用いて、ＣＦ系の反応液でＧＳＴ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を合成した。なお、配列番号１２で表される塩基配列を含む直鎖状ＤＮＡを鋳型として発現させたＧＳＴをＳｑ１２と示し、他の直鎖状ＤＮＡを鋳型とした場合も同様に示す。
大腸菌Ｓ３０抽出液としては、大腸菌BL21 codon plus株から調製された安定同位体標識セルフリー合成用酵素液（大陽日酸）を使用した。酵素やアミノ酸等を除くタンパク質合成用試薬として、ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）を使用した。
各鋳型ＤＮＡを用いたタンパク質合成反応は、下記の表１に示した組成の反応液を、表２に示した組成の透析外液に対して透析し、１８時間行った。反応温度は３０℃、２３℃または１６℃とした。反応スケールとしては、内液（反応液）を３０μＬ、透析外液５００μＬとした。
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有するＧＳＴを合成するための鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１４、１６、１８、２０で表される塩基配列のいずれか、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。また、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するＧＳＴ（Ｎ末端から２番目にリジンを挿入したＧＳＴ）を合成するための鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１３、１５、１７、１９で表される塩基配列のいずれか、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。これら配列番号１２～２０で表される塩基配列を含む直鎖状ＤＮＡを鋳型として用いて、ＣＦ系の反応液でＧＳＴ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を合成した。なお、配列番号１２で表される塩基配列を含む直鎖状ＤＮＡを鋳型として発現させたＧＳＴをＳｑ１２と示し、他の直鎖状ＤＮＡを鋳型とした場合も同様に示す。
大腸菌Ｓ３０抽出液としては、大腸菌BL21 codon plus株から調製された安定同位体標識セルフリー合成用酵素液（大陽日酸）を使用した。酵素やアミノ酸等を除くタンパク質合成用試薬として、ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）を使用した。
各鋳型ＤＮＡを用いたタンパク質合成反応は、下記の表１に示した組成の反応液を、表２に示した組成の透析外液に対して透析し、１８時間行った。反応温度は３０℃、２３℃または１６℃とした。反応スケールとしては、内液（反応液）を３０μＬ、透析外液５００μＬとした。
【0048】
表１及び表２中の「ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）」とは、緩衝液としてＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ７．５）、塩としてＤ－グルタミン酸カリウム及び酢酸アンモニウム、エネルギー源としてＡＴＰ、転写用基質としてＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、その他の試薬としてｃｙｃｌｉｃＡＭＰ、フォリン酸、ＤＴＴ及びポリエチレングリコールを含む混合物である。
【0049】
【表1】
【0050】
【表2】
【0051】
反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）とを、トリシンを１５％含むＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１に示す。
【0052】
図１に示すように、Ｓｑ１２とＳｑ１３の比較、及びＳｑ１４とＳｑ１５の比較から、Ｎ末端から２番目にリジンを挿入することにより、ＧＳＴの発現量が増加することが分かった。また、Ｎ末端から２番目にリジンが挿入されていないＳｑ１８においても、１６℃でもＧＳＴの発現量が多かった。これらＳｑ１２～２０においては、Ｓｑ１５～Ｓｑ２０のＧＳＴの発現量が特に多かった。
【0053】
［例２］
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２～２０で表される配列のいずれか、ＧＦＰタンパク質の改変体（ＧＦＰＳ１）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている。
前記プラスミドＤＮＡを１．０ｎｇ／μＬ用いる以外は例１と同様の方法で、ＧＳＴタグ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を有するＧＦＰ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。
ＧＳＴ融合タンパク質の合成量は、ＧＦＰの蛍光値から判定した。反応液を緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後、マルチモードマイクロプレートリーダーSpectraMax i3（Molecular Devices）を用いて励起４８５ｎｍ、蛍光５３５ｎｍでＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。結果を図２に示す。
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２～２０で表される配列のいずれか、ＧＦＰタンパク質の改変体（ＧＦＰＳ１）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている。
前記プラスミドＤＮＡを１．０ｎｇ／μＬ用いる以外は例１と同様の方法で、ＧＳＴタグ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を有するＧＦＰ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。
ＧＳＴ融合タンパク質の合成量は、ＧＦＰの蛍光値から判定した。反応液を緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後、マルチモードマイクロプレートリーダーSpectraMax i3（Molecular Devices）を用いて励起４８５ｎｍ、蛍光５３５ｎｍでＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。結果を図２に示す。
【0054】
図２に示すように、Ｓｑ１２とＳｑ１３の比較、及びＳｑ１４とＳｑ１５の比較から、ＧＳＴのＮ末端から２番目にリジンを挿入することにより、ＧＳＴ融合タンパク質の合成量が増加した。また、Ｎ末端から２番目にリジンが挿入されていないＳｑ１８においても、１６℃でもＧＳＴ融合タンパク質の合成量が多かった。これらＳｑ１２～２０においては、Ｓｑ１５～Ｓｑ２０のＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の合成量が特に多かった。これらの傾向は例１でＧＳＴのみを発現させた場合と同様であった。
【0055】
［例３］
大腸菌由来の精製ＣｓｐＡを１．０μｇ／μＬの濃度となるように反応液に添加する以外は例１と同様の方法で、配列番号１２～２０で表される塩基配列を含む直鎖状ＤＮＡを鋳型として用いて、ＧＳＴ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を合成した。なお、精製ＣｓｐＡはＣＦ系で合成した。反応温度は２３℃または１６℃とした。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図３に示す。
大腸菌由来の精製ＣｓｐＡを１．０μｇ／μＬの濃度となるように反応液に添加する以外は例１と同様の方法で、配列番号１２～２０で表される塩基配列を含む直鎖状ＤＮＡを鋳型として用いて、ＧＳＴ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を合成した。なお、精製ＣｓｐＡはＣＦ系で合成した。反応温度は２３℃または１６℃とした。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図３に示す。
【0056】
図３に示すように、Ｃｓｐ存在下のＣＦ系ではＧＳＴが十分に発現した。特にＳｑ１６～１８のＧＳＴの発現量が多かった。
【0057】
［例４］
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質のプラスミドＤＮＡを１．０ｎｇ／μＬ用いる以外は、例３と同様の方法で、ＧＳＴタグ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を有するＧＦＰ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。反応温度は２３℃または１６℃とした。
例２と同様の方法で測定したＧＳＴ融合タンパク質の合成量（ＧＦＰの蛍光値）を図４に示す。
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質のプラスミドＤＮＡを１．０ｎｇ／μＬ用いる以外は、例３と同様の方法で、ＧＳＴタグ（Ｓｑ１２～Ｓｑ２０）を有するＧＦＰ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。反応温度は２３℃または１６℃とした。
例２と同様の方法で測定したＧＳＴ融合タンパク質の合成量（ＧＦＰの蛍光値）を図４に示す。
【0058】
【0059】
［例５］
ＧＦＰのＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１５、１８、２３、２４又は２５で表される配列、ＧＦＰタンパク質の改変体（ＧＦＰＳ１）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている。
反応温度を３０℃、２３℃または１６℃とした以外は例４と同様の方法で、ＧＳＴタグ（Ｓｑ１２、Ｓｑ１５、Ｓｑ１８、Ｓｑ２３、Ｓｑ２４、Ｓｑ２５）を有するＧＦＰ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。
例２と同様の方法で測定したＧＳＴ融合タンパク質の合成量（ＧＦＰの蛍光値）を図５に示す。
ＧＦＰのＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１５、１８、２３、２４又は２５で表される配列、ＧＦＰタンパク質の改変体（ＧＦＰＳ１）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている。
反応温度を３０℃、２３℃または１６℃とした以外は例４と同様の方法で、ＧＳＴタグ（Ｓｑ１２、Ｓｑ１５、Ｓｑ１８、Ｓｑ２３、Ｓｑ２４、Ｓｑ２５）を有するＧＦＰ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。
例２と同様の方法で測定したＧＳＴ融合タンパク質の合成量（ＧＦＰの蛍光値）を図５に示す。
【0060】
Ｓｑ２３のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号２３）は、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列にサイレントミューテーションが導入されているが、領域Ｂをコードする塩基配列は野生型と同じである。Ｓｑ２４のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号２４）は、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列が野生型と同じであるが、領域Ｂをコードする塩基配列が最適化されている。Ｓｑ１８のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号１８）は、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列がＳｑ２３と同じで、領域Ｂをコードする塩基配列がＳｑ２４と同じである。
Ｓｑ２５のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号２５）は、Ｓｑ２３のＮ末端から２番目にリジンを挿入したＧＳＴタグである。Ｓｑ１５、Ｓｑ１８、Ｓｑ２５のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号１５、１８、２５）は、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列がそれぞれ異なり、領域Ｂをコードする塩基配列が同じである。
Ｓｑ２５のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号２５）は、Ｓｑ２３のＮ末端から２番目にリジンを挿入したＧＳＴタグである。Ｓｑ１５、Ｓｑ１８、Ｓｑ２５のＧＳＴタグの鋳型ＤＮＡ（配列番号１５、１８、２５）は、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列がそれぞれ異なり、領域Ｂをコードする塩基配列が同じである。
【0061】
図５（ａ）に示すように、Ｓｑ２４のＧＳＴタグに比べてＳｑ２３のＧＳＴタグの方がＧＳＴ融合タンパク質の合成量が多く、Ｓｑ１８のＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質に近かった。このことは、鋳型核酸において、ＧＳＴタグの領域Ｂをコードする塩基配列よりも、領域Ａをコードする塩基配列を最適化する方が可溶なＧＳＴ融合タンパク質の合成量を増加させる効果が高いことを示している。
図５（ｂ）に示すように、Ｃｓｐ存在下のＣＦ系ではＳｑ１５のＧＳＴタグに比べてＳｑ２５のＧＳＴタグの方がＧＳＴ融合タンパク質の合成量が多く、Ｓｑ１８のＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質に近かった。このことは、鋳型核酸において、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列には、Ｃｓｐ存在下のＣＦ系におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成量を増加させるために至適な配列が存在することを示している。
図５（ｂ）に示すように、Ｃｓｐ存在下のＣＦ系ではＳｑ１５のＧＳＴタグに比べてＳｑ２５のＧＳＴタグの方がＧＳＴ融合タンパク質の合成量が多く、Ｓｑ１８のＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質に近かった。このことは、鋳型核酸において、ＧＳＴタグの領域Ａをコードする塩基配列には、Ｃｓｐ存在下のＣＦ系におけるＧＳＴ融合タンパク質の合成量を増加させるために至適な配列が存在することを示している。
【0062】
［例６］
キナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ６）のＮ末端にＨｉｓタグ（Ｎ１１）を有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＭＡＰ２Ｋ６遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。前記鋳型ＤＮＡを１．５ｎｇ／μＬ用いる以外は例１と同様の方法で、Ｈｉｓタグを有するキナーゼを合成した。
キナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ６）のＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＭＡＰ２Ｋ６遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。前記鋳型ＤＮＡを１．５ｎｇ／μＬ用い、ポリエチレングリコールを含まない反応液を用いる以外は、例１と同様の方法で、ＧＳＴタグを有するキナーゼ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。
また、大腸菌由来の精製ＣｓｐＡを１．０μｇ／μＬの濃度となるように反応液に添加する以外は同様の方法で、Ｈｉｓタグを有するキナーゼとＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図６に示す。
キナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ６）のＮ末端にＨｉｓタグ（Ｎ１１）を有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＭＡＰ２Ｋ６遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。前記鋳型ＤＮＡを１．５ｎｇ／μＬ用いる以外は例１と同様の方法で、Ｈｉｓタグを有するキナーゼを合成した。
キナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ６）のＮ末端にＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＭＡＰ２Ｋ６遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡをＰＣＲによって調製した。前記鋳型ＤＮＡを１．５ｎｇ／μＬ用い、ポリエチレングリコールを含まない反応液を用いる以外は、例１と同様の方法で、ＧＳＴタグを有するキナーゼ（ＧＳＴ融合タンパク質）を合成した。
また、大腸菌由来の精製ＣｓｐＡを１．０μｇ／μＬの濃度となるように反応液に添加する以外は同様の方法で、Ｈｉｓタグを有するキナーゼとＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図６に示す。
【0063】
［例７］
キナーゼ（ＡＵＲＫＢ）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＡＵＲＫＢ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＡＵＲＫＢ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図７に示す。
キナーゼ（ＡＵＲＫＢ）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＡＵＲＫＢ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＡＵＲＫＢ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図７に示す。
【0064】
［例８］
キナーゼ（ＳＹＫ）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＳＹＫ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＳＹＫ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図８に示す。
キナーゼ（ＳＹＫ）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＳＹＫ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＳＹＫ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図８に示す。
【0065】
［例９］
プロテインキナーゼ阻害物質（ＴＲＩＢ２）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図９に示す。
プロテインキナーゼ阻害物質（ＴＲＩＢ２）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図９に示す。
【0066】
［例１０］
ヘリカーゼ（ＭＣＭ５）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１０に示す。
ヘリカーゼ（ＭＣＭ５）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２又は１８で表される塩基配列のいずれか、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１０に示す。
【0067】
図６～図１０に示すように、ＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質は、Ｈｉｓタグを有するタンパク質に比べて合成量が多く、かつ可溶性であった。また、反応液にＣｓｐが含まれることにより、可溶なＧＳＴ融合タンパク質の合成量が増加した。
【0068】
［例１１］
プロテインキナーゼ阻害物質（ＴＲＩＢ２）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１３、１５、１８、１９又は２０で表される塩基配列のいずれか、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。反応温度は３０℃または１６℃とした。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１１及び図１２に示す。
プロテインキナーゼ阻害物質（ＴＲＩＢ２）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１３、１５、１８、１９又は２０で表される塩基配列のいずれか、ＴＲＩＢ２遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例６と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。反応温度は３０℃または１６℃とした。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１１及び図１２に示す。
【0069】
［例１２］
キナーゼ（ＡＵＲＫＣ）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＡＵＲＫＣ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１３、１５、１８、１９又は２０で表される塩基配列のいずれか、ＡＵＲＫＣ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例１１と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１３及び図１４に示す。
キナーゼ（ＡＵＲＫＣ）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＡＵＲＫＣ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１３、１５、１８、１９又は２０で表される塩基配列のいずれか、ＡＵＲＫＣ遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例１１と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１３及び図１４に示す。
【0070】
［例１３］
ヘリカーゼ（ＭＣＭ５）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１３、１５、１８、１９又は２０で表される塩基配列のいずれか、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例１１と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１５及び図１６に示す。
ヘリカーゼ（ＭＣＭ５）のＮ末端にＨｉｓタグ配列（Ｎ１１）又はＧＳＴタグを有するＧＳＴ融合タンパク質の鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、Ｈｉｓタグ配列（Ｎ１１）、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡと、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号１２、１３、１５、１８、１９又は２０で表される塩基配列のいずれか、ＭＣＭ５遺伝子、及びＴ７ターミネーターを含む直鎖状ＤＮＡを用いる以外は、例１１と同様の方法でＨｉｓタグ融合タンパク質とＧＳＴ融合タンパク質を合成した。
各種の鋳型ＤＮＡを用いたときのＣｓｐＡを添加した場合（Ｃｓｐ＋）と添加していない場合（Ｃｓｐ－）の反応後の全画分（Ｔ）と可溶画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１５及び図１６に示す。
【0071】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】