特開 2023-6159 筋損傷回復促進剤、筋損傷に伴う炎症抑制剤及び筋損傷回復促進用経口組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023006159

(43)【公開日】2023-01-18

(54)【発明の名称】筋損傷回復促進剤、筋損傷に伴う炎症抑制剤及び筋損傷回復促進用経口組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/23 20060101AFI20230111BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 31/70 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20230111BHJP

   A23L 33/115 20160101ALI20230111BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230111BHJP

【ＦＩ】

A61K31/23

A61P21/00 ZNA

A61P29/00

A61P43/00 121

A61K31/70

A61K38/02

A23L33/115

C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021108607

(22)【出願日】2021-06-30

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】515238932

【氏名又は名称】株式会社みやぎヘルスイノベーション

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100177149

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 浩義

(74)【代理人】

【識別番号】100222922

【弁理士】

【氏名又は名称】和田 朋子

(72)【発明者】

【氏名】橋本 祐里

(72)【発明者】

【氏名】安倍 知紀

(72)【発明者】

【氏名】大石 勝隆

(72)【発明者】

【氏名】畠山 昌樹

【テーマコード（参考）】

4B018

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B018LE01

4B018LE05

4B018MD14

4B018ME14

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA03

4C084CA62

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA52

4C084NA05

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA01

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA52

4C086NA05

4C086ZA94

4C086ZB11

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206DB06

4C206DB48

4C206MA01

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA37

4C206MA42

4C206MA43

4C206MA55

4C206MA57

4C206MA61

4C206MA63

4C206MA72

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZA94

4C206ZB11

4C206ZC75

(57)【要約】

【課題】筋損傷後の炎症を早期に抑え、筋再生を促進することができる筋損傷回復促進剤、筋損傷に伴う炎症抑制剤及び筋損傷回復促進用経口組成物を提供する。
【解決手段】筋損傷回復促進剤は、中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする、
筋損傷回復促進剤。

【請求項2】

タンパク質と、
糖質と、
をさらに含む、請求項１に記載の筋損傷回復促進剤。

【請求項3】

前記中鎖脂肪酸トリグリセリド、前記タンパク質及び前記糖質の合計質量に対する前記中鎖脂肪酸トリグリセリド、前記タンパク質及び前記糖質の質量の割合がそれぞれ４０～７５％、５～４０％及び５～４０％である、
請求項２に記載の筋損傷回復促進剤。

【請求項4】

前記中鎖脂肪酸トリグリセリドを少なくとも一部とする脂質を含み、
前記糖質及び前記タンパク質の合計質量に対する前記脂質の割合で定義されるケトン比が０．７～４である、
請求項２又は３に記載の筋損傷回復促進剤。

【請求項5】

前記中鎖脂肪酸トリグリセリドが、ココナツオイルである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の筋損傷回復促進剤。

【請求項6】

対象が覚醒している時間帯に前記対象に摂取される、
請求項１から５のいずれか一項に記載の筋損傷回復促進剤。

【請求項7】

中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする、
筋損傷に伴う炎症抑制剤。

【請求項8】

中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする、
筋損傷回復促進用経口組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、筋損傷回復促進剤、筋損傷に伴う炎症抑制剤及び筋損傷回復促進用経口組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

骨格筋は、打撲による外力、外科的手術及び運動等により損傷することがある。筋損傷は、筋節の損傷等の構造異常、細胞成分放出の誘発、筋組織に含まれるタンパク質の分解及び細胞透過性の増加、サイトカインの放出、並びに貪食細胞による浸潤を含む炎症プロセスを特徴とする。骨格筋の損傷後の炎症を経て、筋の周囲に存在するサテライト細胞とよばれる骨格筋幹細胞が活性化し、損傷から数週間で筋が再生する。

【0003】

筋損傷への応急処置としては、ＲＩＣＥ処置（安静；Ｒｅｓｔ、冷却；Ｉｃｉｎｇ、圧迫；Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ、挙上；Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）が推奨されている。応急処置後は、疼痛に対する対症的治療及びリハビリテーション等が行われている。しかしながら、ＲＩＣＥ処置では筋損傷後の再生に長い時間を要するため、筋損傷患者の日常生活及びスポーツ活動への復帰が遅れてしまう。そのため、筋再生を促進する薬剤の開発が強く望まれている。

【0004】

筋再生促進剤の有効成分として、特許文献１には、５－ＨＴ_２Ｂ受容体アゴニスト活性を有する化合物が開示されている。特許文献２には、中鎖トリグリセリド等を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、炎症性疾患を治療する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０２１－８４０９号公報

【特許文献2】特表２０１８－５１８５１３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

筋損傷後の炎症を早期に抑えることができれば、筋損傷の回復又は筋再生が促進することが期待される。上記特許文献１では、５－ＨＴ_２Ｂ受容体アゴニスト活性を有する化合物の筋損傷後の炎症への影響については検討されていない。上記特許文献２でも、中鎖トリグリセリド等を含む組成物の筋損傷後の炎症への有効性は検討されておらず、当該組成物が有効であると考えられる炎症性疾患に筋損傷に伴う炎症は含まれていない。

【0007】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、筋損傷後の炎症を早期に抑え、筋再生を促進することができる筋損傷回復促進剤、筋損傷に伴う炎症抑制剤及び筋損傷回復促進用経口組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、中鎖脂肪酸トリグリセリドを主成分として含むケトン食を筋損傷モデルマウスに与えたところ、筋損傷後の炎症が早期に抑えられ、筋再生が促進されることを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

本発明の第１の観点に係る筋損傷回復促進剤は、
中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする。

【0010】

上記本発明の第１の観点に係る筋損傷回復促進剤は、
タンパク質と、
糖質と、
をさらに含む、
こととしてもよい。

【0011】

また、前記中鎖脂肪酸トリグリセリド、前記タンパク質及び前記糖質の合計質量に対する前記中鎖脂肪酸トリグリセリド、前記タンパク質及び前記糖質の質量の割合がそれぞれ４０～７５％、５～４０％及び５～４０％である、
こととしてもよい。

【0012】

上記本発明の第１の観点に係る筋損傷回復促進剤は、
前記中鎖脂肪酸トリグリセリドを少なくとも一部とする脂質を含み、
前記糖質及び前記タンパク質の合計質量に対する前記脂質の割合で定義されるケトン比が０．７～４である、
こととしてもよい。

【0013】

また、前記中鎖脂肪酸トリグリセリドが、ココナツオイルである、
こととしてもよい。

【0014】

上記本発明の第１の観点に係る筋損傷回復促進剤は、
対象が覚醒している時間帯に前記対象に摂取される、
こととしてもよい。

【0015】

本発明の第２の観点に係る筋損傷に伴う炎症抑制剤は、
中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする。

【0016】

本発明の第３の観点に係る筋損傷回復促進用経口組成物は、
中鎖脂肪酸トリグリセリドを有効成分とする。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、筋損傷後の炎症を早期に抑え、筋再生を促進することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】試験例１に係る普通食（Ａ）又はケトン食（Ｂ）を与えた筋損傷モデル動物の筋損傷後１２日目の筋組織切片の免疫蛍光染色画像を示す図である。

【図2】試験例１に係る筋損傷モデル動物の筋損傷後１２日目の筋細胞の線維径（最小フェレ径）を示す図である。

【図3】試験例１に係る筋損傷モデル動物の筋損傷後のＭｙｏＤ１遺伝子の相対的発現量を示す図である。

【図4】試験例１に係る筋損傷モデル動物の筋損傷後のＴＮＦα遺伝子の相対的発現量を示す図である。

【図5】試験例１に係る筋損傷モデル動物の筋損傷後のＣＤ１１ｃ遺伝子の相対的発現量を示す図である。

【図6】試験例１に係る筋損傷モデル動物の筋損傷後のＮｃｆ１遺伝子の相対的発現量を示す図である。

【図7】試験例２に係るマウスの血中ケトン体濃度の経時変化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

【0020】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、中鎖脂肪酸トリグリセリド（以下、“ＭＣＴ”ともいう）を有効成分とする。ＭＣＴは、炭素数が８から１２の脂肪酸のグリセリントリエステルである。ＭＣＴは、炭素数８から１２の脂肪酸トリグリセリドが大部分である混合物であってもよい。ＭＣＴを構成する全脂肪酸に対する炭素数８～１２の脂肪酸の割合は、例えば６０～１００モル％、より好ましくは７０～１００モル％である。ＭＣＴを構成する脂肪酸が、炭素数８のカプリル酸及び炭素数１０のカプリン酸を５０モル％以上、好ましくは６０モル％以上、より好ましくは７０モル％以上含有するＭＣＴがより好ましい。ＭＣＴは動植物からの抽出物であってもよい。好適には、ＭＣＴとしてココナツオイルを使用することができる。

【0021】

脂肪酸の代謝産物であるケトン体は、グルコースに代わるエネルギー源となる。長鎖脂肪酸トリグリセライド由来の長鎖脂肪酸はカイロミクロンを経てリンパ管から大循環系に入り脂肪組織などに貯蔵され、グリコーゲン枯渇時等に分解され消費される。一方、中鎖脂肪酸はカイロミクロンを経ずに門脈に入り肝臓に運ばれ、速やかにエネルギー源となって代謝される。このため、中鎖脂肪酸は糖質摂取が少ない条件において、肝臓でケトン体を速やかに産生することができる。

【0022】

好ましくは、本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、タンパク質と、糖質と、をさらに含む。タンパク質は、特に制限されないが、例えば、コーングルテン、小麦グルテン、大豆タンパク質、小麦タンパク質、ホエイタンパク質、カゼイン、乳タンパク質、動物性タンパク質、卵白及び卵黄等である。

【0023】

糖質は、例えば単糖類、二糖類及び多糖類等を含む。単糖類としては、グルコース、フルクトース及びガラクトース等が挙げられる。二糖類としては、マルトース、スクロース及びラクトース等が挙げられる。多糖類としては、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン及びデキストリン等が挙げられる。

【0024】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤がタンパク質及び糖質を含む場合、好ましくは、ＭＣＴ、タンパク質及び糖質の合計質量Ｍ_ｓに対するＭＣＴの質量の割合は、例えば４０～７５質量％、より好ましくは４２～７５質量％、特に好ましくは４５～７５質量％である。合計質量Ｍ_ｓに対するタンパク質の割合は、例えば、５～４０質量％、好ましくは７～３０質量％、特に好ましくは１０～３０質量％である。合計質量Ｍ_ｓに対する糖質の割合は、例えば、５～４０質量％、好ましくは７～３０質量％、特に好ましくは１０～２０質量％である。合計質量Ｍ_ｓに対する中鎖脂肪酸トリグリセリド、タンパク質及び糖質の質量の割合を上記の範囲とすることで、筋損傷後の筋再生を促進することができる。

【0025】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤はＭＣＴ以外の脂質を含んでもよい。脂質は、その少なくとも一部としてＭＣＴを含む。すなわち、本明細書における“脂質”は、ＭＣＴのみであってもよいが、好ましくはＭＣＴに加えてＭＣＴ以外の脂質を含む。ＭＣＴ以外の脂質としては、例えば、ω３脂肪酸及びω６脂肪酸等の長鎖脂肪酸、ラード及び魚油等の動物性油脂、並びにパーム油、サフラワー油、大豆油、コーン油、ナタネ油及びヤシ油等の植物性油脂等が挙げられる。動物性油脂及び植物性油脂は、分別油、水素添加油及びエステル交換油等であってもよい。

【0026】

好適には、糖質及びタンパク質の合計質量に対する脂質の割合で定義されるケトン比（脂質の質量／（糖質の質量＋タンパク質の質量））が０．７～４、好ましくは０．７～２．９、より好ましくは０．８～２．５、特に好ましくは１．０～２．０又は１．０～１．５となるように各成分が配合される。例えば、ＭＣＴが４０質量部、ＭＣＴ以外の脂質が２０質量部、糖質の質量とタンパク質の質量との合計質量が６０質量部の場合のケトン比は１である。ＭＣＴが７５質量部、ＭＣＴ以外の脂質が２５質量部、糖質の質量とタンパク質の質量との合計質量が２５質量部の場合、ケトン比は４となる。

【0027】

なお、上記の合計質量Ｍ_ｓに対する糖質の割合、糖質の配合量及びケトン比の算出等では、上述の単糖類、二糖類及び多糖類のように、摂取されると数時間で代謝され、グルコース又はエネルギーを発生しうる糖類を“糖質”とする。したがって、ペクチン、βグルカン、フルクタン、イヌリン、アガロース、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、フコイダン、セルロース、キチン、キトサン及びエリスリトール等の食物繊維等は、炭水化物ではあるものの、速やかにグルコース又はエネルギーに代謝されない。このため、上記の合計質量Ｍ_ｓに対する糖質の割合、糖質の配合量及びケトン比の算出では食物線維は“糖質”に含めないものとする。なお、食物繊維等が本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤に配合されることは排除されない。

【0028】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、筋再生を促進する効果を損なわない範囲で、水、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー、機能性成分及び食品添加物等、食品に含まれる成分を含有してもよい。ビタミン類としては、ビタミンＡ、カロテン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン及び葉酸等が挙げられる。ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛及びセレン等が挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸及び酒石酸等が挙げられる。機能性成分として、例えばオリゴ糖、グルコサミン、コラーゲン、セラミド、ローヤルゼリー及びポリフェノール等が挙げられる。筋損傷回復促進剤には、乳化剤、安定剤、増粘剤、ゲル化剤、甘味剤、酸味料、保存料、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、着色剤及び香料等が配合されてもよい。

【0029】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、ＭＣＴに賦形剤を加えて粉末状、顆粒状、ペースト状又はその他に加工してもよい。賦形剤は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軟質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール及びエリスリトール等である。

【0030】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０１～９９．５質量％、０．１～９９質量％、１～８０質量％、１０～６０質量％又は２０～５０質量％のＭＣＴを含む。筋損傷回復促進剤の形態は特に制限されず、ペースト剤、ゲル状剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、錠剤、丸剤及びカプセル剤等であってもよい。

【0031】

好ましくは、本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、筋損傷を有する対象に、上記ケトン比が０．７～４、好ましくは０．７～２．９、より好ましくは０．８～２．５、特に好ましくは１．０～２．０又は１．０～１．５となるように投与される。筋損傷を有する対象が当該筋損傷回復促進剤以外の食物等を摂取する場合は、上記ケトン比になるように筋損傷回復促進剤の組成又は用量を調整すればよい。筋損傷回復促進剤が糖質及びタンパク質を含有しない場合、筋損傷を有する対象が摂取する食物に含まれる糖質及びタンパク質の質量に基づいて、ケトン比が、例えば０．７～４になるように筋損傷回復促進剤の用量を設定すればよい。

【0032】

本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、筋損傷を有する対象の１日の必要カロリーの５０～１００％となるように投与されることが好ましく、より好ましくは７０～１００％、特に好ましくは８０～１００％となるように投与される。これにより血中ケトン体濃度を向上させることで、筋損傷後の筋再生を促進することができる。

【0033】

上記の筋損傷回復促進剤は経口投与されても、経管投与されてもよい。また、投与回数に制限はなく、筋損傷を有する対象の状態に応じて投与回数を適宜選択することができる。下記試験例２でケトン体の血中濃度の変化を検討したところ、筋損傷回復促進剤を摂取すると、ケトン体の血中濃度は、活動期に増加し、睡眠時間帯に低下することが判明した。したがって、好ましくは、筋損傷回復促進剤は対象が覚醒している時間帯、特には当該対象が覚醒して活動している時間帯に当該対象に摂取される。なお、筋損傷回復促進剤を摂取する対象は動物であれば特に限定されず、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトである。

【0034】

なお、別の実施の形態では、上記筋損傷回復促進剤と、当該筋損傷回復促進剤の好ましい摂取時刻又は時間帯が記載された指示書と、を備える、筋損傷回復促進キットが提供される。当該指示書には、上記筋損傷回復促進剤を、覚醒している時間帯に摂取するのが好ましい旨が記載される。

【0035】

下記試験例１に示すように、本実施の形態に係る筋損傷回復促進剤は、筋損傷後の炎症を早期に抑え、筋繊維径を増大、すなわち筋再生を促進することができる。当該筋損傷回復促進剤は任意の筋組織に対して有効であるが、好ましくは、骨格筋、平滑筋及び心筋の損傷に適用するのが好ましく、特には運動障害の生じやすい骨格筋の損傷に有効である。

【0036】

また、筋損傷回復促進剤における脂質、糖質及びタンパク質に関して、ケトン比を０．７～４とすることで、筋損傷を有する対象におけるケトン体の血中濃度を高く維持することができる。これにより、筋損傷後の炎症を早期に抑えるとともに、筋衛星細胞の活性化を促進し、筋再生をさらに促進させることができる。

【0037】

別の実施の形態では、上記筋損傷回復促進剤は、筋損傷に伴う炎症抑制剤としても使用できる。また、他の実施の形態では、上記筋損傷回復促進剤は、筋損傷回復促進用経口組成物としても使用できる。経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。

【0038】

サプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フィイルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液及び懸濁液等の任意の形態でよい。サプリメントは、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでもよい。

【0039】

“機能性食品”とは、健康の維持の目的で摂取する食品又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品及び栄養補助食品等を含む。この中でも保健機能食品である特定保健用食品又は栄養機能食品が好ましい。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、甘味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤及び香料等を筋損傷回復促進用経口組成物に添加してもよい。

【0040】

機能性食品である食品及び飲料は特に限定されるものではない。機能性食品の形態は、例えば、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶及び緑茶等の飲料；キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム及びゼリー等の菓子；麺、パン、米飯及びビスケット等の穀類加工品；ソーセージ、ハム及びかまぼこ等の練り製品；バター及びヨーグルト等の乳製品；並びに調味料等である。

【0041】

また、上記筋損傷回復促進剤は、食品添加剤として食品に添加されてもよい。この場合、当該食品添加剤は、食品に添加しやすいように、ペースト剤、ゲル状剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、及び顆粒剤等であってもよい。

【0042】

他の実施の形態では、ＭＣＴを患者に投与することにより筋損傷を治療する方法が提供される。また、別の実施の形態は、筋損傷を治療するためのＭＣＴの使用である。他の実施の形態では、筋損傷回復促進剤としての使用のためのＭＣＴが提供される。また、別の実施の形態は、筋損傷回復促進剤の製造のためのＭＣＴの使用である。また、上記筋損傷回復促進剤は、筋再生促進剤として使用されてもよい。また、上記筋損傷回復促進剤は、経管栄養組成物、特に中心静脈から投与する中心静脈栄養用組成物として使用してもよい。

【実施例0043】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0044】

試験例１
［筋損傷モデル動物］
６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（雄、日本エスエルシー社製）を取得し、９週齢時に実験に供した。購入後８週齢まで普通食（ＣＥ２）で馴化し、９週齢からマウスを２群に分け、ケトン食（ＭＣＴ－ＫＤ）又は普通食（配合飼料ＡＩＮ９３Ｍ、リサーチダイエット社製、以降ノーマルダイエット；ＮＤともいう）を与えながら、１０週齢で筋損傷を惹起した。筋損傷を惹起では、イソフルラン麻酔下、両後肢の前脛骨筋に蛇毒カルジオトキシン（ＣＴＸ）１０μＭを１００μＬ投与した。ＣＴＸ投与により筋損傷を発生させたモデル動物は、筋損傷からの筋再生に関する研究で広く用いられている。

【0045】

ＭＣＴ－ＫＤ及びＮＤの組成を表１に示す。ＭＣＴ－ＫＤは、ペースト飼料（リサーチダイエット社製）に、ＭＣＴパウダー（Ｑｕｅｓｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ社製）を質量比で１．２１５倍、スクロース（リサーチダイエット社製）を０．０４３３倍、コーンスターチ（リサーチダイエット社製）を０．３４６６倍、カゼイン（オリエンタル酵母社製）を０．２６７倍混合し、ペレット化して調製した。

【0046】

【表1】

【0047】

ＭＣＴ－ＫＤ及びＮＤにおけるエネルギー源の質量比、カロリー比及びケトン比をそれぞれ表２に示す。

【0048】

【表2】

【0049】

ＣＴＸ投与後１日後、３日後、５日後、７日後及び１２日後に解剖により前脛骨筋を採取し、遺伝子発現量の解析及び筋組織切片の作製に供した。

【0050】

［筋組織切片の作製］
前脛骨筋の採取後直ちに、液体窒素で冷却したイソペンタンに浸して急速凍結した。クライオスタット（ライカバイオシステムズ社製）を用いて凍結筋組織を厚さ１０μｍに薄切し、スライドグラスに貼り付けた。

【0051】

［筋組織切片の免疫蛍光染色］
筋組織切片を、室温下で３０分間、十分に風乾させた。その後、筋組織切片を－２０℃に冷却したアセトンに浸し、－２０℃下で１０分間処理して固定した。固定化切片を風乾し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ブロッキング試薬（５％ウシ胎児血清，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ）を滴下し、ブロッキング処理を２０分間行った。

【0052】

次に、ブロッキング試薬で５００倍希釈した１次抗体（抗ラミニン抗体、ラビット宿主抗体（シグマアルドリッチ社製））を滴下し、室温で２時間反応させた。１次抗体が結合するラミニンはすべての筋細胞で発現するタンパク質であるので、本実験では、切片中の個々の筋細胞の面積を測定するために１次抗体を使用した。１次抗体と反応させた後の筋組織切片をＰＢＳで洗浄後、ブロッキング試薬で５００倍に希釈した２次抗体（Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｆ（ａｂ’）２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製））を１時間反応させた。蛍光色素がコンジュゲートした抗ラット抗体である２次抗体が１次抗体に結合して、ラミニンを染色する。２次抗体との反応後、筋組織切片をＰＢＳで洗浄し、筋細胞の中心核を染色するためにＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｈａｒｄ・Ｓｅｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を用いて封入し、倒立顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（キーエンス社製）で蛍光を観察した。

【0053】

［筋再生の評価］
蛍光の観察により取得した画像データに基づき筋再生を評価した。本試験では、中心核を持つ筋細胞（中心核を有する単一筋繊維）を再生筋の指標とした。画像データを画像解析ソフトＦｉｊｉに取り込んだ後、中心核を持つ筋細胞を抽出した。抽出された個々の細胞の断面積を、ラミニン染色された細胞膜に基づいて測定した。面積の測定には、Ｆｉｊｉの組み込み解析プログラムであるＡｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓを使用した。測定結果を、最小フェレ（Ｆｅｒｅｔ）径で表した。

【0054】

［遺伝子発現の評価］
解剖によりサンプリングした前脛骨筋から、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により遺伝子発現を評価した。凍結した前脛骨筋の筋を、マイクロスマッシュＭＳ－１００Ｒ（トミー精工社製）を用いて、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社製）で破砕し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡを除去し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ及びｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ社製）をそれぞれ用いてｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ（商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ ＩＩ（タカラバイオ社製）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）及び各遺伝子に対するフォワードプライマーとリバースプライマーとを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲの増幅条件は、９５℃で１０秒間に続いて、９５℃で５秒間、５７℃で１０秒間及び７２℃で１０秒間を１サイクルとしての４５サイクルである。筋損傷実験におけるリアルタイムＰＣＲの内部標準として一般的に用いられるＣｍａｓ遺伝子の発現量で、すべての遺伝子の発現量を正規化した。

【0055】

評価の対象とした遺伝子は、筋細胞分化のマスター遺伝子であるＭｙｏＤ１遺伝子、炎症性サイトカインであるＴＮＦα遺伝子、マクロファージ等のマーカーであるＣＤ１１ｃ遺伝子及び好中球等のマーカーであるＮｃｆ１遺伝子である。Ｃｍａｓ遺伝子に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。ＭｙｏＤ１遺伝子に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。ＴＮＦα遺伝子に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。ＣＤ１１ｃ遺伝子に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号７及び８に示す。Ｎｃｆ１遺伝子に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。

【0056】

（結果）
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、それぞれＮＤ及びＭＣＴ－ＫＤを与えたマウスの筋損傷後１２日目の筋組織切片の免疫蛍光染色画像を示す。図２は図１に示す画像に基づいて測定した最小フェレ径を示す。なお、ＮＤがｎ＝３、ＭＣＴ－ＫＤがｎ＝４である。ＭＣＴ－ＫＤはＣＴＸ投与により損傷した筋繊維径の増大、すなわち筋再生を促進することが示された（ｐ＝０．０３）。

【0057】

図３、図４、図５及び図６は、それぞれＭｙｏＤ１遺伝子、ＴＮＦα遺伝子、ＣＤ１１ｃ遺伝子及びＮｃｆ１遺伝子の相対的発現量を示す。なお、図３～６においてＮＤがｎ＝３、ＭＣＴ－ＫＤがｎ＝４である。図３に示すように、ＭｙｏＤ１遺伝子の発現は、損傷後１日目においてＮＤよりもＭＣＴ－ＫＤのほうが高かった。これは、ＭＣＴ－ＫＤが筋細胞分化を損傷後より早期から促進することを示している。

【0058】

図４に示すように、ＭＣＴ－ＫＤによって、ＴＮＦα遺伝子の発現が低下していることから、損傷後の炎症が抑制されていることが示唆された。図５によれば、ＭＣＴ－ＫＤによってＣＤ１１ｃ遺伝子の発現が低下していることから、損傷後の炎症が抑制されていることが示唆された。図６より、ＭＣＴ－ＫＤによって、Ｎｃｆ１遺伝子の発現が低下していることから、損傷後の炎症が抑制されていることが示唆された。

【0059】

以上のことから、ＭＣＴ－ＫＤにより、筋損傷後の炎症が早期に抑えられ、筋衛星細胞の活性化が促進され、筋繊維径が増大することがわかった。

【0060】

試験例２
試験例１で示された筋損傷に対するＭＣＴ－ＫＤの効果はケトン体を介すると考えられる。そこで、ＭＣＴ－ＫＤによるケトン体の血中濃度の変化について検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢オス）に、ＭＣＴ－ＫＤ又はＮＤを各群２週間給餌後（自由摂餌）、８週齢にてテールカット法により数滴の血液を採取した。プレシジョンエクシードを使用して６時間ごとに血中ケトン体濃度を測定した（ＭＣＴ－ＫＤがｎ＝８、ＮＤがｎ＝８）。

【0061】

（結果）
図７に示すように、ケトン体の血中濃度はＭＣＴ－ＫＤ摂取群において、活動期の初期にピークとなる顕著な日内リズムが観察された（ｐ＜０．０５）。一方、ＭＣＴ－ＫＤ摂取群のケトン体血中濃度は、睡眠時間帯においては対照群と同レベルにまで低下していることが分かった。このことは、１日の中で特定の時間帯にＭＣＴ－ＫＤを摂取するだけで、十分な効果が期待できることを示している。

【0062】

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【産業上の利用可能性】

【0063】

本発明は、筋損傷の治療に好適である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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