特開 2023-66094 再建組織の障害の予防又は治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023066094

(43)【公開日】2023-05-15

(54)【発明の名称】再建組織の障害の予防又は治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 33/00 20060101AFI20230508BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20230508BHJP

【ＦＩ】

A61K33/00

A61P9/00

A61P43/00 105

A61K9/14

A61K47/04

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021176604

(22)【出願日】2021-10-28

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人科学技術振興機構 研究成果展開事業 センター・オブ・イノベーションプログラム「乳幼児からの健やかな脳の育成による積極的自立社会創成拠点」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100163544

【弁理士】

【氏名又は名称】平田 緑

(72)【発明者】

【氏名】大谷 直矢

(72)【発明者】

【氏名】冨田 興一

(72)【発明者】

【氏名】久保 盾貴

(72)【発明者】

【氏名】小林 光

(72)【発明者】

【氏名】小林 悠輝

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076BB01

4C076CC11

4C076CC26

4C076DD29H

4C076FF70

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA06

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA43

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZB21

(57)【要約】      （修正有）

【課題】再建手術後に再建組織に生じる障害を予防又は治療するための医薬を提供することを課題とする。
【解決手段】シリコン微粒子を、経口投与又は皮膚もしくは粘膜上に留置することにより、再建手術後に再建組織に生じる障害を予防又は治療することができる。例えば、手術後における移植又は再接着した組織の壊死を予防又は治療することができる。前記シリコン微粒子は、ｐＨ７以上の水溶液に接触すると水素を発生するシリコン単体を含有する微粒子である。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

シリコン微粒子を含有する、再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤。

【請求項2】

前記障害が壊死である、請求項１に記載の予防又は治療剤。

【請求項3】

前記壊死が、虚血再灌流による壊死である、請求項２に記載の予防又は治療剤。

【請求項4】

前記障害が、虚血再灌流障害である、請求項１に記載の予防又は治療剤。

【請求項5】

前記再建手術が、遊離組織移植又は再接着である、請求項１～４のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項6】

前記再建手術の周術期に投与が開始される請求項１～５のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項7】

前記シリコン微粒子が、水と接して水素を発生し得るシリコン単体を含有する微粒子である、請求項１～６のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項8】

前記シリコン微粒子が、酸化シリコン膜が表面に形成されているシリコン微粒子である、請求項１～７のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項9】

前記シリコン微粒子が、シリコン微細粒子及び／又は該シリコン微細粒子の凝集体である、請求項１～８のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項10】

前記シリコン微粒子が多孔質シリコン粒子である、請求項1～８のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項11】

前記シリコン微粒子が、親水化処理されたシリコン微粒子である、請求項１～１０のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【請求項12】

経口投与用である、請求項１～１１のいずれか１に記載の予防又は治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、再建手術後の障害の予防又は治療に関する。

【背景技術】

【0002】

癌や外傷等により生じた身体欠損の再建のために、軟部組織の遊離移植術は、欠かすことのできない手技である。また、事故等により切断された組織の再建のために、血管吻合を行って血行を再建し生着させる再接着手術も、欠かすことのできない手技である。これら手術においては移植組織及び切断された組織が虚血環境に晒されることは避けられない。一定時間虚血状態に置かれた組織が血行の再灌流を受けた場合、酸化ストレス、炎症及びアポトーシスによる組織障害が引き起こされることが知られている。組織移植術や再接着を成功させるにはこの虚血再灌流障害を抑制することが重要である。これまでに抗炎症作用や抗アポトーシス効果を有する薬剤の使用や手術手技など様々な研究が行われている。

【0003】

水素は、ヒドロキシラジカルなどの酸化力の強い活性酸素と反応することで、組織の酸化ストレスを軽減する効果を有する。近年、水素の医療応用へ向けた研究が多数行われており、形成外科分野でも、水素による組織の虚血再灌流障害の抑制効果を示す研究が報告されている(非特許文献１－３)。これまでの研究では、水素の体内への投与方法は水素水の投与や水素ガスの吸入が主であった。しかし、水素はそもそも常温で水に溶けにくく、揮発しやすい気体であるため、水素水による水素の体内への取り込み量には限界がある。また、水素ガスの吸入も、長時間継続的に吸入し続けることは現実的に困難であり、高濃度の水素は可燃性を有することなどの安全性の問題などがある

【0004】

シリコン微粒子は水と接して水素を発生することができる。ｐＨが５未満の酸性水溶液との接触ではこの反応はほとんど進行せず、ｐＨ７以上の水溶液に接したときは、反応が進行し、ｐＨ８以上で反応がより速く進行する。また、シリコン微粒子を表面処理することにより、上記反応が好適に進む。さらに、シリコン微粒子は水溶液と接触している間、持続的に２０時間以上にわたり水素を発生し続け、条件によっては、シリコン微粒子１ｇで水素を４００ｍｌ以上発生する（特許文献１、特許文献２）。水素４００ｍｌは飽和水素水２２リットルに含まれる水素に相当する。

【0005】

腎臓疾患、炎症性疾患（炎症性腸疾患、関節炎、肝炎、皮膚炎）、内臓不快感、うつ病又はうつ状態、パーキンソン病、自閉スペクトラム症、記憶障害、脊髄損傷、難聴、脳虚血再灌流障害、糖尿病及び二日酔いについて、シリコン微粒子のこれら疾患の予防又は治療に係る発明を本出願人は特許出願した（特許文献３－１７）。また、シリコン微粒子は腎臓の虚血再灌流障害を軽減する（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１６－１５５１１８号公報

【特許文献2】特開２０１７－１０４８４８号公報

【特許文献3】国際公開２０１９／０２１７６９号公報

【特許文献4】国際公開２０１９／２３５５７７号公報

【特許文献5】特開２０１９‐２１４５５６号公報

【特許文献6】特開２０２０‐００７３００号公報

【特許文献7】特開２０２０－０７９２２８号公報

【特許文献8】特開２０２０－０７９２４０号公報

【特許文献9】特開２０２０－１１７４８０号公報

【特許文献10】特開２０２０－１１７４８１号公報

【特許文献11】特開２０２０－１１７４８２号公報

【特許文献12】特開２０２０－１１７４８３号公報

【特許文献13】特開２０２０－１１７４８４号公報

【特許文献14】特開２０２０－１１７４８５号公報

【特許文献15】特開２０２０－１１７４８６号公報

【特許文献16】特開２０２０－２００３０２号公報

【特許文献17】国際公開２０２０／１５２９８５号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Zhao L, Wang YB, Qin SR, et al. J Zhejiang Univ Sci B. 2013;14:382-391.

【非特許文献2】Liu YQ, Liu YF, Ma XM, et al. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2015;68:e147-156.

【非特許文献3】Dong XH, Liu H, Zhang MZ, et al. Am J Transl Res. 2019;11:499-508.

【非特許文献4】Kawamura M, Imamura R, et al. Front Med (Lausanne). 2020 Mar 20;7:95.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、再建手術後に再建組織に発症する障害を予防又は治療するための医薬を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

１．シリコン微粒子を含有する、再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤。２．前記障害が壊死である、前項１に記載の予防又は治療剤。３．前記壊死が、虚血再灌流による壊死である、前項２に記載の予防又は治療剤。４．前記障害が、虚血再灌流障害である、前項１に記載の予防又は治療剤。５．前記再建手術が、遊離組織移植又は再接着である、前項１～４のいずれか１に記載の予防又は治療剤。６．前記再建手術の周術期に投与が開始される前項１～５のいずれか１に記載の予防又は治療剤。７．前記シリコン微粒子が、水と接して水素を発生し得るシリコン単体を含有する微粒子である、前項１～６のいずれか１に記載の予防又は治療剤。８．前記シリコン微粒子が、酸化シリコン膜が表面に形成されているシリコン微粒子である、前項１～７のいずれか１に記載の予防又は治療剤。９．前記シリコン微粒子が、シリコン微細粒子及び／又は該シリコン微細粒子の凝集体である、前項１～８のいずれか１に記載の予防又は治療剤。１０．前記シリコン微粒子が多孔質シリコン粒子である、前項1～８のいずれか１に記載の予防又は治療剤。１１．前記シリコン微粒子が、親水化処理されたシリコン微粒子である、前項１～１０のいずれか１に記載の予防又は治療剤。１２．経口投与用である、前項１～１１のいずれか１に記載の予防又は治療剤。１３．シリコン微粒子を含有する再建手術後の再建組織の障害を予防又は治療するための組成物。１４．シリコン微粒子を投与することを含む再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療方法。１５．シリコン微粒子を含有する、再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療に使用するための剤。１６．再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤の調製のためのシリコン微粒子の使用。

【発明の効果】

【0010】

本発明の予防又は治療剤は、再建手術後の障害を予防及び治療することができる。本発明の予防又は治療剤は、再建手術後の再建組織の壊死を好適に予防及び治療することができる。再建組織の全体又は一部が壊死した場合は、整容的及び機能的な障害が避けられず、再手術を要することもあり、患者には身体的・精神的に大きな負担になり、追加治療のための経済的負担も発生する。本発明は、手術手技単独では完全に回避することができないこれらの障害・負担を軽減させ得るため、その技術的効果及び経済的効果の恩恵は大きい。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影された、シリコン微粒子（シリコン結晶子及びその凝集体の混合物）の写真である（実施例２）。

【図2】図２は、実施例２で得られたシリコン微粒子を３６℃、ｐＨ８．２の水に接触させることによって発生したシリコン微粒子１ｇあたりの水素量（累積量）を示すグラフである。

【図3】図３は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影された、シリコン微粒子（シリコン結晶子の凝集体）の写真である（実施例３）。

【図4】図４は、ラットモデルの手術手順を示す写真である。Ａ：ラットの腹部に７×５ｃｍの長方形の皮弁（移植組織）をデザインした。Ｂ：再建手術群（虚血灌流群、Ｉ／Ｒ群）及び再建手術＋シリコン微粒子投与群（虚血灌流＋Ｓｉ群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉ群）では、皮弁の血流を維持する動静脈を血管クリップで３時間閉塞した。Ｃ：皮弁と下床組織の間にシリコンシートを置いた後、皮弁を元の位置に再縫合した。

【図5】図５は、術後７２時間の皮弁の画像である。Ｉ／Ｒは再建手術群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉは再建手術＋シリコン微粒子投与群を示す。（上段）各群の代表的写真を示す。（中段）レーザースペックル血流イメージングシステムによる代表的画像を示す。実線は元の皮弁領域、破線は生存領域（Ｓ）と壊死領域（Ｎ）の境界を示す。（下段）レーザースペックル血流計測システムによる代表的血流画像を示す。血流量が少ない箇所は青紫、血流量が多くなるにつれて水色、黄緑、黄色、オレンジ色で示されている。グレースケール画像では、青紫が濃い灰色、水色から黄緑が薄い灰色、黄色からオレンジ色が白で示されている。

【図6】図６は、術後７２時間の皮弁生存率と皮弁の生存領域の血流量を示す。Ｉ／Ｒは再建手術群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉは再建手術＋シリコン微粒子投与群を示す。Ａ：皮弁生存率を示す。シリコン微粒子投与により再建手術後の皮弁生存率が有意に上昇した。Ｂ：皮弁の生存領域の血流量を示す。再建手術後の皮弁の血流量は、シリコン微粒子投与により上昇する傾向が見られた。＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１；Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ多重比較検定、バーは平均の標準誤差を表す。

【図7】図７は、術後７２時間の皮弁組織のＨＥ染色解析結果を示す。Ｉ／Ｒは再建手術群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉは再建手術＋シリコン微粒子投与群を示す。Ａ：上段は、各群の皮弁組織の表層部の代表的画像を示す（スケールバー：１００μｍ）。下段は、各群の皮弁組織深層部の代表的画像を示す（スケールバー：１００μｍ）。再建手術群では、炎症細胞の浸潤、充血、血管内微小血栓が高度であった。Ｂ：組織損傷解析結果（組織損傷スコア）を示す。再建手術＋シリコン微粒子投与群の組織損傷スコアは再建手術群のスコアに比べて有意に低かった。シリコン微粒子投与により再建手術後の組織損傷が軽減された。＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１；Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ多重比較検定、バーは平均の標準誤差を表す。

【図8】図８は、術後７２時間の皮弁組織のＴＵＮＥＬ染色解析結果を示す。Ｉ／Ｒは再建手術群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉは再建手術＋シリコン微粒子投与群を示す。Ａ：各群の皮弁組織真皮内の代表的画像を示す（スケールバー：２０μｍ）。青色（ＤＡＰＩ）のバックグラウンド中に、ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞が緑色の蛍光で検出された。Ｂ：ＴＵＮＥＬ陽性細胞（アポトーシス細胞）の割合を示す。再建手術＋シリコン微粒子投与群のＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合は、再建手術群に比べて有意に低かった。再建手術によりＴＵＮＥＬ陽性細胞が大きく増加したが、シリコン微粒子投与はＴＵＮＥＬ陽性細胞の増加を抑制した。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１；Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ多重比較検定、バーは平均の標準誤差を表す。

【図9】図９は、術後７２時間の皮弁組織の酸化ストレス測定結果を示す。Ｉ／Ｒは再建手術群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉは再建手術＋シリコン微粒子投与群を示す。再建手術＋シリコン微粒子投与群の皮弁組織内のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルは、再建手術群に比べて有意に低下した。再建手術により増大した酸化ストレスはシリコン微粒子投与により軽減された。＊ｐ＜０．０５；Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ多重比較検定、バーは平均の標準誤差を表す。

【図10】図１０は、術後７２時間の皮弁組織の炎症性サイトカインの測定結果を示す。Ｉ／Ｒは再建手術群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉは再建手術＋シリコン微粒子投与群を示す。Ａ：ＩＬ－１βの相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。Ｂ：ＩＬ－６の相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。Ｃ：ＴＮＦ－αの相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。再建手術＋シリコン微粒子投与群の皮弁組織におけるＩＬ－１β及びＴＮＦ－αの相対的ｍＲＮＡ発現量は、再建手術群に比べて有意に減少した。再建手術によりＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの発現は増加した。シリコン微粒子投与によりＩＬ－１β及びＴＮＦ－α発現量の増加は抑制され、ＩＬ－６の発現量の増加は抑制される傾向が見られた。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１；Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ多重比較検定、バーは平均の標準誤差を表す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の予防又は治療剤に含まれるシリコン微粒子は、シリコン単体を含有する微粒子であって、水に接して水素を発生し得る。

【0013】

前記の「水に接して水素を発生し得るシリコン単体を含有する微粒子（水素発生能を有するシリコン単体を含有する微粒子）」とは、３６℃、ｐＨ８．２の水溶液に接したときに、持続的に水素を発生し、２４時間でシリコン微粒子１グラムあたり１０ｍｌ以上の水素を発生することができるシリコン微粒子を意味する。好ましくは、２０ｍｌ以上、４０ｍｌ以上、８０ｍｌ以上、１５０ｍｌ以上、２００ｍｌ以上、３００ｍｌ以上である。

【0014】

前記シリコン単体とは、高純度シリコンである。本明細書において、高純度シリコンとは、シリコンの純度が９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．５％以上、より好ましくは９９．９％以上、より好ましくは９９．９９％以上、さらに好ましくは９９．９９９％以上のシリコンである。

【0015】

本発明の予防又は治療剤に含まれるシリコン微粒子は、好ましくはシリコン微細粒子、該シリコン微細粒子の凝集体、及び／又は、多孔質シリコン粒子（ポーラスシリコン粒子）である。

【0016】

本発明の予防又は治療剤の有効成分は、好ましくは、シリコン微細粒子、該シリコン微細粒子の凝集体、及び、多孔質シリコン粒子からなる群から選択される少なくとも１種の粒子である。すなわち、好ましい有効成分としては、シリコン微細粒子単独でもよく、シリコン微細粒子の凝集体単独でもよく、多孔質シリコン粒子単独でもよい。また有効成分として２種以上のシリコン微粒子を含んでいてもよい。本発明の予防剤又は治療剤は、好ましくは、シリコン微細粒子及び／又は該シリコン微細粒子の凝集体を含有する。より好ましくは、シリコン微細粒子の凝集体を主成分とする。

【0017】

シリコン単体は、大気に曝露した場合、表面が酸化され酸化シリコン膜が生成する。本発明におけるシリコン微粒子は、好ましくは表面に酸化シリコン膜が形成されている微粒子である。本発明における好ましいシリコン微粒子は、表面に酸化シリコン膜が形成されているシリコン単体からなる微細粒子、表面に酸化シリコン膜が形成されているシリコン単体からなる微細粒子の凝集体、及び表面に酸化シリコン膜が形成されている多孔質のシリコン単体からなる粒子、からなる群から選択される少なくとも１種の粒子である。

【0018】

シリコン微粒子中のシリコンの含有量は、好ましくは１０重量％以上、さらに好ましくは２０％重量以上、さらに好ましくは５０％重量以上、最も好ましくは７０重量％以上である。

【0019】

前記酸化シリコン膜は、好ましくは、水酸基（‐ＯＨ基）が付加された酸化シリコン膜である。水酸基が付加された酸化シリコン膜とは、酸化シリコン膜が有する水酸基の数を増加させる処理がなされた酸化シリコン膜である。例えば、親水化処理により水酸基を酸化シリコン膜に付加することができる。水酸基が付加された酸化シリコン膜が形成されたシリコン微粒子は、表面と水の接触効率がよくなり、水素発生反応が促進され、多くの水素を発生することができる。親水化処理の方法は、特に限定されず、公知の親水化処理方法を用いればよい。例えば、過酸化水素水処理、硝酸処理が挙げられる。好ましくは過酸化水素水処理である。過酸化水素水処理により、粒子表面の酸化シリコン膜のＳｉＨ基の水素を除去して水酸基を粒子表面に付加することができる。

【0020】

前記水酸基が付加された酸化シリコン膜が表面に形成されているシリコン微粒子は、好ましくは表面に５×１０^１３／ｃｍ^２以上の水酸基を有する。さらに好ましくは１×１０^１４／ｃｍ^２以上の水酸基を有する。さらに好ましくは３×１０^１４／ｃｍ^２以上の水酸基を有する。該粒子表面とは、シリコン微細粒子の表面、多孔質シリコン粒子の表面、シリコン微細粒子の凝集体の表面及び凝集体を形成するシリコン微細粒子の表面である。

【0021】

過酸化水素水処理の具体的方法は、例えば、シリコン微粒子を過酸化水素水中に浸漬して撹拌する。過酸化水素の濃度は１～３０％が好ましく、より好ましくは１．５～２０％であり、さらに好ましくは２～１５％、２．５～１０％、最も好ましくは３～５％である。浸漬して撹拌する時間は、５～９０分が好ましく、より好ましくは１０～８０分、さらに好ましくは、２０～７０分である。最も好ましくは３０～６０分である。過酸化水素水で処理することによりシリコン微粒子の親水性を向上させることができるが、処理時間が長くなるとシリコン微粒子からの水素発生反応が進行してシリコン微粒子の酸化膜の厚みが増加する。過酸化水素水処理時の過酸化水素水の温度は２０～６０℃が好ましく、より好ましくは、２５～５０℃、より好ましくは３０～４０℃、最も好ましくは３５℃である。

【0022】

シリコン微粒子の形に制限はない。不定形、多角形、球、楕円形、円柱状等が挙げられる。

【0023】

前記シリコン微粒子は、結晶性を有する結晶シリコン微粒子であり得る。また、結晶性を有しないアモルファスシリコン微粒子であり得る。結晶性を有している場合、単結晶でも多結晶でもよい。好ましくは、結晶シリコン微粒子であり、より好ましくは単結晶シリコン微粒子である。

【0024】

前記アモルファスシリコン微粒子は、プラズマＣＶＤ法やレーザーアブレーション法等で形成されるアモルファスシリコン微粒子であり得る。

【0025】

本発明におけるシリコン微粒子の表面に形成される前記酸化シリコン膜は、大気に曝され自然に酸化されて形成された酸化シリコン膜であり得る。また、硝酸等の酸化剤による化学酸化等の公知の方法により、人為的に形成された酸化シリコン膜であり得る。

【0026】

前記酸化シリコン膜の厚さは、シリコン単体からなる微粒子が安定し、効率的な水素発生を可能にする厚さであればよい。例えば０．３ｎｍ～５ｎｍ、０．３ｎｍ～３ｎｍ、０．５ｎｍ～２．５ｎｍ、０．７ｎｍ～２ｎｍ、０．８ｎｍ～１．８ｎｍ、１．０ｎｍ～１．７ｎｍである。酸化シリコン膜は、シリコン単体からなる微粒子の表面のシリコンが酸素と結合して生じるＳｉ_２Ｏ、ＳｉＯ、Ｓｉ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２等の酸化物を含む膜であり得る。Ｓｉ_２Ｏ、ＳｉＯ、Ｓｉ_２Ｏ_３等の不完全にシリコンが酸化された酸化物は水素発生反応を促進する。

【0027】

前記シリコン微細粒子は、結晶性を有する結晶シリコン微細粒子であり得る。また、結晶性を有しないアモルファスシリコン微細粒子であり得る。結晶性を有している場合、単結晶でも多結晶でもよい。好ましいシリコン微細粒子は、結晶シリコン微細粒子であり、より好ましくは単結晶シリコン微細粒子（以下、シリコン結晶子ともいう）である。

【0028】

本発明におけるシリコン微細粒子は、シリコン微細粒子が製造された後に自然に又は人為的に酸化シリコン膜が形成されたシリコン微細粒子であり得る。より好ましいシリコン微細粒子は、シリコン結晶子の表面に酸化シリコン膜が形成されている微細粒子である。

【0029】

本発明におけるシリコン微細粒子は、シリコン単体（高純度シリコン）の塊が粉砕された粒子又はシリコン単体の粒子が粉砕された粒子であり得る。シリコン単体の塊もしくは粒子が粉砕されてシリコン微細粒子が製造されると、そのシリコン微細粒子の表面が自然酸化されて酸化シリコン膜が形成される。

【0030】

本発明におけるシリコン微細粒子の粒子径（微細粒子がシリコン結晶子である場合は結晶子径）は、好ましくは、０．５ｎｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１ｎｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは１．５ｎｍ以上１０μｍ以下、より好ましくは、２ｎｍ以上５μｍ以下、より好ましくは、２．５ｎｍ以上１μｍ以下、５ｎｍ以上５００ｎｍ以下、７．５ｎｍ以上２００ｎｍ以下、１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。粒子径が５００ｎｍ以下であれば、好適な水素の発生速度及び水素発生量が得られ、２００ｎｍ以下であればさらに好適な水素の発生速度及び水素発生量が得られる。

【0031】

本発明におけるシリコン微細粒子の凝集体は、前記シリコン微細粒子の凝集体である。自然に形成されたものでも、人為的に形成されたものでもよい。好ましくは、酸化シリコン膜が形成されたシリコン微細粒子が凝集した凝集体である。自然に形成された凝集体は、消化管内で凝集したままであると考えられる。好ましい凝集体は、内部に空隙を有し水分子が凝集体に浸入して内部の微細粒子と反応できる構造を有する。自然に形成された凝集体の水素発生速度は、凝集体サイズに依存しないことより、該凝集体は、内部に空隙を有し水分子が凝集体に浸入して内部の微細粒子と反応できる構造を有する。

【0032】

シリコン微細粒子の凝集体の大きさに特に制限はない。好ましいシリコン微細粒子の凝集体の粒子径は、５０ｎｍ以上５００μｍ以下である。

【0033】

本発明におけるシリコン微細粒子の凝集体を構成するシリコン微細粒子の粒子径は、好ましくは、０．５ｎｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１ｎｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは１．５ｎｍ以上１０μｍ以下、より好ましくは、２ｎｍ以上５μｍ以下、より好ましくは、２．５ｎｍ以上１μｍ以下、５ｎｍ以上５００ｎｍ以下、７．５ｎｍ以上２００ｎｍ以下、１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。シリコン凝集体を構成するシリコン微細粒子は、結晶シリコン微細粒子であってもアモルファスシリコン微細粒子であってもよい。好ましい凝集体は、結晶子径１ｎｍ以上１０μｍ以下のシリコン結晶子の凝集体である。好ましくは、表面に酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子が凝集した凝集体である。

【0034】

本発明の予防又は治療剤は、好ましくは結晶子径１ｎｍ～１μｍ、より好ましくは結晶子径１ｎｍ以上１００ｎｍ以下のシリコン結晶子であって、その表面に酸化シリコン膜が形成されている
結晶子、及び／又はその凝集体を含有する。好ましくは、表面に酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子の凝集体を主成分として含有する。

【0035】

本発明の予防又は治療剤は、好ましくは結晶子径１ｎｍ～１μｍ、より好ましくは結晶子径１ｎｍ以上１００ｎｍ以下のシリコン結晶子であって、その表面に水酸基が付加された酸化シリコン膜が形成されている結晶子、及び／又はその凝集体を含有する。好ましくは、表面に水酸基が付加された酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子の凝集体を主成分として含有する。

【0036】

多孔質シリコン粒子（ポーラスシリコン粒子）は、シリコン粒子の多孔質体であり得る。またシリコン微細粒子が凝集され加工された多孔質体であってもよい。前記多孔質シリコン粒子は、好ましくは、多孔質のシリコン単体からなる粒子であって、表面に酸化シリコン膜が形成されている粒子である。より好ましくは、該酸化シリコン膜は水酸基が付加された酸化シリコン膜である。

【0037】

前記多孔質シリコン粒子は、結晶性を有する多孔質シリコン粒子であり得る。また、結晶性を有しないアモルファス多孔質シリコン粒子であり得る。結晶性を有している場合、単結晶でも、多結晶でもよい。

【0038】

多孔質シリコン粒子に存在する空隙の大きさに制限はないが、通常は０．３ｎｍ～１μｍであり得、好ましくは、０．５ｎｍ～０．１μｍであり得る。多孔質シリコン粒子は高い水素発生能を実現するために十分な表面積を有する。多孔質シリコン粒子は凝集して凝集体を形成していてもよい。多孔質シリコン粒子及び多孔質シリコン粒子の凝集体の大きさに特に制限はない。その大きさは、好ましくは２００ｎｍ～４００μｍであり得る。

【0039】

シリコン微細粒子の凝集体及び多孔質シリコン粒子は、全体としての粒子径が大きく、かつ表面積が大きい粒子であるため、経口投与用には好適な粒子である。粒子が大きければ消化管、特に腸管の細胞膜及び細胞間を通過せず、体内にシリコン微粒子が吸収されず安全性の観点から優れている。

【0040】

本発明の予防又は治療剤に含まれるシリコン微細粒子の粒子サイズ分布、シリコン単体からなる微細粒子の粒子サイズ分布もしくは結晶子サイズ分布に特に制限はない。多分散であってもよい。特定範囲の粒子サイズもしくは結晶子サイズを持つシリコン微細粒子を含有する製剤であってもよい。また、シリコン微細粒子の凝集体のサイズ分布に特に制限はない。

【0041】

水素の発生速度は、シリコン微粒子の粒子径、粒度分布及び／又は酸化シリコン膜の膜厚により調整することができる。

【0042】

本発明のシリコン微粒子の製造方法に特に制限はないが、シリコン含有粒子を目的とする粒子径まで物理的に粉砕することによって製造することができる。物理的粉砕法の好適な例は、ビーズミル粉砕法、遊星ボールミル粉砕法、衝撃波粉砕法、高圧衝突法、ジェットミル粉砕法、又はこれらを２種以上組み合わせた粉砕法である。また、公知の化学的方法を採用することも可能である。製造コスト又は、製造管理の容易性の観点から、好適な粉砕法は、物理的粉砕法である。シリコン単体の微細粒子からなる微粒子は、大気に曝露することにより、表面が酸化され酸化シリコン膜が形成される。また、粉砕した後に過酸化水素水や硝酸等の酸化剤による化学酸化等の公知の方法により、人為的に酸化シリコン膜を形成させてもよい。

【0043】

シリコン含有粒子をビーズミル装置を用いて目的とする粒子径にまで粉砕して製造する場合、適宜、ビーズの大きさ及び／又は種類を変えることにより、目的とする粒子の大きさ又は粒度分布を得ることができる。

【0044】

出発材料のシリコン含有粒子は、高純度シリコン粒子であれば制限はない。例えば、市販の高純度シリコン粒子粉末が挙げられる。出発材料のシリコン含有粒子は単結晶でも多結晶でも、アモルファスでもよい。

【0045】

本願は、シリコン微粒子を含有する再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤に係る発明、シリコン微粒子を含有する再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療のための組成物に係る発明、シリコン微粒子を投与することを含む再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療方法に係る発明、シリコン微粒子を含有する再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療に使用するための剤に係る発明、及び、再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤の調製のためのシリコン微粒子の使用に係る発明等を含む。本願明細書におけるシリコン微粒子を含有する再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤に係る発明の説明及び実施形態等は、これら全ての発明の説明及び実施形態等である。

【0046】

本発明の再建手術後の再建組織の障害の予防又は治療剤には、再建手術後の再建組織の障害を予防する剤、再建手術後の再建組織の障害を治療する剤、及び再建手術後の再建組織の障害を予防及び治療する剤が含まれる。

【0047】

本発明における再建手術とは、がんの手術、外傷及び先天性異常等の様々な原因により生じた組織欠損、機能障害又は変形などに対して行う外科的治療である。本発明における再建手術には、遊離組織移植及び再接着等の手術が含まれる。

【0048】

本発明における遊離組織移植は、自己の身体の他の部位の組織又は他人の組織を移植する手術である。具体的には、皮膚、皮下脂肪、筋肉、骨、神経、リンパ組織及び腸管等が、採取部で切り離され、再建部位に移植される。移植組織の血管は採取部の組織より切り離されて、再建部位で血管吻合される。本発明において好ましい遊離組織移植は、自己の身体の他の部位からの移植である。また、本発明において好ましい遊離組織としては、皮下脂肪、筋肉、皮膚、及び骨が挙げられ、特に好ましい遊離組織としては、皮下脂肪及び筋肉が挙げられる。本明細書において、移植組織を皮弁ともいう。

【0049】

本発明における再接着は、完全切断又は不全切断された組織の再接着手術である。血行がない又は極めて乏しい状態の組織の血管の吻合及び骨や神経等の接合が行われる。本発明の予防治療剤は、完全切断又は不全切断された指又は手の再接着後の障害を好適に予防又は治療することができる。

【0050】

本発明における再建手術後は、再建手術終了後から手術後半年までであり、好ましくは、再建手術終了後から手術後３ヶ月であり、より好ましくは、再建手術終了後から手術後１ヶ月であり、さらに好ましくは、再建手術終了後から手術後２週間であり、さらに好ましくは、再建手術終了後から手術後１週間であり、さらに好ましくは、手術直後から手術後３日であり得る。

【0051】

本発明の予防又は治療剤は、再建手術後における再建組織の障害の発症の予防、症状の軽減、症状の改善、症状の増悪の抑制、症状の早期回復等の効果を奏する。

【0052】

本発明における再建手術後の再建組織の障害は、再建手術後に再建された組織に発症する障害であり、壊死、虚血再灌流障害、炎症、アポトーシスの亢進、再建組織の機能障害、変形、及び萎縮等が挙げられる。

【0053】

本発明の予防又は治療剤は、再建手術後の再建組織の壊死の予防及び治療に好適に用いられ得る。本発明の予防治療剤は、再建組織の生存率を向上させ、壊死を抑制する。後述の試験例に示すように、ラットを用いた遊離組織移植モデルにおける移植組織（皮弁）では、本発明の予防又は治療剤を投与した場合は、投与しない場合と比較して、生存率は上昇し、壊死する領域を半分以下に抑えることができる。移植組織又は再接着組織の全部又は一部が壊死した場合は、整容的及び機能的な障害が避けられず、再手術を要することもあり、再建手術において壊死を抑制し生存率を向上させることは非常に重要である。本発明における再建組織の壊死は、虚血再灌流を原因とする壊死と、それ以外を原因とする壊死（例えば、採取時、保存時、移植時又は再接着時に生じる血流不全等による壊死）が含まれる。本発明の予防又は治療剤は、虚血再灌流による壊死の予防及び治療に好適に用いられ得る。

【0054】

本発明の予防又は治療剤は、再建手術後の虚血再灌流障害の予防及び治療に好適に用いられ得る。再建手術においては、遊離された組織や切断された組織が虚血環境に晒されることは避けられず、一定時間虚血状態に置かれた組織が血液の再灌流を受けた場合、酸化ストレス、炎症及びアポトーシスによる組織障害が引き起こされることが知られている。よって、再建手術後に再建組織の状態を良好に保つためには、虚血再灌流障害を抑制することが重要である。再建手術後の虚血再灌流障害としては、炎症、アポトーシスの亢進、組織障害、壊死、変形、萎縮が挙げられる。

【0055】

本発明におけるシリコン微粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、長時間（２０時間以上）にわたり水素を発生し続ける性質を持つ。本発明のシリコン微粒子はｐＨ７以上の水溶液と接触すると水素を発生し、ｐＨ８以上でより多くの水素を発生する。一方、ｐＨ５以下では水素をほとんど発生しない性質を有する。

【0056】

本発明におけるシリコン微粒子を経口投与した場合には、上記のような性質により、胃では水素をほとんど発生しないと考えらえるが、腸内で水素を発生する。正常マウスに本発明におけるシリコン微粒子を投与すると大腸の一部である盲腸において水素発生が確認され、同条件で正常マウスに通常食を与えても、水素は検出限界以下であった。腸内の食物の滞留時間は、通常ヒトでは２０時間以上であることより、本発明の予防又は治療剤は、経口投与されることにより腸内で長時間にわたって水素を発生し続け、体内に水素を配給することができると考えられる。

【0057】

また皮膚又は粘膜上にシリコン微粒子を長時間留置することにより経皮又は経粘膜で体内に水素を長時間にわたって配給することができると考えられる。

【0058】

また、本発明の予防又は治療剤は、水素水のように投与前に水素が拡散してしまうことがない。この性質は医薬品等の製品の品質保持に貢献し、製造者、販売者及び利用者の利便性に貢献する。

【0059】

ラットに本発明に係るシリコン微粒子を投与した後に、血漿の抗酸化力を評価（ＢＡＰテスト）したところ、シリコン微粒子投与群で抗酸化力が有意に高くなったことが、本発明者等の研究により確認されている（ＷＯ２０１９／２３５５７７）。

【0060】

酸化ストレス軽減作用については、酸化ストレスが関与する疾患モデル動物を用いた研究において水素水と比較して顕著な効果を示す（ＷＯ２０１９／２３５５７７）ことが本発明者等の研究により確認されている。よって、水素水にはない別の作用があることが考えられる。シリコン微粒子投与マウスと非投与マウスの大腸組織を比較すると、シリコン微粒子投与マウスの大腸には、生体内で抗酸化作用に関わるグルタチオンモノスルフィドやシステインモノスルフィドなどが多く含まれていた。これはシリコン微粒子の特有の作用である可能性がある（特開２０２０－１１７４８１、ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０１６１７６）。また、他の機序として、例えば、シリコン微粒子と水との反応によって腸内で生じる発生初期状態の水素を捕獲したタンパク質、又は水素原子が電子を供与する結果還元力が強くなったタンパク質が、各器官に輸送され、ヒドロキシラジカルと反応し、それを消滅させる機序が考えられる。

【0061】

本発明の予防又は治療剤の予防又は治療対象は、ヒト及び非ヒト動物である。好ましい非ヒト動物として、ペットや家畜等が挙げられる。

【0062】

本発明におけるシリコン微粒子は、その１種又は２種以上がそのままヒトや非ヒト動物に投与されてもよいが、必要に応じて、許容される添加剤又は担体と混合され、当業者に周知の形態に製剤化されて投与され得る。そのような添加剤又は担体としては、例えば、ｐＨ調整剤（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、クエン酸等）、賦形剤（例えば、マンニトール、ソルビトールの如き糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプンの如きデンプン誘導体；又は、結晶セルロースの如きセルロース誘導体等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムの如きステ
アリン酸金属塩；又はタルク等）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムの如きセルロース誘導体等）、防腐剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンの如きパラオキシ安息香酸エステル類；又はクロロブタノール、ベンジルアルコールの如きアルコール類等）が挙げられる。これら添加剤及び担体は、単独又は２種以上を混合してシリコン微粒子に配合され得る。好ましい添加剤としては、ｐＨを８以上に調整可能なｐＨ調整剤が挙げられる。好ましいｐＨ調整剤としては、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。

【0063】

本発明の予防又は治療剤の投与経路に特に制限はないが、好ましい投与経路として、経口、経皮、経粘膜（口腔、直腸、膣等）が挙げられる。

【0064】

経口投与用製剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤（ドライシロップ剤）、経口ゼリー剤等が挙げられる。経皮投与用又は経粘膜投与用製剤としては、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。

【0065】

錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び散剤等は、腸溶性製剤とすることができる。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤に腸溶性のコーティングを施す。腸溶性コーティング剤としては、胃難溶性腸溶性コーティング剤を用いることができる。カプセル剤は腸溶性カプセルに、本発明のシリコン微粒子を充填することにより、腸溶性にすることができる。

【0066】

本発明の予防又は治療剤は、上記の剤形に製剤化した後、ヒト又は非ヒト動物に投与され得る。

【0067】

本発明の予防又は治療剤中のシリコン微粒子の含有量は特に制限はないが、例えば、０．１～１００重量％、１～９９重量％、５～９５％が挙げられる。

【0068】

本発明の予防又は治療剤の投与開始時期は特に制限はないが、再建手術の周術期に投与開始されるのが好ましい。手術７日前から手術後２日の間に投与開始されるのがより好ましく、手術前２日から手術後１日の間に投与開始されるのがさらに好ましい。

【0069】

本発明におけるシリコン微粒子の投与量及び投与回数は、投与対象、その年齢、体重、性別、目的（予防用か治療用か等）、症状の重篤度、剤形、投与経路等の条件によって適宜変化しうる。ヒトに投与する場合、シリコン微粒子の好ましい投与量は、例えば、１日当たり、約１０ｍｇ～１０ｇ、好ましくは約１００ｍｇ～５ｇ、より好ましくは約５００ｍｇ～２ｇ投与される。また、投与回数は、１日当たり１回又は複数回、又は数日に1回であってもよい。例えば、１日当たり１～３回、１～２回、又は１回であってよい。

【0070】

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例0071】

＜実施例１＞ 高純度シリコン粉末（大阪チタニウムテクノロジーズ社製、粒度分布＜φ３００μｍ（但し、結晶粒子径が１μｍ超のシリコン粒子）、純度９９．９９９％）を篩にかけて４５μｍ以上の粒子を除去した。得られたシリコン粒子２００ｇを、９９．５ｗｔ％のエタノール溶液４Ｌ（リットル）中に分散させ、φ０．５μｍのジルコニア製ビーズ（容量７５０ｍｌ）を加えて、ビーズミル装置（アイメックス株式会社製、横型連続式レディーミル（型式、ＲＨＭ－０８））を用いて、４時間、回転数２５００ｒｐｍで粉砕（一段階粉砕）を行って微細化した。

【0072】

微細化されたシリコン粒子を含むエタノール溶液は、ビーズミル装置の粉砕室内部に設けられたセパレーションスリットにより、ビーズと分離された後、減圧蒸発装置を用いて３０℃～３５℃に加熱された。エタノール溶液を蒸発させることによって、微細化されたシリコン粒子（結晶子）が得られた。

【0073】

上記方法により得られた、微細化されたシリコン粒子（結晶子）の平均結晶子径は、２０～３０ｎｍであり、ほとんどの結晶子が凝集体を形成していた。また、結晶子は酸化シリコン膜に被覆されており、酸化シリコン膜の厚さは約１ｎｍであった。得られた酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子及びその凝集体の混合物は、本発明の有効成分であるシリコン微粒子の一実施形態である。

【0074】

＜実施例２＞ 実施例１で得られたシリコン結晶子及びその凝集体を、ガラス容器中で、過酸化水素水（３ｗｔ％）と混合し、３５℃で３０分間撹拌した。過酸化水素水で処理されたシリコン結晶子及びその凝集体を、公知の遠心分離処理装置を用いて、固液分離処理によって過酸化水素水を除いた。さらにその後、得られたシリコン結晶子及びその凝集体とエタノール溶液（９９．５ｗｔ％）とを混合し、十分に撹拌した。エタノール溶液と混合されたシリコン結晶子及びその凝集体を、公知の遠心分離処理装置を用いて、固液分離処理によって揮発性の高いエタノール溶液を除いてから十分に乾燥させた。得られた過酸化水素水処理された、酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子及びその凝集体の混合物は、本発明の有効成分であるシリコン微粒子の一実施形態である。得られたシリコン微粒子の電子走査顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図１に示す。なお、得られたシリコン結晶子の凝集体の水素発生速度は、凝集体サイズに依存しなかった。

【0075】

実施例２で得られたシリコン微粒子（シリコン結晶子及びその凝集体）の水素発生量を測定した。シリコン微粒子１０ｍｇを容量１００ｍｌのガラス瓶（硼ケイ酸ガラス 厚さ１ｍｍ程度、ＡＳＯＮＥ社製ラボランスクリュー管瓶）に入れた。炭酸水素ナトリウムでｐＨ８．２に調整した水をこのガラス瓶に入れて、液温を３６℃の温度条件において密閉し、該ガラス瓶内の液中の水素濃度を測定した。水素濃度の測定には、ポータブル溶存水素計（東亜ＤＫＫ株式会社製、型式ＤＨ－３５Ａ）を用いた。シリコン微粒子１ｇあたりの水素発生量を図２に示す。

【0076】

＜実施例３＞ 実施例２と同様の方法で、実施例１で得られたシリコン微粒子（シリコン結晶子及びその凝集体）を過酸化水素水で処理しエタノール溶液と混合し撹拌した。エタノール溶液と混合されたシリコン微粒子をスプレードライヤ（ＡＤＬ３１１Ｓ‐Ａ、ヤマト科学製）を用いて乾燥させた。得られたシリコン結晶子の凝集体は、本発明の有効成分であるシリコン微粒子の一実施形態である。得られたシリコン微粒子（シリコン結晶子の凝集体）の電子走査顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図３に示す。

【0077】

＜実施例４＞ 実施例１と同様に一段階粉砕を行った。一段階粉砕に用いたφ０．５μｍのジルコニア製ビーズ（容量７５０ｍｌ）は、ビーズミル粉砕室内部において、自動的にシリコン結晶子を含む溶液から分離された。得られたシリコン結晶子を含む溶液に、０．３μｍのジルコニア製ビーズ（容量７５０ｍｌ）を加えて４時間、回転数２５００ｒｐｍでシリコン結晶子をさらに粉砕（二段階粉砕）して微細化した。

【0078】

ビーズは、上述のとおりシリコン結晶子を含む溶液から分離され、得られたシリコン結晶子を含むエタノール溶液は、実施例１と同様に減圧蒸発装置を用いて４０℃に加熱された。エタノールは蒸発し、二段階粉砕されたシリコン結晶子が得られた。このように二段階粉砕された酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子も本発明の有効成分であるシリコン微粒子の一実施形態である。

【0079】

＜実施例５＞ 実施例２で得られた過酸化水素水処理された酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子及びその凝集体の混合物を、市販のカプセル３号に充填し、カプセル製剤を得た。本カプセル製剤は過酸化水素水処理された酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子の凝集体を主成分とし、さらに過酸化水素水処理された酸化シリコン膜が形成されているシリコン結晶子を含有する。

【0080】

＜試験例＞

【0081】

Ａ．試験材料と試験方法

【0082】

Ａ１．実験動物 すべての動物実験は、大阪大学の動物倫理委員会の承認を得て行われた。Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（CLEA Japan, inc., Tokyo, Japan）（１０週齢、３４０－３７０ｇ）を２４匹使用した。ラットは標準的な環境（２２－２５℃、１２：１２－ｈｏｕｒ ｄａｙ／ｎｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅ）で飼育し、手術前後には餌と水を自由に摂取させた。

【0083】

Ａ２．シリコン微粒子を含む飼料の調製 オリエンタル酵母工業株式会社製、型番ＡＩＮ９３Ｍに、実施例２で製造したシリコン微粒子（シリコン結晶子及びその凝集体）を１ｗｔ％になるように混合した。さらにクエン酸水溶液（ｐＨ４）を、該シリコン微粒子と該飼料との総量に対して約０．５ｗｔ％の量で加え、公知の混錬装置を用いて混錬し、シリコン微粒子を含む飼料を得た。

【0084】

Ａ３．試験設計 ラットを無作為に、（１）Ｓｈａｍ群（ｎ＝８）（２）再建手術群（虚血再灌流群、Ｉ／Ｒ群）（ｎ＝８）（３）再建手術＋シリコン微粒子投与群（虚血再灌流＋シリコン微粒子投与群、Ｉ／Ｒ＋Ｓｉ群）（ｎ＝８）の３つのグループに分割した。Ｓｈａｍ群と再建手術群のラットには、実験中通常の食事を与えた。再建手術＋シリコン微粒子投与群のラットには、手術の１週間前から試験終了時まで、シリコン微粒子を含む飼料を与えた。

【0085】

Ａ４．手術方法 手術方法は、これまでに報告されている方法に従った（Hao Y, et al. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2019;72:1661-1668.）。ラットにはイソフルランを吸入して麻酔をかけた。腹部に７×５ｃｍの長方形の皮弁（移植組織）をデザインした。皮弁には皮膚と皮下脂肪が含まれる。その後、皮弁をデザインに沿って挙上し、右の浅腹壁動静脈を結紮して、左の血管茎からのみ血流が供給されるようにした。再建手術群及び再建手術＋シリコン微粒子投与群では、血管クリップを用いて左の浅腹壁動静脈を閉塞し、皮弁の虚血を誘導した。Ｓｈａｍ群では虚血操作は行わなかった。その後、下床の組織からの血行再生を防ぐために、全ての群において、皮弁と下床の組織との間に厚さ０．１ｍｍのシリコンシートを留置した。３時間血管を閉塞した後に血管クリップと外し、血管茎に脈動が戻ったことを確認した後、皮弁を元の位置に再縫合した（図４）。

【0086】

Ａ５．皮弁生存率と生存領域の血流の評価 皮弁の生存率及び血流の評価は、これまでに報告されている方法に基づいて行った（Hao Y, et al. 同上）。血管クリップを外して血液を再灌流させた７２時間後に、各ラットを麻酔下に手術台に固定して皮弁全体を露出させた。皮弁の生存率及び血流は、生存及び壊死現象の一般的な観察と、レーザースペックル血流イメージングシステム（Omegazone OZ-1; Omegawave, Inc., Tokyo, Japan）によって評価した。皮弁の生存率は、元の皮弁面積に対する生存面積の比率として定義した。生存領域の血流量は、ＯＺ－１を用いて画像中の生存領域を区切ることにより自動的に算出されＰＵ（ｍＬ／ｍｉｎ／１００ｇ）で表された。皮弁の生存率と生存領域の血流量を評価した後、ラットを安楽死させた。さらなる分析のために、皮弁の血管茎の近位部から組織を採取した。

【0087】

Ａ６．組織学的解析 組織サンプルは４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋後、４μｍの切片に切り出した。切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介したデオキシウリジン三リン酸ニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）染色を行った。ＨＥ染色したスライドの組織学的変化は、以前に報告されている方法（Ren H, et al. Plast Reconstr Surg. 2018;142:23e-33e.）に若干の修正を加えた組織損傷スコアを用いて評価した。具体的には、炎症細胞の浸潤、充血、血管内微小血栓などの病理学的所見に応じて、０（なし）、１（極軽度）、２（軽度）、３（中等度）、４（重度）のように組織損傷をスコア化した。ＴＵＮＥＬ染色は、CF(商標)488A TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit（Biotium, Inc., Fremont, CA, USA）を用いて、メーカーの指示に従って行った。切片はVECTASHIELD(商標) Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)を用いて細胞核を対比
染色した。定量的な分析のために、異なる皮膚組織の異なる３つの視野におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞を、既報の方法（Ren H, et al. 同上）で測定した。データは、視野ごとの核の総数に対するＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合で表した。組織学的解析には、BZ-X800 (Keyence, Osaka, Japan)と Image J (a public domain program developed at the US National Institutes of Health)を使用した。

【0088】

Ａ７．酸化ストレス測定 既報（Ren H, et al. 同上）の通り、酸化ストレスマーカーとして、皮弁組織中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度を測定した（Ren H, et al. 同上）。凍結した組織５０ｍｇを氷上で切り分け、ＲＩＰＡバッファー内でホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、１００００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上澄み液を分析に用いた。ＭＤＡ及び総タンパク質の測定は、Amplite(商標) Colorimetric Malondialdehyde Quantitation kit (AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA, USA)及び DC(商標) Protein Assay kit (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)を用いて、メーカーの指示に従って行った。光学濃度は、マイクロプレートリーダー（SH-9000Lab; HITACHI, Tokyo, Japan）を用いて測定した。ＭＤＡ濃度はｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎで表した。

【0089】

Ａ８．組織内の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ測定 既報（Liu B, et al. J Cell Biochem. 2019;120:18162-18171.）の通り、組織内の炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルを測定するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。皮弁組織のＴｏｔａｌ ＲＮＡは、TRIzol(商標) Plus RNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、メーカーの指示に従って抽出した。抽出したＲＮＡの濃度は、分光光度計 (NanoDrop(商標) 2000; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)を用いて測定した。SuperScript(商標) IV First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、メーカーの指示に従って、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡの逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＩＬ－１β（Ｒｎ００５８０４３２＿ｍ１）、ＩＬ－６（Ｒｎ０１４１０３３０＿ｍ１）、ＴＮＦ－α（Ｒｎ９９９９９０１７＿ｍ１）、及びβ－アクチン（Ｒｎ００６６７８６９＿ｍ１）のTaqMan(商標) Gene Expression Assaysを用いて行った。また、TaqMan(商標) Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)を用いて、QuantStudio(商標) 7 Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)で、メーカーの指示に従った測定を行った。コントロールとしてはβ－ａｃｔｉｎを用いた。各遺伝子の発現量は、２^{－ΔΔＣＴ}法を用いて評価した。

【0090】

Ａ９．統計解析 JMP(商標) Pro 16 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ多重比較検定を行い、測定結果を解析した。統計的に有意な差は、Ｐ＜０．０５と定義した。データは平均±標準誤差で示した。

【0091】

Ｂ．結果

【0092】

Ｂ１． Ｓｈａｍ群の２匹のラットは、再灌流後７２時間までに自己摂食によって生存皮弁組織の部分欠損を生じたため、解析から除外した。最終的な解析はＳｈａｍ群（ｎ＝６）、再建手術群（ｎ＝８）、再建手術＋シリコン微粒子投与群（ｎ＝８）で行った。

【0093】

Ｂ２．皮弁の生存率と血流の評価 再灌流の７２時間後には、壊死した皮弁組織は茶色、灰色、又は黒色に変色し、弾力性を失っていた。一方、生存している組織はピンク又は白で、正常な弾力性を保っていた（図５）。皮弁生存率の平均値は、Ｓｈａｍ群、再建手術群、再建手術＋シリコン微粒子投与群でそれぞれ７８．７±８．０％、４５．８±４．０％、６３．５±３．１％であった。再建手術群の皮弁生存率はＳｈａｍ群に比べて有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。再建手術＋シリコン微粒子投与群の皮弁生存率は、再建手術群に比べて有意に高く（Ｐ＜０．０５）、Ｓｈａｍ群とは有意差がなかった（図６Ａ）。シリコン微粒子投与により再建手術後の皮弁生存率が有意に上昇した。Ｓｈａｍ群の壊死部分は、血管クリップで閉塞した血管から元々血液が配給されていない部分と考えられる。Ｓｈａｍ群の生存領域に対する再建手術群及び再建手術＋シリコン微粒子投与群の壊死領域の割合を換算すると、それぞれ４２％と１９％になる。シリコン微粒子投与により壊死領域が半分以下になった。Ｓｈａｍ群、再建手術群、再建手術＋シリコン微粒子投与群の生存領域の平均血流量は、それぞれ２５．０±１．２ＰＵ、１９．６±１．１ＰＵ、２０．９±１．８ＰＵであった。再建手術群の血流量はＳｈａｍ群と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。再建手術後の皮弁の血流量は、シリコン微粒子投与により上昇する傾向が見られた（図６Ｂ）。

【0094】

Ｂ３．組織障害 再建手術群のＨＥ染色では、炎症性細胞の浸潤、充血、血管内微小血栓などの組織損傷が認められた。再建手術群の組織損傷スコアはＳｈａｍ群に比べて有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。シリコン微粒子投与により、これらの病理学的変化は抑制され、再建手術＋シリコン微粒子投与群の組織損傷スコアは再建手術群に比べて有意に低かった（Ｐ＜０．０１）。シリコン微粒子投与により組織損傷が軽減された（図７）。

【0095】

Ｂ４．アポトーシス ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞は、Ｓｈａｍ群、再建手術群、再建手術＋シリコン微粒子投与群で、それぞれ１１．５±１．１％、３６．５±４．３％、２２．６±１．７％であった。ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞の割合は、再建手術群及び再建手術＋シリコン微粒子投与群ではＳｈａｍ群に比べて有意に高かった（それぞれＰ＜０．００１、Ｐ＜０．０５）。再建手術＋シリコン微粒子投与群のアポトーシスの割合は再建手術群に比べて有意に低かった（Ｐ＜０．０１）。再建手術によりアポトーシスが亢進するが、シリコン微粒子はアポトーシスの亢進を抑制した（図８）。

【0096】

Ｂ５．酸化ストレス Ｓｈａｍ群、再建手術群、再建手術＋シリコン微粒子投与群の皮弁組織の平均ＭＤＡ濃度は、それぞれ２４．９±４．１ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、５５．１±８．７ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、３１．５±３．７ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。再建手術群のＭＤＡ濃度はＳｈａｍ群に比べて有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）。一方、再建手術＋シリコン微粒子投与群では、再建手術群に比べてＭＤＡ濃度が有意に低下した（Ｐ＜０．０５）。再建手術により増大した酸化ストレスはシリコン微粒子投与により軽減された（図９）。

【0097】

Ｂ６．炎症性サイトカイン 再建手術群では、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αの相対的なｍＲＮＡの発現がＳｈａｍ群と比較して有意に増加した。一方、再建手術＋シリコン微粒子投与群では、再建手術群に比べて炎症性サイトカインの相対的なｍＲＮＡの発現が減少する傾向が見られた。特に、ＩＬ－１βとＴＮＦ－αのｍＲＮＡは、再建手術群に比べて有意に減少した（それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）（図１０）。

【産業上の利用可能性】

【0098】

癌や外傷等により生じた身体欠損の再建手術を成功に導き、多くの患者のＱＯＬ改善、並びに身体的及び経済的負担の軽減につながる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】