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特開2023-67248血清または血漿中の還元型アルブミン濃度または酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を測定する方法およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023067248
(43)【公開日】2023-05-16
(54)【発明の名称】血清または血漿中の還元型アルブミン濃度または酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を測定する方法およびキット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/52 20060101AFI20230509BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230509BHJP
【ＦＩ】
G01N33/52 C
G01N33/68
【審査請求】未請求
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021178318
(22)【出願日】2021-10-29
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003975
【氏名又は名称】日東紡績株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】内木 智朗
(72)【発明者】
【氏名】多田 功生
(72)【発明者】
【氏名】福島 雅夫
(72)【発明者】
【氏名】山下 隼
(72)【発明者】
【氏名】矢冨 裕
(72)【発明者】
【氏名】安川 恵子
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045BB36
2G045DA38
2G045FB11
2G045GC10
(57)【要約】
【課題】
発色試薬を用いて、還元型アルブミンを簡易に測定する方法において、従来の方法より、標準法に対する乖離が少なく、より正確な測定が可能な方法およびそのためのキットを提供する。
【解決手段】
特定の酸化剤を添加した検体の吸光度に対する無添加の検体の吸光度の差を用いて還元型アルブミン濃度を測定する。
【選択図】なし
発色試薬を用いて、還元型アルブミンを簡易に測定する方法において、従来の方法より、標準法に対する乖離が少なく、より正確な測定が可能な方法およびそのためのキットを提供する。
【解決手段】
特定の酸化剤を添加した検体の吸光度に対する無添加の検体の吸光度の差を用いて還元型アルブミン濃度を測定する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
チオールと反応して吸光度が変化する発色物質と、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤とを含む、還元型アルブミン濃度を測定するためのキットであって、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、キット。
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、キット。
【請求項2】
前記発色物質は、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質である、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）である、請求項１に記載のキット。
【請求項4】
前記アルキル化剤が、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、請求項１～３の何れか１項に記載のキット。
【請求項5】
前記酸化剤が、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、請求項１～３の何れか１項に記載のキット。
【請求項6】
タンパク変性剤を含む、請求項１～５の何れか１項に記載のキット。
【請求項7】
前記酸化剤のモル濃度が、前記酸化剤を含む試薬と検体または標準品とを混合した際にアルブミンのモル濃度の１０倍以上となり、前記酸化剤と前記アルブミンを含む混合物に前記ＢＤＡＢを含む試薬を混合した際の前記発色物質のモル濃度の２７０倍以下となるように設定されている、請求項１～６の何れか１項に記載のキット。
【請求項8】
キャリブレーターとして、標準血清若しくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液を含む、請求項１～７の何れか１項に記載のキット。
【請求項9】
前記酸化剤および緩衝液を含有する第１試薬と、前記発色物質および緩衝液を含有する第２試薬とを含み、前記第１試薬および前記第２試薬のいずれかに若しくは両方にタンパク変性剤を含む、請求項１～８の何れか１項に記載のキット。
【請求項10】
還元型アルブミン濃度を測定する方法であって、
試料に、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を添加し、次いでチオールと反応して吸光度が変化する発色物質を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定する工程と、
他方、前記試料に、酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬を混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定する工程と、
前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、前記吸光度差（ΔＯＤ）から前記試料中の還元型アルブミン濃度を算出する工程とを含み、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、方法。
試料に、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を添加し、次いでチオールと反応して吸光度が変化する発色物質を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定する工程と、
他方、前記試料に、酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬を混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定する工程と、
前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、前記吸光度差（ΔＯＤ）から前記試料中の還元型アルブミン濃度を算出する工程とを含み、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、方法。
【請求項11】
前記発色物質は、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記アルキル化剤が、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、請求項１０～１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記酸化剤が、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、請求項１０～１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項15】
更にタンパク変性剤を、前記試料に添加する、請求項１０～１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項16】
標準血清若しくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液をキャリブレーターとして用いて検量線を作成する、請求項１０～１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記標準血清若しくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液の希釈系列を作成し、
前記希釈系列の各希釈液に前記酸化剤を添加し、次いで前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定し、
他方、前記希釈系列の各希釈液を、前記酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定し、
前記各希釈液について、前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、
前記各希釈液についての前記吸光度差（ΔＯＤ）と、前記各希釈液の既知の還元型アルブミン濃度とから、前記検量線を作成する、請求項１６に記載の方法。
前記希釈系列の各希釈液に前記酸化剤を添加し、次いで前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定し、
他方、前記希釈系列の各希釈液を、前記酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定し、
前記各希釈液について、前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、
前記各希釈液についての前記吸光度差（ΔＯＤ）と、前記各希釈液の既知の還元型アルブミン濃度とから、前記検量線を作成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
還元型アルブミンの割合を決定する方法であって、
改良ＢＣＰ法により試料中の総アルブミン濃度を決定し、
請求項１０～１７の何れか１項に記載の方法により前記試料中の還元型アルブミン濃度を決定し、
前記還元型アルブミン濃度を前記総アルブミン濃度で割って、前記還元型アルブミンの割合を算出する、方法。
改良ＢＣＰ法により試料中の総アルブミン濃度を決定し、
請求項１０～１７の何れか１項に記載の方法により前記試料中の還元型アルブミン濃度を決定し、
前記還元型アルブミン濃度を前記総アルブミン濃度で割って、前記還元型アルブミンの割合を算出する、方法。
【請求項19】
１から、請求項１８に記載する方法により決定した還元型アルブミンの割合を差し引いて、酸化型アルブミンの割合を算出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血清または血漿中の還元型アルブミン濃度または酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を簡易に測定する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【0002】
血中のアルブミンは生体中で最も総量が多いタンパク質であり、酸化型または還元型の形態をとる。このため、ヒト血清若しくは血漿中の酸化型アルブミンの割合は、全身の酸化ストレスを反映する指標と考えられ、慢性腎疾患、糖尿病などの慢性疾患の進行に伴って増加することが報告されている（非特許文献１および２）。また、パーキンソン病、アルツハイマー病などの老化に伴う中枢神経系疾患の補助的な診断のためのバイオマーカーとして使用し得るとの報告もある（非特許文献３および４）。そのため、酸化型または還元型アルブミンの割合の測定はこれらの疾患の診断やリスク判定に有用と考えられている（特許文献１および非特許文献１）。
【0003】
酸化型または還元型アルブミンの割合の測定は、ＨＰＬＣを用いる方法（非特許文献１および２ならびに特許文献５）または質量分析器を用いる方法（非特許文献２および５）で行われている。これらの方法は、十分確立されており、高い精度で酸化型または還元型アルブミンの割合を測定できるため、標準的な方法として用いられている。
しかし、これらの方法は、スループットに限界があり、特に質量分析器を用いる方法では、質量分析の中でも分子量の大きなタンパクを高分解能で測定できる機器（例えば、ＥＳＴ－ＴＯＦ ＭＳ）が必要となる（非特許文献２および５）。
しかし、これらの方法は、スループットに限界があり、特に質量分析器を用いる方法では、質量分析の中でも分子量の大きなタンパクを高分解能で測定できる機器（例えば、ＥＳＴ－ＴＯＦ ＭＳ）が必要となる（非特許文献２および５）。
【0004】
一方、より簡便でスループットが高い測定法として発色試薬を用いる方法が開発されており、アルブミンを測定する代表的な方法としては、ＢＣＰ法および改良ＢＣＰ法が知られている。また、ＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法とを組み合わせることで、還元型アルブミンを定量する方法も報告されている（特許文献１および２）。
ＢＣＰ法は、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）がアルブミンに結合すると吸収スペクトルが変化するメタクロマジーを利用してアルブミンを定量する方法である。しかし、ＢＣＰは、還元型アルブミンと酸化型アルブミンに対する反応性に違いがあるため、両者の割合により総アルブミン値が影響を受けることから、酸化剤により、還元型アルブミンを酸化型アルブミンに変換してからＢＣＰと反応させる改良ＢＣＰ法が開発され、これが総アルブミンを定量する標準的な方法として用いられている。また、改良ＢＣＰ法では、種々の酸化剤について検討がなされており、過マンガン酸カリウム、過ヨウ化ナトリウム、メタバナジン酸ナトリウムなどの酸化剤では、還元型アルブミンのＳＨ基による影響を十分に回避することができず、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）試薬でこの影響を回避できることが報告されている（非特許文献６）。このため、改良ＢＣＰ法では、標準的に、酸化剤としてＳＤＳおよびＤＴＮＢの組み合わせが用いられている（特許文献３）。
ＢＣＰ法は、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）がアルブミンに結合すると吸収スペクトルが変化するメタクロマジーを利用してアルブミンを定量する方法である。しかし、ＢＣＰは、還元型アルブミンと酸化型アルブミンに対する反応性に違いがあるため、両者の割合により総アルブミン値が影響を受けることから、酸化剤により、還元型アルブミンを酸化型アルブミンに変換してからＢＣＰと反応させる改良ＢＣＰ法が開発され、これが総アルブミンを定量する標準的な方法として用いられている。また、改良ＢＣＰ法では、種々の酸化剤について検討がなされており、過マンガン酸カリウム、過ヨウ化ナトリウム、メタバナジン酸ナトリウムなどの酸化剤では、還元型アルブミンのＳＨ基による影響を十分に回避することができず、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）試薬でこの影響を回避できることが報告されている（非特許文献６）。このため、改良ＢＣＰ法では、標準的に、酸化剤としてＳＤＳおよびＤＴＮＢの組み合わせが用いられている（特許文献３）。
【0005】
ＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法とを組み合わせて、還元型アルブミン濃度を測定する方法は、改良ＢＣＰ法により総アルブミン濃度を決定し、これからＢＣＰ法で決定したアルブミン濃度を引いた値を還元型アルブミン濃度として算出する方法であり、この方法でも、改良ＢＣＰ法で用いる酸化剤は、標準的にＳＤＳおよびＤＴＮＢの組み合わせである（特許文献１および２）。
このＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法を組み合わせて還元型アルブミン濃度または割合を決定する方法では、標準的な方法であるＨＰＬＣ法で測定される酸化型または還元型アルブミンの割合に対して低い相関（ｒ＝０．５３）が報告されており（非特許文献７）、患者検体では測定誤差が大きいため、アルブミンの酸化還元状態を推定できないという報告もある（非特許文献８)。また、このようなＢＣＰを用いて還元型アルブミン濃度または割合を決定する方法では、これら標準的方法に比べ、総アルブミンの濃度が高い試料ほど酸化型アルブミンの濃度が高く測定される傾向があると共に、感度が低いという問題がある。
このＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法を組み合わせて還元型アルブミン濃度または割合を決定する方法では、標準的な方法であるＨＰＬＣ法で測定される酸化型または還元型アルブミンの割合に対して低い相関（ｒ＝０．５３）が報告されており（非特許文献７）、患者検体では測定誤差が大きいため、アルブミンの酸化還元状態を推定できないという報告もある（非特許文献８)。また、このようなＢＣＰを用いて還元型アルブミン濃度または割合を決定する方法では、これら標準的方法に比べ、総アルブミンの濃度が高い試料ほど酸化型アルブミンの濃度が高く測定される傾向があると共に、感度が低いという問題がある。
【0006】
発色試薬系で、還元型アルブミン濃度を測定する他の方法として、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）を用いる方法（ＢＤＡＢ法）も報告されている（非特許文献９および特許文献４）。この方法は、ＢＤＡＢのカチオンに対するチオール基の求核反応の結果生ずる吸光度変化を利用することを特徴とし、血清もしくは血漿中のチオールの大部分が還元型アルブミンに由来することから、血清もしくは血漿中のチオール濃度を測定することにより還元型アルブミン濃度を近似的に決定するものである（非特許文献９、１０、および１１ならびに特許文献４）。このＢＤＡＢ法は、直接還元型アルブミン濃度を測定し得る点でＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法とを組み合わせる方法とは異なる。また、この方法では、それ以前に血清中のチオール基の発色試薬として５，５’－ジチオビス（２-ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）が用いられていた方法と異なり、共存物質の影響を除くためにカラムクロマトグラフィー等による前処理を行う必要がないとされている（特許文献４）。
【0007】
しかし、このＢＤＡＢ法でも、本発明者らによる検討の結果、標準的な方法であるＨＰＬＣ法と改良ＢＣＰ法の測定結果から算出される還元型アルブミン濃度に対して、乖離する検体が散見することが分かっており、標準的な方法に対してより相関し、より信頼性の高い結果が得られる測定方法が望まれる。また、この方法でキャリブレーターとして使っている還元型アルブミンは、Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅという特殊なカラムを使って精製しており（非特許文献９）、キャリブレーターの調製に手間がかかるという問題がある。また、ＢＤＡＢを用いる方法で、酸化型または還元型アルブミンの割合を決定することはこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２０１８－０２５４８６
【特許文献2】特開２０１８－１９４４５３
【特許文献3】特許第３２６６０７９号
【特許文献4】特開平１－１６１１５１号
【特許文献5】特開２０１７－０５８２７８
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｍａｓｕｄｏ Ｒ．ｅｔ ａｌ．， “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｏｎｍｅｒｃａｐｔａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２０１７, Ｖｏｌ．６１， Ｎｏ．２， ｐ．７９－８４
【非特許文献2】Ｎａｇｕｍｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．， “Ｃｙｓ３４－Ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｉｓ ａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｌａｓｍａ Ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ”ＰＬＯＳ ＯＮＥ， ２０１４， Ｖｏ．９, Ｎｏ．１， ｐ． ｅ８５２１６．
【非特許文献3】Ｃｏｓｔａ Ｍ ｅｔ． ａｌ．， “Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２０１８， Ｖｏｌ．６３， ｐ．１３９５-１４０４
【非特許文献4】Ｕｅｎｏ Ｓ ｅｔ． ａｌ．， “Ｎｏｎｍｅｒｃａｐｔａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ａｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ａｎｄ ＰＡＲＫ２ ｄｉｓｅａｓｅ”， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０２０， Ｖｏｌ．７， Ｎｏ．３， Ｐ．３０７－３１７
【非特許文献5】Ｍａｇｚａｌ Ｆ．ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎ－ｖｉｖｏ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ － ａ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｈｙｐｏａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａ”ＰＬＯＳ ＯＮＥ, ２０１７， Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．５， ｐ． ｅ０１７７７９９
【非特許文献6】村本 良三 （他２名）、“正確度を改善したブロムクレゾールパープル法による血清アルブミン定量法の開発”、臨床化学、１９９７、２６巻１号、ｐ．３８－４３
【非特許文献7】Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ｓ． ｅｔ ａｌ．． “Ｎｅｗ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ ｐｕｒｐｌｅ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２０２０, Ｖｏｌ．６７， Ｎｏ．３，２５７－２６２
【非特許文献8】吉冨史美、（他６名）、“ヒト血清アルブミン酸化還元状態を推定する新規分光学的測定法”、第５９回日本臨床化学会年会 抄録集、 ２０１９年、 ｐ．１９４
【非特許文献9】濱 三和夫、田中 満直． “血液中メルカプトアルブミンの測定”緒方医学化学研究所報告、平成三年度号、ｐ． ７ - １３、１９９１．
【非特許文献10】Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．， “Ｒｅｄｏｘ Ａｌｂｕｍｉｎｏｍｉｃｓ： Ｏｘｉｄｉｚｅｄ Ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ” Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ＆ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ, ２０１２， Ｖｏｌ．１７， Ｎｏ．１１， ｐ．１５１５－ １５２７
【非特許文献11】Ｔｕｒｅｌｌ Ｌ．ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｔｈｉｏｌ ｐｏｏｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ：Ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｔｏ ｒｅｄｏｘ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ” Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１３, Ｖｏｌ．６５， ｐ．２４４-２５３
【非特許文献12】Ｃｈｅｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．， “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｏｌｓ” Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗ， ２０１０， Ｖｏｌ．３９， Ｎｏ．６， ｐ．２１２０－２１３５
【非特許文献13】Ｄｅｎｇ Ｌ．ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｄｉｋｅｔｏｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ： Ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１１， Ｖｏｌ．７６， ｐ．９２９４-９３０４
【非特許文献14】Ｓｈｅｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．， “Ａ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｐｒｏｂｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＮＢＤ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔｈｉｏｌｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ”， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１５， Ｖｏｌ．７， Ｎｏ．１５， ｐ．６４１９－６４２５
【非特許文献15】Ｒｏｓ－Ｌｉｓ Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．， “Ｓｑｕａｒａｉｎｅｓ ａｓ Ｆｌｕｏｒｏ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｉｏｌ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ Ｔｈｉｏｌｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２００４, Ｖｏｌ．１２６， Ｎｏ．１３， ｐ．４０６４－４０６５
【非特許文献16】Ｆａｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｆａｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｑｕａｒａｉｎｅ－ｂａｓｅｄｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ２０１３, Ｖｏｌ．８０， ｐ．８８６－８９３
【非特許文献17】Ｙａｓｕｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．， “Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｓｓａｙ ｍｅｒｃａｐｔｏａｌｂｕｍｉｎ／ｎｏｎ－ｍｅｒｃａｐｔｏａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒａｎｇｅｓ”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, Ｖｏｌ．１７，ｐ．ｅ００１３２， ２０１９．
【非特許文献18】Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ．ｅｔ． ａｌ．， “Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ”Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ, Ｖｏｌ．３１６， Ｎｏ．１－２， ｐ．１７５－１７８， ２００２．
【非特許文献19】Ｆａｂｉｓｉａｋ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．， “Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ／Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＳ３４ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ ＳＤｓ－ＰＡＧＥ Ａｓｓａｙ”Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ＆ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ, Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５， ｐ．８５５－８６５， ２００２．
【非特許文献20】Ｔｕｒｅｌｌ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，“Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｂｕｍｉｎ ｔｈｉｏｌ ｔｏ ｓｕｌｆｅｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ” Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９, Ｖｏｌ．４２， Ｎｏ．４， ｐ．３０５－１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
従って、本発明は、発色試薬を用いて、還元型アルブミン濃度を簡易に測定する方法において、従来の方法より、標準的な方法に対する乖離が少なく、より正確な測定が可能な方法およびそのためのキットを提供することを目的とする。本発明はまた、標準血清もしくは血漿などの調製が容易な試料をキャリブレーターとして利用が可能な還元型アルブミンの測定方法およびそのためのキットを提供することも目的とする。本発明はさらに、発色試薬を用いて、酸化型または還元型アルブミンの割合を決定する新規方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、従来のＢＤＡＢ法による還元型アルブミン濃度の測定で、標準法に対して比較的大きく乖離する試料が存在することを確認し、この問題を改善すべく検討を重ね、ＢＤＡＢ等の、チオールと反応して吸光度が変化する物質を用いた測定系において、特定の酸化剤を添加した検体の吸光度に対する無添加の検体の吸光度の差を用いて還元型アルブミン濃度を測定することで、標準法に対する乖離を改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、本発明は、以下の還元型アルブミンを測定するためのキット、試料中の還元型アルブミン濃度を測定する方法、および酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を決定する方法を提供する。
［１］ チオールと反応して吸光度が変化する発色物質と、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤とを含む、還元型アルブミン濃度を測定するためのキットであって、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、キット。
［２］ 前記発色物質は、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質であり、例えば、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）、７－ニトロ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］クロメン－１－オン、ジケトピロロピロール、１，３－ビス（４－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ－２－ヒドロキシ－フェノール）クロコニン、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾールマレイミド、および２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（２－メトキシエトキシ）メチル）－ジフェニル］スクアラインからなる群から選択される、［１］に記載のキット。
［３］ 前記発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）である、［１］に記載のキット。
［４］ 前記アルキル化剤が、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１］～［３］の何れか１項に記載のキット。
［５］ 前記酸化剤が、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１］～［３］の何れか１項に記載のキット。
［６］ タンパク変性剤を含む、［１］～［５］の何れか１項に記載のキット。
［７］ 前記酸化剤のモル濃度が、前記酸化剤を含む試薬と試料とを混合した際に混合物中のアルブミンのモル濃度の１０倍以上となり、前記混合物に前記発色物質を含む試薬を混合した際に前記発色物質のモル濃度の２７０倍以下となるように設定されている、［１］～［６］の何れか１項に記載のキット。
［８］ キャリブレーターとして、標準血清もしくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液を含む［１］～［７］の何れか１項に記載のキット。
［９］ 前記酸化剤および緩衝液を含有する第１試薬と、前記発色物質および緩衝液を含有する第２試薬とを含み、前記第１試薬および前記第２試薬のいずれか一方または両方にタンパク変性剤を含む、［１］～［８］の何れか１項に記載のキット。
［１０］ 還元型アルブミン濃度を測定する方法であって、
試料に、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を添加し、次いでチオールと反応して吸光度が変化する発色物質を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定する工程と、
他方、前記試料を、前記酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定する工程と、
前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、前記吸光度差（ΔＯＤ）から前記試料中の還元型アルブミン濃度を算出する工程とを含み、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、方法。
［１１］ 前記発色物質は、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質で、例えば、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）、７－ニトロ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］クロメン－１－オン、ジケトピロロピロール、１，３－ビス（４－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ－２－ヒドロキシ－フェノール）クロコニン、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾールマレイミド、２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（ブチルカルバメイト））－ジフェニル］スクアライン、および２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（２－メトキシエトキシ）メチル）－ジフェニル］スクアラインからなる群から選択される、［１０］に記載の方法。
［１２］ 前記発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）である、［１０］に記載の方法。
［１３］ 前記アルキル化剤が、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１０］～［１２］の何れか１項に記載の方法。
［１４］ 前記酸化剤が、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１０］～［１２］の何れか１項に記載の方法。
［１５］ 更に、タンパク変性剤を前記試料に添加する、［１０］～［１４］の何れか１項１項に記載の方法。
［１６］ 標準血清若しくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液をキャリブレーターとして用いて検量線を作成する、［１０］～［１５］の何れか１項に記載の方法。
［１７］ 前記キャリブレーターの希釈系列を作成し、
前記希釈系列の各希釈液に前記酸化剤を添加し、次いで前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定し、
他方、前記希釈系列の各希釈液を、前記酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定し、
前記各希釈液について、前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、
前記各吸光度差（ΔＯＤ）と、前記各希釈液の既知の還元型アルブミン濃度とから、前記検量線を作成する、［１６］に記載の方法。
［１８］ 還元型アルブミンの割合を決定する方法であって、
改良ＢＣＰ法により試料中の総アルブミン濃度を決定し、
［１０］～［１７］の何れか１項に記載の方法により前記試料中の還元型アルブミン濃度を決定し、
前記還元型アルブミン濃度を前記総アルブミン濃度で割って、前記還元型アルブミンの割合を算出する、方法。
［１９］ １から、［１８］に記載する方法により決定した還元型アルブミンの割合を差し引いて、酸化型アルブミンの割合を算出する方法。
［１］ チオールと反応して吸光度が変化する発色物質と、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤とを含む、還元型アルブミン濃度を測定するためのキットであって、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、キット。
［２］ 前記発色物質は、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質であり、例えば、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）、７－ニトロ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］クロメン－１－オン、ジケトピロロピロール、１，３－ビス（４－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ－２－ヒドロキシ－フェノール）クロコニン、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾールマレイミド、および２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（２－メトキシエトキシ）メチル）－ジフェニル］スクアラインからなる群から選択される、［１］に記載のキット。
［３］ 前記発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）である、［１］に記載のキット。
［４］ 前記アルキル化剤が、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１］～［３］の何れか１項に記載のキット。
［５］ 前記酸化剤が、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１］～［３］の何れか１項に記載のキット。
［６］ タンパク変性剤を含む、［１］～［５］の何れか１項に記載のキット。
［７］ 前記酸化剤のモル濃度が、前記酸化剤を含む試薬と試料とを混合した際に混合物中のアルブミンのモル濃度の１０倍以上となり、前記混合物に前記発色物質を含む試薬を混合した際に前記発色物質のモル濃度の２７０倍以下となるように設定されている、［１］～［６］の何れか１項に記載のキット。
［８］ キャリブレーターとして、標準血清もしくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液を含む［１］～［７］の何れか１項に記載のキット。
［９］ 前記酸化剤および緩衝液を含有する第１試薬と、前記発色物質および緩衝液を含有する第２試薬とを含み、前記第１試薬および前記第２試薬のいずれか一方または両方にタンパク変性剤を含む、［１］～［８］の何れか１項に記載のキット。
［１０］ 還元型アルブミン濃度を測定する方法であって、
試料に、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を添加し、次いでチオールと反応して吸光度が変化する発色物質を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定する工程と、
他方、前記試料を、前記酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定する工程と、
前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、前記吸光度差（ΔＯＤ）から前記試料中の還元型アルブミン濃度を算出する工程とを含み、
前記酸化剤が、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される、方法。
［１１］ 前記発色物質は、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質で、例えば、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）、７－ニトロ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］クロメン－１－オン、ジケトピロロピロール、１，３－ビス（４－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ－２－ヒドロキシ－フェノール）クロコニン、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾールマレイミド、２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（ブチルカルバメイト））－ジフェニル］スクアライン、および２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（２－メトキシエトキシ）メチル）－ジフェニル］スクアラインからなる群から選択される、［１０］に記載の方法。
［１２］ 前記発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）である、［１０］に記載の方法。
［１３］ 前記アルキル化剤が、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１０］～［１２］の何れか１項に記載の方法。
［１４］ 前記酸化剤が、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）からなる群から選択される、［１０］～［１２］の何れか１項に記載の方法。
［１５］ 更に、タンパク変性剤を前記試料に添加する、［１０］～［１４］の何れか１項１項に記載の方法。
［１６］ 標準血清若しくは血漿、精製アルブミン溶液、または精製還元型アルブミン溶液をキャリブレーターとして用いて検量線を作成する、［１０］～［１５］の何れか１項に記載の方法。
［１７］ 前記キャリブレーターの希釈系列を作成し、
前記希釈系列の各希釈液に前記酸化剤を添加し、次いで前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定し、
他方、前記希釈系列の各希釈液を、前記酸化剤を添加せずに前記発色物質を含む試薬と混合した後、前記所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定し、
前記各希釈液について、前記吸光度（ＯＤｏｘ）と前記吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、
前記各吸光度差（ΔＯＤ）と、前記各希釈液の既知の還元型アルブミン濃度とから、前記検量線を作成する、［１６］に記載の方法。
［１８］ 還元型アルブミンの割合を決定する方法であって、
改良ＢＣＰ法により試料中の総アルブミン濃度を決定し、
［１０］～［１７］の何れか１項に記載の方法により前記試料中の還元型アルブミン濃度を決定し、
前記還元型アルブミン濃度を前記総アルブミン濃度で割って、前記還元型アルブミンの割合を算出する、方法。
［１９］ １から、［１８］に記載する方法により決定した還元型アルブミンの割合を差し引いて、酸化型アルブミンの割合を算出する方法。
【0013】
本発明により、ＨＰＬＣ法および質量分析法による測定を伴う方法よりも、より簡便にスループットが高い還元型アルブミンの測定が可能となる。また、ＢＣＰ／改良ＢＣＰ法および従来のＢＤＡＢ法よりも標準法に対する相関が高く、標準法に対する乖離が少ないため、より正確に還元型アルブミン濃度を測定することができる。
【0014】
ここで、本明細書で用いるいくつかの用語について、定義する。
本明細書で用いる場合、「ＨＰＬＣ法」とは、ＨＰＬＣを用いて酸化型／還元型アルブミン比または総アルブミン中の酸化型または還元型アルブミンの割合を決定する方法をいうものとする。
本明細書で用いる場合、「ＨＰＬＣ法」とは、ＨＰＬＣを用いて酸化型／還元型アルブミン比または総アルブミン中の酸化型または還元型アルブミンの割合を決定する方法をいうものとする。
【0015】
本明細書で用いる場合、「質量分析法」とは、質量分析機器を用いて酸化型／還元型アルブミン比または総アルブミン中の酸化型または還元型アルブミンの割合を決定する方法をいうものとする。また、特に言及しない限り、「質量分析法」による分析は、非特許文献２および５に記載する手順及び条件で行うものとする。
【0016】
本明細書で用いる場合、「改良ＢＣＰ法」とは、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を試料に添加して還元型アルブミンを酸化型アルブミンに変換した後にブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）を酸化型アルブミンと反応させて総アルブミン濃度を測定する方法を意味する。
【0017】
本明細書で総アルブミン中の酸化型または還元型アルブミンの割合を決定する方法に言及する場合、「標準法」とは、特許文献５に記載する手順及び条件に従って実施する「ＨＰＬＣ法」をいうものとする。この標準法では、具体的には、イオン交換基としてＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）を有するイオン交換樹脂が充填された陰イオン交換カラムを使用し、緩衝液Ａにて平衡化後、検体を注入し、同時に７．５分間、１．０ｍＬ／分の流速で、緩衝液Ａ（１００％から７５％）と緩衝液Ｂ（０％から２５％）によるリニアグラジエントにかけて、酸化型アルブミンおよび還元型アルブミンを分離し、励起波長２８０ｎｍ、検出波長３４０ｎｍの蛍光で検出を行う。
緩衝液Ａ：６０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
緩衝液Ｂ：１Ｍ ＭｇＣｌ２
緩衝液Ａ：６０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
緩衝液Ｂ：１Ｍ ＭｇＣｌ２
【0018】
また、本明細書で総アルブミン濃度を決定する方法に言及する場合、「標準法」とは、特許文献３に記載する手順に従って実施する「改良ＢＣＰ法」をいうものとする。この標準法では、具体的には、１５μＬの検体に対して８５μＬの第一試薬（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、１００μＭ ＤＴＮＢ、および０．０３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）を添加、３７℃で５分間インキュベーション後、１５０μＬの第二試薬（２５０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．５溶液中に、１５０μＭブロモクレソールパープル、および０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む）を添加して、さらに３７℃で２０分間インキュベーションをし、吸光度６００ｎｍ（主波長）／６６０（副波長）を測定して、総アルブミン濃度を決定する。
【0019】
本明細書で還元型アルブミン濃度を決定する方法に言及する場合、「標準法」とは、上記「標準法」によって総アルブミン中の還元型アルブミンの割合を決定し、上記「標準法」によって総アルブミン濃度を決定し、得られた総アルブミン濃度に還元型アルブミンの割合をかけて還元型アルブミン濃度を決定する方法をいうものとする。
【0020】
本明細書で用いる場合、「ＢＤＡＢ法」とは、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）を発色物質として、還元型アルブミン濃度を測定する方法を意味する。
また、本明細書で用いる場合、「改良ＢＤＡＢ法」という用語は、「ＢＤＡＢ法」において、検体に還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を含む溶液を添加して調製した試料に、ＢＤＡＢを含む試薬を添加し、所定の波長で測定した吸光度（ＯＤｏｘ）と、同じ検体に酸化剤を含まない溶液を添加して調製した試料に、ＢＤＡＢを含む試薬を添加し、所定の波長で測定した吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）とを測定し、両者の吸光度差（ΔＯＤ）から試料中の還元型アルブミン濃度を算出する方法をいうものとする。
また、本明細書で用いる場合、「従来のＢＤＡＢ法」とは、「ＢＤＡＢ法」において、検体を還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤で処理せずに、ＢＤＡＢを含む試薬を添加し、所定の波長で測定した吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）から試料中の還元型アルブミン濃度を算出する方法をいうものとする。
また、本明細書で用いる場合、「改良ＢＤＡＢ法」という用語は、「ＢＤＡＢ法」において、検体に還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を含む溶液を添加して調製した試料に、ＢＤＡＢを含む試薬を添加し、所定の波長で測定した吸光度（ＯＤｏｘ）と、同じ検体に酸化剤を含まない溶液を添加して調製した試料に、ＢＤＡＢを含む試薬を添加し、所定の波長で測定した吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）とを測定し、両者の吸光度差（ΔＯＤ）から試料中の還元型アルブミン濃度を算出する方法をいうものとする。
また、本明細書で用いる場合、「従来のＢＤＡＢ法」とは、「ＢＤＡＢ法」において、検体を還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤で処理せずに、ＢＤＡＢを含む試薬を添加し、所定の波長で測定した吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）から試料中の還元型アルブミン濃度を算出する方法をいうものとする。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】上段のグラフは、血漿１検体を特許文献５に記載する手順に従ってＨＰＬＣ法（標準法）により分析したクロマトグラムを示す。下段左の表は、上段のクロマトグラムの還元型アルブミンのピークと酸化型アルブミンのピークの面積および面積割合を示す。下段右の表は、血漿１検体を特許文献３に記載する手順に従って改良ＢＣＰ法（標準法）により測定した総アルブミン濃度およびこれにＨＰＬＣ法（標準法）により決定した還元型アルブミンの割合をかけて算出した還元型アルブミン濃度を示す。
【図2】標準血清をマレイミドで処理する前にＨＰＬＣ法（標準法）により分析したクロマトグラム、および標準血清をマレイミドで処理した後でＨＰＬＣ法（標準法）により分析したクロマトグラムを示す。マレイミドで処理することにより、還元型アルブミンのピークが完全に消失し、酸化型アルブミンのピークが大きくなっていることを確認できる。
【図3】図３は、表１０に示すデータを用いて作成した還元型アルブミン濃度を決定するための検量線である。図３ＡおよびＢは、吸光度差（ΔＯＤ）を用いて還元型アルブミン濃度を決定する検量線であり、図３Ａは線形検量線であり、図３Ｂは非線形検量線である。図３Ｃは、ＯＤｎｏｎ－ｏｘを用いて還元型アルブミン濃度を決定する検量線であり、従来の「ＢＤＡＢ法」と同様の検量線である。
【図4】１２人のドナーから得た検体（血清８件、血漿４件）を、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度に基づいて、緩衝液で希釈して１８３．５μＭの濃度に調整した試料を、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により図３に示す検量線を用いて還元型アルブミン濃度を決定し、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）の基準値１８３．５μＭからの乖離を評価した結果を示す。図４Ａは、各検体の基準値からの乖離を示し、図４Ｂは、基準値からの乖離の分布を示す。図４Ｂ中のバーの上端及び下端は、それぞれ各測定法で標準法に対する最大較差（絶対値）および最小較差（絶対値）を示す。ボックスの上端及び下端は、それぞれ７５％パーセンタイル値および２５％パーセンタイル値を示す。×は、標準法に対する較差の中央値を示す。
【図5】１２人のドナーから得た検体（血清８件、血漿４件）を、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度に基づいて、緩衝液で希釈して総て１８３．５μＭの濃度に調整した試料を用いて、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と、改良ＢＣＰ法（標準法）により酸化型アルブミンの割合を算出し、標準法（ＨＰＬＣ法）による酸化型アルブミンの割合に対する乖離を評価した結果を示す。図中のバーの上端及び下端は、それぞれ各測定法で標準法に対する最大較差（絶対値）および最小較差（絶対値）を示す。ボックスの上端及び下端は、それぞれ７５％パーセンタイル値および２５％パーセンタイル値を示す。×は、標準法に対する較差の中央値を示す。（特許文献５、ならびに非特許文献１および２の様に、酸化型アルブミンの割合を記述する事が一般的に多いため、本明細書でも、酸化型アルブミンの割合を優先的に記載する。）
【図6】表１３に示す試験結果について、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対する各方法で決定した酸化型アルブミンの割合の相関関係を示す。
【図7】３２人のドナーから得た検体（血清２１件、血漿１１件）について、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により還元型アルブミン濃度を決定し、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度に対する乖離を評価した試験結果を示す。図中のバーの上端及び下端は、それぞれ各測定法で標準法に対する最大較差（絶対値）および最小較差（絶対値）を示す。ボックスの上端及び下端は、それぞれ７５％パーセンタイル値および２５％パーセンタイル値を示す。×は、標準法に対する較差の中央値を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、線形検量線と非線形検量線を作成し、還元型アルブミン濃度を決定した。
【図8】３２人のドナーから得た検体（血清２１件、血漿１１件）について、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と改良ＢＣＰ法（標準法）により酸化型アルブミンの割合を決定し、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミン濃度に対する乖離を評価した試験結果を示す。図中のバーの上端及び下端は、それぞれ各測定法で標準法に対する最大較差（絶対値）および最小較差（絶対値）を示す。ボックスの上端及び下端は、それぞれ７５％パーセンタイル値および２５％パーセンタイル値を示す。×は、標準法に対する較差の中央値を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、線形検量線と非線形検量線を作成し、還元型アルブミン濃度を決定した。
【図9】表２３に示す試験結果について、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対する各方法で決定した酸化型アルブミンの割合の相関関係を示す。
【図10】３２人のドナーから得た検体（血清２１件、血漿１１件）について、酸化剤としてヨードアセトアミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により還元型アルブミン濃度を決定し、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度に対する乖離を評価した結果を示す。図中のバーの上端及び下端は、それぞれ各測定法で標準法に対する最大較差（絶対値）および最小較差（絶対値）を示す。ボックスの上端及び下端は、それぞれ７５％パーセンタイル値および２５％パーセンタイル値を示す。×は、標準法に対する較差の中央値を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、線形検量線と非線形検量線を作成し、還元型アルブミン濃度を決定した。
【図11】３２人のドナーから得た検体（血清２１件、血漿１１件）について、酸化剤としてヨードアセトアミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と改良ＢＣＰ法（標準法）により酸化型アルブミンの割合を決定し、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対する乖離を評価した結果を示す。図中のバーの上端及び下端は、それぞれ各測定法で標準法に対する最大較差（絶対値）および最小較差（絶対値）を示す。ボックスの上端及び下端は、それぞれ７５％パーセンタイル値および２５％パーセンタイル値を示す。×は、標準法に対する較差の中央値を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、線形検量線と非線形検量線を作成し、還元型アルブミン濃度を決定した。
【図12】表２６に示す試験結果について、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対する各方法で決定した酸化型アルブミンの割合の相関関係を示す。
【図13】標準血清、精製アルブミン溶液または精製還元型アルブミン溶液を用いて、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）または改良ＢＤＡＢ法（補正あり）により作成した還元型アルブミン濃度の検量線を示す。
【図14】標準血清、またはシステイン溶液を用いて、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）または改良ＢＤＡＢ法（補正あり）により作成した還元型アルブミン濃度の検量線を示す。
【図15】各種標準血清を用いて、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）または改良ＢＤＡＢ法（補正あり）により作成した還元型アルブミン濃度の検量線を示す。
【図16】各種標準血清又は血漿を用いて、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）または改良ＢＤＡＢ法（補正あり）により作成した還元型アルブミン濃度の検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明の実施の形態を詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に限定して理解されるべきものではない。
【0023】
１．還元型アルブミン濃度を測定する方法
本発明の一の実施形態は、チオールと反応して吸光度が変化する物質を用いて試料中の還元型アルブミン濃度を測定する方法に関する。
ヒト血中アルブミンは、その分子中に３５個のシステイン残基（ＳＨ基）を有し、そのうち１７対は分子内ジスルフィド結合を形成しているが、Ｎ末端より３４番目システインのＳＨ基は遊離している場合と酸化されている場合がある。前者を還元型アルブミンといい、後者を酸化型アルブミンという。ヒト血清アルブミンは生体中で最も総量が多いタンパク質のため、ヒト血清もしくは血漿中の酸化型アルブミンの割合は、全身の酸化ストレスを反映する指標と考えられており、慢性腎疾患、糖尿病などの慢性疾患の進行に伴って上昇することが報告されている（非特許文献１および２）。また、パーキンソン病、アルツハイマー病などの老化に伴う中枢神経系疾患の補助的な診断のためのバイオマーカーとしての使用も報告されている（非特許文献３および４）。このため、還元型アルブミン濃度、酸化型もしくは還元型アルブミンの割合、および酸化型／還元型アルブミン比の測定はこれらの状態および疾患の診断やリスク判定に利用される。
本発明の一の実施形態は、チオールと反応して吸光度が変化する物質を用いて試料中の還元型アルブミン濃度を測定する方法に関する。
ヒト血中アルブミンは、その分子中に３５個のシステイン残基（ＳＨ基）を有し、そのうち１７対は分子内ジスルフィド結合を形成しているが、Ｎ末端より３４番目システインのＳＨ基は遊離している場合と酸化されている場合がある。前者を還元型アルブミンといい、後者を酸化型アルブミンという。ヒト血清アルブミンは生体中で最も総量が多いタンパク質のため、ヒト血清もしくは血漿中の酸化型アルブミンの割合は、全身の酸化ストレスを反映する指標と考えられており、慢性腎疾患、糖尿病などの慢性疾患の進行に伴って上昇することが報告されている（非特許文献１および２）。また、パーキンソン病、アルツハイマー病などの老化に伴う中枢神経系疾患の補助的な診断のためのバイオマーカーとしての使用も報告されている（非特許文献３および４）。このため、還元型アルブミン濃度、酸化型もしくは還元型アルブミンの割合、および酸化型／還元型アルブミン比の測定はこれらの状態および疾患の診断やリスク判定に利用される。
【0024】
チオールと反応して吸光度が変化する発色物質としては、チオール基の求核反応の結果、吸光度変化を起こす物質が好ましく、ジスルフィド構造を有しないチオール反応物質がより好ましい。このような物質は、例えば、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）、７－ニトロ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］クロメン－１－オン、ジケトピロロピロール、１，３－ビス（４－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ－２－ヒドロキシ－フェノール）クロコニン、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾールマレイミド、２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（２－メトキシエトキシ）メチル）－ジフェニル］スクアライン、２，４－ビス［４－（Ｎ，Ｎ－ビス（ブチルカルバメイト））－ジフェニル］スクアライン等のスクアライン系色素等を挙げることができる。スクアライン系色素は、下記構造：
を有する化合物であり、好ましいスクアライン系色素は、式中のＲが、それぞれ独立して
（式中の左端が上記化合物のＮと結合する）の化合物であり、より好ましい化合物は、式中のＲが、上記の構造の何れかである化合物である。
上述した各発色物質については、非特許文献１２～１６に詳細に記載されている。
【化1】
を有する化合物であり、好ましいスクアライン系色素は、式中のＲが、それぞれ独立して
【化2】
（式中の左端が上記化合物のＮと結合する）の化合物であり、より好ましい化合物は、式中のＲが、上記の構造の何れかである化合物である。
上述した各発色物質については、非特許文献１２～１６に詳細に記載されている。
【0025】
発色物質としては、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）が特に好ましい。
４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）は、
の構造を有する化合物であり、６１２ｎｍに最大吸光度波長を有する。ＢＤＡＢと還元型アルブミンとの反応は、以下に示すカチオンに対するチオール基の求核反応であり、この反応の結果生じる複合体では、６１２ｎｍでの吸光度が減少し、この吸光度変化によって、チオール基の量を直接測定することができる。
測定波長は、試料中に存在する夾雑物質の吸収スペクトル等を考慮して、ＢＤＡＢの発色を特異的に検出できる波長を選択すればよいが、通常は、最大吸収波長である６１２ｎｍ付近、具体的には、５７０～６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍ～６２５ｎｍの範囲から選択すればよく、最大吸収波長である６１２ｎｍが好ましい。また、ＢＤＡＢに対するチオール基の求核反応は、ＢＤＡＢが酸性下で上記のカチオンとなることで生じるため、酸性下、典型的にはｐＨ５～６の溶液中でＢＤＡＢと還元型アルブミンを反応させることが好ましい。従って、ＢＤＡＢを含む発色試薬は、通常緩衝液を含み、酸性下、典型的にはｐＨ５～６に維持されている。
４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）は、
【化3】
の構造を有する化合物であり、６１２ｎｍに最大吸光度波長を有する。ＢＤＡＢと還元型アルブミンとの反応は、以下に示すカチオンに対するチオール基の求核反応であり、この反応の結果生じる複合体では、６１２ｎｍでの吸光度が減少し、この吸光度変化によって、チオール基の量を直接測定することができる。
【化4】
測定波長は、試料中に存在する夾雑物質の吸収スペクトル等を考慮して、ＢＤＡＢの発色を特異的に検出できる波長を選択すればよいが、通常は、最大吸収波長である６１２ｎｍ付近、具体的には、５７０～６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍ～６２５ｎｍの範囲から選択すればよく、最大吸収波長である６１２ｎｍが好ましい。また、ＢＤＡＢに対するチオール基の求核反応は、ＢＤＡＢが酸性下で上記のカチオンとなることで生じるため、酸性下、典型的にはｐＨ５～６の溶液中でＢＤＡＢと還元型アルブミンを反応させることが好ましい。従って、ＢＤＡＢを含む発色試薬は、通常緩衝液を含み、酸性下、典型的にはｐＨ５～６に維持されている。
【0026】
ＢＤＡＢの濃度は、試料と混合した際に試料中の総ての還元型アルブミンがＢＤＡＢと反応し、酸化剤による発色の影響を受けない濃度とすることが好ましい。この点、ヒト血清中のアルブミン濃度の正常値の上限は、約５ｇ／ｄＬであり、これに、還元型アルブミンの割合、試薬との混合による希釈および還元型アルブミンを完全に酸化型アルブミンに変換するために必要な酸化剤の量等を考慮すると、ＢＤＡＢを含む試薬の濃度は、通常１５～８０μＭで調整し、試薬のボリュームを、アルブミンを含む検体の１５～４５倍、好ましくは１５～４０倍とすればよい。同様の点から、ＢＤＡＢの濃度は、反応混合液中の還元型アルブミンのモル濃度に対して、１．５～６倍、好ましくは１．５～３倍となり、反応混合液中の酸化剤のモル濃度に対して、０．０５～０．５倍となるように調整することが好ましい。
【0027】
本発明では、このようなＢＤＡＢ等のチオールと反応して吸光度が変化する発色物質を用いる発色反応で試料中の還元型アルブミンの濃度を測定する方法において、検体を２つに分け、一方の検体に還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を含む溶液を添加した試料（補正用試料）と、他方の検体に酸化剤を含まない同量の溶液を添加した試料（還元型アルブミン測定用試料）を準備する。次いで、それぞれ発色物質（例えばＢＤＡＢ）を含む試薬と混合し、所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）および吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定し、両者の吸光度差（ΔＯＤ）を求め、この吸光度差（ΔＯＤ）から試料中の還元型アルブミン濃度を算出する。
【0028】
遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤を添加すると還元型アルブミンは完全に酸化型アルブミンに変換されるが、酸化剤による処理を行った試料を、発色物質を含む試薬と混合した場合でも、ブランクに対して吸光度の減少が認められ、発色物質が還元型アルブミン以外の物質と反応しているまたは還元型アルブミン以外の物質によって測定波長の吸光度が影響を受けていると考えられる検体がある。このような検体では、還元型アルブミン以外の物質による吸光度の減少が還元型アルブミンによる減少として測定されることとなり、ＨＰＬＣ法との乖離を生じさせている原因と理解される。このような現象を踏まえ、本発明の方法では、酸化剤による処理を行った試料の吸光度（ＯＤｏｘ）と酸化剤による処理を行なわない試料の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）の吸光度差（ΔＯＤ）を用いることで、還元型アルブミンに由来しない吸光度変化を排除する補正を行って、還元型アルブミンを正確に測定する。
従来のＢＤＡＢ法の問題、およびその原因は、本発明者らによって初めて認識されたものであり、また、その解決原理は、ＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法とを組み合わせて還元型アルブミンを測定する方法とは全く異なることを理解されたい。
従来のＢＤＡＢ法の問題、およびその原因は、本発明者らによって初めて認識されたものであり、また、その解決原理は、ＢＣＰ法と改良ＢＣＰ法とを組み合わせて還元型アルブミンを測定する方法とは全く異なることを理解されたい。
【0029】
本発明の方法ではまた、遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤として特定の化合物を使用する。本発明者らの検討の結果、原因は不明であるが、改良ＢＣＰ法で、還元型アルブミンを酸化型アルブミンに変換するために用いられる５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）では、当該変換は生じるものの上記補正によって、標準法であるＨＰＬＣ法に対する乖離を減少させることが困難であることが分かっている。
【0030】
本発明者らは、様々な遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤について本発明の方法に対する適合性を検証し、特定の化合物を選択することで上記補正によって、標準法であるＨＰＬＣ法に対する乖離を減少させることができることを確認している。具体的には、本発明の好ましい実施形態において、遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤は、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される。
【0031】
アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アセチル、４－クロロ－３，５－ジニトロベンゾトリフルオリド（ＣＮＢＦ）、およびブロモアセトニルキノリニウムブロミド（ＢＱＢ）が挙げられる。ハロゲン化アセチルとしては、例えば、ハロゲン化酢酸、ハロゲン化アセトアミドおよびハロゲン化アセトフェノンが挙げられ、より具体的には、ヨード酢酸、ヨードアセトアミドおよびヨードアセトフェノン等が挙げられる。
マレイミドの誘導体としては、例えば、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－エチルマレイミド等のＮ－アルキル（好ましくはＮ－Ｃ１－５アルキル）マレイミド、Ｎ，Ｎ’－ｐ－フェニレンジマレイミド等のＮ，Ｎ’－Ｃ５－１２芳香族環ジマレイミドが挙げられる。置換ジチオジピリジンの置換基としては、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、等が挙げられ、具体的化合物としては、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、２，２’－ジチオビス（５－アミノピリジン）、２，２’－ジチオビス（５－ヒドロキシピリジン）が挙げられる。
これらの中でも、置換若しくは非置換ジチオジピリジンは、ＢＤＡＢの反応ｐＨであるｐＨ５～６で酸化反応ができる点で分析上有利であり、補正による効果も大きい点で好ましく、特に２，２’－ジピリジルジスルフィドが好ましい。
マレイミドの誘導体としては、例えば、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－エチルマレイミド等のＮ－アルキル（好ましくはＮ－Ｃ１－５アルキル）マレイミド、Ｎ，Ｎ’－ｐ－フェニレンジマレイミド等のＮ，Ｎ’－Ｃ５－１２芳香族環ジマレイミドが挙げられる。置換ジチオジピリジンの置換基としては、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、等が挙げられ、具体的化合物としては、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、２，２’－ジチオビス（５－アミノピリジン）、２，２’－ジチオビス（５－ヒドロキシピリジン）が挙げられる。
これらの中でも、置換若しくは非置換ジチオジピリジンは、ＢＤＡＢの反応ｐＨであるｐＨ５～６で酸化反応ができる点で分析上有利であり、補正による効果も大きい点で好ましく、特に２，２’－ジピリジルジスルフィドが好ましい。
【0032】
酸化剤の濃度は、酸化剤を含む試薬と試料とを混合した際に混合物中の還元型アルブミンがすべて酸化型アルブミンに変換し、更にＢＤＡＢを含む試薬を混合した際にＢＤＡＢの発色に悪影響を及ぼさない濃度とすることが好ましい。このような酸化剤の濃度は、酸化剤の種類の他、反応温度や反応時間によっても変わり得るが、通常、反応試薬中の酸化剤のモル濃度が、酸化剤を含む試薬と試料とを混合した際に混合物中のアルブミンのモル濃度の１０倍以上となり、この混合物に更にＢＤＡＢを含む試薬を混合した際にＢＤＡＢのモル濃度の２７０倍以下となるように設定すればよい。
この点、ヒト血清中のアルブミン濃度の正常値の上限は、約５ｇ／ｄＬであり、これに、還元型アルブミンの割合、試薬との混合による希釈および還元型アルブミンとの反応に必要なＢＤＡＢの量等を考慮すると、試薬中の酸化剤の濃度は、通常１～５００ｍＭ、好ましくは２～２００ｍＭとなるように設定される。なお、血清または血漿を希釈して反応に供する場合には、希釈率も考慮して酸化剤の濃度を決めることが好ましい。
この点、ヒト血清中のアルブミン濃度の正常値の上限は、約５ｇ／ｄＬであり、これに、還元型アルブミンの割合、試薬との混合による希釈および還元型アルブミンとの反応に必要なＢＤＡＢの量等を考慮すると、試薬中の酸化剤の濃度は、通常１～５００ｍＭ、好ましくは２～２００ｍＭとなるように設定される。なお、血清または血漿を希釈して反応に供する場合には、希釈率も考慮して酸化剤の濃度を決めることが好ましい。
【0033】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法では、タンパク変性剤を試料に添加する。
【0034】
本発明に使用されるタンパク変性剤としては、タンパク質を変性させ、ＢＤＡＢの呈色を上昇させる（＝感度を上げる）ものが好ましく、例えば、尿素；グアニジン塩酸塩、グアニジン硫酸塩等のグアニジン塩；フッ化ナトリウム、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム等の有機塩；エタノール等のアルコール；アセトン等のケトン類などが挙げられ、これらは単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
中でもグアニジン塩、特にグアニジン塩酸塩が好ましい。
また、タンパク変性作用を有する、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤等の界面活性剤を含んでもよく、上記タンパク質変性剤と共に用いてもよい。
中でもグアニジン塩、特にグアニジン塩酸塩が好ましい。
また、タンパク変性作用を有する、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤等の界面活性剤を含んでもよく、上記タンパク質変性剤と共に用いてもよい。
【0035】
このような界面活性剤としては、特許文献３に記載する界面活性剤が挙げられるが、中でも陰イオン界面活性剤が好ましい。また、陰イオン界面活性剤としては、アルキル硫酸エステル系界面活性剤が好ましく、特にラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
タンパク変性剤は、発色物質を含む試薬の添加前もしくは添加時に添加することが好ましい。
タンパク変性剤は、発色物質を含む試薬の添加前もしくは添加時に添加することが好ましい。
【0036】
タンパク変性剤の濃度は、変性剤の種類に応じて変わり得るが、ＢＤＡＢの還元型アルブミンの測定値に影響を与えずにＢＤＡＢの呈色を向上させる濃度とすることが好ましい。
通常、反応混合液中で０．５～８０質量％となるように試薬中の濃度を設定すればよく、好ましくは１０～７０質量％、より好ましくは２０～６０質量％となるように試薬中の濃度を設定すればよい。
通常、反応混合液中で０．５～８０質量％となるように試薬中の濃度を設定すればよく、好ましくは１０～７０質量％、より好ましくは２０～６０質量％となるように試薬中の濃度を設定すればよい。
【0037】
還元型アルブミンの測定に用いる検体は、典型的には、ヒト血清または血漿であるが、輸血用アルブミン製剤などの血液製剤等を検体とすることもできる。
【0038】
検体は、そのまま測定に供することもできるが、還元型アルブミンが比較的不安定なため、安定化剤を添加して分析に供する試料を調製することが好ましい。安定化剤としては、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩等を挙げることができ、クエン酸塩が好ましい。また、還元型アルブミンは、ｐＨ５～６で安定なため、これら安定化剤を検体に添加することにより、得られる試料がｐＨ５～６となるようにすることが好ましい。
【0039】
分析に供する試料の量は、試薬中のＢＤＡＢおよび酸化剤等の濃度および試薬分注量に応じて、代わり得るが、通常は、１～４０μＬであり、好ましくは２～１５μＬである。
試料に酸化剤を含む試薬を添加した際の反応時間は、１０～１２０分とすることができ、１０～２０分が好ましい。また、試料と酸化剤を含む試薬の混合液にＢＤＡＢを含む発色試薬を添加した際の反応温度は、１５～３７℃であり、好ましくは３７℃である。試料と酸化剤を含む試薬の混合液にＢＤＡＢを含む発色試薬を添加した際の反応時間は、１０～３０分とすることができ、１５～２０分が好ましい。また、反応温度は、通常１５～３７℃とすることができ、３７℃が好ましい。
吸光度の測定は、例えば、ＢＤＡＢの最大吸収波長である６１２ｎｍ付近、具体的には５７０～６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍ～６２５ｎｍの範囲から選択される波長、特に好ましくは最大吸収波長である６１２ｎｍで行えばよい。また、ＢＤＡＢに対するチオール基の求核反応は、酸性下で生じるため、酸性の溶液中でＢＤＡＢと還元型アルブミンを反応させることが好ましい。試料および試薬の分注から吸光度の測定を、自動分析機を用いて行うことも可能である。
試料に酸化剤を含む試薬を添加した際の反応時間は、１０～１２０分とすることができ、１０～２０分が好ましい。また、試料と酸化剤を含む試薬の混合液にＢＤＡＢを含む発色試薬を添加した際の反応温度は、１５～３７℃であり、好ましくは３７℃である。試料と酸化剤を含む試薬の混合液にＢＤＡＢを含む発色試薬を添加した際の反応時間は、１０～３０分とすることができ、１５～２０分が好ましい。また、反応温度は、通常１５～３７℃とすることができ、３７℃が好ましい。
吸光度の測定は、例えば、ＢＤＡＢの最大吸収波長である６１２ｎｍ付近、具体的には５７０～６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍ～６２５ｎｍの範囲から選択される波長、特に好ましくは最大吸収波長である６１２ｎｍで行えばよい。また、ＢＤＡＢに対するチオール基の求核反応は、酸性下で生じるため、酸性の溶液中でＢＤＡＢと還元型アルブミンを反応させることが好ましい。試料および試薬の分注から吸光度の測定を、自動分析機を用いて行うことも可能である。
【0040】
改良ＢＤＡＢ法では、酸化剤での処理を行った試料と、酸化剤での処理を行わなかった試料との吸光度差（ΔＯＤ）を利用して還元型アルブミンを測定するために、従来のＢＤＡＢ法と異なり、精製アルブミン、および精製還元型アルブミンのみならず、標準血清または標準血漿を用いて検量線を作成することが可能である。この場合、検量線は、標準血清または標準血漿中の還元型アルブミン濃度を標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）で決定しておく一方で、標準血清または標準血漿の希釈系列について酸化剤での処理を行った試料と、酸化剤での処理を行わなかった試料との吸光度差（ΔＯＤ）を決定して、還元型アルブミン濃度と吸光度差（ΔＯＤ）をプロットして作成することができる。
【0041】
より具体的には、本発明の一の実施形態においては、キャリブレーターとして標準血清または標準血漿等を用いてその希釈系列を作成し、希釈系列の各希釈血清または血漿に酸化剤を含む溶液を添加し、次いでＢＤＡＢを含む試薬と混合した後で、所定の波長で吸光度（ＯＤｏｘ）を測定し、他方、同じ希釈系列の各希釈血清または血漿を、酸化剤を含まない溶液を同量添加し、次いでＢＤＡＢを含む試薬と混合した後、所定の波長で吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を測定し、各希釈血清または血漿について、吸光度（ＯＤｏｘ）と吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）との吸光度差（ΔＯＤ）を求め、各吸光度差（ΔＯＤ）と、各希釈血清または血漿の既知の還元型アルブミン濃度（標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）で決定される）とから検量線を作成する。このような補正がなされた検量線は、還元型アルブミン以外の物質によるＢＤＡＢの発色への影響が除かれているため、標準法と高い相関係数を有し傾きが１に近い。このため、従来のＢＤＡＢ法より、より正確に還元型アルブミン濃度を測定することができる。
【0042】
本発明による改良ＢＤＡＢ法は、ＢＣＰ法または改良ＢＣＰ法と組み合わせて、簡易に、総アルブミン中の酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を決定することができる。
例えば、上記の改良ＢＤＡＢ法で還元型アルブミン濃度を決定し、改良ＢＣＰ法により総アルブミン濃度を決定し、還元型アルブミン濃度を総アルブミン濃度で割って、総アルブミン中の還元型アルブミンの割合を決定することもできる。また、そこで得られた還元型アルブミンの割合を１から差し引くことにより酸化型アルブミンの割合を算出する事もできる。
例えば、上記の改良ＢＤＡＢ法で還元型アルブミン濃度を決定し、改良ＢＣＰ法により総アルブミン濃度を決定し、還元型アルブミン濃度を総アルブミン濃度で割って、総アルブミン中の還元型アルブミンの割合を決定することもできる。また、そこで得られた還元型アルブミンの割合を１から差し引くことにより酸化型アルブミンの割合を算出する事もできる。
【0043】
２．還元型アルブミンを測定するためのキット
本発明の他の実施形態は、上述した還元型アルブミンを測定する方法を実施するためのキットに関する。
従って、この実施形態によるキットは、チオールと反応して吸光度が変化する発色物質と、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤とを含む。発色物質および酸化剤の具体例は、上述の通りである。好ましい実施形態では、発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）であり、酸化剤は、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される。また、酸化剤は、置換若しくは非置換ジチオジピリジンがより好ましく、２，２’－ジピリジルジスルフィドが特に好ましい。
本発明の他の実施形態は、上述した還元型アルブミンを測定する方法を実施するためのキットに関する。
従って、この実施形態によるキットは、チオールと反応して吸光度が変化する発色物質と、還元型アルブミンの遊離ＳＨ基を酸化する酸化剤とを含む。発色物質および酸化剤の具体例は、上述の通りである。好ましい実施形態では、発色物質は、４－４’－ビスジメチルアミノベンズヒドロール（ＢＤＡＢ）であり、酸化剤は、アルキル化剤、マレイミドおよびその誘導体、ならびに置換若しくは非置換ジチオジピリジンからなる群から選択される。また、酸化剤は、置換若しくは非置換ジチオジピリジンがより好ましく、２，２’－ジピリジルジスルフィドが特に好ましい。
【0044】
また、好ましい実施形態では、キットは、タンパク変性剤を含み、その具体例も上述の通りである。
また、酸化剤、ＢＤＡＢおよびタンパク変性剤の試薬中の濃度も、前述の通り設定することができる。
また、酸化剤、ＢＤＡＢおよびタンパク変性剤の試薬中の濃度も、前述の通り設定することができる。
【0045】
また、上述の通り、改良ＢＤＡＢ法用のキットは、キャリブレーターとして、血清若しくは血漿の標準品、精製アルブミン、または精製還元型アルブミンを含むことができ、特に、製造が容易な血清若しくは血漿の標準品が便宜である。
従来のＢＤＡＢ法では、Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使って精製した還元型アルブミンをキャリブレーターとして使用しており、キャリブレーターの調製に非常に手間がかかっていた。改良ＢＤＡＢ法用のキットでは、このような調整に手間のかかる標準品を用いる必要はなく、これは実務上大きな利点である。
従来のＢＤＡＢ法では、Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使って精製した還元型アルブミンをキャリブレーターとして使用しており、キャリブレーターの調製に非常に手間がかかっていた。改良ＢＤＡＢ法用のキットでは、このような調整に手間のかかる標準品を用いる必要はなく、これは実務上大きな利点である。
【0046】
キットを構成する各試薬は、生化学または臨床化学検査用試薬で通常用いられる成分を含んでよい。このような成分としては、例えば、緩衝剤、防腐剤、タンパク変性剤に該当しない界面活性剤等が挙げられる。これらの成分は、生化学または臨床化学検査用試薬で用いられる際に通常選択される濃度範囲とすればよい。
界面活性剤としては、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などが挙げられる。
また、緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、ベロナール、ホウ酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、グッド緩衝剤（例えば３－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等）が挙げられる。これら緩衝剤を含む緩衝液は、試料および試薬を、改良ＢＤＡＢ法を実施する上で適切なｐＨを保持するために、適宜適切な緩衝液を選択することが好ましい。特に、還元型アルブミンは、ｐＨ５～６で安定なため、試料に添加される試薬、特に発色物質を含む試薬は、緩衝液でｐＨ５～６となるように調製することが好ましい。他方、酸化剤を含む試薬は、ｐＨ５～８とすることができるが、ｐＨ５～６とすることが好ましい。
界面活性剤としては、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などが挙げられる。
また、緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、ベロナール、ホウ酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、グッド緩衝剤（例えば３－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等）が挙げられる。これら緩衝剤を含む緩衝液は、試料および試薬を、改良ＢＤＡＢ法を実施する上で適切なｐＨを保持するために、適宜適切な緩衝液を選択することが好ましい。特に、還元型アルブミンは、ｐＨ５～６で安定なため、試料に添加される試薬、特に発色物質を含む試薬は、緩衝液でｐＨ５～６となるように調製することが好ましい。他方、酸化剤を含む試薬は、ｐＨ５～８とすることができるが、ｐＨ５～６とすることが好ましい。
【0047】
本発明の一の実施形態によれば、キットは、酸化剤、および緩衝液を含有する第１試薬と、ＢＤＡＢおよび緩衝液を含有する第２試薬とを含み、前記第一試薬、および前記第二試薬のいずれか一方または両方にタンパク質変性剤を含む。
【0048】
より具体的なキットの例を、以下に示す。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【実施例0049】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0050】
Ｉ．従来のＢＤＡＢ法との比較による改良ＢＤＡＢ法の検討
本試験では、改良ＢＤＡＢ法の補正による効果を従来のＢＤＡＢ法と比較して評価した。
１．材料および測定方法
１－１．検体
ドナーから個別に採取した血液から調製したヒト血清および血漿を使用し、安定化剤であるクエン酸緩衝液で、還元型アルブミン濃度が一律１８３μＭになるように希釈して試料を調製した。還元型アルブミン濃度は、下記「１－３」に記載する標準法により決定した。
本試験では、改良ＢＤＡＢ法の補正による効果を従来のＢＤＡＢ法と比較して評価した。
１．材料および測定方法
１－１．検体
ドナーから個別に採取した血液から調製したヒト血清および血漿を使用し、安定化剤であるクエン酸緩衝液で、還元型アルブミン濃度が一律１８３μＭになるように希釈して試料を調製した。還元型アルブミン濃度は、下記「１－３」に記載する標準法により決定した。
【0051】
１－２．標準品
標準血清としてコンセーラ１号（日水製薬）を使用し、クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で希釈系列を調製してキャリブレーターとした（希釈倍数：１～１０倍。還元型アルブミン濃度：１０～３００μＭ）。還元型アルブミン濃度は、下記「１－３」に記載する標準法により決定した。
標準血清としてコンセーラ１号（日水製薬）を使用し、クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で希釈系列を調製してキャリブレーターとした（希釈倍数：１～１０倍。還元型アルブミン濃度：１０～３００μＭ）。還元型アルブミン濃度は、下記「１－３」に記載する標準法により決定した。
【0052】
１－３．標準法による還元型アルブミン濃度ならびに酸化型または還元型アルブミンの割合（基準値）の決定
試料中の酸化型または還元型アルブミンの割合（ピーク面積％（以下、酸化型または還元型アルブミンの割合について、％は、ピーク面積％を意味する）、基準値）は、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、試料中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、下記式の通り、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
ＨＰＬＣ法による酸化型または還元型アルブミンの割合の決定は、特許文献５に従って実施した。具体的には、イオン交換基としてＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）を有するイオン交換樹脂が充填された陰イオン交換カラムを使用し、以下の緩衝液Ａにて平衡化した。その後、検体を注入し、同時に、緩衝液Ａ（１００％から７５％）と以下の緩衝液Ｂ（０％から２５％）によるリニアグラジエントに、７．５分間１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速でかけて、酸化型アルブミンおよび還元型アルブミンを分離し、励起波長２８０ｎｍ、検出波長３４０ｎｍの蛍光での検出を行った。
緩衝液Ａ：６０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
緩衝液Ｂ：１Ｍ ＭｇＣｌ２
改良ＢＣＰ法による総アルブミン濃度の決定は、特許文献３の記載に従って実施をした。１５μＬの検体に対して８５μＬの第一試薬（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、１００μＭ ＤＴＮＢ、および０．０３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有）を添加、３７℃で５分間インキュベーション後、１５０μＬの第二試薬（２５０ｍコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に、１５０μＭブロモクレソールパープル、および０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有）を添加して、さらに３７℃で２０分間インキュベーションし、６００ｎｍ（主波長）／６６０（副波長）で吸光度を測定した
一例として、血漿１検体をＨＰＬＣ法（標準法）により分析したクロマトグラムを図１に示す。還元型アルブミンと酸化型アルブミンを示すピークの面積比は、それぞれ、７９．７％および２０．３％である。また、改良ＢＣＰ法（標準法）により同じ検体の総アルブミン濃度は、５５０μＭと決定され、これにＨＰＬＣ法により決定された還元型アルブミンの割合（７９．７％）をかけることで還元型アルブミン濃度が、４３９μＭと算出された。
試料中の酸化型または還元型アルブミンの割合（ピーク面積％（以下、酸化型または還元型アルブミンの割合について、％は、ピーク面積％を意味する）、基準値）は、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、試料中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、下記式の通り、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
【数1】
ＨＰＬＣ法による酸化型または還元型アルブミンの割合の決定は、特許文献５に従って実施した。具体的には、イオン交換基としてＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）を有するイオン交換樹脂が充填された陰イオン交換カラムを使用し、以下の緩衝液Ａにて平衡化した。その後、検体を注入し、同時に、緩衝液Ａ（１００％から７５％）と以下の緩衝液Ｂ（０％から２５％）によるリニアグラジエントに、７．５分間１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速でかけて、酸化型アルブミンおよび還元型アルブミンを分離し、励起波長２８０ｎｍ、検出波長３４０ｎｍの蛍光での検出を行った。
緩衝液Ａ：６０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
緩衝液Ｂ：１Ｍ ＭｇＣｌ２
改良ＢＣＰ法による総アルブミン濃度の決定は、特許文献３の記載に従って実施をした。１５μＬの検体に対して８５μＬの第一試薬（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、１００μＭ ＤＴＮＢ、および０．０３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有）を添加、３７℃で５分間インキュベーション後、１５０μＬの第二試薬（２５０ｍコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に、１５０μＭブロモクレソールパープル、および０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有）を添加して、さらに３７℃で２０分間インキュベーションし、６００ｎｍ（主波長）／６６０（副波長）で吸光度を測定した
一例として、血漿１検体をＨＰＬＣ法（標準法）により分析したクロマトグラムを図１に示す。還元型アルブミンと酸化型アルブミンを示すピークの面積比は、それぞれ、７９．７％および２０．３％である。また、改良ＢＣＰ法（標準法）により同じ検体の総アルブミン濃度は、５５０μＭと決定され、これにＨＰＬＣ法により決定された還元型アルブミンの割合（７９．７％）をかけることで還元型アルブミン濃度が、４３９μＭと算出された。
【0053】
１－４．前処理と吸光度測定
全ての検体および標準品希釈液は、それぞれ補正用と還元型アルブミン測定用として５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の検体および標準品希釈液には１０μＬの２ｍＭマレイミド(シグマアルドリッチ製、５００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を、還元型アルブミン測定用の検体および標準品希釈液には５００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２を同量添加、混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（１５μＭ ＢＤＡＢ（東京化成工業製）、および６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）を、２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、キュベット（１０ｍｍパス）に溶液を移して６１２ｎｍの波長で、吸光度を測定した。前処理および吸光度測定は、各検体および各標準品希釈液について、補正用と還元型アルブミン測定用の試料を３セット（ｎ＝３）準備して実施した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用い、次に述べる補正、検量線作成、濃度算出に使用した。）
全ての検体および標準品希釈液は、それぞれ補正用と還元型アルブミン測定用として５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の検体および標準品希釈液には１０μＬの２ｍＭマレイミド(シグマアルドリッチ製、５００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を、還元型アルブミン測定用の検体および標準品希釈液には５００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２を同量添加、混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（１５μＭ ＢＤＡＢ（東京化成工業製）、および６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）を、２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、キュベット（１０ｍｍパス）に溶液を移して６１２ｎｍの波長で、吸光度を測定した。前処理および吸光度測定は、各検体および各標準品希釈液について、補正用と還元型アルブミン測定用の試料を３セット（ｎ＝３）準備して実施した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用い、次に述べる補正、検量線作成、濃度算出に使用した。）
【0054】
１－５．酸化剤処理による還元型アルブミンの消失の確認
標準品希釈液に、酸化剤溶液を添加する前後の補正用試料をＨＰＬＣ法で分析し、酸化剤により還元型アルブミンのピークが消失しているかを確認した。図２に、標準品（希釈倍数：１倍）に、２ｍＭマレイミド溶液を添加する前後の補正用試料をＨＰＬＣ法で分析したクロマトグラムの例を示す。酸化剤により還元型アルブミンのピークが消失していることが確認された。
標準品希釈液に、酸化剤溶液を添加する前後の補正用試料をＨＰＬＣ法で分析し、酸化剤により還元型アルブミンのピークが消失しているかを確認した。図２に、標準品（希釈倍数：１倍）に、２ｍＭマレイミド溶液を添加する前後の補正用試料をＨＰＬＣ法で分析したクロマトグラムの例を示す。酸化剤により還元型アルブミンのピークが消失していることが確認された。
【0055】
１－６．検量線の作成
改良ＢＤＡＢ法では、以下の表に示す通り、各標準品希釈液の補正用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｏｘ）から対応する還元型アルブミン測定用試料の同じ波長での吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を差し引き、ΔＯＤを算出した。
次いで、各標準品希釈液のΔＯＤと、上記１－３より算出した還元型アルブミン濃度をプロットし、検量線を作成した。作成した検量線は、図３に示す。検量線は、最小二乗法による線形検量線（図３Ａ）と、４パラメータロジスティクスモデルによる非線形検量線（図３Ｂ）を作成した。
比較対象として、特許文献４に記載する従来のＢＤＡＢ法に従って、還元型アルブミン濃度を決定する検量線を作成した（図３Ｃ）。ここでは各標準品希釈液の補正用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｏｘ）は使用せずに（補正無し）、各標準品希釈液の還元型アルブミン測定用試料の同じ波長での吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）のみを使い、各標準品希釈液の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）と上記１－３より算出した還元型アルブミン濃度をプロットし、検量線を作成した。
改良ＢＤＡＢ法では、以下の表に示す通り、各標準品希釈液の補正用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｏｘ）から対応する還元型アルブミン測定用試料の同じ波長での吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を差し引き、ΔＯＤを算出した。
【表10】
次いで、各標準品希釈液のΔＯＤと、上記１－３より算出した還元型アルブミン濃度をプロットし、検量線を作成した。作成した検量線は、図３に示す。検量線は、最小二乗法による線形検量線（図３Ａ）と、４パラメータロジスティクスモデルによる非線形検量線（図３Ｂ）を作成した。
比較対象として、特許文献４に記載する従来のＢＤＡＢ法に従って、還元型アルブミン濃度を決定する検量線を作成した（図３Ｃ）。ここでは各標準品希釈液の補正用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｏｘ）は使用せずに（補正無し）、各標準品希釈液の還元型アルブミン測定用試料の同じ波長での吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）のみを使い、各標準品希釈液の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）と上記１－３より算出した還元型アルブミン濃度をプロットし、検量線を作成した。
【0056】
１－７．各検体の還元型アルブミン濃度ならびに酸化型アルブミンの割合の決定
改良ＢＤＡＢ法では、各検体の補正用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｏｘ）から対応する還元型アルブミン測定用試料の同じ波長での吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を差し引き、ΔＯＤを算出した。各データを、以下の表に示す。
次いで、各検体のΔＯＤを、上述の各標準品希釈液のΔＯＤと還元型アルブミン濃度をプロットした検量線（線形および非線形）に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。
従来のＢＤＡＢ法に従った方法では、各検体の還元型アルブミン測定用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を、上述の各標準品希釈液の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）と還元型アルブミン濃度をプロットした検量線に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。
また、何れの方法でも、算出した還元型アルブミン濃度を、改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した同じ検体の総アルブミン濃度で割り、還元型アルブミンの割合（％）を算出した。さらに、そこで算出した還元型アルブミンの割合（％）を１から差し引き、酸化型アルブミンの割合を算出した（近年の論文等では酸化型アルブミンの割合での表示が一般的になりつつあるため、以下では酸化型アルブミンの割合を記載する）。得られた還元型アルブミン濃度および酸化型アルブミンの割合を以下の表に示す。
改良ＢＤＡＢ法では、各検体の補正用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｏｘ）から対応する還元型アルブミン測定用試料の同じ波長での吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を差し引き、ΔＯＤを算出した。各データを、以下の表に示す。
【表11】
次いで、各検体のΔＯＤを、上述の各標準品希釈液のΔＯＤと還元型アルブミン濃度をプロットした検量線（線形および非線形）に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。
従来のＢＤＡＢ法に従った方法では、各検体の還元型アルブミン測定用試料の６１２ｎｍでの吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を、上述の各標準品希釈液の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）と還元型アルブミン濃度をプロットした検量線に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。
また、何れの方法でも、算出した還元型アルブミン濃度を、改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した同じ検体の総アルブミン濃度で割り、還元型アルブミンの割合（％）を算出した。さらに、そこで算出した還元型アルブミンの割合（％）を１から差し引き、酸化型アルブミンの割合を算出した（近年の論文等では酸化型アルブミンの割合での表示が一般的になりつつあるため、以下では酸化型アルブミンの割合を記載する）。得られた還元型アルブミン濃度および酸化型アルブミンの割合を以下の表に示す。
【表12】
【表13】
【0057】
１－８．評価方法
従来のＢＤＡＢ法（補正なし）、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形検量線）および改良ＢＤＡＢ法（補正あり、非線形検量線）で決定した還元型アルブミンの濃度、ならびにそれらの方法と改良ＢＣＰ法から決定した酸化型アルブミンの割合（１－（還元型アルブミン濃度／トータルアルブミン濃度）から、標準法で決定したそれぞれの基準値を差し引き、その差の絶対値を基準法からの乖離とした。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）が、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小しているかどうかによって各酸化剤による補正効果を評価した。
従来のＢＤＡＢ法（補正なし）、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形検量線）および改良ＢＤＡＢ法（補正あり、非線形検量線）で決定した還元型アルブミンの濃度、ならびにそれらの方法と改良ＢＣＰ法から決定した酸化型アルブミンの割合（１－（還元型アルブミン濃度／トータルアルブミン濃度）から、標準法で決定したそれぞれの基準値を差し引き、その差の絶対値を基準法からの乖離とした。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）が、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小しているかどうかによって各酸化剤による補正効果を評価した。
【0058】
【0059】
【0060】
表１４および図４で示すように、従来のＢＤＡＢ法では１８３μＭから大きく乖離する検体があったが、改良ＢＤＡＢ法では、１例を除く全ての検体において乖離が減少することが確認された。
また、表１５および図５で示すように、従来のＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化元型アルブミンの割合（％）は、ＨＰＬＣ法（標準法）と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）から大きく乖離する検体があったが、改良ＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）は、全ての検体でその乖離が減少することが確認された。また、図６に示す通り、従来のＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）に比べ、改良ＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）は、ＨＰＬＣ法（標準法）と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）に対する相関が改善した。
また、表１５および図５で示すように、従来のＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化元型アルブミンの割合（％）は、ＨＰＬＣ法（標準法）と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）から大きく乖離する検体があったが、改良ＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）は、全ての検体でその乖離が減少することが確認された。また、図６に示す通り、従来のＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）に比べ、改良ＢＤＡＢ法と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）は、ＨＰＬＣ法（標準法）と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した酸化型アルブミンの割合（％）に対する相関が改善した。
【0061】
ＩＩ．各種酸化剤の比較検討（１）
本試験は、試験Ｉの結果を踏まえ、様々な酸化剤について改良ＢＤＡＢ法を従来のＢＤＡＢ法と比較して評価した。
本試験は、試験Ｉの結果を踏まえ、様々な酸化剤について改良ＢＤＡＢ法を従来のＢＤＡＢ法と比較して評価した。
【0062】
１．材料および測定
１－１．検体および標準品
検体は試験Ｉで使用した血清検体を使用し、標準品は試験Ｉで使用した標準品を使用した。ただし、本試験は全ての検体を一律、クエン酸緩衝液と１：１の体積比で混合して１／２に希釈した。従って、本試験で用いる検体の還元型アルブミン濃度は異なる。
１－１．検体および標準品
検体は試験Ｉで使用した血清検体を使用し、標準品は試験Ｉで使用した標準品を使用した。ただし、本試験は全ての検体を一律、クエン酸緩衝液と１：１の体積比で混合して１／２に希釈した。従って、本試験で用いる検体の還元型アルブミン濃度は異なる。
【0063】
１－２．標準法による還元型アルブミン濃度ならびに酸化型または還元型アルブミンの割合（基準値）の決定
試験Ｉと同様に、試料中の酸化型または還元型アルブミンの割合（％、基準値）は、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、試料中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
試験Ｉと同様に、試料中の酸化型または還元型アルブミンの割合（％、基準値）は、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、試料中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
【0064】
１－３．酸化剤
酸化剤溶液として、以下の８種類のチオ－ル反応剤の溶液を調製した。
・２００ｍＭ ４－ビニルピリジン（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・２００ｍＭ ヨードアセトアミド（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・２００ｍＭ ヨード酢酸 (富士フィルム和光純薬製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・１ｍＭ ２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・１ｍＭ ６，６’－ジチオジニコチン酸（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・４ｍＭ マレイミド （シグマアルドリッチ製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）
・４ｍＭ ２，２’－ジピリジルジスルフィド（東京化成工業製、５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で希釈）
・４ｍＭ ４，４’－ジピリジルジスルフィド（東京化成工業製、５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で希釈）
酸化剤溶液として、以下の８種類のチオ－ル反応剤の溶液を調製した。
・２００ｍＭ ４－ビニルピリジン（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・２００ｍＭ ヨードアセトアミド（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・２００ｍＭ ヨード酢酸 (富士フィルム和光純薬製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・１ｍＭ ２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・１ｍＭ ６，６’－ジチオジニコチン酸（東京化成工業製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）
・４ｍＭ マレイミド （シグマアルドリッチ製、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）
・４ｍＭ ２，２’－ジピリジルジスルフィド（東京化成工業製、５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で希釈）
・４ｍＭ ４，４’－ジピリジルジスルフィド（東京化成工業製、５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で希釈）
【0065】
１－４．前処理と吸光度測定
前処理および吸光度測定は基本的には上記試験Ｉと同様に行ったが、より多くの検体に対応するためにプレートリーダーを使用した。それに合わせて感度を担保するため、試料および各試薬の添加量、酸化剤や他の試薬の濃度等に若干の変更を加えた。
具体的には、全ての検体および標準品希釈液は、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の検体および標準品希釈液には１０μＬの各酸化剤を、還元型アルブミン測定用の検体および標準品希釈液には２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２２５μＬの発色試薬（３５μＭ ＤＢＡＢ（東京化成工業製）、および６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）を２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で、吸光度を測定した。前処理および吸光度測定は、各検体および各標準品希釈液について、補正用と還元型アルブミン測定用の試料を３セット（ｎ＝３）準備して実施した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用い、次に述べる補正、検量線作成、濃度算出に使用した。
前処理および吸光度測定は基本的には上記試験Ｉと同様に行ったが、より多くの検体に対応するためにプレートリーダーを使用した。それに合わせて感度を担保するため、試料および各試薬の添加量、酸化剤や他の試薬の濃度等に若干の変更を加えた。
具体的には、全ての検体および標準品希釈液は、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の検体および標準品希釈液には１０μＬの各酸化剤を、還元型アルブミン測定用の検体および標準品希釈液には２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２２５μＬの発色試薬（３５μＭ ＤＢＡＢ（東京化成工業製）、および６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）を２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で、吸光度を測定した。前処理および吸光度測定は、各検体および各標準品希釈液について、補正用と還元型アルブミン測定用の試料を３セット（ｎ＝３）準備して実施した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用い、次に述べる補正、検量線作成、濃度算出に使用した。
【0066】
１－５．検量線の作成、還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合の決定
試験Ｉと同様にして標準品希釈系列を使用して、検量線を作成し（補正ありの線形検量線、補正ありの非線形検量線、および補正無しの検量線）、改良ＢＤＡＢ法では、各検体のΔＯＤを補正ありの線形検量線、または補正ありの非線形検量線に当てはめ、従来のＢＤＡＢ法では、各検体を酸化剤で処理しない試料の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を、補正無しの検量線に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。また、何れの方法でも、算出した還元型アルブミン濃度を、改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した同じ検体の総アルブミン濃度で割り、還元型アルブミンの割合（％）を算出し、さらに還元型アルブミンの割合を１から差し引いて酸化型アルブミンの割合（％）を算出した。
試験Ｉと同様にして標準品希釈系列を使用して、検量線を作成し（補正ありの線形検量線、補正ありの非線形検量線、および補正無しの検量線）、改良ＢＤＡＢ法では、各検体のΔＯＤを補正ありの線形検量線、または補正ありの非線形検量線に当てはめ、従来のＢＤＡＢ法では、各検体を酸化剤で処理しない試料の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を、補正無しの検量線に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。また、何れの方法でも、算出した還元型アルブミン濃度を、改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した同じ検体の総アルブミン濃度で割り、還元型アルブミンの割合（％）を算出し、さらに還元型アルブミンの割合を１から差し引いて酸化型アルブミンの割合（％）を算出した。
【0067】
１－６．評価方法
試験Ｉと同様にして各方法で決定した還元型アルブミンの濃度または酸化型アルブミンの割合から、標準法で決定したそれぞれの基準値を差し引き、その差の絶対値を基準法からの乖離とした。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）が、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小しているかどうかによって各酸化剤による補正効果を評価した。
試験Ｉと同様にして各方法で決定した還元型アルブミンの濃度または酸化型アルブミンの割合から、標準法で決定したそれぞれの基準値を差し引き、その差の絶対値を基準法からの乖離とした。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）が、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小しているかどうかによって各酸化剤による補正効果を評価した。
【0068】
２．結果
以下の表１６に、還元型アルブミン濃度を、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により決定した結果を、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度と共に示す。また、表１７に、酸化型アルブミンの割合を、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と改良ＢＣＰ法により決定した結果を、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した還元型アルブミン濃度と共に示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）を利用する場合、線形検量線と非線形検量線を作成して決定した還元型アルブミン濃度および当該還元型アルブミン濃度を使用して算出した酸化型アルブミンの割合を示す。
表１８および１９には、酸化剤として、４－ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、またはマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により決定した還元型アルブミン濃度およびこれに改良ＢＣＰ法を組み合わせて決定した酸化型アルブミンの割合が、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度および標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対して乖離した程度を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）を利用する場合、線形検量線と非線形検量線を作成して決定した還元型アルブミン濃度および当該還元型アルブミン濃度を使用して算出した酸化型アルブミンの割合を示す。
上記表に示す通り、８種の酸化剤の総てにおいて、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）での補正効果が認められ、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比べて還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合は標準法による基準値に対して乖離が減少した。
以下の表１６に、還元型アルブミン濃度を、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により決定した結果を、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度と共に示す。また、表１７に、酸化型アルブミンの割合を、酸化剤としてマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と改良ＢＣＰ法により決定した結果を、標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した還元型アルブミン濃度と共に示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）を利用する場合、線形検量線と非線形検量線を作成して決定した還元型アルブミン濃度および当該還元型アルブミン濃度を使用して算出した酸化型アルブミンの割合を示す。
表１８および１９には、酸化剤として、４－ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）、６，６’－ジチオジニコチン酸、マレイミド、２，２’－ジピリジルジスルフィド、４，４’－ジピリジルジスルフィド、またはマレイミドを用いる改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により決定した還元型アルブミン濃度およびこれに改良ＢＣＰ法を組み合わせて決定した酸化型アルブミンの割合が、標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度および標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対して乖離した程度を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）を利用する場合、線形検量線と非線形検量線を作成して決定した還元型アルブミン濃度および当該還元型アルブミン濃度を使用して算出した酸化型アルブミンの割合を示す。
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
上記表に示す通り、８種の酸化剤の総てにおいて、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）での補正効果が認められ、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比べて還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合は標準法による基準値に対して乖離が減少した。
【0069】
ＩＩＩ．各種酸化剤の比較検討（２）
本試験は、試験Ｉの結果を踏まえ、更に様々な酸化剤について改良ＢＤＡＢ法を従来のＢＤＡＢ法と比較して評価した。
本試験は、試験Ｉの結果を踏まえ、更に様々な酸化剤について改良ＢＤＡＢ法を従来のＢＤＡＢ法と比較して評価した。
【0070】
１．材料および測定
１－１．検体および標準品
検体および標準品は、試験ＩＩと同じである。また、検体をクエン酸緩衝液と１：１の体積比で混合して１／２に希釈した点も同一である。
１－１．検体および標準品
検体および標準品は、試験ＩＩと同じである。また、検体をクエン酸緩衝液と１：１の体積比で混合して１／２に希釈した点も同一である。
【0071】
１－２．標準法による還元型アルブミン濃度ならびに酸化型または還元型アルブミンの割合（基準値）の決定
試験Ｉと同様に、試料中の酸化型または還元型アルブミンの割合（％、基準値）は、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、試料中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
試験Ｉと同様に、試料中の酸化型または還元型アルブミンの割合（％、基準値）は、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、試料中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
【0072】
１－３．酸化剤、前処理および吸光度測定
酸化剤として、４種類のチオール反応剤を用い、基本的には試験ＩＩと同様に前処理および吸光度測定を行ったが、試薬の反応性や溶解度に合わせて、試薬調製用緩衝液、試薬、および混合比を変更して実施した。各チオール反応剤、前処理条件および吸光度測定は以下の通りである。
酸化剤として、４種類のチオール反応剤を用い、基本的には試験ＩＩと同様に前処理および吸光度測定を行ったが、試薬の反応性や溶解度に合わせて、試薬調製用緩衝液、試薬、および混合比を変更して実施した。各チオール反応剤、前処理条件および吸光度測定は以下の通りである。
【0073】
５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）
４ｍＭ ５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（シグマアルドリッチ製）を、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に希釈して、酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用および還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には１０μＬの酸化剤溶液を、還元型アルブミン測定用の検試料には２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（３９μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
４ｍＭ ５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（シグマアルドリッチ製）を、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に希釈して、酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用および還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には１０μＬの酸化剤溶液を、還元型アルブミン測定用の検試料には２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（３９μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
【0074】
２，２’－ジチオ二安息香酸
０．３ｍＭ２，２’－ジチオ二安息香酸（東京化成工業製）を、６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に希釈して、酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には３５μＬの酸化剤溶液を添加し、還元型アルブミン測定用の試料には上記トリス緩衝液を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（３９μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
０．３ｍＭ２，２’－ジチオ二安息香酸（東京化成工業製）を、６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に希釈して、酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には３５μＬの酸化剤溶液を添加し、還元型アルブミン測定用の試料には上記トリス緩衝液を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（３９μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
【0075】
ビス（４－ニトロフェニル）ジスルフィド
０．４ｍＭビス（４－ニトロフェニル）ジスルフィド（東京化成工業製）を、６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）および２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に希釈して、酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には３５μＬの酸化剤溶液を添加し、還元型アルブミン測定用の試料には上記トリス緩衝液を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（３９μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
０．４ｍＭビス（４－ニトロフェニル）ジスルフィド（東京化成工業製）を、６Ｍ塩酸グアニジン（東京化成工業製）および２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に希釈して、酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には３５μＬの酸化剤溶液を添加し、還元型アルブミン測定用の試料には上記トリス緩衝液を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２００μＬの発色試薬（３９μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
【0076】
過酸化水素
５０ｍＭ過酸化水素（富士フィルム和光純薬製）を、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２に希釈して酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には１０μＬの酸化剤溶液を添加し、還元型アルブミン測定用の試料にはトリス緩衝液、ｐＨ７．２を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２２５μＬの発色試薬（３５μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
５０ｍＭ過酸化水素（富士フィルム和光純薬製）を、２５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．２に希釈して酸化剤溶液を調製した。次に、各希釈検体および各標準品希釈液を、補正用と還元型アルブミン測定用として１５μＬずつ９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。補正用の試料には１０μＬの酸化剤溶液を添加し、還元型アルブミン測定用の試料にはトリス緩衝液、ｐＨ７．２を同量添加、混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、２２５μＬの発色試薬（３５μＭ ＤＢＡＢ、および６Ｍ塩酸グアニジンを２５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に溶解）を添加、混合し、室温で２０分間インキュベーションした後、プレートリーダーにて６１２ｎｍの波長で吸光度を測定した。３セット（ｎ＝３）の平均値を各検体および各標準品希釈液の測定値として用いた。
【0077】
１－４．検量線の作成、還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合の決定
試験Ｉと同様にして標準品希釈系列を使用して、検量線を作成し（補正ありの線形検量線、補正ありの非線形検量線、および補正無しの検量線）、改良ＢＤＡＢ法では、各検体のΔＯＤを補正ありの線形検量線、または補正ありの非線形検量線に当てはめ、従来のＢＤＡＢ法では、各検体を酸化剤で処理しない試料の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を、補正無しの検量線に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。また、何れの方法でも、算出した還元型アルブミン濃度を、改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した同じ検体の総アルブミン濃度で割り、還元型アルブミンの割合（％）を算出し、還元型アルブミンの割合を１から差し引いて酸化型アルブミンの割合（％）を算出した。
試験Ｉと同様にして標準品希釈系列を使用して、検量線を作成し（補正ありの線形検量線、補正ありの非線形検量線、および補正無しの検量線）、改良ＢＤＡＢ法では、各検体のΔＯＤを補正ありの線形検量線、または補正ありの非線形検量線に当てはめ、従来のＢＤＡＢ法では、各検体を酸化剤で処理しない試料の吸光度（ＯＤｎｏｎ－ｏｘ）を、補正無しの検量線に当てはめ、還元型アルブミン濃度を算出した。また、何れの方法でも、算出した還元型アルブミン濃度を、改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した同じ検体の総アルブミン濃度で割り、還元型アルブミンの割合（％）を算出し、還元型アルブミンの割合を１から差し引いて酸化型アルブミンの割合（％）を算出した。
【0078】
１－５．評価方法
試験Ｉと同様にして各方法で決定した還元型アルブミンの濃度または酸化型アルブミンの割合から、標準法で決定したそれぞれの基準値を差し引き、その差の絶対値を基準法からの乖離とした。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）が、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小しているかどうかによって各酸化剤による補正効果を評価した。
試験Ｉと同様にして各方法で決定した還元型アルブミンの濃度または酸化型アルブミンの割合から、標準法で決定したそれぞれの基準値を差し引き、その差の絶対値を基準法からの乖離とした。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）が、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小しているかどうかによって各酸化剤による補正効果を評価した。
【0079】
２．結果
以下の表に、酸化剤として、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）、２，２’－ジチオ二安息香酸、ビス（４－ニトロフェニル）ジスルフィド、または過酸化水素を用いた改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により決定した還元型アルブミン濃度、ならびに当該還元型アルブミン濃度と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した総アルブミン濃度から算出された酸化型アルブミンの割合を、それぞれ標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度および標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対して乖離した程度を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、線形検量線と非線形検量線を作成して決定した還元型アルブミン濃度を示し、酸化型アルブミンの割合は、これらの検量線から決定した還元型アルブミン濃度を使用した値を示す。
上記表に示す通り、本試験で用いた４種類の酸化剤を使った改良ＢＤＡＢ法では、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小している検体もあったが、基準値に対する乖離が縮小しなかった検体、むしろ基準値に対する乖離が大きくなった検体も多くあり、全体として明らかな補正の効果が見られなかった。
以下の表に、酸化剤として、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）、２，２’－ジチオ二安息香酸、ビス（４－ニトロフェニル）ジスルフィド、または過酸化水素を用いた改良ＢＤＡＢ法（補正あり）または従来のＢＤＡＢ法（補正なし）により決定した還元型アルブミン濃度、ならびに当該還元型アルブミン濃度と改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した総アルブミン濃度から算出された酸化型アルブミンの割合を、それぞれ標準法（ＨＰＬＣ法＆改良ＢＣＰ法）により決定した還元型アルブミン濃度および標準法（ＨＰＬＣ法）により決定した酸化型アルブミンの割合に対して乖離した程度を示す。改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、線形検量線と非線形検量線を作成して決定した還元型アルブミン濃度を示し、酸化型アルブミンの割合は、これらの検量線から決定した還元型アルブミン濃度を使用した値を示す。
【表20】
【表21】
上記表に示す通り、本試験で用いた４種類の酸化剤を使った改良ＢＤＡＢ法では、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）と比較して、基準値に対する乖離が縮小している検体もあったが、基準値に対する乖離が縮小しなかった検体、むしろ基準値に対する乖離が大きくなった検体も多くあり、全体として明らかな補正の効果が見られなかった。
【0080】
ＩＶ．マレイミドを酸化剤として用いた拡張試験
１．材料および測定方法
１－１．検体
検体は、試験Ｉで使用した検体（血清および血漿）に加え、ドナーから採血直後に全血を安定化剤であるクエン酸緩衝液と１：１ボリューム比で混合し、遠心後、採取した血漿も使用した（実運用で想定されている検体の酸化を防ぎ安定保存するための調製法である。非特許文献１７参照）。試験Ｉで使用した検体は、測定直前にクエン酸緩衝液と１：１の体積比で混合して１／２に希釈をした。
標準品は試験Ｉで使用した標準品を使用した。
１－２．酸化剤
４ｍＭマレイミド（シグマアルドリッチ製、トリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を用いた。
１－３．その他
その他の点は、試験ＩＩと同様に実施した。
１．材料および測定方法
１－１．検体
検体は、試験Ｉで使用した検体（血清および血漿）に加え、ドナーから採血直後に全血を安定化剤であるクエン酸緩衝液と１：１ボリューム比で混合し、遠心後、採取した血漿も使用した（実運用で想定されている検体の酸化を防ぎ安定保存するための調製法である。非特許文献１７参照）。試験Ｉで使用した検体は、測定直前にクエン酸緩衝液と１：１の体積比で混合して１／２に希釈をした。
標準品は試験Ｉで使用した標準品を使用した。
１－２．酸化剤
４ｍＭマレイミド（シグマアルドリッチ製、トリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を用いた。
１－３．その他
その他の点は、試験ＩＩと同様に実施した。
【0081】
２．結果
以下の表２２および２３ならびに図７および８に、各方法により決定された還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合ならびにこれらの値の基準値に対する乖離を示す。また、下記表２４に、表２３に示す酸化型アルブミンの割合の値の基準値に対する乖離の統計解析を示し、図９に、各方法により決定された酸化型アルブミンの割合の基準値の相関を示す。
上記表ならびに図７および８に示す通り、還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合が、標準法による基準値から乖離する検体があったが、全体として補正により基準値からの乖離が減少し、乖離度合いのばらつきも収束した。
また、図９に示す通り、酸化型アルブミンの割合について、標準法との相関係数が従来のＢＤＡＢ法（補正なし）では０．８８であったのに対し、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形）では０．９７になり、相関直線の傾きもＢＤＡＢ法（補正なし）では０．６８であったのに対して、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、０．９７（線形検量線）および０．９３（非線形検量線）となり、傾きがより１に近づいた。従って、改良ＢＤＡＢ法では標準法に近似するより正確な数値が得られることが確認された。
以下の表２２および２３ならびに図７および８に、各方法により決定された還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合ならびにこれらの値の基準値に対する乖離を示す。また、下記表２４に、表２３に示す酸化型アルブミンの割合の値の基準値に対する乖離の統計解析を示し、図９に、各方法により決定された酸化型アルブミンの割合の基準値の相関を示す。
【表22】
【表23】
【表24】
上記表ならびに図７および８に示す通り、還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合が、標準法による基準値から乖離する検体があったが、全体として補正により基準値からの乖離が減少し、乖離度合いのばらつきも収束した。
また、図９に示す通り、酸化型アルブミンの割合について、標準法との相関係数が従来のＢＤＡＢ法（補正なし）では０．８８であったのに対し、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形）では０．９７になり、相関直線の傾きもＢＤＡＢ法（補正なし）では０．６８であったのに対して、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、０．９７（線形検量線）および０．９３（非線形検量線）となり、傾きがより１に近づいた。従って、改良ＢＤＡＢ法では標準法に近似するより正確な数値が得られることが確認された。
【0082】
V．ヨードアセトアミドを酸化剤として用いた拡張試験
１．材料および測定方法
１－１．検体
検体は試験ＩＶと同じ検体を同様に処理して使用した。
１－２．酸化剤
２００ｍＭヨードアセトアミド（東京化成工業製、トリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）を用いた。
１－３．その他
その他の点は、試験ＩＩと同様に実施した。
１．材料および測定方法
１－１．検体
検体は試験ＩＶと同じ検体を同様に処理して使用した。
１－２．酸化剤
２００ｍＭヨードアセトアミド（東京化成工業製、トリス緩衝液、ｐＨ８．０に溶解）を用いた。
１－３．その他
その他の点は、試験ＩＩと同様に実施した。
【0083】
２．結果
以下の表２５および２６ならびに図１０および１１に、各方法により決定された還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合ならびにこれらの値の基準値に対する乖離を示す。また、下記表２７に、表２６に示す酸化型アルブミンの割合の値の基準値に対する乖離の統計解析を示し、図１２に各方法により決定された酸化型アルブミンの割合の基準値の相関を示す。
上記表ならびに図１０および１１に示す通り、還元型アルブミン濃度および酸化型アルブミン割合について、検体によっては標準法による基準値から大きく乖離する検体があったが、全体として補正により乖離が減少し、乖離度合いのばらつきも収束した。より具体的には、還元型アルブミンの濃度について、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形）では３２検体中２５検体、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、非線形）では２４検体で乖離が減少した。酸化型アルブミンの割合について、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形）では３２検体中２６検体、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、非線形）では２４検体で乖離が減少した（図１１）。中には、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）で、標準法による基準値からの乖離が小さく、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）で若干乖離が大きくなったものもあったが、そのような検体でも酸化型アルブミン割合の基準法による基準値からの乖離は７％以下であり、全体として改良ＢＤＡＢ法（補正あり）の標準法からの乖離は小さく、平均で２．２％であり、最も乖離が大きな数値でも６－７％に収まることが確認された。
また、図１２に示す通り、酸化型アルブミンの割合について、標準法との相関係数が従来のＢＤＡＢ法（補正なし）では０．８８であったのに対し、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では０．９７になり、相関直線の傾きもＢＤＡＢ法（補正なし）では０．６８であったのに対して、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、１．０３（線形検量線）および０．９８（非線形検量線）となり、傾きがより１に近づいた。従って、改良ＢＤＡＢ法では標準法に近似するより正確な数値が得られることが確認された。
以下の表２５および２６ならびに図１０および１１に、各方法により決定された還元型アルブミンの濃度および酸化型アルブミンの割合ならびにこれらの値の基準値に対する乖離を示す。また、下記表２７に、表２６に示す酸化型アルブミンの割合の値の基準値に対する乖離の統計解析を示し、図１２に各方法により決定された酸化型アルブミンの割合の基準値の相関を示す。
【表25】
【表26】
【表27】
上記表ならびに図１０および１１に示す通り、還元型アルブミン濃度および酸化型アルブミン割合について、検体によっては標準法による基準値から大きく乖離する検体があったが、全体として補正により乖離が減少し、乖離度合いのばらつきも収束した。より具体的には、還元型アルブミンの濃度について、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形）では３２検体中２５検体、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、非線形）では２４検体で乖離が減少した。酸化型アルブミンの割合について、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、線形）では３２検体中２６検体、改良ＢＤＡＢ法（補正あり、非線形）では２４検体で乖離が減少した（図１１）。中には、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）で、標準法による基準値からの乖離が小さく、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）で若干乖離が大きくなったものもあったが、そのような検体でも酸化型アルブミン割合の基準法による基準値からの乖離は７％以下であり、全体として改良ＢＤＡＢ法（補正あり）の標準法からの乖離は小さく、平均で２．２％であり、最も乖離が大きな数値でも６－７％に収まることが確認された。
また、図１２に示す通り、酸化型アルブミンの割合について、標準法との相関係数が従来のＢＤＡＢ法（補正なし）では０．８８であったのに対し、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では０．９７になり、相関直線の傾きもＢＤＡＢ法（補正なし）では０．６８であったのに対して、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、１．０３（線形検量線）および０．９８（非線形検量線）となり、傾きがより１に近づいた。従って、改良ＢＤＡＢ法では標準法に近似するより正確な数値が得られることが確認された。
【0084】
VI．精製したアルブミンおよび還元型アルブミンの標準品としての使用についての検討
本試験では、種々の標準品について比較検討した。
本試験では、種々の標準品について比較検討した。
【0085】
１．材料および測定方法
１－１．ヒト血清アルブミン標準品の調製
これまでの試験で用いた標準血清（コンセーラ１号）からアルブミンを精製した。担体としてアフィゲルブルーゲル（バイオラッド製）１０ｍＬ（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）を、内径１５ｍｍのプラスチックカラムに充填させ、リン酸緩衝液ｐＨ７．１で平衡化した後に、カラムをキャップし、６ｍＬの標準血清を加え、１時間混合した。その後、カラムを計３０ｍＬのリン酸緩衝液で洗浄し、１．２Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液で溶出した。溶出後の検体は１００ｍＭ ＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で、分子量カットオフ３５００のセルロース性透析膜を使って透析をし、次いで限界ろ過膜にて濃縮して、精製アルブミン溶液を得た。得られた精製アルブミン溶液の酸化型または還元型アルブミンの割合（基準値）を、試験Ｉと同様に、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、精製アルブミン溶液中の還元型アルブミン濃度（基準値）も、試験Ｉと同様に、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
得られた精製アルブミン溶液を、クエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
１－１．ヒト血清アルブミン標準品の調製
これまでの試験で用いた標準血清（コンセーラ１号）からアルブミンを精製した。担体としてアフィゲルブルーゲル（バイオラッド製）１０ｍＬ（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）を、内径１５ｍｍのプラスチックカラムに充填させ、リン酸緩衝液ｐＨ７．１で平衡化した後に、カラムをキャップし、６ｍＬの標準血清を加え、１時間混合した。その後、カラムを計３０ｍＬのリン酸緩衝液で洗浄し、１．２Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液で溶出した。溶出後の検体は１００ｍＭ ＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で、分子量カットオフ３５００のセルロース性透析膜を使って透析をし、次いで限界ろ過膜にて濃縮して、精製アルブミン溶液を得た。得られた精製アルブミン溶液の酸化型または還元型アルブミンの割合（基準値）を、試験Ｉと同様に、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、精製アルブミン溶液中の還元型アルブミン濃度（基準値）も、試験Ｉと同様に、還元型アルブミンの割合をＨＰＬＣ法（標準法）で決定し、総アルブミン濃度を改良ＢＣＰ法（標準法）で決定し、ＨＰＬＣ法で決定した還元型アルブミンの割合（％）に、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
得られた精製アルブミン溶液を、クエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
【0086】
１－２．還元型ヒト血清アルブミン標準品の調製
イソプロピル－チオール－アガロース（クリエイティブバイオマート製）を担体として使い還元型アルブミンを精製した（非特許文献９参照）。４ｍＬ（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）の担体を内径１５ｍｍのプラスチックカラムに充填し、５００ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化後に、カラムをキャップし、上述の通りアフィゲルブルーゲルにて精製した５ｍＬの精製アルブミン溶液を加え、１時間混合した。その後、カラムを計１５ｍＬの５００ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液で洗浄し、２５ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液で溶出した。溶出後の検体は１００ｍＭ ＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で、分子量カットオフ３５００のセルロース性透析膜を使って透析し、次いで限界ろ過膜にて濃縮して、精製還元型ヒト血清アルブミン溶液を得た。溶液中のチオール濃度は、非特許文献９に従って５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応させた際の４１２ｎｍでの吸光度を基に算出した。
得られた精製還元型ヒト血清アルブミン溶液を、クエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
イソプロピル－チオール－アガロース（クリエイティブバイオマート製）を担体として使い還元型アルブミンを精製した（非特許文献９参照）。４ｍＬ（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）の担体を内径１５ｍｍのプラスチックカラムに充填し、５００ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化後に、カラムをキャップし、上述の通りアフィゲルブルーゲルにて精製した５ｍＬの精製アルブミン溶液を加え、１時間混合した。その後、カラムを計１５ｍＬの５００ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液で洗浄し、２５ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液で溶出した。溶出後の検体は１００ｍＭ ＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で、分子量カットオフ３５００のセルロース性透析膜を使って透析し、次いで限界ろ過膜にて濃縮して、精製還元型ヒト血清アルブミン溶液を得た。溶液中のチオール濃度は、非特許文献９に従って５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応させた際の４１２ｎｍでの吸光度を基に算出した。
得られた精製還元型ヒト血清アルブミン溶液を、クエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
【0087】
１－３．比較用標準品
比較用標準品として、これまでの試験で用いた標準血清（コンセーラ１号）と、低分子チオール化合物としてシステインをクエン酸緩衝液に溶解した溶液を使用し、同様にクエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
比較用標準品として、これまでの試験で用いた標準血清（コンセーラ１号）と、低分子チオール化合物としてシステインをクエン酸緩衝液に溶解した溶液を使用し、同様にクエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
【0088】
１－４．酸化剤
酸化剤溶液として、４ｍＭマレイミド（シグマアルドリッチ製、トリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を使用した。
１－５．前処理と吸光度測定
前処理および吸光度測定は、試験ＩＩと同様に行った。
１－６．検量線の作成
各標準品および比較用標準品の希釈系列を使用して、試験Ｉと同様にして、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）による検量線（線形）と、従来のＢＤＡＢ法（補正無し）による検量線を作成した。
１－７．評価
標準血清（コンセーラ１号）により作成した検量線を基準として、今回検討した各標準品および比較用標準品により作成した検量線の傾き、切片を比較した。
酸化剤溶液として、４ｍＭマレイミド（シグマアルドリッチ製、トリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を使用した。
１－５．前処理と吸光度測定
前処理および吸光度測定は、試験ＩＩと同様に行った。
１－６．検量線の作成
各標準品および比較用標準品の希釈系列を使用して、試験Ｉと同様にして、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）による検量線（線形）と、従来のＢＤＡＢ法（補正無し）による検量線を作成した。
１－７．評価
標準血清（コンセーラ１号）により作成した検量線を基準として、今回検討した各標準品および比較用標準品により作成した検量線の傾き、切片を比較した。
【0089】
２．結果
図１３に示す通り、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）では、精製アルブミンおよび精製還元型アルブミンで作成した検量線は、標準血清で作成した検量線からややずれが見られたが、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、ほぼ同様の検量線が得られた。
一方、図１４に示す通り、システイン溶液で作成した検量線は、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）でも、標準血清で作成した検量線から大幅なずれが見られ、補正によってずれは解消されなかった。このことから、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、標準血清、精製アルブミン、および精製還元型アルブミンのいずれも標準品として使用可能であることが示された。
図１３に示す通り、従来のＢＤＡＢ法（補正なし）では、精製アルブミンおよび精製還元型アルブミンで作成した検量線は、標準血清で作成した検量線からややずれが見られたが、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、ほぼ同様の検量線が得られた。
一方、図１４に示す通り、システイン溶液で作成した検量線は、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）でも、標準血清で作成した検量線から大幅なずれが見られ、補正によってずれは解消されなかった。このことから、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）では、標準血清、精製アルブミン、および精製還元型アルブミンのいずれも標準品として使用可能であることが示された。
【0090】
VＩＩ．キャリブレーター候補としての複数種の標準血清・血漿の評価
本試験では複数種の標準血清若しくは血漿の希釈系列を作成して、キャリブレーターとしての適性を評価した。
１．材料および測定方法
１－１．標準血清または血漿ならびに希釈系列の調製
キャリブレーター候補として下記の標準血清または血漿を用いた。
各標準血清または血漿中の還元型アルブミンの割合（基準値）を、試験Ｉと同様に、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、各標準血清または血漿中の総アルブミン濃度は改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した。また、各標準血清または血漿中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、試験Ｉと同様に、ＨＰＬＣ法（標準法）で決定した還元型アルブミンの割合を、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
得られた精製アルブミン溶液を、クエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
各標準血清または血漿は、クエン酸緩衝液で段階的に希釈し希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
１－２．酸化剤
酸化剤溶液として、４ｍＭマレイミド（トリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を使用した。
１－３．前処理と吸光度測定
前処理および吸光度測定は、試験ＩＩと同様に行った。
１－４．検量線の作成
各標準血清または血漿の希釈系列を使用して、試験Ｉと同様にして、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）による検量線（線形）と、従来のＢＤＡＢ法（補正無し）による検量線を作成した（図１５および図１６）。
１－５．評価
標準血清（コンセーラ１号）により作成した検量線を基準として、今回検討した各標準血清または血漿により作成した検量線の傾き、切片を比較した。
本試験では複数種の標準血清若しくは血漿の希釈系列を作成して、キャリブレーターとしての適性を評価した。
１．材料および測定方法
１－１．標準血清または血漿ならびに希釈系列の調製
キャリブレーター候補として下記の標準血清または血漿を用いた。
【表28】
各標準血清または血漿中の還元型アルブミンの割合（基準値）を、試験Ｉと同様に、ＨＰＬＣ法（標準法）によって決定した。また、各標準血清または血漿中の総アルブミン濃度は改良ＢＣＰ法（標準法）で決定した。また、各標準血清または血漿中の還元型アルブミン濃度（基準値）は、試験Ｉと同様に、ＨＰＬＣ法（標準法）で決定した還元型アルブミンの割合を、改良ＢＣＰ法で決定した総アルブミン濃度を掛けて算出した。
得られた精製アルブミン溶液を、クエン酸緩衝液で段階的に希釈して希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
各標準血清または血漿は、クエン酸緩衝液で段階的に希釈し希釈系列を調製し、キャリブレーターとして使用した。
１－２．酸化剤
酸化剤溶液として、４ｍＭマレイミド（トリス緩衝液、ｐＨ７．２に溶解）を使用した。
１－３．前処理と吸光度測定
前処理および吸光度測定は、試験ＩＩと同様に行った。
１－４．検量線の作成
各標準血清または血漿の希釈系列を使用して、試験Ｉと同様にして、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）による検量線（線形）と、従来のＢＤＡＢ法（補正無し）による検量線を作成した（図１５および図１６）。
１－５．評価
標準血清（コンセーラ１号）により作成した検量線を基準として、今回検討した各標準血清または血漿により作成した検量線の傾き、切片を比較した。
【0091】
２．結果
従来のＢＤＡＢ法（補正無し）の場合、一部の標準血漿を用いて作製した検量線は、基準とした検量線に対して乖離を生じたが、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）の場合、何れの標準血清または血漿でも基準とした検量線に対して乖離がなく、類似の検量線を得た（図１５および１６）。このことから、本発明の方法では、測定レンジをカバーすることができるだけの還元型アルブミン濃度が得られれば、血清または血漿をキャリブレーターとして使用できることが示唆された。
従来のＢＤＡＢ法（補正無し）の場合、一部の標準血漿を用いて作製した検量線は、基準とした検量線に対して乖離を生じたが、改良ＢＤＡＢ法（補正あり）の場合、何れの標準血清または血漿でも基準とした検量線に対して乖離がなく、類似の検量線を得た（図１５および１６）。このことから、本発明の方法では、測定レンジをカバーすることができるだけの還元型アルブミン濃度が得られれば、血清または血漿をキャリブレーターとして使用できることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
