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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023068430
(43)【公開日】2023-05-17
(54)【発明の名称】抗菌ペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230510BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230510BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230510BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230510BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230510BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230510BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20230510BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20230510BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230510BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230510BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K4/00
C07K7/00
C07K14/00
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021179551
(22)【出願日】2021-11-02
(71)【出願人】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小森 優美
(72)【発明者】
【氏名】桑原 弘
(72)【発明者】
【氏名】青木 幹雄
(72)【発明者】
【氏名】味方 和樹
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA30X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA15
4H045BA17
4H045BA19
4H045EA20
4H045EA29
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗菌活性を有する新たなポリペプチドを提供する。
【解決手段】（ａ）特定の配列を含むアミノ酸配列、（ｂ）前記特定の配列を含むアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）前記特定の配列を含むアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【選択図】図４
【解決手段】（ａ）特定の配列を含むアミノ酸配列、（ｂ）前記特定の配列を含むアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）前記特定の配列を含むアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記のいずれかのアミノ酸配列を含み、抗菌活性を有するポリペプチド；
（１ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、
（１ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（１ｄ）上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上２６以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（２ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、
（２ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（２ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（２ｄ）上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上８以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（３ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（３ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
（１ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、
（１ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（１ｄ）上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上２６以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（２ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、
（２ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（２ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（２ｄ）上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上８以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（３ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（３ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【請求項2】
請求項１に記載の（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含み、抗菌活性を有するポリペプチド。
【請求項3】
請求項１または２に記載のポリペプチドの前駆体ポリペプチド。
【請求項4】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項6】
配列番号２に記載のＤＮＡ配列を有する、請求項５に記載の核酸。
【請求項7】
請求項５または６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項8】
請求項５または６に記載の核酸が導入された形質転換体。
【請求項9】
請求項８に記載の形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法。
【請求項10】
請求項１または２に記載のポリペプチドと添加剤とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗菌ペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
抗菌ペプチドは、多種な生物が産生することができ、生体防御に重要な役割を果たす。抗菌ペプチドは、抗生物質と比べて即効性が高いこと、および消化酵素等によってアミノ酸に分解され環境中に残留しないことから、耐性菌を生じにくいと考えられている。抗菌ペプチドは、今日深刻な社会問題となっている薬剤耐性菌への対抗手段として期待されている。
【0003】
乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）が産生する抗菌ペプチドとして、ナイシンＡが知られている。ナイシンＡは、耐熱性芽胞菌を含む多くのグラム陽性菌に対して高い抗菌活性を示し、酸に対して安定で、腸管内の消化酵素でアミノ酸に分解されることから、５０か国以上で食品保存料として実用されている。しかしながら、ナイシンＡは中性からアルカリ性域では不安定であり、中性域での熱安定性も低い。そのため、ナイシンＡの利用は、酸性域にｐＨ調整して市販されることが多い食品の保存料等に限られていた。また、ナイシンＡは細胞内での翻訳後修飾によって生じる異常アミノ酸を含むこと、およびランチオニン等によるモノスルフィド結合の架橋構造をとることから、化学合成やｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳による合成が困難であった。米国特許第４５８４１９９号明細書（特許文献１）、米国特許第３２９５９８９号明細書（特許文献２）、国際公開第８９／１２３９９号（特許文献３）、国際公開第２００４／０２９０８２号（特許文献４）には、ナイシンが食品の保存のために用いられることが開示されている。
【0004】
ポリリジンは、放線菌の培養により産生される天然のペプチド性抗菌物質である。ポリリジンもまた、食品の保存料として利用されている。ポリリジンは熱に対しては安定であるが、ｐＨ９以上では抗菌活性を失う。ポリリジンは食品成分に吸着されて抗菌活性が低下しやすいことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第４５８４１９９号明細書
【特許文献2】米国特許第３２９５９８９号明細書
【特許文献3】国際公開第８９／１２３９９号
【特許文献4】国際公開第２００４／０２９０８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、抗菌活性を有する新たなポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下に例示する項目に関する。
［１］ 下記のいずれかのアミノ酸配列を含み、抗菌活性を有するポリペプチド；
（１ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、
（１ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（１ｄ）上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上２６以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（２ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、
（２ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（２ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（２ｄ）上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上８以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（３ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（３ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
［２］ ［１］に記載の（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含み、抗菌活性を有するポリペプチド。
［３］ ［１］または［２］に記載のポリペプチドの前駆体ポリペプチド。
［４］ 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、［３］に記載のポリペプチド。
［５］ ［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
［６］ 配列番号２に記載のＤＮＡ配列を有する、［５］に記載の核酸。
［７］ ［５］または［６］に記載の核酸を含むベクター。
［８］ ［５］または［６］に記載の核酸が導入された形質転換体。
［９］ ［８］に記載の形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法。
［１０］ ［１］または［２］に記載のポリペプチドと添加剤とを含む組成物。
［１］ 下記のいずれかのアミノ酸配列を含み、抗菌活性を有するポリペプチド；
（１ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、
（１ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（１ｄ）上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上２６以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（２ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、
（２ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（２ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、
（２ｄ）上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上８以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（３ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（３ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
［２］ ［１］に記載の（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含み、抗菌活性を有するポリペプチド。
［３］ ［１］または［２］に記載のポリペプチドの前駆体ポリペプチド。
［４］ 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、［３］に記載のポリペプチド。
［５］ ［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
［６］ 配列番号２に記載のＤＮＡ配列を有する、［５］に記載の核酸。
［７］ ［５］または［６］に記載の核酸を含むベクター。
［８］ ［５］または［６］に記載の核酸が導入された形質転換体。
［９］ ［８］に記載の形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法。
［１０］ ［１］または［２］に記載のポリペプチドと添加剤とを含む組成物。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、抗菌活性を有する新たなポリペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】新規ポリペプチドであるラクトバシンＡの構造を示す図である。
【図2】実験４において、ラクトバシンＡのアミノ酸配列とラクトコッシンＡのアミノ酸配列との相同性解析結果である。
【図3】実験４において、ラクトバシンＡのアミノ酸配列とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列との相同性解析結果である。
【図4】実験５において、ラクトバシンＡの全長ポリペプチドおよび部分ポリペプチドの抗菌活性試験の結果を示す図である。
【図5】実験６において、ラクトバシンＡの全長ポリペプチドのｐＨ安定性試験の結果を示す図である。
【図6】実験６において、ラクトバシンＡの部分ポリペプチドのｐＨ安定性試験の結果を示す図である。
【図7】実験７において、ラクトバシンＡの全長ポリペプチドおよび部分ポリペプチドの熱安定性試験の結果を示す図である。
【図8】実験８において、ラクトバシンＡの全長ポリペプチドの酸化安定性試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【0011】
［抗菌活性を有するポリペプチド］
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは下記のいずれかのアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。
（１ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、
（１ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または
（１ｄ）上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上２６以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列。
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは下記のいずれかのアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。
（１ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、
（１ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または
（１ｄ）上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上２６以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列。
【0012】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して例えば８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなってもよい。
【0013】
「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置および種類等によっても異なるが、例えば１～１０個であってよい。本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して例えば１以上１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【0014】
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加の一例は、ポリペプチドの機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられる。
【0015】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、上記（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。ポリペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列においてＣ末端および／またはＮ末端のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなってもよく、Ｃ末端の１以上２６以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなってもよく、Ｎ末端の１以上１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなってもよい。（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列においてＣ末端またはＮ末端のアミノ酸残基が欠損していなくてもよい。（１ａ）～（１ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、後述する（２ａ）～（２ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよく、（３ａ）～（３ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。
【0016】
配列番号３に記載のアミノ酸配列は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１のゲノム配列から予測されたタンパク質の成熟体のアミノ酸配列である。配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる新規ポリペプチドをラクトバシンＡ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｎ Ａ）とも称する。
【0017】
ラクトバシンＡは広範な細菌種に対して抗菌活性を有し、特に食中毒の原因ともなる耐熱性芽胞菌、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌等に対して抗菌活性を有する。ポリペプチドの抗菌活性は、例えば後述の抗菌活性試験の方法に従って測定することができる。ラクトバシンＡは、ｐＨ安定性が高く、酸性域（例えばｐＨ４．０）だけでなく、中性域（例えばｐＨ７．４）からアルカリ性域（例えばｐＨ１０．０）においても抗菌活性を有する。ラクトバシンＡは、熱安定性が高く、例えば中性域での熱処理後（温度８０℃、１００℃、１２１℃等）でも抗菌活性を有する。ラクトバシンＡは、酸化安定性が高く、例えば１０ｍＭ過酸化水素処理後でも抗菌活性を有する。ラクトバシンＡは、ポリリジンと同等以上の抗菌活性を有する。以上のように、ラクトバシンＡは、高い抗菌活性を有する天然由来ポリペプチドであり、利用可能なｐＨ域が広く、加熱、酸化等にも安定であるため、抗菌成分として汎用性が高い。ラクトバシンＡは、直鎖状のポリペプチドであり、かつ特殊な修飾を受けたアミノ酸残基を有さないため、化学合成も容易である。
【0018】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは下記のいずれかのアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。
（２ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、
（２ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（２ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または
（２ｄ）上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上８以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列。
（２ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、
（２ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（２ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または
（２ｄ）上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列に対してＣ末端から１以上８以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列。
【0019】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して例えば８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなってもよい。
【0020】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して例えば１以上１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【0021】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、上記（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。ポリペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列においてＣ末端および／またはＮ末端のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなってもよく、Ｃ末端の１以上８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなってもよく、Ｎ末端の１以上１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなってもよい。（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列においてＣ末端またはＮ末端のアミノ酸残基が欠損していなくてもよい。（２ａ）～（２ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、後述する（３ａ）～（３ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。
【0022】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは下記のいずれかのアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。
（３ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（３ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
（３ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（３ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【0023】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して例えば８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなってもよい。
【0024】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して例えば１以上５以下、４以下、３以下または２以下のアミノ酸残基が欠損、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【0025】
配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列の１～１７位のアミノ酸配列である。配列番号６に記載のアミノ酸配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列の１～９位のアミノ酸配列である。配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれラクトバシンＡのＣ末端のアミノ酸残基が欠損しているが抗菌活性を有する。短いアミノ酸配列を有するポリペプチドは、長いアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも化学合成が容易である。ラクトバシンＡの少なくとも一部を有するポリペプチド、例えばラクトバシンＡのＣ末端のアミノ酸残基が欠損しているポリペプチドであっても、ラクトバシンＡと同様にｐＨ安定性、熱安定性および酸化安定性を有する。
【0026】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、シグナルペプチドを含んでもよく、上述のポリペプチドの前駆体ポリペプチドであってよい。前駆体ポリペプチドは細胞内または細胞外でペプチダーゼによって切断され、上述のポリペプチドとなり得る。前駆体ポリペプチドは通常、特定のペプチダーゼによって切断されるためのアミノ酸配列を含む。前駆体ポリペプチドとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。例えば配列番号１として細胞内で合成された前駆体ポリペプチドは、細胞膜上で切断され、抗菌活性を有する成熟体のラクトバシンＡとなる。本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、分泌型ポリペプチドであってもよく、膜結合型ポリペプチドであってもよい。
【0027】
本発明の一実施形態は、上述のポリペプチドを含む組成物である。本発明の一実施形態は、上述のポリペプチドを含む細菌の増殖抑制剤または殺菌剤であってよい。本発明の一実施形態は、上述のポリペプチドを用いた細菌の増殖抑制または殺菌方法である。組成物は、さらに添加剤を含んでよい。添加剤は、例えば界面活性剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、賦形剤、着色剤、香料が挙げられ、これらを組み合わせて含んでもよい。
【0028】
界面活性剤はアニオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤または両性界面活性剤であってよい。アニオン界面活性剤としては、Ｎ－アシルアミノ酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、Ｎ－アシルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、グリセリン脂肪酸エステルの硫酸塩等が挙げられる。ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、アルキロールアミド、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン有機酸脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ステアロイル乳酸カルシウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグリコシド等が挙げられる。両性界面活性剤としては、アルキルベタイン系界面活性剤、アミンオキサイド系界面活性剤、イミダゾリニウムベタイン系界面活性剤が挙げられる。その具体例としては、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ油アルキルベタイン（ヤシ油アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン）、ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ステアリルジメチルベタインナトリウム、ヤシ油脂肪酸アミドアルキルベタイン、パーム油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、リシノレイン酸アミドプロピルベタイン、ステアリルジヒドロキシエチルベタイン等が挙げられる。
【0029】
保存剤または防腐剤としては、安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、イソプロピルパラベン、プロピルパラベン、イソブチルパラベン、ベンジルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル、フェノキシエタノール、エタノール等のアルコール類、あるいはソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸、プロピオン酸またはこれらの塩、塩化ナトリウム等の塩、エチレンジアミン四酢酸塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等が挙げられる。
【0030】
ｐＨ調整剤としては、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、グルコン酸、マレイン酸、コハク酸、グルタミン酸、ピロリン酸、酒石酸、酢酸水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムリン酸二水素カリウム等の酸やアルカリ、緩衝剤等が挙げられる。
【0031】
増粘剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはこれらの塩、プルラン、ゼラチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ポリアクリル酸ナトリウム、アラビアガム、グアーガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー等の有機系粘結剤、増粘性無水ケイ酸、ベントナイト等の無機系粘結剤等が挙げられる。
【0032】
賦形剤としては、結晶セルロース、粉末セルロース、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、軽質無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、二酸化ケイ素、沈降炭酸カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、酸化マグネシウム、乳酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、合成ケイ酸アルミニウム、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、エリスリトール、ブドウ糖、果糖等が挙げられる。
【0033】
［ポリペプチドをコードする核酸］
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述のポリペプチドをコードする核酸である。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。核酸は、５’末端側に開始コドンを、３’末端側に終始コドンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。核酸はイントロン配列を含んでもよく、含んでいなくてもよい。本発明の一実施形態に係る核酸の一例は、配列番号２に記載のＤＮＡ配列を有する。配列番号２は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１のゲノム配列に由来する配列であり、配列番号１に記載の前駆体ポリペプチドをコードする。
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述のポリペプチドをコードする核酸である。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。核酸は、５’末端側に開始コドンを、３’末端側に終始コドンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。核酸はイントロン配列を含んでもよく、含んでいなくてもよい。本発明の一実施形態に係る核酸の一例は、配列番号２に記載のＤＮＡ配列を有する。配列番号２は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１のゲノム配列に由来する配列であり、配列番号１に記載の前駆体ポリペプチドをコードする。
【0034】
核酸は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１が有する核酸配列に限定されず、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置換した塩基配列を含む核酸であってもよい。本発明の一実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチドの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更した塩基配列を含む核酸であってもよい。
【0035】
本発明に係る核酸、化学合成によって、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１のゲノム配列を鋳型にするＰＣＲ等によって得ることができる。
【0036】
［ベクター］
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅、維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞等に導入され、抗菌活性を有するポリペプチドを発現する。ベクターは、宿主細胞へ導入されることによって宿主細胞においてポリペプチドを発現させることができる。発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列およびターミネーター配列を有してもよい。ベクターは、通常の遺伝子工学的手法に準じて基本ベクターに上述の核酸を組み込むことにより構築できる。基本ベクターは、選択マーカー配列を有していてもよい。
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅、維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞等に導入され、抗菌活性を有するポリペプチドを発現する。ベクターは、宿主細胞へ導入されることによって宿主細胞においてポリペプチドを発現させることができる。発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列およびターミネーター配列を有してもよい。ベクターは、通常の遺伝子工学的手法に準じて基本ベクターに上述の核酸を組み込むことにより構築できる。基本ベクターは、選択マーカー配列を有していてもよい。
【0037】
ベクターは、例えば細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、人工染色体ベクター等であってよい。基本ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター等が挙げられる。具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ３２等を挙げることができる。哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えばｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等を挙げることができる。
【0038】
［形質転換体］
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で宿主細胞に導入されてもよい。形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを発現できる。
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で宿主細胞に導入されてもよい。形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを発現できる。
【0039】
核酸が導入される細胞としては、真核生物または原核生物の細胞を用いることができ、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞が挙げられる。細胞は、酵母、大腸菌または哺乳動物の細胞であってよく、哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ等が挙げられる。
【0040】
細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＨＶＪリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、ＤＮＡ直接注射、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。
【0041】
核酸およびベクターは、宿主細胞内で染色体外で保持されていてもよいし、染色体内に組み込まれていてもよい。核酸およびベクターは、形質転換体内で、宿主細胞内で機能するプロモーターの制御下で遺伝子が発現可能な状態で保持されていることが好ましい。
【0042】
核酸が導入された形質転換体は、選択マーカーを用いて選択してもよい。例えば本発明の一実施形態に係る核酸と同時に選択マーカー遺伝子とを宿主細胞に導入し、選択マーカーの性質に応じた方法によって培養する。選択マーカー遺伝子が宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、核酸の導入操作後に、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて宿主細胞を培養すればよい。
【0043】
［ポリペプチドの製造方法］
本発明に係るポリペプチドは、化学合成によって、または上述の核酸が導入された形質転換体を用いて製造することができる。本発明に係るポリペプチドは、上述の核酸が導入された形質転換体を適切な培地を用いて培養して得ることができる。形質転換体の培養は、宿主細胞を培養する方法によって行えばよい。形質転換体が微生物である場合には、例えば微生物における培養に通常使用される炭素源、窒素源、有機および無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。
本発明に係るポリペプチドは、化学合成によって、または上述の核酸が導入された形質転換体を用いて製造することができる。本発明に係るポリペプチドは、上述の核酸が導入された形質転換体を適切な培地を用いて培養して得ることができる。形質転換体の培養は、宿主細胞を培養する方法によって行えばよい。形質転換体が微生物である場合には、例えば微生物における培養に通常使用される炭素源、窒素源、有機および無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。
【0044】
形質転換体を培養することにより、本発明に係るポリペプチドを含有する培養物が得られる。本発明に係るポリペプチドは、例えば形質転換体の中および／または外（例えば形質転換体の培養上清中）に蓄積し得る。本発明に係るポリペプチドは、形質転換体および／またはその培養上清から取得できる。本発明に係るポリペプチドは、形質転換体を適宜破砕、溶解、抽出および精製したポリペプチドであってもよい。破砕、溶解、抽出等は、公知の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。精製は、ポリペプチドの精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。形質転換体は、遠心分離等により培養物から回収してもよい。培養上清中に本発明に係るポリペプチドが蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清から本発明に係るポリペプチドを回収することができる。本発明に係るポリペプチドは、形質転換体の培養上清の任意の画分であってもよい。本発明に係るポリペプチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１をＭＲＳ液体培地等の適切な培地で培養して得ることもできる。本発明に係るポリペプチドは、形質転換体の培養物と同様の方法によって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養物から回収、抽出および精製してもよい。
【実施例0045】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0046】
［実験１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清の抗菌活性試験］
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清が細菌に対して抗菌活性を有するかを検証した。対照として、ナイシンＡ産生株であるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４の培養上清を用いた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１およびナイシンＡ産生株の培養上清は、それぞれの菌をＭＲＳ Ｂｒｏｔｈで温度３０℃で培養し、遠心分離によって菌体を沈殿させた上清を用いた。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清が細菌に対して抗菌活性を有するかを検証した。対照として、ナイシンＡ産生株であるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４の培養上清を用いた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１およびナイシンＡ産生株の培養上清は、それぞれの菌をＭＲＳ Ｂｒｏｔｈで温度３０℃で培養し、遠心分離によって菌体を沈殿させた上清を用いた。
【0047】
（実験１Ａ）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの増殖を抑制するかを検証した。抗菌活性は、平面状に培養した検定菌の上に１０μＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清をスポットするｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法を用いて評価した。ｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法の詳細は、Mayr-Harting, A. et al., Methods Microbiol., 7A, 315-422(1972)の記載のとおりである。まず、表１に記載の各菌株を一晩前培養した。検定菌を測定波長６００ｎＭの吸光度（ＯＤ６００）が０．１～０．３となるように軟寒天培地に混釈し、これを寒天培地上に重層して表１に記載の測定培地を準備した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１またはナイシンＡ産生株の培養上清を検定菌の上にスポットし、表１に記載の温度で一晩インキュベーションした。形成された生育阻止円の大きさを抗菌活性として評価した。結果を表２に示す。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの増殖を抑制するかを検証した。抗菌活性は、平面状に培養した検定菌の上に１０μＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清をスポットするｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法を用いて評価した。ｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法の詳細は、Mayr-Harting, A. et al., Methods Microbiol., 7A, 315-422(1972)の記載のとおりである。まず、表１に記載の各菌株を一晩前培養した。検定菌を測定波長６００ｎＭの吸光度（ＯＤ６００）が０．１～０．３となるように軟寒天培地に混釈し、これを寒天培地上に重層して表１に記載の測定培地を準備した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１またはナイシンＡ産生株の培養上清を検定菌の上にスポットし、表１に記載の温度で一晩インキュベーションした。形成された生育阻止円の大きさを抗菌活性として評価した。結果を表２に示す。
【0048】
（実験１Ｂ）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖を抑制するかを検証した。表２に記載の各菌株を一晩前培養した。検定菌を滅菌生理食塩液に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．０．５（約１～２×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）となるように調整した。これをさらに１０倍希釈して約１～２×１０７ｃｆｕ／ｍＬの検定菌の懸濁液を得た。１００μＬの検定菌懸濁液を測定培地に滴下し、コンラージ棒で均一に塗布した。寒天培地の表面が乾いたら、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１またはナイシンＡ産生株の培養上清を１０μＬ滴下し、３５℃で１８～２４時間、好気性環境下で培養した。形成された生育阻止円の大きさを抗菌活性として評価した。結果を表２に示す。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖を抑制するかを検証した。表２に記載の各菌株を一晩前培養した。検定菌を滅菌生理食塩液に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．０．５（約１～２×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）となるように調整した。これをさらに１０倍希釈して約１～２×１０７ｃｆｕ／ｍＬの検定菌の懸濁液を得た。１００μＬの検定菌懸濁液を測定培地に滴下し、コンラージ棒で均一に塗布した。寒天培地の表面が乾いたら、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１またはナイシンＡ産生株の培養上清を１０μＬ滴下し、３５℃で１８～２４時間、好気性環境下で培養した。形成された生育阻止円の大きさを抗菌活性として評価した。結果を表２に示す。
【0049】
【表1】
【0050】
【表2】
【0051】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清は、多種の細菌に対して抗菌活性を有することがわかった。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清は、抗菌ペプチドとして知られるナイシンＡと似た抗菌性スペクトルを示した。
【0052】
［実験２．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１が有する抗菌成分の単離・精製］
（１）活性成分の精製
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清に含まれる抗菌成分を次の方法で単離および精製した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１をＭＲＳ Ｂｒｏｔｈで培養後、培養液を６０００ｇで１０分間遠心分離し、培養上清を回収した。培養上清をさらにポアサイズ０．２２μｍのセルロースアセテート膜に通して、細胞を除去した。細胞を除いた培養上清５００ｍＬに対して８０％硫酸アンモニウムを添加して６℃で一晩攪拌し、抗菌ペプチドを含むタンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を１３０００ｇで６０分間遠心分離して回収し、５０ｍＬの５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６；以下「ｂｕｆｆｅｒ Ａ」ともいう。）で再溶解した。この溶液を、Ｃｅｌｉｔｅ ｃｏｌｕｍｎ（ｂｉｏｔａｇｅ社製）にロードして不純物を除去した。続いて、ｂｕｆｆｅｒ Ａで平衡化したアミコンウルトラメンブレン ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてバッファー置換を行った。さらに、Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ ＦＦ １ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）を接続したＡＫＴＡ ｐｕｒｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｃｙｔｉｖａ社製）用いて分画を行った。移動相としては移動相Ａにｂｕｆｆｅｒ Ａ、移動相Ｂに１Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。グラジエント条件として初期移動相組成をＢ０％、最終組成をＢ１００％とし、グラジエント時間を１０分に設定した。フラクションは１ｍＬずつ回収した。このうち活性画分を３ｍＬ ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＲＣ（ＧＥヘルスケア社製）を接続したＡＫＴＡ ｐｕｒｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｒ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてさらに精製した。移動相としては、移動相Ａに０．１％ギ酸、移動相Ｂに０．１％ギ酸、エタノールを用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで逆相クロマトグラフィーを実施した。グラジエント条件として初期移動相組成をＢ０％、最終組成をＢ１００％とし、グラジエント時間を１０分に設定した。フラクションは１ｍＬずつ回収した。精製した画分は－３０℃で保存した。得られた画分の抗菌活性は下記のように評価した。
（１）活性成分の精製
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清に含まれる抗菌成分を次の方法で単離および精製した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１をＭＲＳ Ｂｒｏｔｈで培養後、培養液を６０００ｇで１０分間遠心分離し、培養上清を回収した。培養上清をさらにポアサイズ０．２２μｍのセルロースアセテート膜に通して、細胞を除去した。細胞を除いた培養上清５００ｍＬに対して８０％硫酸アンモニウムを添加して６℃で一晩攪拌し、抗菌ペプチドを含むタンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を１３０００ｇで６０分間遠心分離して回収し、５０ｍＬの５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６；以下「ｂｕｆｆｅｒ Ａ」ともいう。）で再溶解した。この溶液を、Ｃｅｌｉｔｅ ｃｏｌｕｍｎ（ｂｉｏｔａｇｅ社製）にロードして不純物を除去した。続いて、ｂｕｆｆｅｒ Ａで平衡化したアミコンウルトラメンブレン ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてバッファー置換を行った。さらに、Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ ＦＦ １ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）を接続したＡＫＴＡ ｐｕｒｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｃｙｔｉｖａ社製）用いて分画を行った。移動相としては移動相Ａにｂｕｆｆｅｒ Ａ、移動相Ｂに１Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。グラジエント条件として初期移動相組成をＢ０％、最終組成をＢ１００％とし、グラジエント時間を１０分に設定した。フラクションは１ｍＬずつ回収した。このうち活性画分を３ｍＬ ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＲＣ（ＧＥヘルスケア社製）を接続したＡＫＴＡ ｐｕｒｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｒ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてさらに精製した。移動相としては、移動相Ａに０．１％ギ酸、移動相Ｂに０．１％ギ酸、エタノールを用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで逆相クロマトグラフィーを実施した。グラジエント条件として初期移動相組成をＢ０％、最終組成をＢ１００％とし、グラジエント時間を１０分に設定した。フラクションは１ｍＬずつ回収した。精製した画分は－３０℃で保存した。得られた画分の抗菌活性は下記のように評価した。
【0053】
（２）抗菌活性試験
抗菌ペプチドの抗菌活性は、実験１Ａと同じｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法を用いて評価した。検定菌には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（ＮＢＲＣ１５８９３）を用いた。一晩培養した検定菌を４×１０７ＣＦＵ／ｍＬの密度になるようにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＡＯＡＣ ａｇａｒに混釈して、２％ ａｇａｒ含有ＭＲＳプレート上に重層した。試験液を検定菌の上にスポットし、３０℃で一晩インキュベーションした。Ｌ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の大きさを抗菌活性として評価した。
抗菌ペプチドの抗菌活性は、実験１Ａと同じｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法を用いて評価した。検定菌には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（ＮＢＲＣ１５８９３）を用いた。一晩培養した検定菌を４×１０７ＣＦＵ／ｍＬの密度になるようにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＡＯＡＣ ａｇａｒに混釈して、２％ ａｇａｒ含有ＭＲＳプレート上に重層した。試験液を検定菌の上にスポットし、３０℃で一晩インキュベーションした。Ｌ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の大きさを抗菌活性として評価した。
【0054】
［実験３．抗菌性物質の構造決定］
（１）酸性トリプシン消化
次の方法に従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清に含まれる抗菌ポリペプチドを同定した。まず、精製した活性画分２５０μＬをＴｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎ ＳＤＳ Ｐａｇｅで分離したのち、目的のバンドを切り出して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｒｏｍ Ｇｅｌ Ｓｌｉｃｅｓ（コスモバイオ社製）によってタンパク質を抽出した。タンパク質を含む試料をＡｃｃｕＭＡＰ（商標） Ｌｏｗ ｐＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてトリプシン消化した。Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｋｉｔｓのプロトコルに従って試料を還元アルキル化したのち、２５μＬ ｒＬｙｓ－Ｃを加えて３７℃で４時間反応させた。反応溶液を希釈してさらに２５μＬ ｒＬｙｓ－Ｃを加えて３７℃で１６時間反応させた。その後、Ｔｒｙｐｓｉｎを２０μＬ添加して３７℃で３時間インキュベーションし、２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加して反応を停止した。消化物は脱塩後、質量分析計によって反応の進行を確認した。
（１）酸性トリプシン消化
次の方法に従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１の培養上清に含まれる抗菌ポリペプチドを同定した。まず、精製した活性画分２５０μＬをＴｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎ ＳＤＳ Ｐａｇｅで分離したのち、目的のバンドを切り出して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｒｏｍ Ｇｅｌ Ｓｌｉｃｅｓ（コスモバイオ社製）によってタンパク質を抽出した。タンパク質を含む試料をＡｃｃｕＭＡＰ（商標） Ｌｏｗ ｐＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてトリプシン消化した。Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｋｉｔｓのプロトコルに従って試料を還元アルキル化したのち、２５μＬ ｒＬｙｓ－Ｃを加えて３７℃で４時間反応させた。反応溶液を希釈してさらに２５μＬ ｒＬｙｓ－Ｃを加えて３７℃で１６時間反応させた。その後、Ｔｒｙｐｓｉｎを２０μＬ添加して３７℃で３時間インキュベーションし、２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加して反応を停止した。消化物は脱塩後、質量分析計によって反応の進行を確認した。
【0055】
（２）臭化シアンによる化学的断片化
精製した活性画分１００μＬを５０μｍｏｌ臭化シアンを含む７０％（ｖ／ｖ）ギ酸に溶解した。反応は室温で１８時間行った。方法の詳細は、E Gross, Methods in enzymology, 27, 238 (1967)に記載のとおりである。断片化ペプチドは脱塩後、質量分析計によって分析した。
精製した活性画分１００μＬを５０μｍｏｌ臭化シアンを含む７０％（ｖ／ｖ）ギ酸に溶解した。反応は室温で１８時間行った。方法の詳細は、E Gross, Methods in enzymology, 27, 238 (1967)に記載のとおりである。断片化ペプチドは脱塩後、質量分析計によって分析した。
【0056】
（３）質量分析
活性画分のペプチド断片の解析は、インターフェイスにエレクトロスプレーイオン化法を用いた液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により実施した。液体クロマトグラフとオートサンプラーにはＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用した。移動相Ａに０．５％ギ酸、移動相Ｂに０．５％ギ酸、メタノールを用い、流速２５０ｎＬ／ｍｉｎで測定を行った。グラジエント条件として初期移動相組成をＢ５％、最終組成をＢ５５％とし、グラジエント時間を９０分と設定した。分析用カラムとしては、Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ ７５μｍ×５０ｃｍ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ Ｃ１８，２μｍ，１００Å（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。質量分析計としては、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＤＤＡ）モードにてＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。測定溶媒には、１００％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸を用いた。
活性画分のペプチド断片の解析は、インターフェイスにエレクトロスプレーイオン化法を用いた液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により実施した。液体クロマトグラフとオートサンプラーにはＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用した。移動相Ａに０．５％ギ酸、移動相Ｂに０．５％ギ酸、メタノールを用い、流速２５０ｎＬ／ｍｉｎで測定を行った。グラジエント条件として初期移動相組成をＢ５％、最終組成をＢ５５％とし、グラジエント時間を９０分と設定した。分析用カラムとしては、Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ ７５μｍ×５０ｃｍ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ Ｃ１８，２μｍ，１００Å（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。質量分析計としては、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＤＤＡ）モードにてＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。測定溶媒には、１００％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸を用いた。
【0057】
（４）ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
得られたプロダクトイオンスペクトルに対して、ＰＥＡＫＳ Ｓｔｕｄｉｏ １０．６を用いて抗菌ペプチドの配列解析を行った。
得られたプロダクトイオンスペクトルに対して、ＰＥＡＫＳ Ｓｔｕｄｉｏ １０．６を用いて抗菌ペプチドの配列解析を行った。
【0058】
（５）推定配列とゲノム解析の照合
ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより推定した配列は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１株の全ゲノム塩基配列の６ｆｒａｍｅ翻訳に対して検索を行った。
ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより推定した配列は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１株の全ゲノム塩基配列の６ｆｒａｍｅ翻訳に対して検索を行った。
【0059】
以上により、精製画分に含まれていた抗菌ペプチドのアミノ酸配列を決定した。抗菌ペプチドの前駆体全長配列を配列番号１に、そのゲノム配列を配列番号２に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、翻訳後にペプチダーゼによってリーダーペプチドが切断されて、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する成熟型の抗菌ペプチドとなる（図１）。
【0060】
［実験４．抗菌ペプチドのアミノ酸配列相同性検索］
同定された抗菌ペプチドのアミノ酸配列について、抗菌ペプチドのデータベースであるＤＲＡＭＰ(Kang, X. et al., Sci. Data 6, 148 (2019))およびＢＡＣＴＩＢＡＳＥ（Hammami, R. et al., BMC Microbiol., 10, 22 (2010)）に収録されている既知の抗菌ペプチドのアミノ酸配列との相同性検索を行った。その結果、精製画分に含まれていた抗菌ペプチドと類似性が最も高いペプチドはラクトコッシンＡ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉｎ Ａ）（配列番号８）であったが、ほとんど一致しなかった（図２）。
同定された抗菌ペプチドのアミノ酸配列について、抗菌ペプチドのデータベースであるＤＲＡＭＰ(Kang, X. et al., Sci. Data 6, 148 (2019))およびＢＡＣＴＩＢＡＳＥ（Hammami, R. et al., BMC Microbiol., 10, 22 (2010)）に収録されている既知の抗菌ペプチドのアミノ酸配列との相同性検索を行った。その結果、精製画分に含まれていた抗菌ペプチドと類似性が最も高いペプチドはラクトコッシンＡ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉｎ Ａ）（配列番号８）であったが、ほとんど一致しなかった（図２）。
【0061】
ＢＬＡＳＴにて、Ｑｕｅｒｙにリーダー配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列を、Ｄａｔａｂａｓｅに「Ａｌｌ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＰＲＦ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ＷＧＳ ｐｒｏｊｅｃｔｓ」を用いて相同性検索を行った。その結果、「ＭＳＫＦＱＱＬＴＰＥＤＬＭＥＴＫＧＧＫＩＹＨＡＴＰＷＱＩＣＮＳＫＴＨＫＣＷＡＤＮＡＡＩＡＲＴＣＧＲＶＩＶＮＧＷＬＱＨＧＰＷ」配列（配列番号９）のｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（由来：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が類似性の最も高いペプチドとして見つかったが、一致率は半分以下であった（図３）。以上より、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＳＣ－２００１から見つかった配列番号１に記載のポリペプチドは、新規の抗菌ペプチドであると考えられる。
【0062】
［実験５．合成ペプチドの抗菌活性試験］
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる成熟型全長ラクトバシンＡおよび配列番号４～７に記載のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチド（表３）の抗菌活性を評価した。各ポリペプチドは水に溶解して、表４または表５に記載の濃度とした。各ポリペプチドは化学合成ペプチドであり、北海道システムサイエンス社から入手した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、抗菌活性を評価した。ポジティブコントロールとして、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。対照であるポリリジンは、ε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＳＰＬ０１（コスモ・バイオ株式会社製）を用いた。分子量を２５００と仮定し、濃度０．０１２５％のポリリジン製品（約５０μＭ）を減圧乾固し、２０倍（約１ｍＭ，２．５ｍｇ／ｍＬ）、４０倍（約２ｍＭ，５．０ｍｇ／ｍＬ）、８０倍（約４ｍＭ，１０ｍｇ／ｍＬ）濃縮となる容量の水で再溶解し、抗菌活性試験に供した。合成ポリペプチドの抗菌活性試験の結果を表４～表５および図４に示す。
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる成熟型全長ラクトバシンＡおよび配列番号４～７に記載のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチド（表３）の抗菌活性を評価した。各ポリペプチドは水に溶解して、表４または表５に記載の濃度とした。各ポリペプチドは化学合成ペプチドであり、北海道システムサイエンス社から入手した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、抗菌活性を評価した。ポジティブコントロールとして、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。対照であるポリリジンは、ε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＳＰＬ０１（コスモ・バイオ株式会社製）を用いた。分子量を２５００と仮定し、濃度０．０１２５％のポリリジン製品（約５０μＭ）を減圧乾固し、２０倍（約１ｍＭ，２．５ｍｇ／ｍＬ）、４０倍（約２ｍＭ，５．０ｍｇ／ｍＬ）、８０倍（約４ｍＭ，１０ｍｇ／ｍＬ）濃縮となる容量の水で再溶解し、抗菌活性試験に供した。合成ポリペプチドの抗菌活性試験の結果を表４～表５および図４に示す。
【0063】
【表3】
【0064】
【表4】
【0065】
【表5】
【0066】
成熟型全長の合成ポリペプチドは、１００ｎＭ以上の濃度でＬ．ｓａｋｅｉに対する抗菌活性を有することが確認された。ラクトバシンＡのＮ末端側の配列を有する部分ポリペプチド（ｐａｒｔ１およびｐａｒｔ３）はＬ．ｓａｋｅｉに対する抗菌活性を有することが示された。ｐａｒｔ１は、ポリリジンと同程度の抗菌活性を有することが示された。
【0067】
［実験６．広ｐＨ域安定性試験］
１０μＭラクトバシンＡ、１０μＭナイシンＡ、１ｍＭｐａｒｔ１および５ｍＭｐａｒｔ３について、広範なｐＨ域において抗菌活性を有しているかを評価した。各ペプチドは、下記のバッファーで再溶解して調製した；Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（５０ｍＭ、ｐＨ１０．０）。それぞれのｐＨに調製した試験溶液を３０℃でインキュベーションした。インキュベーションの時間は、０時間、０．５時間、２時間、４時間、６時間、２４時間とし、インキュベーション終了時には終濃度０．２％になるようにＴＦＡを添加した。ＴＦＡ添加後の試験溶液のｐＨが酸性であることをｐＨ試験紙で確認した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、ｐＨ処理後のポリペプチドの抗菌活性を評価した。ポジティブコントロール（ＰＣ）として、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。０．２％ＴＦＡ水溶液で調製したのみの試料を未処理のコントロールとした。結果を表６および図５～図６に示す。
１０μＭラクトバシンＡ、１０μＭナイシンＡ、１ｍＭｐａｒｔ１および５ｍＭｐａｒｔ３について、広範なｐＨ域において抗菌活性を有しているかを評価した。各ペプチドは、下記のバッファーで再溶解して調製した；Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（５０ｍＭ、ｐＨ１０．０）。それぞれのｐＨに調製した試験溶液を３０℃でインキュベーションした。インキュベーションの時間は、０時間、０．５時間、２時間、４時間、６時間、２４時間とし、インキュベーション終了時には終濃度０．２％になるようにＴＦＡを添加した。ＴＦＡ添加後の試験溶液のｐＨが酸性であることをｐＨ試験紙で確認した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、ｐＨ処理後のポリペプチドの抗菌活性を評価した。ポジティブコントロール（ＰＣ）として、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。０．２％ＴＦＡ水溶液で調製したのみの試料を未処理のコントロールとした。結果を表６および図５～図６に示す。
【0068】
実施例において使用したナイシンＡは、Ｎｉｓｉｎ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ２．５％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を濃縮精製して用いた。ナイシンＡの詳細はJ. C. Slootweg et al., J. Pept. Sci., 19, 692-699(2013)に記載のとおりである。市販の２．５％ナイシンＡ１ｇ（ナイシンＡを約２５ｍｇ含有）を秤量し、２５ｍＬの水を添加して１５分間室温で攪拌した。遠心分離（１５分、２５００ｒｐｍ）で沈殿を分離し、上清のみを別のチューブへ移した。この溶液にジクロロメタンを２０ｍＬ添加した。水層と有機層の間に生じた白色沈殿を回収するため、上層および下層を除去した。さらに遠心分離（１５分、２５００ｒｐｍ）を行い、上層および下層の除去を再度行った。減圧遠心機で目的の中間層を乾固し、７．４５ｍＬの水で再溶解することで、１ｍＭのＮｉｓｉｎ精製物が得られた。この精製物をナイシンＡとして各安定性試験に用いた。
【0069】
【表6】
【0070】
ラクトバシンＡは、ｐＨ４～ｐＨ１０．０まで広範囲のｐＨ域において、２４時間インキュベーションしても抗菌活性を失わなかった。一方、ナイシンＡは中性～アルカリ性域で抗菌活性を失っていた。ラクトバシンＡの部分ポリペプチドも低ｐＨおよび高ｐＨ条件下で活性が低下しなかった。ラクトバシンＡおよびその部分ポリペプチドは、広範なｐＨ域で抗菌活性を有しており、ｐＨ安定性に優れていることがわかった。
【0071】
［実験７．熱安定性試験］
１０μＭラクトバシンＡ、１０μＭナイシンＡ、１ｍＭｐａｒｔ１および５ｍＭｐａｒｔ３について、熱処理後に抗菌活性を有しているかを評価した。試験溶液を８０℃で１０分間、８０℃で３０分間、１００℃で１０分間、１００℃で３０分間、または１２１℃で１５分間、熱処理した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、熱処理後のポリペプチドの抗菌活性を評価した。ポジティブコントロール（ＰＣ）として、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。加熱操作を行っていない試料を未処理のコントロールとした。結果を表７および図７に示す。
１０μＭラクトバシンＡ、１０μＭナイシンＡ、１ｍＭｐａｒｔ１および５ｍＭｐａｒｔ３について、熱処理後に抗菌活性を有しているかを評価した。試験溶液を８０℃で１０分間、８０℃で３０分間、１００℃で１０分間、１００℃で３０分間、または１２１℃で１５分間、熱処理した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、熱処理後のポリペプチドの抗菌活性を評価した。ポジティブコントロール（ＰＣ）として、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。加熱操作を行っていない試料を未処理のコントロールとした。結果を表７および図７に示す。
【0072】
【表7】
【0073】
ラクトバシンＡは、８０℃または１００℃で１０分または３０分間、１２１℃で１５分間熱処理しても抗菌活性を失わなかった。一方、ナイシンＡは８０℃１０分間の熱処理では活性が残存していたが、それ以上の熱処理では抗菌活性を失っていた。ラクトバシンＡの部分ポリペプチドも８０℃または１００℃で１０分または３０分間、１２１℃で１５分間熱処理しても抗菌活性を失わなかった。ラクトバシンＡおよびその部分ポリペプチドは、熱安定性に優れていることがわかった。
【0074】
［実験８．酸化安定性試験］
ラクトバシンＡおよびナイシンＡについて酸化処理後に抗菌活性を有しているかを評価した。酸化処理の方法は、Toshihiro T. et al., J. Proteome Res., 12, 753-762(2013)に記載のとおりである。１ｍＭのラクトバシンＡまたはナイシンＡ溶液に対して終濃度１０ｍＭになるように過酸化水素を添加して、４０℃で６時間反応させた。反応終了後、ポリペプチドの濃度が１０μＭまたは１μＭの濃度となるように反応液を水で希釈した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、酸化処理後のポリペプチドの抗菌活性を評価した。酸化反応の進行は、酸化処理を実施しない試験溶液を基準として、酸化処理実施試験溶液のＬＣ／ＭＳ測定により得られるピーク面積の相対値として算出した。ポジティブコントロール（ＰＣ）として、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。結果を表８および図８に示す。
ラクトバシンＡおよびナイシンＡについて酸化処理後に抗菌活性を有しているかを評価した。酸化処理の方法は、Toshihiro T. et al., J. Proteome Res., 12, 753-762(2013)に記載のとおりである。１ｍＭのラクトバシンＡまたはナイシンＡ溶液に対して終濃度１０ｍＭになるように過酸化水素を添加して、４０℃で６時間反応させた。反応終了後、ポリペプチドの濃度が１０μＭまたは１μＭの濃度となるように反応液を水で希釈した。上述の抗菌活性試験に記載のｓｐｏｔ－ｏｎ－ｌａｗｎ法と同じ方法で、ポリペプチド滴下によるＬ．ｓａｋｅｉの生育阻止円の形成によって、酸化処理後のポリペプチドの抗菌活性を評価した。酸化反応の進行は、酸化処理を実施しない試験溶液を基準として、酸化処理実施試験溶液のＬＣ／ＭＳ測定により得られるピーク面積の相対値として算出した。ポジティブコントロール（ＰＣ）として、ナイシンＡを産生する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ－１１４５４株）の培養上清を使用した。結果を表８および図８に示す。
【0075】
【表8】
【0076】
ラクトバシンＡは、１０ｍＭ過酸化水素による酸化処理で抗菌活性を失わなかった。一方、ナイシンＡは同じ酸化処理によって抗菌活性を失っていた。ラクトバシンＡは、酸化安定性に優れていることがわかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】