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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023069894
(43)【公開日】2023-05-18
(54)【発明の名称】インスリン受容体の発現促進剤
(51)【国際特許分類】
A23L 33/135 20160101AFI20230511BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20230511BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230511BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20230511BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230511BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20230511BHJP
A23K 10/18 20160101ALI20230511BHJP
【ＦＩ】
A23L33/135
A61K35/747
A61P25/28
A61P25/20
A61P43/00 105
A23L2/00 F
A23L2/52
A23K10/18
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021182084
(22)【出願日】2021-11-08
(71)【出願人】
【識別番号】711002926
【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】神 太郎
(72)【発明者】
【氏名】村上 弘樹
(72)【発明者】
【氏名】松本 菜々恵
(72)【発明者】
【氏名】小林 俊二郎
(72)【発明者】
【氏名】石元 広志
(72)【発明者】
【氏名】上川内 あづさ
(72)【発明者】
【氏名】森 郁恵
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4B117
4C087
【Ｆターム（参考）】
2B150AA01
2B150AA02
2B150AA03
2B150AA05
2B150AA06
2B150AA08
2B150AB10
2B150AB20
2B150AC06
2B150AC08
2B150AE02
2B150AE05
2B150AE13
2B150AE16
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD86
4B018ME03
4B018ME14
4B117LC04
4B117LK23
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC59
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA05
4C087ZA15
4C087ZC41
(57)【要約】
【課題】本発明は、インスリン受容体の発現を促進させる安全性に優れた食品、飲料、飼料を提供することを課題とする。
【解決手段】ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属の微生物を含む、インスリン受容体の発現を促進するための組成物、これを含むことを特徴とするインスリン受容体の発現を促進するための食品、飲料又は飼料、並びに、記憶障害および睡眠障害の治療および改善のための、前記組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、飼料、又は医薬品を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属の微生物を含む、インスリン受容体の発現を促進するための組成物、これを含むことを特徴とするインスリン受容体の発現を促進するための食品、飲料又は飼料、並びに、記憶障害および睡眠障害の治療および改善のための、前記組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、飼料、又は医薬品を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属の微生物を含むインスリン受容体の発現を促進するための組成物。
【請求項2】
前記ラクトバチルス属がラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ビフィドバクテリウム属がビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）種であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ラクトバチルス属が、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＳＢＴ２２２７株から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
前記ビフィドバクテリウム属が、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＳＢＴ０４３０株、ＳＢＴ２７８６株から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１または３に記載の組成物。
【請求項6】
動物の臓器におけるインスリン受容体の発現を促進するための、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
臓器が脳である、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする、インスリン受容体の発現を促進するための食品、飲料、又は飼料。
【請求項9】
記憶障害および睡眠障害からなる群から選択される障害の治療および改善のための、請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、飼料、又は医薬品。
【請求項10】
記憶障害を有すると診断されていない対象において記憶を改善するための又は睡眠障害を有すると診断されていない対象において睡眠を促進するための、請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インスリン受容体の発現を促進させる安定性及び安全性に優れたインスリン受容体発現促進用組成物に関する。また、本発明は、該インスリン受容体発現促進組成物を含有する、食品、飲料、飼料、並びに、記憶障害および睡眠障害の治療および改善のための、前記組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、飼料、又は医薬品に関する。
【背景技術】
【0002】
インスリン受容体は、インスリン結合部位を有するαサブユニット２個と、細胞膜貫通部位とチロシンキナーゼ活性を示す細胞質部位を有するβサブユニットがジスルフィド結合で結びついたヘテロ四量体である。インスリンがインスリン受容体αサブユニットに結合すると、βサブユニットの高次構造が変化し、チロシンキナーゼ活性が増加する。その結果、インスリン受容体基質（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：ＩＲＳ）のチロシン残基がリン酸化され、さらに、その下流の細胞内シグナル伝達分子がリン酸化され、カスケードが活性化される。シグナル伝達経路は、ＰＩ３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ）系を活性化する経路とＲａｓ－ＭＡＰＫ系を活性化する経路と大きく２つの経路がある。ＰＩ３Ｋ活性化により、ＰＤＫ１（ＰＩ３Ｋ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）、Ａｋｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ｐ７０ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ、ＧＳＫ－３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３β）などがリン酸化される。インスリン受容体シグナルの活性化により、ＤＮＡからの転写、翻訳、タンパク質合成は促進し、グリコーゲン合成、グルコース輸送をはじめ多くの細胞機能が調節される（非特許文献１および非特許文献２）。
【0003】
インスリン受容体シグナルは、グルコース、アミノ酸の細胞内取り込み促進や脂質合成等の代謝調節因子として働くばかりでなく、細胞増殖、成長因子としても働いており、ひいては神経回路網の形成・維持・修復や学習・記憶といった脳の高次神経活動にも関与することが明らかになっている。
【0004】
インスリン受容体シグナルと認知機能との関連については、インスリン受容体、ＩＲＳ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔをはじめとしたインスリン受容体シグナル伝達分子の発現量と機能は、加齢、痴呆、神経変性疾患（アルツハイマー病、レビー小体型痴呆など）において低下する一方、学習活動により、特に海馬において上昇すること（非特許文献３～９）、培養神経細胞では、インスリンは、アルツハイマー病の病因であるβアミロイド・ペプチド（Ａβ）沈着とタウタンパク質の過剰リン酸化を阻止すること（非特許文献６～９）、Ａβが神経細胞において、インスリンのインスリン受容体への結合を競合的に阻害すること（非特許文献１０）などが報告されている。これらの知見は、インスリン受容体シグナルが、神経細胞の機能維持と病態に深く関わっている可能性を示唆している。
【0005】
また、経鼻腔インスリンを用いたアルツハイマー病および軽度認知障害を対象とした第ＩＩ層臨床試験が報告されており、この臨床研究では経鼻腔インスリン投与群において、認知機能や日常生活指標に有意な効果が示されている（非特許文献１１）。アルツハイマー病の治療標的としてもインスリン受容体シグナルが注目されていることから、インスリン受容体発現促進剤はインスリン受容体シグナルを活性化し、認知機能改善・向上能を有することが期待される。
【0006】
これまでに、インスリン受容体の発現を促進する物質としてはベルベリン（非特許文献１２）などが報告されている。しかしベルベリンの副作用として、吐き気、嘔吐、過敏、鬱、呼吸困難、徐脈、心損傷、低血圧、発作、麻痺、痙攣、死亡を誘発する可能性が報告されており、健常人が予防的観点から日常的に服用することは困難であった。
【0007】
そこで、本発明者らは、日常摂取しても安全であることが確認できている微生物の中から、インスリン受容体の発現量を増加させる菌を鋭意探索した結果、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属の微生物を見出し、本発明を完成させるに至った。
【0008】
本発明のインスリン受容体発現の評価には、キイロショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（以下、ショウジョウバエという）を用いた。ショウジョウバエは、生物学の様々な分野でモデル生物として用いられている。２０００年には全ゲノムが決定され、ヒトの疾患に関する遺伝子の約７５％がショウジョウバエにも存在すると推定され、近年ではアルツハイマーやパーキンソン病、メタボリックシンドロームなど疾患モデルのショウジョウバエが開発されており、実際に疾患発症メカニズムの解明や、治療薬剤のスクリーニングに用いられている（非特許文献１３，１４）
【0009】
ヒトやマウスなど哺乳類にみられるインスリン受容体シグナルは、ショウジョウバエにもよく保存されており、その特徴や分子基盤の多くが哺乳類と共通していることが明らかになっている。例えば、栄養状態に応じて体液中のインスリンレベルを変化させ、インスリン受容体シグナル、さらには細胞や組織の成長を調節すること（非特許文献１５）、過食させたショウジョウバエは２型糖尿病の特徴であるインスリン抵抗性を示すこと（非特許文献１６）などが報告されており、ショウジョウバエはインスリン受容体シグナルの研究のモデル生物として適していると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.)125,141-146(2005)
【非特許文献2】Zick Y. Trends Cell Biol. 2001;11:437-441.
【非特許文献3】Zhao W-Q, et al. Mol Cell Endocrinol.2001;177:125-134.
【非特許文献4】Zhao W-Q, et al. Eur J Pharmacol.2004;490:71-81.
【非特許文献5】Gasparini L, et al. Trends Pharmacol Sci.2002;23:288-293.
【非特許文献6】Gaparini L, et al. Trends Neurosci.2003;26:404-406.
【非特許文献7】Gasparini L, et al. J Neurosci.2001;21:2561-2570.
【非特許文献8】Carro E, et al. Eur J Pharmacol.2004;490:127-133.
【非特許文献9】Trejo JL, et al. J Mol Med.2004;82:156-162.
【非特許文献10】Xie L, et al. J Neurosci.2002;22:RC221
【非特許文献11】Craft S, Baker LD, Montine TJ et al:Intracranial insulintherapy for Alzheimer's disease and amnestic mild cognitiveimpairment. Arch Neurol 69:29-38, 2012
【非特許文献12】Zhang H, Wei J, Xue R, Wu JD, Zhao W, Wang ZZ,Wang SK, Zhou ZZ, Song DQ, Wang YW, Pan HN,Kong WJ, Jiang JD: Berberine lowers blood glucose in-type 2 diabetes mellitus patients through increasing insulin receptor expression. Metabolism, 59: 285-292,2010.
【非特許文献13】Pandey, U. B. & Nichols, C. D. Human Disease Models in Drosophila melanogaster and the Role of the Fly in Therapeutic Drug Discovery. Drug Deliv. 63, 411-436 (2011)
【非特許文献14】Ugur, B., Chen, K. & Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis. Model. Mech. 9, 235-244 (2016).
【非特許文献15】S. Oldham, E. Hafen Insulin/IGF and target of rapamycin signailing: a TOR de force in growth control. Trends Cell Biol, 13(2003), pp.79-85.
【非特許文献16】Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster Biochim Biophys Acta. 2012 1822(8): 1230-1237.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、インスリン受容体の発現を促進させる安全性に優れた食品、飲料、飼料、又は医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を進めたところ、特定の微生物がインスリン受容体の発現を促進することを見出した。
すなわち本発明は、以下の様態を含むものである。
（１）ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属の微生物を含むインスリン受容体の発現を促進するための組成物。
（２）前記ラクトバチルス属がラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種であることを特徴とする（１）に記載の組成物。
（３）前記ビフィドバクテリウム属がビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）種であることを特徴とする（１）に記載の組成物。
（４）前記ラクトバチルス属が、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＳＢＴ２２２７株から選択される１つ以上であることを特徴とする（１）または（２）に記載の組成物。
（５）前記ビフィドバクテリウム属が、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＳＢＴ０４３０株、ＳＢＴ２７８６株から選択される１つ以上であることを特徴とする（１）または（３）に記載の組成物。
（６）動物の臓器におけるインスリン受容体の発現を促進するための、（１）乃至（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）臓器が脳である、（６）に記載の組成物。
（８）（１）乃至（７）のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする、インスリン受容体の発現を促進するための食品、飲料、又は飼料。
（９）記憶障害および睡眠障害からなる群から選択される障害の治療および改善のための、（１）乃至（７）のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、飼料、又は医薬品。
（１０）記憶障害を有すると診断されていない対象において記憶を改善するための又は睡眠障害を有すると診断されていない対象において睡眠を促進するための、（１）乃至（７）のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、又は飼料。
すなわち本発明は、以下の様態を含むものである。
（１）ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属の微生物を含むインスリン受容体の発現を促進するための組成物。
（２）前記ラクトバチルス属がラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種であることを特徴とする（１）に記載の組成物。
（３）前記ビフィドバクテリウム属がビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）種であることを特徴とする（１）に記載の組成物。
（４）前記ラクトバチルス属が、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＳＢＴ２２２７株から選択される１つ以上であることを特徴とする（１）または（２）に記載の組成物。
（５）前記ビフィドバクテリウム属が、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＳＢＴ０４３０株、ＳＢＴ２７８６株から選択される１つ以上であることを特徴とする（１）または（３）に記載の組成物。
（６）動物の臓器におけるインスリン受容体の発現を促進するための、（１）乃至（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）臓器が脳である、（６）に記載の組成物。
（８）（１）乃至（７）のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする、インスリン受容体の発現を促進するための食品、飲料、又は飼料。
（９）記憶障害および睡眠障害からなる群から選択される障害の治療および改善のための、（１）乃至（７）のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、飼料、又は医薬品。
（１０）記憶障害を有すると診断されていない対象において記憶を改善するための又は睡眠障害を有すると診断されていない対象において睡眠を促進するための、（１）乃至（７）のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする食品、飲料、又は飼料。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、インスリン受容体の発現を促進させる安定性及び安全性に優れたインスリン受容体発現促進組成物を提供するものである。また、該インスリン受容体発現促進組成物を含有する、食品、飲料、飼料、又は医薬品を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明によって見出されたインスリン受容体の発現促進効果の高い菌であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株のインスリン受容体の発現促進効果を示した図。
【図2】インスリン受容体を強制発現させたショウジョウバエの睡眠を示した図。インスリン受容体の発現が促進されることにより睡眠が促進される。
【図3】インスリンシグナルを活性化させたショウジョウバエの睡眠を示した図。インスリン受容体が活性化されることにより睡眠が促進される。
【図4】本発明のインスリン受容体発現促進剤であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株のショウジョウバエの睡眠を示した図。
【図5】脳のインスリン受容体を不活性化させたショウジョウバエの睡眠を示した図。インスリン受容体が不活性化されることにより、本発明のインスリン受容体発現促進剤の睡眠増加効果が抑制される。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明のインスリン受容体発現促進組成物について説明する。本発明の有効成分はビフィドバクテリウム・アドレセンティス種、ラクトバチルス・プランタルム種に属する微生物であって、インスリン受容体発現促進効果を有するものであればいずれも利用することができる。
【0016】
ビフィドバクテリウム・アドレセンティス種、ラクトバチルス・プランタルム種であればその菌株は特に限定されないが、好ましい例としてはビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）種ではＳＢＴ０４３０株、ＳＢＴ２７８６株が、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種ではＳＢＴ２２２７株が挙げられる。
【0017】
これら微生物は、単独で用いることもできるし、適宜２種以上の菌を組み合わせて用いても良い。
【0018】
微生物の培養は、各微生物に適した条件を採用すればよい。例えば、培地には乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地、化学的に規定された合成培地等種々の培地を用いることができる。このような培地としては、還元脱脂乳やＭＲＳ培地などを例示することができる。
【0019】
得られた培養物から遠心分離などの集菌手段によって分離された菌体をそのまま本発明の有効成分として用いることができる。生菌体が好ましいが、菌体に何らかの処理を加ええても良く、濃縮、乾燥、凍結乾燥などした菌体を用いることもできるし、加熱乾燥などにより死菌体にしても良く、その処理方法は特に限定されるものではない。
菌体として純粋に分離されたものだけでなく、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
培養物などの形態としては、合成培地であるＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、還元脱脂乳培地など一般的に乳酸菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが、特に限定されるものではない。
菌体として純粋に分離されたものだけでなく、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
培養物などの形態としては、合成培地であるＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、還元脱脂乳培地など一般的に乳酸菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが、特に限定されるものではない。
【0020】
本発明のインスリン受容体発現促進組成物は、食品、飲料、飼料等に添加することができる。その際、本発明のインスリン受容体発現促進組成物はそのまま使用してもよいが、食品、飲料、及び飼料に通常含まれる他の原材料とともに使用できることから、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に用いることも出来る。また、ヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品、及び飼料に配合することも可能である。
【0021】
本発明のインスリン受容体発現促進組成物は、一実施態様において、糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満症、記憶障害、睡眠障害などの疾患又は障害を有すると診断されていない対象が摂取するための食品、飲料、飼料等に添加することができる。
【0022】
本発明のインスリン受容体発現促進組成物は、動物の臓器におけるインスリン受容体の発現を促進する。動物としては、鳥類、魚類、及び哺乳類が好ましく、特に、哺乳類の中でもヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジが好ましい。臓器としては、脳、眼球、内分泌組織、肺臓、近位消化管、胃腸管、肝臓、膵臓、腎臓、骨格筋、脂肪組織が好ましい。
【0023】
（インスリン受容体発現促進組成物の評価方法）
本発明のインスリン受容体発現促進組成物のインスリン発現促進作用は、実施例に記載したショウジョウバエを対象とした動物試験により確認することができる。
本発明のインスリン受容体発現促進組成物のインスリン発現促進作用は、実施例に記載したショウジョウバエを対象とした動物試験により確認することができる。
【0024】
以下に実施例、試験例を示し、本発明について詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例0025】
（試験例１）微生物のインスリン受容体発現促進作用
１．試験方法
（１）供与菌
本発明によって見出されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株のインスリン受容体の発現促進効果をＲＮＡシーケンスにて調べた。
（２）インスリン受容体発現の評価
乳酸菌等の凍結乾燥粉末を終濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるよう餌に混ぜて調整してショウジョウバエに投与した。コントロールとしては乳酸菌等を添加しない餌を投与した。投与４日目のハエを各群３２匹ずつをマイクロチューブに回収した。回収したハエはマイクロチューブごと液体窒素で凍結し、ボルテックスミキサーで撹拌して頭部から胴体、羽などの付属物を分離した後、目開き７１０μｍと４２５μｍの篩を使用して頭部のみを回収した。回収した頭部はマイクロチューブに入れ、１００μｌのＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ， Ｔｏｋｙｏ）を加えてペッスルで十分に磨り潰した。ＲＮＡ抽出は、キットのプロトコールを一部改変して行った。頭部を磨り潰した溶液にＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓを９００μｌ加えた後、遠心分離（１２，０００ｇ， ５ｍｉｎ， ４℃）で組織細片を沈殿させ、上清を新しいチューブに回収した。クロロホルムを２００μｌ加えて撹拌し、５分静置した後、遠心分離（１２，０００ｇ， １０ ｍｉｎ， ４℃）をした。下層のクロロホルム層をピペットで除去し、残った上層に等量のクロロホルムを添加して撹拌した後、再度遠心分離（１２，０００ｇ， １０ｍｉｎ， ４℃）をした。中間層が入らないように上層のみを丁寧に新しいチューブに回収し、そこにイソプロパノールを１ ｍｌ添加した。十分に撹拌して１０分間静置した後、遠心分離（１２，０００ｇ， ５ｍｉｎ， ４℃）した。ペレットを崩さないように溶液を除去し、７５％冷エタノールで２回洗浄した。１０分程度風乾し、１００μｌのＤＮａｓｅ， ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解した。抽出したＲＮＡ溶液はＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒでＲＮＡ品質を確認した後、ＲＮＡ－ｓｅｑに供与した。
２．試験結果
コントロール群のインスリン受容体の発現量を１とした時、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株のそれぞれのインスリン受容体の発現量の相対値を図１に示す。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株のインスリン受容体の発現量はコントロール群に比べて２．１倍、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株は２．４倍と有意な増加が認められた。これらの微生物は、顕著なインスリン受容体発現促進効果を有する菌株であることが示された。
１．試験方法
（１）供与菌
本発明によって見出されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株のインスリン受容体の発現促進効果をＲＮＡシーケンスにて調べた。
（２）インスリン受容体発現の評価
乳酸菌等の凍結乾燥粉末を終濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるよう餌に混ぜて調整してショウジョウバエに投与した。コントロールとしては乳酸菌等を添加しない餌を投与した。投与４日目のハエを各群３２匹ずつをマイクロチューブに回収した。回収したハエはマイクロチューブごと液体窒素で凍結し、ボルテックスミキサーで撹拌して頭部から胴体、羽などの付属物を分離した後、目開き７１０μｍと４２５μｍの篩を使用して頭部のみを回収した。回収した頭部はマイクロチューブに入れ、１００μｌのＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ， Ｔｏｋｙｏ）を加えてペッスルで十分に磨り潰した。ＲＮＡ抽出は、キットのプロトコールを一部改変して行った。頭部を磨り潰した溶液にＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓを９００μｌ加えた後、遠心分離（１２，０００ｇ， ５ｍｉｎ， ４℃）で組織細片を沈殿させ、上清を新しいチューブに回収した。クロロホルムを２００μｌ加えて撹拌し、５分静置した後、遠心分離（１２，０００ｇ， １０ ｍｉｎ， ４℃）をした。下層のクロロホルム層をピペットで除去し、残った上層に等量のクロロホルムを添加して撹拌した後、再度遠心分離（１２，０００ｇ， １０ｍｉｎ， ４℃）をした。中間層が入らないように上層のみを丁寧に新しいチューブに回収し、そこにイソプロパノールを１ ｍｌ添加した。十分に撹拌して１０分間静置した後、遠心分離（１２，０００ｇ， ５ｍｉｎ， ４℃）した。ペレットを崩さないように溶液を除去し、７５％冷エタノールで２回洗浄した。１０分程度風乾し、１００μｌのＤＮａｓｅ， ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解した。抽出したＲＮＡ溶液はＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒでＲＮＡ品質を確認した後、ＲＮＡ－ｓｅｑに供与した。
２．試験結果
コントロール群のインスリン受容体の発現量を１とした時、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株のそれぞれのインスリン受容体の発現量の相対値を図１に示す。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株のインスリン受容体の発現量はコントロール群に比べて２．１倍、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株は２．４倍と有意な増加が認められた。これらの微生物は、顕著なインスリン受容体発現促進効果を有する菌株であることが示された。
【0026】
（試験例２）インスリン受容体を強制発現させたショウジョウバエの睡眠
本発明によって見出されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を摂取することにより、インスリン受容体の発現が有意に上昇することを見出した（試験例１）。この結果を受けて、インスリン受容体の発現上昇が睡眠量の増加に作用するのかについて検討した。
１．試験方法
（１）インスリン受容体を強制発現させたショウジョウバエ
ＲＵ４８６に依存してＧａｌ４転写活性を有するＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系統を発現誘導に用いた。発現誘導にはＲＵ４８６を最終濃度５００μＭを餌に混ぜてハエに投与した。コントロールには溶媒（エタノール）を与えた。テストにはＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ－Ｇａｌ４、ＵＡＳ系統を交配したＦ１世代のメス個体を用いた。ハエ系統は、温度２３℃、明暗周期（１２ｈ Ｌｉｇｈｔ／１２ｈ Ｄａｒｋ）に制御したインキュベーター（ＭＩＲ－２５４ ＳＡＮＹＯ）内で飼育した。
（２）睡眠促進作用の評価
ショウジョウバエを、１％ Ｂａｃｔａｇａｒ、５％ スクロースから構成される飼料とともに直径５ｍｍのガラスチューブに入れ、ショウジョウバエの行動を測定するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｉｋｉｎｅｔｉｃｓ社製）で３日間行動を測定した。ショウジョウバエでは、不動期間（動かない期間）が５分以上の場合を“睡眠”と定義されている。そこで、測定３日目の夜間の最初の３時間（概日時間でＺＴ１２～１５）の睡眠量について試験群とコントロール群を比較した。
２．試験結果
インスリン受容体を強制発現したハエでは睡眠量が有意に増加した（図２）。
本発明によって見出されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を摂取することにより、インスリン受容体の発現が有意に上昇することを見出した（試験例１）。この結果を受けて、インスリン受容体の発現上昇が睡眠量の増加に作用するのかについて検討した。
１．試験方法
（１）インスリン受容体を強制発現させたショウジョウバエ
ＲＵ４８６に依存してＧａｌ４転写活性を有するＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系統を発現誘導に用いた。発現誘導にはＲＵ４８６を最終濃度５００μＭを餌に混ぜてハエに投与した。コントロールには溶媒（エタノール）を与えた。テストにはＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ－Ｇａｌ４、ＵＡＳ系統を交配したＦ１世代のメス個体を用いた。ハエ系統は、温度２３℃、明暗周期（１２ｈ Ｌｉｇｈｔ／１２ｈ Ｄａｒｋ）に制御したインキュベーター（ＭＩＲ－２５４ ＳＡＮＹＯ）内で飼育した。
（２）睡眠促進作用の評価
ショウジョウバエを、１％ Ｂａｃｔａｇａｒ、５％ スクロースから構成される飼料とともに直径５ｍｍのガラスチューブに入れ、ショウジョウバエの行動を測定するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｉｋｉｎｅｔｉｃｓ社製）で３日間行動を測定した。ショウジョウバエでは、不動期間（動かない期間）が５分以上の場合を“睡眠”と定義されている。そこで、測定３日目の夜間の最初の３時間（概日時間でＺＴ１２～１５）の睡眠量について試験群とコントロール群を比較した。
２．試験結果
インスリン受容体を強制発現したハエでは睡眠量が有意に増加した（図２）。
【0027】
（試験例３）インスリンシグナルを脳内で活性化させたショウジョウバエの睡眠
人為的にインスリン受容体を脳内で発現させた場合、睡眠を促進させることができる（実験例２）。一方で、菌体を投与した場合と比べて睡眠促進効果が弱かった。その理由として、内在性のインスリンによる受容体の活性化が限定的な可能性がある。そこで、常時活性化型のインスリン受容体を脳で発現させた場合の睡眠効果を検討した。
１．試験方法
・常時活性化型インスリン受容体を脳内で発現させたショウジョウバエ
神経細胞特異的にＩｎＲａｃｔを発現させたハエの睡眠を調べた。脳内にＧａｌ４転写活性を有するＧａｌ４系統のハエを使用した。ハエは、温度２３℃、明暗周期（１２ｈ Ｌｉｇｈｔ／１２ｈＤａｒｋ）に制御したインキュベーター（ＭＩＲ－２５４ ＳＡＮＹＯ）内で飼育した。
・睡眠行動の測定とデータ解析
試験例２と同様の方法で行った。
２．試験結果
インスリンシグナルを脳内で活性化させたショウジョウバエでは、活性化していないハエと比較して、より強い睡眠増加効果が得られた（図３）。
人為的にインスリン受容体を脳内で発現させた場合、睡眠を促進させることができる（実験例２）。一方で、菌体を投与した場合と比べて睡眠促進効果が弱かった。その理由として、内在性のインスリンによる受容体の活性化が限定的な可能性がある。そこで、常時活性化型のインスリン受容体を脳で発現させた場合の睡眠効果を検討した。
１．試験方法
・常時活性化型インスリン受容体を脳内で発現させたショウジョウバエ
神経細胞特異的にＩｎＲａｃｔを発現させたハエの睡眠を調べた。脳内にＧａｌ４転写活性を有するＧａｌ４系統のハエを使用した。ハエは、温度２３℃、明暗周期（１２ｈ Ｌｉｇｈｔ／１２ｈＤａｒｋ）に制御したインキュベーター（ＭＩＲ－２５４ ＳＡＮＹＯ）内で飼育した。
・睡眠行動の測定とデータ解析
試験例２と同様の方法で行った。
２．試験結果
インスリンシグナルを脳内で活性化させたショウジョウバエでは、活性化していないハエと比較して、より強い睡眠増加効果が得られた（図３）。
【0028】
（試験例４）インスリン受容体の発現促進作用を持つ菌の睡眠促進作用
上記試験例１で見出したインスリン受容体の発現促進作用を持つ菌が、睡眠促進作用があるかを検討した。
１．試験方法
（１）供与菌
高いインスリン受容体の発現促進効果を持つ菌として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を用いた。
（２）睡眠促進作用の評価
野生型のショウジョウバエＣＳ２２０２ｕ系統を、温度２５℃で１２時間ごとの明暗周期下で飼育した、羽化後５日の未交尾のメスの個体を評価に用いた。ショウジョウバエに、上記（１）の菌を投与した。睡眠の評価は試験例２と同様とした。
２．試験結果
図４に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株の睡眠量を示す。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を摂取した群はコントロール群と比較して、睡眠量が有意に増加した。
上記試験例１で見出したインスリン受容体の発現促進作用を持つ菌が、睡眠促進作用があるかを検討した。
１．試験方法
（１）供与菌
高いインスリン受容体の発現促進効果を持つ菌として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を用いた。
（２）睡眠促進作用の評価
野生型のショウジョウバエＣＳ２２０２ｕ系統を、温度２５℃で１２時間ごとの明暗周期下で飼育した、羽化後５日の未交尾のメスの個体を評価に用いた。ショウジョウバエに、上記（１）の菌を投与した。睡眠の評価は試験例２と同様とした。
２．試験結果
図４に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株の睡眠量を示す。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＳＢＴ２７８６株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を摂取した群はコントロール群と比較して、睡眠量が有意に増加した。
【0029】
（試験例５）インスリン受容体を不活性化させたショウジョウバエの睡眠
１．試験方法
・インスリン受容体を不活性化させたショウジョウバエ
Ｇａｌ４／ＵＡＳ法を用いて、脳内の細胞群特異的に常時不活性型ＩｎＲ（ＩｎＲＤＮ）を発現させたハエに、本発明によって見出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を投与し、睡眠を調べた。ハエ系統は、温度２３℃、明暗周期（１２ｈ Ｌｉｇｈｔ／１２ｈ Ｄａｒｋ）に制御したインキュベーター（ＭＩＲ－２５４ ＳＡＮＹＯ）内で飼育した。
・睡眠行動の測定とデータ解析
試験例２と同様の方法で行った。
２．試験結果
ＩｎＲＤＮを脳内で発現させたハエに、本発明によって見出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を投与し睡眠行動を調べた結果、睡眠量の増加は観察されなかった（図５）。
１．試験方法
・インスリン受容体を不活性化させたショウジョウバエ
Ｇａｌ４／ＵＡＳ法を用いて、脳内の細胞群特異的に常時不活性型ＩｎＲ（ＩｎＲＤＮ）を発現させたハエに、本発明によって見出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を投与し、睡眠を調べた。ハエ系統は、温度２３℃、明暗周期（１２ｈ Ｌｉｇｈｔ／１２ｈ Ｄａｒｋ）に制御したインキュベーター（ＭＩＲ－２５４ ＳＡＮＹＯ）内で飼育した。
・睡眠行動の測定とデータ解析
試験例２と同様の方法で行った。
２．試験結果
ＩｎＲＤＮを脳内で発現させたハエに、本発明によって見出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＢＴ２２２７株を投与し睡眠行動を調べた結果、睡眠量の増加は観察されなかった（図５）。
【産業上の利用可能性】
【0030】
本発明は、インスリン受容体発現を促進する新たな組成物として、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス種、ラクトバチルス・プランタルム種に属する微生物、該微生物を含む組成物と該組成物を含む食品、飲料、及び飼料を提供するものである。また、前記組成物を含むことを特徴とする、記憶障害および睡眠障害の治療および改善のための食品、飲料、飼料、又は医薬品を提供する。本発明の組成物等を摂取することによりインスリン受容体発現を促進し、記憶の改善や睡眠の促進をすることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
