特開2023-7068蛍光色素、蛍光色素で標識された生体分子、及び化合物又はその塩
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023007068
(43)【公開日】2023-01-18
(54)【発明の名称】蛍光色素、蛍光色素で標識された生体分子、及び化合物又はその塩
(51)【国際特許分類】
C09B 23/14 20060101AFI20230111BHJP
C07D 335/06 20060101ALI20230111BHJP
【ＦＩ】
C09B23/14
C07D335/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021110071
(22)【出願日】2021-07-01
(71)【出願人】
【識別番号】000004112
【氏名又は名称】株式会社ニコン
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(72)【発明者】
【氏名】片山 由貴子
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼塚 賢二
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 洋平
(57)【要約】
【課題】新規な蛍光色素、及び前記蛍光色素として使用可能な化合物を提供する。
【解決手段】下記一般式（ｓ１）で表される化合物又はその塩からなる蛍光色素。Ｒは、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の炭化水素基を表す。また、前記蛍光色素で標識された生体分子。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】下記一般式（ｓ１）で表される化合物又はその塩からなる蛍光色素。Ｒは、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の炭化水素基を表す。また、前記蛍光色素で標識された生体分子。
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（ｓ１）で表される化合物又はその塩からなる蛍光色素。
［式中、Ｒは、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の炭化水素基を表す。］
【化1】
【請求項2】
前記Ｒが、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の芳香族炭化水素基である、請求項１に記載の蛍光色素。
【請求項3】
前記一般式（ｓ１）で表される化合物が、下記一般式（ｓ１－１）で表される化合物である、請求項２に記載の蛍光色素。
［式中、Ｘは、－ＮＲａＲｂで表される基（Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表し、Ｒｃは炭素数１～５のアルキル基を表す）、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、又は置換基を有してもよいアシル基を表す。］
【化2】
【請求項4】
前記一般式（ｓ１－１）で表される化合物が、下記式（Ｓ―ＮＨＡｃ）又は（Ｓ－ＮＨ２）で表される化合物である、請求項３に記載の蛍光色素。
【化3】
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光色素で標識された生体分子。
【請求項6】
下記一般式（ｓ１ａ）で表される化合物又はその塩。
［式中、Ｒａは、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の炭化水素基（但し、４－（ジメチルアミノ）フェニル基を含むものは除く。）を表す。］
【化4】
【請求項7】
前記Ｒａが、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の芳香族炭化水素基である、請求項６に記載の化合物又はその塩。
【請求項8】
前記一般式（ｓ１ａ）で表される化合物が、下記一般式（ｓ１ａ－１）で表される化合物である、請求項７に記載の化合物又はその塩。
［式中、Ｘａは、－ＮＲａＲｂで表される基（Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表し、Ｒｃは炭素原子数１～５のアルキル基を表す。ただし、Ｒａ及びＲｂの両方がアルキル基となることはない。）、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、又は置換基を有してもよいアシル基を表す。］
【化5】
［式中、Ｘａは、－ＮＲａＲｂで表される基（Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表し、Ｒｃは炭素原子数１～５のアルキル基を表す。ただし、Ｒａ及びＲｂの両方がアルキル基となることはない。）、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、又は置換基を有してもよいアシル基を表す。］
【請求項9】
前記一般式（ｓ１ａ－１）で表される化合物が、下記式（Ｓ―ＮＨＡｃ）又は（Ｓ－ＮＨ２）で表される化合物である、請求項８に記載の化合物又はその塩。
【化6】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は蛍光色素、蛍光色素で標識された生体分子、及び化合物又はその塩に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオイメージングで利用される超解像顕微鏡観察では、通常の蛍光観察よりも強い励起光が必要である。そのため、強い励起光でも褪色することがない耐光性の高い蛍光色素が求められる。近年、蛍光色素としては、凝集にともなって蛍光が増大する凝集誘起発光（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ：ＡＩＥ）性を有する蛍光色素が報告されている（非特許文献１）。また、一般的な有機蛍光色素のストークスシフトは、数１０ｎｍ前後であり、吸収光と発光とのスペクトルの重なりが大きい。そのため、発光の自己吸収が起こりやすく、発光効率が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Andong Shao et al., Insight into aggregation-induced emission characteristics of red-emissive quinoline-malononitrile by cell tracking and real-time trypsin detection. Chem. Sci., 2014, 5, 1383-1389.
【発明の概要】
【0004】
本発明の一実施態様は、下記一般式（ｓ１）で表される化合物又はその塩からなる蛍光色素である。
【0005】
【化1】
【0006】
本発明の一実施態様は、前記蛍光色素で標識された生体分子である。
【0007】
本発明の一実施態様は、下記一般式（ｓ１ａ）で表される化合物又はその塩である。
【0008】
【化2】
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）の吸収スペクトルを示す。
【図2A】化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）の蛍光スペクトルを示す。
【図2B】化合物（Ｓ－ＮＨ２）の蛍光スペクトルを示す。
【図3】蛍光染色細胞の顕微鏡観察に用いたフィルタの特性を示す。
【図4】細胞に取り込ませた化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）、化合物（Ｓ－ＮＨ２）、及びＡＴＴＯ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒの退色カーブを示す。
【図5A】化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）で染色した細胞のタイムラプス画像を示す。
【図5B】化合物（Ｓ－ＮＨ２）で染色した細胞のタイムラプス画像を示す。
【図5C】Ａｔｔｏ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒで染色した細胞のタイムラプス画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書及び本特許請求の範囲において、「脂肪族」とは、芳香族に対する相対的な概念であって、芳香族性を持たない基、化合物等を意味するものと定義する。
「芳香族炭化水素基」は、芳香環を少なくとも１つ有する炭化水素基を意味する。芳香環は、４ｎ＋２個のπ電子をもつ環状共役系であれば特に限定されず、単環式でも多環式でもよい。芳香環は、芳香族炭化水素環であってもよく、芳香族複素環であってもよい。
「アルキル基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の１価の飽和炭化水素基を包含するものとする。アルコキシ基又はアシル基中のアルキル基も同様である。
「アルキレン基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の２価の飽和炭化水素基を包含するものとする。
「置換基を有してもよい」と記載する場合、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換する場合と、メチレン基（－ＣＨ２－）を２価の基で置換する場合との両方を含む。
「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
「凝集誘起発光性」又は「ＡＩＥ性」とは、凝集にともなって蛍光が増大する化合物の性質を意味する。
「芳香族炭化水素基」は、芳香環を少なくとも１つ有する炭化水素基を意味する。芳香環は、４ｎ＋２個のπ電子をもつ環状共役系であれば特に限定されず、単環式でも多環式でもよい。芳香環は、芳香族炭化水素環であってもよく、芳香族複素環であってもよい。
「アルキル基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の１価の飽和炭化水素基を包含するものとする。アルコキシ基又はアシル基中のアルキル基も同様である。
「アルキレン基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の２価の飽和炭化水素基を包含するものとする。
「置換基を有してもよい」と記載する場合、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換する場合と、メチレン基（－ＣＨ２－）を２価の基で置換する場合との両方を含む。
「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
「凝集誘起発光性」又は「ＡＩＥ性」とは、凝集にともなって蛍光が増大する化合物の性質を意味する。
【0011】
本明細書及び本特許請求の範囲において、化学式で表される構造によっては不斉炭素が存在し、エナンチオ異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）やジアステレオ異性体（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）が存在し得るものがあるが、その場合は一つの式でそれら異性体を代表して表す。それらの異性体は単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。
【0012】
［蛍光色素］
一実施態様において、本発明は、下記一般式（ｓ１）で表される化合物（以下、「化合物（Ｓ１）」ともいう）又はその塩からなる蛍光色素を提供する。
一実施態様において、本発明は、下記一般式（ｓ１）で表される化合物（以下、「化合物（Ｓ１）」ともいう）又はその塩からなる蛍光色素を提供する。
【0013】
【化3】
【0014】
化合物（Ｓ１）は、蛍光性化合物である。化合物（Ｓ１）の吸収波長は、一例として、４００～６００ｎｍ付近である。化合物（Ｓ１）の吸収波長は、一例として４００～５００ｎｍ付近であり、一例として４５０～６００ｎｍである。化合物（Ｓ１）の蛍光波長は、一例として、６００～８００ｎｍ付近である。化合物（Ｓ１）は、従来の蛍光色素と比べて、耐光性に優れており、ストークスシフトが大きい。
【0015】
前記一般式（ｓ１）中、Ｒは、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数１～１８の炭化水素基を表す。前記炭化水素基は、脂肪族炭化水素基であってもよく、芳香族炭化水素基であってもよい。
【0016】
Ｒにおける脂肪族炭化水素基は、飽和脂肪族炭化水素基であってもよく、不飽和脂肪族炭化水素基であってもよい。前記脂肪族炭化水素基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基、又は構造中に環を含む脂肪族炭化水素基等が挙げられる。
【0017】
Ｒにおける直鎖状の脂肪族炭化水素基の炭素原子数としては、例えば、炭素原子数１～１６、炭素原子数１～１２、炭素原子数１～１０、又は炭素原子数１～６が挙げられる。Ｒにおける分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の炭素数としては、例えば、炭素原子数３～１６、炭素原子数３～１２、炭素原子数３～１０、又は炭素原子数３～６が挙げられる。Ｒにおける構造中に環を含む脂肪族炭化水素基の炭素数としては、例えば、炭素原子数３～１６、炭素原子数３～１２、炭素原子数３～１０、又は炭素原子数３～６が挙げられる。
【0018】
Ｒにおける芳香族炭化水素基は、単環式でも多環式でもよい。Ｒにおける芳香族炭化水素基が有する芳香環の炭素原子数としては、炭素原子数５～１８、炭素原子数５～１６、又は炭素原子数６～１６が挙げられる。芳香環としては、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン等の芳香族炭化水素環；前記芳香族炭化水素環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換された芳香族複素環等が挙げられる。芳香族複素環におけるヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。芳香族複素環の具体例としては、ピロリジン環、ピリジン環、チオフェン環等が挙げられる。
【0019】
Ｒにおける芳香族炭化水素基の炭素数としては、例えば、炭素原子数６～１６、炭素原子数６～１２、又は炭素原子数６～１０が挙げられる。Ｒにおける芳香族炭化水素基が有する芳香環は、一例として芳香族炭化水素環であり、一例として単環である。Ｒにおける芳香族炭化水素基は、例えば、水素原子の一部が置換されてもよいフェニル基である。前記フェニル基の水素原子を置換する置換基としては、例えば、後述の－ＮＲａＲｂで表される基が挙げられる。
【0020】
Ｒにおける炭化水素基は、電子供与基となる置換基を有する。電子供与基は、電子を押し出す力を有する置換基である。Ｒにおける炭化水素基が有する電子供与基の数は、特に限定されない。一例として、Ｒにおける炭化水素基が有する電子供与基の数は、１個である。
【0021】
Ｒは、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数６～１８の芳香族炭化水素基であってもよく、電子供与基となる置換基を有する炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基であってもよい。Ｒは、一例として、水素原子の一部が置換されてもよいフェニル基である。
【0022】
Ｒにおける炭化水素基が芳香族炭化水素基である場合、一例として、Ｒは、電子供与基となる置換基を有する芳香族炭化水素環を含む。芳香族炭化水素環が有する電子供与基としては、例えば、－ＮＲａＲｂで表される基（Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表し、Ｒｃは炭素原子数１～５のアルキル基を表す）、アルコキシ基、及びアシル基が挙げられるが、これらに限定されない。前記電子供与基としてのアルコキシ基及びアシル基が有するアルキル基としては、炭素原子数１～５の直鎖状アルキル基又は炭素原子数３～５の分岐鎖状アルキル基が挙げられる。
【0023】
Ｒにおける炭化水素基は、電子供与基に加えて、電子供与基以外の置換基を有してもよく、有していなくてもよい。一例としては、Ｒにおける炭化水素基は、電子供与基以外の置換基を有さない。
【0024】
化合物（Ｓ１）は、例えば、下記一般式（ｓ１－１）で表される化合物である。
【0025】
【化4】
【0026】
前記一般式（ｓ１－１）中、Ｘは、－ＮＲａＲｂで表される基（Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表し、Ｒｃは炭素数１～５のアルキル基を表す）、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、又は置換基を有してもよいアシル基を表す。
【0027】
－ＮＲａＲｂで表される基において、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表す。Ｒｃは炭素原子数１～５のアルキル基を表す。
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃにおける炭素原子数１～５のアルキル基としては、炭素原子数１～５の直鎖状アルキル基、炭素原子数３～５の分岐鎖状アルキル基、炭素原子数３～５のシクロアルキル基が挙げられる。炭素原子数１～５の直鎖状アルキル基は、炭素原子数１～４、炭素原子数１～３、又は炭素原子数１若しくは２の直鎖状アルキル基であってもよい。炭素原子数３～５の分岐鎖状アルキル基は、炭素原子数３又は４の分岐鎖状アルキル基であってもよい。炭素原子数３～５のシクロアルキル基は、炭素原子数３又は４のシクロアルキル基であってもよい。
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃにおける炭素原子数１～５のアルキル基としては、炭素原子数１～５の直鎖状アルキル基、炭素原子数３～５の分岐鎖状アルキル基、炭素原子数３～５のシクロアルキル基が挙げられる。炭素原子数１～５の直鎖状アルキル基は、炭素原子数１～４、炭素原子数１～３、又は炭素原子数１若しくは２の直鎖状アルキル基であってもよい。炭素原子数３～５の分岐鎖状アルキル基は、炭素原子数３又は４の分岐鎖状アルキル基であってもよい。炭素原子数３～５のシクロアルキル基は、炭素原子数３又は４のシクロアルキル基であってもよい。
【0028】
－ＮＲａＲｂで表される基は、一例として、Ｒａが水素原子であり、Ｒｂが－ＣＯＲｃで表される基である。この場合、化合物（Ｓ１）は、凝集誘起発光（ＡＩＥ）性を有する傾向がある。ＡＩＥ性とは、凝集にともなって蛍光が増大する化合物の性質をいう。化合物（Ｓ１）がＡＩＥ性を有する場合、耐光性がより向上する。
【0029】
－ＮＲａＲｂで表される基は、一例として、Ｒａ及びＲｂがいずれも水素原子である。この場合、化合物（Ｓ１）は、発光強度が向上する傾向がある。
【0030】
化合物（Ｓ１）の具体例を以下に示すが、これに限定されない。
【0031】
【化5】
【0032】
化合物（Ｓ１）は、塩の形態であってもよい。例えば、化合物（Ｓ１）の塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩；トリエチルアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。化合物（Ｓ）の酸付加塩として、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の鉱酸塩；p－トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。
【0033】
化合物（Ｓ１）は、耐光性が高く、ストークスシフトが大きい。そのため、蛍光顕微鏡（たとえば超解像顕微鏡）を用いたバイオイメージング用の蛍光色素として好適に用いることができる。
【0034】
耐光性を有する公知の蛍光色素としては、Ａｔｔｏ４６５（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）、Ｃ－Ｎａｐｈｏｘ－ＴＥＧ（東京化成工業）、及びＡＩＥ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ（ＡＩＥｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）等が知られている。しかしながら、これらの蛍光色素は、ストークスシフトが小さい、合成方法が複雑である等の難点がある。
化合物（Ｓ）は、耐光性が高く、ストークスシフトが大きいことに加えて、合成方法が簡易であり、低コストで合成できるという利点を有する。
化合物（Ｓ）は、耐光性が高く、ストークスシフトが大きいことに加えて、合成方法が簡易であり、低コストで合成できるという利点を有する。
【0035】
化合物（Ｓ１）又はその塩は、耐光性に優れることから、特に、通常の蛍光顕微鏡よりも強い励起光を用いる超解像顕微鏡観察用の蛍光色素として適用可能である。化合物（Ｓ１）又はその塩は、耐光性に優れているため、長時間観察を行った場合にも退色が生じにくい。そのため、例えば、長時間のタイムラプス画像の取得等にも適している。
化合物（Ｓ１）は、一例として、蛍光波長が６００～８００ｎｍであるため、蛍光波長が異なる波長の蛍光色素と組み合わせて、多重染色を行うことができる。
化合物（Ｓ１）又はその塩は、ストークスシフトが比較的広い。一般的な有機蛍光色素のストークスシフトが数１０ｎｍ前後であるのに対し、化合物（Ｓ１）又はその塩のストークスシフトは、一例として、１００ｎｍ以上である。ストークスシフトが広いことにより、吸収光と発光のスペクトルの重なりが小さくなり、自己吸収が起こりにくい。また、波長変換分野では、ストークスシフトが広いことにより、吸収する波長と発光する波長とをダイナミックに変換することが可能となる。さらに、分子標識の分野では、励起光が重なる他の蛍光色素と組み合わせることにより、単一励起光による多重染色も可能となる。
さらに、化合物（Ｓ１）は、比較的分子量が小さく、合成が容易である。そのため、安価にバイオイメージング用の色素を製造できる。
化合物（Ｓ１）は、一例として、蛍光波長が６００～８００ｎｍであるため、蛍光波長が異なる波長の蛍光色素と組み合わせて、多重染色を行うことができる。
化合物（Ｓ１）又はその塩は、ストークスシフトが比較的広い。一般的な有機蛍光色素のストークスシフトが数１０ｎｍ前後であるのに対し、化合物（Ｓ１）又はその塩のストークスシフトは、一例として、１００ｎｍ以上である。ストークスシフトが広いことにより、吸収光と発光のスペクトルの重なりが小さくなり、自己吸収が起こりにくい。また、波長変換分野では、ストークスシフトが広いことにより、吸収する波長と発光する波長とをダイナミックに変換することが可能となる。さらに、分子標識の分野では、励起光が重なる他の蛍光色素と組み合わせることにより、単一励起光による多重染色も可能となる。
さらに、化合物（Ｓ１）は、比較的分子量が小さく、合成が容易である。そのため、安価にバイオイメージング用の色素を製造できる。
【0036】
（製造方法）
化合物（Ｓ１）は、例えば、下記Ｓｃｈｅｍｅ Ａに示す方法を用いて製造することができる。以下、Ｓｃｈｅｍｅ Ａに記載の製造方法の一例について説明する。
化合物（Ｓ１）は、例えば、下記Ｓｃｈｅｍｅ Ａに示す方法を用いて製造することができる。以下、Ｓｃｈｅｍｅ Ａに記載の製造方法の一例について説明する。
【0037】
まず、Zhao, Dongbing、Beiring, BernhardとGlorius, Frank著「Ruthenium-NHC-Catalyzed Asymmetric Hydrogenation of Flavones and Chromones: General Access to Enantiomerically Enriched Flavanones, Flavanols, Chromanones, and Chromanols」（Angewandte Chemie Int. Ed. (2013) , 52(32), 8454-8458）に記載される方法等を用いて、化合物（Ｔ－２）を合成する。例えば、チオフェノール及びアセト酢酸エチルをポリりん酸（ＰＰＡ）の存在下で反応させて化合物（Ｔ－１）を得る。反応条件としては、例えば、９０℃で３０分間が挙げられる。次に、化合物（Ｔ－１）をマロノニトリルと反応させて、化合物（Ｔ－２）を得る。反応は、例えば、温度０℃で四塩化チタン、ピリジン及びジクロロメタンと混合した後、室温で反応を行うことができる。
【0038】
次に、化合物（Ｔ－２）に、化合物（１）を反応させて、化合物（Ｓ１）を得る。反応は、例えば、アルゴン雰囲気下、無水トルエンの存在下で行うことができる。反応条件としては、室温で、２時間還流が挙げられる。化合物（１）の官能基が保護基で保護されている場合には、脱保護剤を添加して反応させてもよい。
このようにして、化合物（Ｓ１）を製造することができる。
このようにして、化合物（Ｓ１）を製造することができる。
【0039】
【化6】
【0040】
［生体分子］
一実施態様において、本発明は、化合物（Ｓ１）又はその塩からなる蛍光色素で標識された生体分子を提供する。
一実施態様において、本発明は、化合物（Ｓ１）又はその塩からなる蛍光色素で標識された生体分子を提供する。
【0041】
「生体分子」とは、生体を構成する分子またはそれらを模倣して合成された分子を意味する。生体分子としては、生体高分子（核酸、タンパク質、多糖）、及びこれらの構成単位であるヌクレオチド、ヌクレオシド、並びにこれらのオリゴマー、アミノ酸、ペプチド、糖、並びに脂質等が挙げられる。タンパク質としては、抗体、酵素、ホルモン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0042】
化合物（Ｓ１）又はその塩からなる蛍光色素と、生体分子との結合は、公知の方法により行うことができる。例えば、化合物（Ｓ１）又はその塩に、生体分子が有する官能基と反応可能な官能基を導入し、前記官能基どうしの結合を介して、化合物（Ｓ１）を生体分子に結合させる方法が挙げられる。
【0043】
生体分子中の官能基及び化合物（Ｓ１）に導入する官能基の組合せとしては、例えば、アミノ基とカルボキシ基、ヒドロキシ基とカルボキシ基、ＮＨＳエステル基及とびアミノ基、マレイミド基とチオール基、及びアジド基とプロパルギル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
本実施形態の生体分子は、耐光性に優れた蛍光色素である化合物（Ｓ１）又はその塩で標識されているため、蛍光顕微鏡、たとえば超解像顕微鏡観察によるバイオイメージングに好適に用いることができる。
【0045】
［化合物］
一実施態様において、本発明は、下記一般式（ｓ１ａ）で表される化合物又はその塩を提供する。
一実施態様において、本発明は、下記一般式（ｓ１ａ）で表される化合物又はその塩を提供する。
【0046】
【化7】
【0047】
一般式（ｓ１ａ）中のＲａは、前記一般式（ｓ１）中のＲと同様である。但し、Ｒａでは、４－（ジメチルアミノ）フェニル基を含むものは除かれる。
【0048】
前記一般式（ｓ１ａ）で表される化合物としては、下記一般式（ｓ１ａ－１）で表される化合物が挙げられる。
【0049】
【化8】
［式中、Ｘａは、－ＮＲａＲｂで表される基（Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、又は－ＣＯＲｃで表される基を表し、Ｒｃは炭素数１～５のアルキル基を表す。ただし、Ｒａ及びＲｂの両方がアルキル基となることはない。）、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、又は置換基を有してもよいアシル基を表す。］
【0050】
一般式（ｓ１ａ－１）中のＸａは、前記一般式（ｓ１－１）中のＸと同様である。但し、Ｘａが－ＮＲａＲｂで表される基である場合、Ｒａ及びＲｂの両方がアルキル基となることはない。
【0051】
一般式（ｓ１ａ）で表される化合物は、塩の形態であってもよい。塩としては、化合物（Ｓ１）の塩として挙げたものと同様のものが挙げられる。
【0052】
一般式（ｓ１ａ）で表される化合物の具体例としては、前記式（Ｓ－ＮＨＡｃ）又は（Ｓ－ＮＨ２）で表される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
式（Ｓ－ＮＨＡｃ）で表される化合物（以下、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）ともいう）は、ＡＩＥ性を有し、耐光性に極めて優れた化合物である。
式（Ｓ－ＮＨ２）で表される化合物（以下、化合物（Ｓ－ＮＨ２）ともいう）は、ＡＩＥ性を有さないが、耐光性に優れた化合物である。
式（Ｓ－ＮＨ２）で表される化合物（以下、化合物（Ｓ－ＮＨ２）ともいう）は、ＡＩＥ性を有さないが、耐光性に優れた化合物である。
【0054】
一般式（ｓ１ａ）で表される化合物は、化合物（Ｓ１）に包含される化合物であり、蛍光色素として使用することができる。
【0055】
以上、本発明の実施形態について詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例0056】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0057】
［合成例］
（2-(2-methyl-4H-thiochromen-4-ylidene)malononitrile（化合物（Ｔ－２））の合成）
化合物（Ｔ－２）を、Donkers, Robert L.とWorkentin, Mark S.著「Elucidation of the Electron Transfer Reduction Mechanism of Anthracene Endoperoxides」（J. Am. Chem. Soc. (2004), 126(6), 1688-1698）に掲載されている方法で合成した。
（2-(2-methyl-4H-thiochromen-4-ylidene)malononitrile（化合物（Ｔ－２））の合成）
化合物（Ｔ－２）を、Donkers, Robert L.とWorkentin, Mark S.著「Elucidation of the Electron Transfer Reduction Mechanism of Anthracene Endoperoxides」（J. Am. Chem. Soc. (2004), 126(6), 1688-1698）に掲載されている方法で合成した。
【0058】
【化9】
【0059】
（(E)-N-(4-(2-(4-(dicyanomethylene)-4H-thiochromen-2-yl)vinyl)phenyl)acetamide（化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ））の合成）
化合物（Ｔ－２）３００ｍｇをアルゴン雰囲気下で無水アセトニトリル７５ｍＬに溶解した。これに、ピペリジン（富士フイルム和光純薬）１．７ｍＬと酢酸（富士フイルム和光純薬）１．７ｍＬを加えて室温で３０分かき混ぜた。次にこの溶液を加熱し、１８時間還流した。反応液に現れた赤色固体をろ過し、メタノールで洗浄し、赤色粉末固体４４８．２ｍｇを得た。
化合物（Ｔ－２）３００ｍｇをアルゴン雰囲気下で無水アセトニトリル７５ｍＬに溶解した。これに、ピペリジン（富士フイルム和光純薬）１．７ｍＬと酢酸（富士フイルム和光純薬）１．７ｍＬを加えて室温で３０分かき混ぜた。次にこの溶液を加熱し、１８時間還流した。反応液に現れた赤色固体をろ過し、メタノールで洗浄し、赤色粉末固体４４８．２ｍｇを得た。
【0060】
得られた化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）のＮＭＲおよびＦＤ－ＭＳ測定を行い、以下の結果より構造を同定した。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）：δ（ｐｐｍ）１０．２（１Ｈ，ｓ），８．７７（１Ｈ，ｄ,Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（１Ｈ，ｍ），７．７３（２Ｈ，ｍ），７．７２（１Ｈ，ｍ），７．６５（２Ｈ，ｍ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ）７．６３（１Ｈ，ｓ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ），２．０７（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５．７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）：δ（ｐｐｍ）１６９．１，１５６．２，１４８．６，１４１．６，１３７．４，１３４．９，１３３．１，１３０．２，１２９．４，１２８．９，１２８．５，１２８．２，１２５．１，１２４．７，１２１．２，１１９．４，１１７．９，１１６．４，６７．０，２４．６。ＦＤ－ＭＳ ｍ/ｚ ３６９．１ （Ｍ＋）。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）：δ（ｐｐｍ）１０．２（１Ｈ，ｓ），８．７７（１Ｈ，ｄ,Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（１Ｈ，ｍ），７．７３（２Ｈ，ｍ），７．７２（１Ｈ，ｍ），７．６５（２Ｈ，ｍ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ）７．６３（１Ｈ，ｓ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ），２．０７（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５．７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）：δ（ｐｐｍ）１６９．１，１５６．２，１４８．６，１４１．６，１３７．４，１３４．９，１３３．１，１３０．２，１２９．４，１２８．９，１２８．５，１２８．２，１２５．１，１２４．７，１２１．２，１１９．４，１１７．９，１１６．４，６７．０，２４．６。ＦＤ－ＭＳ ｍ/ｚ ３６９．１ （Ｍ＋）。
【0061】
【化10】
【0062】
（(E)-2-(2-(4-aminostyryl)-4H-thiochromen-4-ylidene)malononitrileの合成（化合物（Ｓ－ＮＨ２））の合成）
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）２１８ｍｇに塩酸（富士フイルム和光純薬）１０ｍＬとジオキサン（東京化成工業）２０ｍＬの混合溶媒を加え、加熱して１８時間還流した。反応終了後、反応液を４Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和し、酢酸エチル（関東化学）で抽出し有機溶媒層を分取後、硫酸マグネシウムで乾燥し有機溶媒を除去した。アセトニトリルと水を移動相としたＯＤＳカラムで精製し、橙色固体８７ｍｇを得た。
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）２１８ｍｇに塩酸（富士フイルム和光純薬）１０ｍＬとジオキサン（東京化成工業）２０ｍＬの混合溶媒を加え、加熱して１８時間還流した。反応終了後、反応液を４Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和し、酢酸エチル（関東化学）で抽出し有機溶媒層を分取後、硫酸マグネシウムで乾燥し有機溶媒を除去した。アセトニトリルと水を移動相としたＯＤＳカラムで精製し、橙色固体８７ｍｇを得た。
【0063】
得られた化合物（Ｓ－ＮＨ２）のＮＭＲとＥＩ－ＭＳ測定を行い、以下の結果より構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．９２（ｄ,Ｊ＝ ８．４Ｈｚ,１Ｈ）,７．６６（ｄ,Ｊ＝８．０Ｈｚ,１Ｈ）,７．６１（ｍ,１Ｈ）,７．５５（ｍ,１Ｈ）,７．４９（ｓ,１Ｈ）,７．３９（ｄ,Ｊ＝８．３Ｈｚ,２Ｈ）,７．２１（ｄ,Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ， Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）１５６．２，１４９．１，１４８．７，１３８．１，１３５．２，１３２．０，１２９．９，１２８．６，１２８．３，１２７．5，１２６．０，１２１．３，１２０．５，１１７．７，１１６．５，１１５．３，６７．６。ＥＩ－ＭＳｍ／ｚ３２７．１（Ｍ＋），２０５．２，１４９．０。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．９２（ｄ,Ｊ＝ ８．４Ｈｚ,１Ｈ）,７．６６（ｄ,Ｊ＝８．０Ｈｚ,１Ｈ）,７．６１（ｍ,１Ｈ）,７．５５（ｍ,１Ｈ）,７．４９（ｓ,１Ｈ）,７．３９（ｄ,Ｊ＝８．３Ｈｚ,２Ｈ）,７．２１（ｄ,Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ， Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）１５６．２，１４９．１，１４８．７，１３８．１，１３５．２，１３２．０，１２９．９，１２８．６，１２８．３，１２７．5，１２６．０，１２１．３，１２０．５，１１７．７，１１６．５，１１５．３，６７．６。ＥＩ－ＭＳｍ／ｚ３２７．１（Ｍ＋），２０５．２，１４９．０。
【0064】
【化11】
【0065】
［吸収スペクトル、蛍光スペクトルの測定］
（試料調製）
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）０．５ｍｇを秤量し、０．５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｄ５２９３，東京化成工業株式会社）に溶解した。また、化合物（Ｓ－ＮＨ２）１ｍｇを秤量し、０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）の各ＤＭＳＯ溶液のモル濃度は、それぞれ２．７ｍｍｏｌ／Ｌ及び６．１ｍｍｏｌ／Ｌである（表１）。このＤＭＳＯ溶液を表２に記載の容量で希釈し、それぞれ１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液を得た。
（試料調製）
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）０．５ｍｇを秤量し、０．５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｄ５２９３，東京化成工業株式会社）に溶解した。また、化合物（Ｓ－ＮＨ２）１ｍｇを秤量し、０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）の各ＤＭＳＯ溶液のモル濃度は、それぞれ２．７ｍｍｏｌ／Ｌ及び６．１ｍｍｏｌ／Ｌである（表１）。このＤＭＳＯ溶液を表２に記載の容量で希釈し、それぞれ１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液を得た。
【0066】
【表1】
【0067】
【表2】
【0068】
（吸収スペクトルの測定）
１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液及び１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液を、ＤＭＳＯでそれぞれ２０μｍｏｌ／Ｌに希釈し、９６ウェルプレート（ＥＺＶＩＥＷ（登録商標），ＡＧＣテクノグラス株式会社）の１穴にそれぞれ２００μＬずつ入れた。マイクロプレートリーダー（Ｓｐａｒｋ（登録商標），Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３５０ｎｍから７００ｎｍまでの吸収スペクトルを取得した。得られた吸収スペクトルの吸光度を吸収ピーク値が１．００となるように規格化した。
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）の吸収スペクトルを図１に示す。
１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液及び１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液を、ＤＭＳＯでそれぞれ２０μｍｏｌ／Ｌに希釈し、９６ウェルプレート（ＥＺＶＩＥＷ（登録商標），ＡＧＣテクノグラス株式会社）の１穴にそれぞれ２００μＬずつ入れた。マイクロプレートリーダー（Ｓｐａｒｋ（登録商標），Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３５０ｎｍから７００ｎｍまでの吸収スペクトルを取得した。得られた吸収スペクトルの吸光度を吸収ピーク値が１．００となるように規格化した。
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）の吸収スペクトルを図１に示す。
【0069】
（蛍光スペクトルの測定）
１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液及び１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液を、それぞれＤＭＳＯで２０μｍｏｌ／Ｌに希釈し、９６ウェルプレートの１穴にそれぞれ２００μＬずつ入れた。また、各化合物の凝集の程度と蛍光スペクトルの強度の関係を取得するために、ＤＭＳＯ濃度が異なる２０μｍｏｌ／Ｌの化合物溶液を調製した。１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液または１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液０．０１ｍＬに、それぞれＤＭＳＯと超純水（ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｉｎｔｅｇｒａｌ ３，１８．２ＭΩ・ｃｍ）を表３に示すように添加して、ＤＭＳＯ濃度が２０，４０，６０，８０％となる化合物溶液をそれぞれ調製した。これらを９６ウェルプレートの１穴にそれぞれ２００μＬずついれた。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍで励起したときの５００ｎｍから８００ｎｍの蛍光スペクトルを得た。
１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液及び１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液を、それぞれＤＭＳＯで２０μｍｏｌ／Ｌに希釈し、９６ウェルプレートの１穴にそれぞれ２００μＬずつ入れた。また、各化合物の凝集の程度と蛍光スペクトルの強度の関係を取得するために、ＤＭＳＯ濃度が異なる２０μｍｏｌ／Ｌの化合物溶液を調製した。１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）溶液または１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物（Ｓ－ＮＨ２）溶液０．０１ｍＬに、それぞれＤＭＳＯと超純水（ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｉｎｔｅｇｒａｌ ３，１８．２ＭΩ・ｃｍ）を表３に示すように添加して、ＤＭＳＯ濃度が２０，４０，６０，８０％となる化合物溶液をそれぞれ調製した。これらを９６ウェルプレートの１穴にそれぞれ２００μＬずついれた。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍで励起したときの５００ｎｍから８００ｎｍの蛍光スペクトルを得た。
【0070】
【表3】
【0071】
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）の蛍光スペクトルを図２Ａに示す。化合物（Ｓ－ＮＨ２）の蛍光スペクトルを図２Ｂに示す。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）は、超純水の割合が高く分子の凝集度が高いときに蛍光強度が強くなったことから、凝集誘起発光（ＡＩＥ）性を有することが確認できた（図２Ａ）。一方、化合物（Ｓ－ＮＨ２）は、超純水の割合が高く凝集度が高いときに蛍光が消失し、ＡＩＥ性は認められなかった。
【0072】
［細胞の染色試験］
（細胞の染色）
染色用の細胞として、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）細胞を用いた。
５００ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄ５７９６）に対し、５０ｍＬのＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１０４３７－０２８）及び５ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１５１４０－１４８）を添加したものを培養液として用いた。ＨｅＬａ細胞を培養した直径６０ｍｍの細胞培養ディッシュ（３５３００４，Ｆａｌｃｏｎ（登録商標），Ｃｏｒｎｉｎｇ）から培養液を除去した後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１４１９０－２５０）を用いて細胞表面を洗浄した。ＰＢＳを除去した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｔ３９２４）０．５ｍＬを添加し、ディッシュ底面全体に行き渡らせた後、３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定したインキュベーター（ＩＰ４００，ヤマト科学株式会社）内に５分間置いた。ディッシュを取り出し、細胞がディッシュ底面から剥離していることを確認した後、ディッシュを叩いて細胞同士の凝集を解いた。約４．５ｍＬの培養液で剥離した細胞を１５ｍＬチューブ（３５２０９６，Ｆａｌｃｏｎ（登録商標），Ｃｏｒｎｉｎｇ）に回収し、遠沈管に入れて遠心分離機（ＣＦ１６ＲＮ，ｈｉｍａｃ）を用いて１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行った。上澄みの培養液とトリプシン－ＥＤＴＡ溶液の混合溶液を回収し、培養液を添加してＨｅＬａ細胞懸濁液を得た。
（細胞の染色）
染色用の細胞として、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）細胞を用いた。
５００ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄ５７９６）に対し、５０ｍＬのＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１０４３７－０２８）及び５ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１５１４０－１４８）を添加したものを培養液として用いた。ＨｅＬａ細胞を培養した直径６０ｍｍの細胞培養ディッシュ（３５３００４，Ｆａｌｃｏｎ（登録商標），Ｃｏｒｎｉｎｇ）から培養液を除去した後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１４１９０－２５０）を用いて細胞表面を洗浄した。ＰＢＳを除去した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｔ３９２４）０．５ｍＬを添加し、ディッシュ底面全体に行き渡らせた後、３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定したインキュベーター（ＩＰ４００，ヤマト科学株式会社）内に５分間置いた。ディッシュを取り出し、細胞がディッシュ底面から剥離していることを確認した後、ディッシュを叩いて細胞同士の凝集を解いた。約４．５ｍＬの培養液で剥離した細胞を１５ｍＬチューブ（３５２０９６，Ｆａｌｃｏｎ（登録商標），Ｃｏｒｎｉｎｇ）に回収し、遠沈管に入れて遠心分離機（ＣＦ１６ＲＮ，ｈｉｍａｃ）を用いて１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行った。上澄みの培養液とトリプシン－ＥＤＴＡ溶液の混合溶液を回収し、培養液を添加してＨｅＬａ細胞懸濁液を得た。
【0073】
直径３５ｍｍのガラスボトムディッシュ（Ｄ１１１３０Ｈ，松浪硝子工業株式会社）に２ｍＬの培養液を入れ、ＨｅＬａ細胞懸濁液０．１ｍＬを添加した。ガラスボトムディッシュ底面に細胞が均一になるように振とうし、３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定したインキュベーター内で一晩培養した。
【0074】
化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）を、それぞれＤＭＳＯに溶解し、化合物の最終濃度が２０μｍｏｌ／ＬになるようにそれぞれＤＭＥＭと混合し、さらにＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｆ－１２７（Ｐ３０００ＭＰ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を最終濃度が０．１％となるように添加して各染色溶液を作製した。比較としてＡＴＴＯ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（ＡＤ４６５－３１，ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を用い、化合物の最終濃度が２０μｍｏｌ／ＬになるようにＤＭＥＭと混合し、さらにＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｆ－１２７を最終濃度が０．１％となるように添加して、染色溶液を作製した。
【0075】
ＨｅＬａ細胞がガラスボトムディッシュ底面に接着していることを確認し、培養液を除去した。次いで、染色溶液２ｍＬを添加して、３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定したインキュベーター内に３０分間静置した。次いで、染色溶液を除去しＤＭＥＭを添加して、蛍光観察用の細胞試料とした。
【0076】
（細胞のタイムラプス観察）
蛍光物質を取り込ませた細胞は、電動倒立顕微鏡（Ｔｉ－Ｅ， Ｎｉｋｏｎ）、水銀ランプ（Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔ， Ｎｉｋｏｎ）、ｓＣＭＯＳカメラ（浜松ホトニクス， ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ ｖ２）、顕微鏡コントロールソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， Ｎｉｋｏｎ）を用いてタイムラプス観察を行った。それぞれの化合物を取り込んだ培養細胞の蛍光像を得るために、励起フィルタ（４３８ｎｍ／２９ｎｍ）、ダイクロイックミラー（４６０ｎｍＬＰ）、吸収フィルタ（６３０ｎｍ／９２ｎｍ）からなる蛍光フィルターキューブを用いた。図３に、各フィルタの特性を示す。
蛍光物質を取り込ませた細胞は、電動倒立顕微鏡（Ｔｉ－Ｅ， Ｎｉｋｏｎ）、水銀ランプ（Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔ， Ｎｉｋｏｎ）、ｓＣＭＯＳカメラ（浜松ホトニクス， ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ ｖ２）、顕微鏡コントロールソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， Ｎｉｋｏｎ）を用いてタイムラプス観察を行った。それぞれの化合物を取り込んだ培養細胞の蛍光像を得るために、励起フィルタ（４３８ｎｍ／２９ｎｍ）、ダイクロイックミラー（４６０ｎｍＬＰ）、吸収フィルタ（６３０ｎｍ／９２ｎｍ）からなる蛍光フィルターキューブを用いた。図３に、各フィルタの特性を示す。
【0077】
タイムラプス観察における照射光の強度は、減光フィルタによって同じ強度が照射されるように設定した。化合物を取り込んだ細胞が視野内に十数個程度認められる試料部位を選択したのち、励起光を連続的に照射しながら撮像した。
【0078】
（データ処理）
得られた蛍光画像データは、視野内から興味範囲を選び興味範囲の蛍光強度の数値を出力した。得られた蛍光強度の数値を、それぞれのデータの測定開始時の数値で規格化することで、各データ間の退色までの時間を比較した。
得られた蛍光画像データは、視野内から興味範囲を選び興味範囲の蛍光強度の数値を出力した。得られた蛍光強度の数値を、それぞれのデータの測定開始時の数値で規格化することで、各データ間の退色までの時間を比較した。
【0079】
（結果）
図４に、細胞に取り込まれた各化合物の退色カーブを示す。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）又は化合物（Ｓ－ＮＨ２）で染色した細胞は、ＡＴＴＯ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒで染色した細胞と比較して、退色の速度が遅かった。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）と化合物（Ｓ－ＮＨ２）との比較では、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）で染色した細胞の方が、退色の速度が遅かった。
図４に、細胞に取り込まれた各化合物の退色カーブを示す。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）又は化合物（Ｓ－ＮＨ２）で染色した細胞は、ＡＴＴＯ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒで染色した細胞と比較して、退色の速度が遅かった。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）と化合物（Ｓ－ＮＨ２）との比較では、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）で染色した細胞の方が、退色の速度が遅かった。
【0080】
図５Ａに、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）で染色した細胞のタイムラプス画像を示す。図５Ｂに、化合物（Ｓ－ＮＨ２）で染色した細胞のタイムラプス画像を示す。図５Ｃに、ＡＴＴＯ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒで染色した細胞のタイムラプス画像を示す。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）で染色した細胞及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）で染色した細胞のいずれも、励起光の照射後１００秒でも蛍光が維持された。一方、ＡＴＴＯ４６５－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒで染色した細胞は、急速に退色し、励起光の照射後５０秒後には蛍光が消失した。化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）で染色した細胞は、化合物（Ｓ－ＮＨ２）で染色した細胞よりも、照射後１００秒における蛍光強度が強かった。
これらの結果は、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）が優れた耐光性を有することを示す。特に、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）は、ＡＩＥ性を有し、顕著な耐光性を有することが確認された。
これらの結果は、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）及び化合物（Ｓ－ＮＨ２）が優れた耐光性を有することを示す。特に、化合物（Ｓ－ＮＨＡｃ）は、ＡＩＥ性を有し、顕著な耐光性を有することが確認された。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
