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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023071073
(43)【公開日】2023-05-22
(54)【発明の名称】鋳型ＤＮＡの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20230515BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230515BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021183664
(22)【出願日】2021-11-10
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】岡村 好子
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 宏和
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR20
4B063QS26
(57)【要約】
【課題】ｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡを多量、安価、簡便、且つ迅速に調製できるようにする。
【解決手段】鋳型ＤＮＡの製造方法は、カセット２本鎖ＤＮＡを準備する工程ａと、標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程ｂと、それらをＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程ｃと、該ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、サポート配列と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、標的配列と、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得る工程ｄと、該２本鎖ＤＮＡを同一配列同士の間で切断し、サポート配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する鋳型ＤＮＡを得る工程ｅとを備えている。
【選択図】図１
【解決手段】鋳型ＤＮＡの製造方法は、カセット２本鎖ＤＮＡを準備する工程ａと、標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程ｂと、それらをＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程ｃと、該ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、サポート配列と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、標的配列と、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得る工程ｄと、該２本鎖ＤＮＡを同一配列同士の間で切断し、サポート配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する鋳型ＤＮＡを得る工程ｅとを備えている。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡをセルフリークローニングシステムにより製造する方法であって、
（ａ）ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、サポート配列と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列とを含む断片からなり、両端に突出配列を有し且つ該断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡを準備する工程と、
（ｂ）前記カセット２本鎖ＤＮＡの前記突出配列に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、所望のｓｇＲＮＡの標的配列とを有し、５’末端がリン酸化された標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程と、
（ｃ）前記カセット２本鎖ＤＮＡと前記標的配列含有オリゴヌクレオチドをＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程と、
（ｄ）前記標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、前記サポート配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記標的配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得る工程と、
（ｅ）工程ｄで得られた前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡを前記同一配列同士の間で切断し、サポート配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する前記鋳型ＤＮＡを得る工程とを備える、鋳型ＤＮＡの製造方法。
（ａ）ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、サポート配列と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列とを含む断片からなり、両端に突出配列を有し且つ該断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡを準備する工程と、
（ｂ）前記カセット２本鎖ＤＮＡの前記突出配列に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、所望のｓｇＲＮＡの標的配列とを有し、５’末端がリン酸化された標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程と、
（ｃ）前記カセット２本鎖ＤＮＡと前記標的配列含有オリゴヌクレオチドをＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程と、
（ｄ）前記標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、前記サポート配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記標的配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得る工程と、
（ｅ）工程ｄで得られた前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡを前記同一配列同士の間で切断し、サポート配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する前記鋳型ＤＮＡを得る工程とを備える、鋳型ＤＮＡの製造方法。
【請求項2】
工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、それぞれの鎖の５’末端に前記突出配列を有し、
工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドは、前記カセット２本鎖ＤＮＡのリン酸化されている鎖と結合する前記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端のみがリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドは、前記カセット２本鎖ＤＮＡのリン酸化されている鎖と結合する前記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端のみがリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、前記断片の一方の鎖の両端に前記突出配列を有し、
工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは、前記標的配列の両端にそれぞれ前記カセット２本鎖ＤＮＡにおける前記突出配列の一方に相補的な第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、他方に相補的な第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは、前記標的配列の両端にそれぞれ前記カセット２本鎖ＤＮＡにおける前記突出配列の一方に相補的な第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、他方に相補的な第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列は、末端に制限酵素ＤｒａＩサイト又は制限酵素ＢｔｇＺＩサイト、及びＰＡＭ配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
工程ｄにおける前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡは、前記カセット２本鎖ＤＮＡの、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列及び前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端にそれぞれ結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅により得る、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記プライマーが、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に耐性を有するプライマーである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
工程ｅにおける前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡの切断は、前記制限酵素ＤｒａＩサイト又は前記制限酵素ＢｔｇＺＩサイトに対応する制限酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる切断である、請求項４に記載の方法。
【請求項9】
工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、
（ａ１）サポート配列とベース配列とを含むベース配列含有２本鎖ＤＮＡを準備する工程であって、前記ベース配列は、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列との間に配置され且つ両端に制限酵素サイトを有する可変領域の配列とからなる、工程と、
（ａ２）前記可変領域の前記制限酵素サイトを制限酵素により切断して前記カセット２本鎖ＤＮＡを得る工程と、を含む方法により調製する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
（ａ１）サポート配列とベース配列とを含むベース配列含有２本鎖ＤＮＡを準備する工程であって、前記ベース配列は、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列との間に配置され且つ両端に制限酵素サイトを有する可変領域の配列とからなる、工程と、
（ａ２）前記可変領域の前記制限酵素サイトを制限酵素により切断して前記カセット２本鎖ＤＮＡを得る工程と、を含む方法により調製する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程ａ１における前記ベース配列含有２本鎖ＤＮＡは、前記サポート配列と前記ベース配列とを有するベース配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型とする、前記サポート配列及び前記ベース配列の少なくとも一方に結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅により調製する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記可変領域の前記制限酵素サイトは、Ｔｙｐｅ－ＩＩＳ、非連続配列若しくは非回文配列を認識するＴｙｐｅ－ＩＩＣ及びＴｙｐｅ－ＩＩＧからなる群から選択される２種類の制限酵素サイトを有する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
工程ａ２における前記カセット２本鎖ＤＮＡは、工程ａ１で得られた前記ベース配列含有２本鎖ＤＮＡに前記制限酵素サイトに対応する１種類目の制限酵素による切断と脱リン酸化を同時に行い、各酵素を失活させた後に前記制限酵素サイトに対応する２種類目の制限酵素により切断して得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
前記キットは、前記カセット２本鎖ＤＮＡ、前記ＤＮＡ結合酵素、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、増幅用プライマー及び４種類のデオキシリボヌクレオチドを含む、キット。
前記キットは、前記カセット２本鎖ＤＮＡ、前記ＤＮＡ結合酵素、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、増幅用プライマー及び４種類のデオキシリボヌクレオチドを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、鋳型ＤＮＡの製造方法に関し、特にｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、様々な生物種の遺伝子操作を可能にし、基礎研究のみならず、医学を含む応用研究にも影響を与えている。特に近年では、ゲノム編集のみならず、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）の検出等の応用利用も行われている。
【0003】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用するためには、ｃｒＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）が１つになったｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を使用する必要がある。このｓｇＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼを使用して試験管内転写で作製する場合、対象配列毎に鋳型ＤＮＡを調製する必要がある。
【0004】
現在この鋳型ＤＮＡの調製方法としては、プラスミドベクターへのクローニング又はＰＣＲ法で調製する方法が知られている。
【0005】
非特許文献１には、プラスミドベクターへのクローニングによる、ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を得るための鋳型ＤＮＡの調製方法が開示されている。非特許文献１の調製方法では、初めに標的配列に対する２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成しておき、これらをアニーリングして２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを作製する。その後、該２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをベクターにライゲーションし、続いて形質転換及びダイレクトシークエンスによるポジティブクローンの選択を行うことで鋳型ＤＮＡを調製することができる。
【0006】
非特許文献２には、ＰＣＲ法によるｓｇＲＮＡ用鋳型ＤＮＡの調製方法が開示されている。非特許文献２の調製方法では、標的配列を含むＤＮＡ、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及びｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部の３種類のオリゴＤＮＡを化学合成しておき、これらのオリゴＤＮＡをＰＣＲにより伸長させることで鋳型ＤＮＡを調製することができる。
【0007】
また、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社のｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）人工遺伝子合成受託サービス等を利用して鋳型ＤＮＡを合成してもらうことも行われている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】「ゲノム編集｜２０２０」、フナコシ株式会社出版、フナコシニュース２０２０年５月１５日号（Ｎｏ．７０３）、ｐ．１－４０（ｐ．１６の右カラム）
【非特許文献2】「ガイドＲＮＡ合成キット ＣＵＧＡ（登録商標）７ ｇＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 別冊「参考資料」」、株式会社ニッポンジーン出版、製品マニュアル、改訂版Ｒ３０２、ｐ．１－１１（ｐ．３、４）
【非特許文献3】塚本智史著「クローニング不要！ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）－ｂａｓｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるノックアウトマウスの作製」、株式会社医学生物学研究所出版、ＩＤＴテクニカルレポート、ｖｏｌ．１、ｐ．１－６（ｐ．３の図１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかし、非特許文献１に記載されているプラスミドベクターへのクローニングによる鋳型ＤＮＡの調製方法では、形質転換及びダイレクトシークエンスによるポジティブクローンの選択に時間を要するため、鋳型ＤＮＡを調製するまでに数日程度の時間を要する。また、細胞を扱う必要があるため、ｇＲＮＡ製造のハイスループット化に適していない。
【0010】
また、非特許文献２に記載されているＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの調製では、Ｔ７プロモーター配列と、標的配列と、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部とを有する上記標的配列を含むＤＮＡを化学合成する必要があるため、鋳型ＤＮＡを調製するまでに数日程度の時間が必要とされている。また、ＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの調製方法では、合成した鋳型ＤＮＡの塩基配列の正確性に欠けることがあるため、この鋳型ＤＮＡから作製するｓｇＲＮＡが所望の機能を果たさないこともあり得る。
【0011】
また、非特許文献３に記載されているようなｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）人工遺伝子合成受託サービス等を利用して鋳型ＤＮＡを得ることは、数週間の時間を必要とし、また、上記各方法と比較してコストが高くなる。
【0012】
以上のように、これらの調製方法では鋳型ＤＮＡを調製するまでに数日～数週間程度の時間を要するうえに、合成した鋳型ＤＮＡの塩基配列の正確性に欠ける問題点を有するものもある。また、これらの方法では多くの工程数を要するため、鋳型ＤＮＡの合成におけるコストが高くなる。さらに、いずれの方法もｓｇＲＮＡ製造のハイスループット化に適していない。
【0013】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、標的ＤＮＡに含まれる標的配列を有するオリゴヌクレオチドを用意するだけで、ｓｇＲＮＡを得るための鋳型ＤＮＡを多量、安価、簡便、且つ迅速に調製できる鋳型ＤＮＡの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
上記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、ｓｇＲＮＡ転写における共通部分にあたるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡを作製しておき、該カセット２本鎖ＤＮＡと標的配列を有するオリゴヌクレオチドをセルフリークローニングシステムによって連結及び増幅することで、ｓｇＲＮＡを得るための鋳型ＤＮＡを製造できることを見出して本発明を完成した。
【0015】
具体的に、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法は、ｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡをセルフリークローニングシステムにより製造する方法であって、（ａ）ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、サポート配列と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列とを含む断片からなり、両端に突出配列を有し且つ該断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡを準備する工程と、（ｂ）前記カセット２本鎖ＤＮＡの前記突出配列に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、所望のｓｇＲＮＡの標的配列とを有し、５’末端がリン酸化された標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程と、（ｃ）前記カセット２本鎖ＤＮＡと前記標的配列含有オリゴヌクレオチドをＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程と、（ｄ）前記標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、前記サポート配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記標的配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、からなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得る工程と、（ｅ）工程ｄで得られた前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡを前記同一配列同士の間で切断し、サポート配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する前記鋳型ＤＮＡを得る工程とを備えることを特徴とする。
【0016】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法によると、ｓｇＲＮＡ転写における共通部分の塩基配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡを作製しておき、該カセット２本鎖ＤＮＡとｓｇＲＮＡの標的とする標的ＤＮＡから調製した標的配列を有するオリゴヌクレオチドを連結して標的配列含有環状体ヌクレオチドを調製し、該標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型として増幅させることでｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡを製造できる。従って、この鋳型ＤＮＡを試験管内転写することで、所望の標的認識配列を有するｓｇＲＮＡを多量且つ迅速に提供することができる。また、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法によると、多種類の鋳型ＤＮＡを短時間で提供できることからＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの製造方法より汎用性が高い。さらに、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法はセルフリーシステムで行うことができるため、鋳型ＤＮＡ製造のハイスループット化に適している。
【0017】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、それぞれの鎖の５’末端に前記突出配列を有し、工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドは、前記カセット２本鎖ＤＮＡのリン酸化されている鎖と結合する前記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端のみがリン酸化されていてもよい。
【0018】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、前記断片の一方の鎖の両端に前記突出配列を有し、工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは、前記標的配列の両端にそれぞれ前記カセット２本鎖ＤＮＡにおける前記突出配列の一方に相補的な第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、他方に相補的な第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。
【0019】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列は、末端に制限酵素ＤｒａＩサイト又は制限酵素ＢｔｇＺＩサイト及びＰＡＭ配列を有してもよい。
【0020】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。
【0021】
工程ｃにおいてエキソヌクレアーゼ活性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、標的配列含有２本鎖ＤＮＡを、標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型とするローリングサークル型増幅で得ることができる。従って、同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを容易に得ることができる。
【0022】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、工程ｄにおける前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡは、前記カセット２本鎖ＤＮＡの、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列及び前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端にそれぞれ結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅により得ることが好ましい。また、前記プライマーが、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に耐性を有するプライマーであることが好ましい。
【0023】
このようにすると、工程ｄにおける標的配列含有２本鎖ＤＮＡを、標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型とする超分岐ローリングサークル型増幅で得ることができる。従って、同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを迅速に得ることができる。
【0024】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、工程ｅにおける前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡの切断は、前記制限酵素ＤｒａＩサイト又は前記制限酵素ＢｔｇＺＩサイトに対応する制限酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる切断であってもよい。
【0025】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、（ａ１）サポート配列とベース配列とを含むベース配列含有２本鎖ＤＮＡを準備する工程であって、前記ベース配列は、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列との間に配置され且つ両端に制限酵素サイトを有する可変領域の配列とからなる、工程と、（ａ２）前記可変領域の前記制限酵素サイトを制限酵素により切断して前記カセット２本鎖ＤＮＡを得る工程と、を含む方法により調製することが好ましい。また、工程ａ１における前記ベース配列含有２本鎖ＤＮＡは、前記サポート配列と前記ベース配列とを有するベース配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型とする、前記サポート配列及び前記ベース配列の少なくとも一方に結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅により調製することが好ましい。
【0026】
このようにすると、工程ａにおけるカセット２本鎖ＤＮＡを迅速かつ多量に得ることができる。
【0027】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において、前記可変領域の前記制限酵素サイトは、Ｔｙｐｅ－ＩＩＳ、非連続配列若しくは非回文配列を認識するＴｙｐｅ－ＩＩＣ及びＴｙｐｅ－ＩＩＧからなる群から選択される２種類の制限酵素サイトを有することが好ましい。また、工程ａ２における前記カセット２本鎖ＤＮＡは、工程ａ１で得られた前記ベース配列含有２本鎖ＤＮＡに前記制限酵素サイトに対応する１種類目の制限酵素による切断と脱リン酸化を同時に行い、各酵素を失活させた後に前記制限酵素サイトに対応する２種類目の制限酵素により切断して得ることが好ましい。
【0028】
このようにすると、工程ａ１における２本鎖ＤＮＡに対して、制限酵素による切断と脱リン酸化を別の工程として行う必要がなくなるため、所望のカセット２本鎖ＤＮＡを容易に得ることができる。
【0029】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法を実施するためのキットにおいて、前記キットは、前記カセット２本鎖ＤＮＡ、前記ＤＮＡ結合酵素、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、増幅用プライマー及び４種類のデオキシリボヌクレオチドを含むことが好ましい。
【0030】
このようなキットはｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡを製造するために必要な道具が全て揃っている。加えて、該キットにはカセット２本鎖ＤＮＡが含まれていることから、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法の工程ｂ～ｅを実施するだけで所望の鋳型ＤＮＡを製造できる。従って、標的認識配列を有するｓｇＲＮＡを迅速且つ多量に提供することができる。また、該キットは、カセット２本鎖ＤＮＡと標的配列含有オリゴヌクレオチドを連結して標的配列含有環状体ヌクレオチドを調製し、これを鋳型として増幅させるだけで所望の鋳型ＤＮＡを製造できる。従って、該キットを使用することで多種類の鋳型ＤＮＡを提供することができ、鋳型ＤＮＡ製造用のキットとして汎用性が高い。
【発明の効果】
【0031】
本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法によると、ｓｇＲＮＡ転写における共通部分の塩基配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡを作製しておき、該カセット２本鎖ＤＮＡとｓｇＲＮＡの標的とする標的ＤＮＡから調製した標的配列を有するオリゴヌクレオチドを連結して標的配列含有環状体ヌクレオチドを調製し、該標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型として増幅させることでｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡを製造できる。従って、この鋳型ＤＮＡを試験管内転写することで、所望の標的認識配列を有するｓｇＲＮＡを多量且つ迅速に提供することができる。また、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法によると、予め準備したカセット２本鎖ＤＮＡを用いて多種類の鋳型ＤＮＡを短時間で提供できることからＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの製造方法より汎用性が高い。さらに、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法はセルフリーシステムで行うことができるため、鋳型ＤＮＡ製造のハイスループット化に適している。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】本発明の一実施形態に係る鋳型ＤＮＡの製造方法における製造工程ａ～ｅを説明するための概要図である。
【図2】本発明の一実施形態に係る鋳型ＤＮＡの製造方法において使用するカセット２本鎖ＤＮＡの好適な準備方法を説明するための概要図である。
【図3】本発明の一実施形態の変形例に係る鋳型ＤＮＡの製造方法における製造工程ａ、ｂを説明するための概要図である。（ａ）は工程ａを説明する図であり、（ｂ）は工程ｂを説明する図である。
【図4】実施例１に係る鋳型ＤＮＡの製造方法におけるベースオリゴヌクレオチドとサポートオリゴヌクレオチドを連結させて環状化した際のＤＮＡマップを示す図である。
【図5】実施例１において準備したカセット２本鎖ＤＮＡを電気泳動した結果を示す写真である。
【図6】実施例２に係る鋳型ＤＮＡの製造方法におけるベースオリゴヌクレオチドとサポートオリゴヌクレオチドを連結させて環状化した際のＤＮＡマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0034】
本発明の一実施形態に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法の概要を図１に示す。図１に示すように、本実施形態に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法は以下で詳述する工程ａ～ｅを含み、ｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡ（１）をセルフリークローニングシステムにより製造する方法である。特に、本実施形態に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法は、２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）を使用する点に特徴を有する。
【0035】
図１左側中段（拡大図を含む）に示すように、工程ａは、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）と、サポート配列（５）と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）を含む断片からなり、両端に突出配列（６Ａ、６Ｂ）を有し且つ該断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）を準備する工程である。特に本実施形態において、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）は、それぞれの鎖の５’末端に突出配列（６Ａ、６Ｂ）を有することを特徴とする。本実施形態において、工程ａにおけるカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の準備方法は特に限定されない。カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の好適な準備方法については後述する。
【0036】
本明細書においてｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とは、ｓｇＲＮＡの足場となる配列のことを指す。また、本実施形態において、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）は、末端に制限酵素ＤｒａＩサイト又は制限酵素ＢｔｇＺＩサイト、及びＰＡＭ配列を有することが好ましい。このようにすると、後述する工程ｅにおいて、制限酵素ＤｒａＩ又はＢｔｇＺＩを使用して標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）を同一配列同士の間で容易に切断することができる。また、ＰＡＭ配列を有することからＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる切断も可能となる。
【0037】
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）は、鋳型ＤＮＡ（１）に対して転写反応をするときに必要となる配列である。本実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）は、鋳型ＤＮＡ（１）の転写反応に用いるＲＮＡポリメラーゼに従って選択でき、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合Ｔ７プロモーター配列を好適に使用できるが、これに限定されない。
【0038】
本明細書において、サポート配列（５）とは、ｓｇＲＮＡとしての機能には不要な配列のことを指す。本実施形態において、サポート配列（５）の塩基の長さ及び種類は、該サポート配列を含む鋳型ＤＮＡ（１）を転写して得られるｓｇＲＮＡの機能を阻害しない限りにおいて、適宜選択することができる。
【0039】
図１の例では、突出配列（６Ａ）として「ＡＴＣＣ」の配列、及び突出配列（６Ｂ）として「ＧＴＴＴ」の配列を有する場合を説明しているが、これらの配列に限定されない。本実施形態において、突出配列（６Ａ、６Ｂ）は、後述するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ａ、９Ｂ）とそれぞれ相補的に結合できる限りにおいて、適宜選択することができる。
【0040】
本実施形態において、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）は、断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡを好適に使用することができる。従って、それぞれの鎖の５’末端にリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）を使用することができるし、片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡ（図示せず）を使用することもできる。
【0041】
図１左側上段に示すように、工程ｂは、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の突出配列（６Ａ、６Ｂ）に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ａ、９Ｂ）と、所望のｓｇＲＮＡの標的配列（８）とを有し、５’末端がリン酸化された標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）を調製する工程である。特に本実施形態において、工程ｂにおける標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）は２本鎖であり、一方の鎖の５’末端のみがリン酸化されている（アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＯＮ）の５’末端のみがリン酸化されている）。ここで、図１ではカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の両方の鎖の５’末端がリン酸化されているが、一方の鎖のみがリン酸化されている場合は、後に当該一方の鎖がニック無しに完全に環状となるように標的配列含有オリゴヌクレオチドはカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）のリン酸化されている鎖と結合する上記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端のみがリン酸化される。本実施形態において、工程ｂにおける標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）の調製方法は特に限定されない。
【0042】
図１左側上段を参照しつつ、本実施形態における、標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）の好適な調製方法を説明する。初めに、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の片方の鎖の突出配列（６Ａ）に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ａ）を５’側に有し、且つ所望のｓｇＲＮＡの標的配列（８）を３’側に有するセンスオリゴヌクレオチド（Ｓｅｎｓｅ－ＯＮ）を準備する。また、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の他方の鎖の突出配列（６Ｂ）に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ｂ）を５’側に有し、所望のｓｇＲＮＡの標的配列（８）を３’側に有し、且つ５’末端がリン酸化されているアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＯＮ）を準備する。なお、当該センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、所望の配列通りに常法によって１塩基ずつ正確に合成された合成オリゴヌクレオチドであることが好ましい。続いて、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングして２本鎖化し、標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）を好適に調製できる。
【0043】
本実施形態において、カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ａ、９Ｂ）は、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の突出配列（６Ａ、６Ｂ）に従って選択でき、例えば図１上段に示すようにカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ａ）として「ＴＡＧＧ」の配列、及びカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ｂ）として「ＣＡＡＡ」の配列を使用できるが、これに限定されない。
【0044】
図１左側下段に示すように、工程ｃは、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）と標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）をＤＮＡ結合酵素（ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ）により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）を得る工程である。より具体的には、初めにカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の突出配列（６Ａ、６Ｂ）が、標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）のカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（９Ａ、９Ｂ）と相補的に結合する。この状態において、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）と標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）の両端をＤＮＡ結合酵素で連結させることにより標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）を得ることができる。このようにして得られる標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）は、例えば図１の例では標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）のうち５’末端がリン酸化されていなかった鎖が構成する外側の環に１つのニック（Ｎｉｃｋ）を有する。このとき、オリゴヌクレオチドが二次構造を取りやすい場合などのときは、ニックは１塩基以上のギャップ（ｇａｐ）でも良い。
【0045】
本実施形態において、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）は、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）と標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ａ）を連結してなる環状体ヌクレオチドを意味する。
【0046】
図１の例では、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）は外側の環に１つのニックを有する場合を説明したが、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）におけるニックの数は特に限定されない。
【0047】
本実施形態において、工程ｃで使用するＤＮＡ結合酵素は、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs社製）を好適に使用できる。しかし、ＤＮＡ結合酵素の種類は特に限定されず、当業者に周知のＤＮＡ結合酵素を適宜選択できる。また、ＤＮＡ結合酵素を用いる連結反応の条件についても適宜設定できる。
【0048】
図１右側上段及び中段に示すように、工程ｄは、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）を鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）により増幅し、サポート配列（５）と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）と、標的配列（８）と、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）を得る工程である。より詳細には、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）のニックを含む外側の環状体ヌクレオチドを鋳型として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）によりニックから増幅を開始し、標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）を得る。
【0049】
本実施形態において、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）はエキソヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。このような鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）を用いると、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）を鋳型とするローリングサークル型増幅で標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）を得ることができるため好適である。このような鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）としては、例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを好適に使用できる。
【0050】
本実施形態において、工程ｄにおける標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）は、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）の末端にそれぞれ結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅で得ることが好ましい。このようにすると、標的配列含有環状体ヌクレオチド（１０）中の複数のプライマー認識配列（図示せず）を起点として複数の標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）を同時に合成できるため好適である。また、プライマーは６Ｒ５Ｓプライマー等のランダムプライマーを用いることができる。また、このようなプライマーは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）のエキソヌクレアーゼ活性に耐性を有するプライマーであることが好ましい。上記プライマーが鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）のエキソヌクレアーゼ活性に耐性を有しない場合、複数のプライマー認識配列を起点とする同時合成を行うことができない。
【0051】
図１右側下段に示すように、工程ｅは、標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）を同一配列同士の間で切断し、サポート配列（５）とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）と標的配列（８）とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とからなる配列を有する鋳型ＤＮＡ（１）を得る工程である。ここで、上記の通り、例えばｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）の末端に制限酵素ＤｒａＩサイト又は制限酵素ＢｔｇＺＩサイトが設けられている場合、制限酵素ＤｒａＩ又はＢｔｇＺＩを用いて工程ｅを行うことができる。
【0052】
本実施形態において得られる鋳型ＤＮＡ（１）は、ｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡ（１）として好適に使用できる。また、鋳型ＤＮＡ（１）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用するためのｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡ（１）として好適に使用でき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて使用するためのｓｇＲＮＡとして最も好適に使用できるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの種類は特に限定されない。
【0053】
本実施形態において、工程ｅでの標的配列含有２本鎖ＤＮＡ（１２）における同一配列同士の間での切断は、例えば制限酵素を用いる切断のほか、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる切断を行うことができる。この場合、上記の通り、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）の末端にＰＡＭ配列が設けられる。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる切断は、制限酵素を用いて切断する場合と比較して切断位置がより限定的であり、所望の位置以外での切断を防ぐことができるため好適である。また、本実施形態において、上記同一配列同士の間での切断反応の条件は適宜設定できる。
【0054】
本実施形態において、鋳型ＤＮＡ（１）は、少なくともＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）と標的配列（８）とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とからなる配列を有する。また、上述の通り、鋳型ＤＮＡ（１）は、該鋳型ＤＮＡを転写して得られるＲＮＡがｓｇＲＮＡとして機能できる限りにおいて、上記配列の他にサポート配列（５）をさらに含むものであってよい。
【0055】
本実施形態に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法は、上記工程ａ～ｅをセルフリーシステム（無細胞系）で実施することができる。従って、本実施形態の製造方法は細胞を扱う必要がなく、鋳型ＤＮＡ（１）の製造における手間を大幅に削減することができる。また、本実施形態の製造方法はセルフリーシステムで実施できるため、ハイスループット化に適している。そのため、所望のｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡ（１）を多量且つ迅速に提供することを可能にする。
【0056】
本実施形態に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法の工程ａにおいて使用するカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の好適な準備方法を図２に示す。図２に示すように、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）の好適な準備方法は、例えば以下で詳述する工程ａ１及びａ２を含む。
【0057】
図２右側上段に示すように、工程ａ１は、サポート配列（５）とベース配列（１７）とを含むベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ａ）を準備する工程であって、ベース配列（１７）は、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）と、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）との間に配置され且つ両端に制限酵素サイトを有する可変領域の配列（１８）と、からなる。
【0058】
図２を参照しつつ、本実施形態における工程ａ１のベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ａ）の好適な準備方法を説明する。初めに、図２左側上段に示すようにｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）と可変領域の配列（１８）とを有するベースオリゴヌクレオチド（１３Ａ、１３Ｂ）とサポートオリゴヌクレオチド（１４Ａ、１４Ｂ）を準備する。さらに、各オリゴヌクレオチド（１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ）の端部の配列に相補的な配列を有し且つ当該オリゴヌクレオチドの端部を跨るようにアニーリングできる配列を有するスプリントオリゴヌクレオチド（１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ）を準備する。続いて、図２左側中段に示すようにベースオリゴヌクレオチド（１３Ａ、１３Ｂ）及びサポートオリゴヌクレオチド（１４Ａ、１４Ｂ）並びにスプリントオリゴヌクレオチド（１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ）をアニーリングした後にＤＮＡ結合酵素を用いて連結し、１本鎖のベース配列含有環状体ヌクレオチド（１６）を調製する。なお、この方法はｃｉｒｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｉｎｔｏ ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＩＯＳ）法と呼ばれている。また、図２左側中段の１本鎖のベース配列含有環状体ヌクレオチド（１６）では、スプリントオリゴヌクレオチド（１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ）を図示していない。続いて、図２左側下段に示すように、得られた１本鎖のベース配列含有環状体ヌクレオチド（１６）を鋳型とし、スプリントオリゴヌクレオチドが結合した箇所を開始点として、サポート配列（５）及びベース配列（１７）の少なくとも一方に結合する２種類以上のプライマーと鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）を用いるローリングサークル型増幅によりベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ａ）を好適に準備することができる。また、プライマーは６Ｒ５Ｓプライマー等のランダムプライマーを用いることができる。なお、この方法は、ＭＰＲＣＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｙ－ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ）法と呼ばれている。
【0059】
本実施形態において、サポート配列（５）及びベース配列（１７）の少なくとも一方に結合する２種類以上のプライマーは、当業者に周知のプライマーを適宜選択できる。また、ローリングサークル型増幅で使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）は、エキソヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。このような鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）としては、例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを好適に使用できる。
【0060】
図２右側に示すように、工程ａ２は、可変領域の制限酵素サイトを制限酵素により切断してカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）を得る工程である。なお、図２の例では、可変領域の制限酵素サイトがＢｃｏＤＩサイトの場合を説明している。より具体的には、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ａ）に対して制限酵素ＢｃｏＤＩを作用させ、可変領域の配列（１８）の両端を同時に２箇所切断することで、それぞれの鎖の５’側に突出配列（６Ａ、６Ｂ）を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）を得ることができる（図２下段の拡大図参照）。
【0061】
本実施形態において、工程ａ２における可変領域の制限酵素サイトと制限酵素の種類はＢｃｏＤＩに限定されるものではなく、当業者に周知のものであれば適宜選択することができる。
【0062】
また、本実施形態において、可変領域の制限酵素サイトは、Ｔｙｐｅ－ＩＩＳ、非連続配列若しくは非回文配列を認識するＴｙｐｅ－ＩＩＣ及びＴｙｐｅ－ＩＩＧからなる群から選択される２種類の制限酵素サイトを有するものとすることができる。このようにすると、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ａ）をＴｙｐｅ－ＩＩＳ、Ｔｙｐｅ－ＩＩＣ又はＴｙｐｅ－ＩＩＧのいずれかの制限酵素で切断した後に、切断部にリン酸基を残すことができる。さらに、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ａ）に上記制限酵素サイトに対応する１種類目の制限酵素による切断と脱リン酸化を同時に行い、各酵素を失活させた後に上記制限酵素サイトに対応する２種類目の制限酵素により切断することで片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡ（図示せず）を得ることができる。
【0063】
本発明の一実施形態の変形例に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法を図３を参照しつつ説明する。特に、本変形例に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法は、１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）を使用する点に特徴を有する。
【0064】
一実施形態の変形例に係る製造方法は、上述した一実施形態に係る製造方法とは以下の２点で異なる。１点目は、工程ａにおいて断片の一方の鎖の両端に突出配列（６Ａ、６Ｃ）を有するカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）を使用することである。２点目は、工程ｂにおいて、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の突出配列（６Ａ）に相補的な第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（２３）と、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の突出配列（６Ｃ）に相補的な第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（２４）とを標的配列（８）の両端にそれぞれ有する１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）を使用することである。その他の工程については上述した本発明の一実施形態に係る鋳型ＤＮＡ（１）の製造方法と同様である。
【0065】
【0066】
本変形例において、工程ａは、上記した一実施形態の工程ａと基本的に同様である。特に本変形例においては、図３ａに示すように、工程ａは、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）及びＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）を含む断片からなり、該断片の一方の鎖の両端に突出配列（６Ａ、６Ｃ）を有し且つ該断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）を準備する工程である。本変形例において、工程ａにおけるカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の準備方法は特に限定されない。
【0067】
図３ａを参照しつつ、本変形例における、工程ａのカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の好適な準備方法をより具体的に説明する。図３ａに示すように、初めに、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ｂ）を準備する。このベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ｂ）は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）と可変領域の配列（１８）とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）とからなるベース配列（１７）と、図示しないサポート配列（５）とを有する２本鎖ＤＮＡである。また、図３の例では、該ベース配列含有２本鎖ＤＮＡの可変領域の配列（１８）は、ＢｃｏＤＩサイト（２０）と、ＭｗｏＩサイト（２１）と、ＢｃｏＤＩサイト（２０）とＭｗｏＩサイト（２１）との間に配置される可変配列（２２）と、からなる。初めに、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ（１９Ｂ）に制限酵素ＭｗｏＩを作用させ、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列（３）の３’末端に突出配列（６Ｃ）を有し且つ他方の鎖の５’末端にリン酸基を含むように切断する。続いて、切断して得られた断片に制限酵素ＢｃｏＤＩを作用させ、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（４）の５’側に突出配列（６Ａ）を有し且つ該突出配列の５’末端にリン酸基を含むように切断する。これにより、一方の鎖の両端に突出配列（６Ａ、６Ｃ）を有し且つ両方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）を好適に準備することができる。
【0068】
図３ａの例では、制限酵素サイトとしてＢｃｏＤＩサイト（２０）とＭｗｏＩサイト（２１）を有する場合を説明したが、一方の鎖の両端に突出配列（６Ａ、６Ｃ）を形成できる限り制限酵素サイトはこれらに限定されず、当業者に周知の制限酵素サイトであれば適宜選択することができる。
【0069】
本変形例において、工程ｂは、上記した一実施形態の工程ｂと基本的に同様である。特に本変形例においては、図３ｂに示すように、工程ｂは、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の突出配列（６Ａ）に相補的な第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（２３）と、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の突出配列（６Ｃ）に相補的な第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（２４）とを標的配列（８）の両端にそれぞれ有し且つ５’末端がリン酸化されている１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）を調製する工程である。本変形例において、工程ｂにおける１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）の調製方法は特に限定されないが、所望の配列通りに常法によって１塩基ずつ正確に合成された合成オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【0070】
図示しないが、本変形例において、工程ｃは、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）と、１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）をＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程である。より具体的には、初めにカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）の突出配列（６Ａ、６Ｃ）が、１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）の第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（２３）及び第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列（２４）と相補的に結合する。この状態において、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）と１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）をＤＮＡ結合酵素で連結させることにより標的配列含有環状体ヌクレオチドを得ることができる。
【0071】
本変形例において、工程ｃは、使用するカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）と１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド（７Ｂ）の構造が異なることと、これらの結合及び連結の態様が異なること以外は、上記した一実施形態に係る製造方法の工程ｃと同様である。従って、ニックの数、ＤＮＡ結合酵素の種類及びＤＮＡ結合酵素を用いる連結反応の条件等は特に限定されず、例えば上記した一実施形態に係る製造方法の工程ｃと同様にすることができる。
【0072】
図示しないが、本変形例において、工程ｄ及びｅは、上記した一実施形態に係る製造方法の工程ｄ及びｅと同様である。このようにして、鋳型ＤＮＡ（１）を調製することができる。
【0073】
本発明の一実施形態に係るキットは、図示しないが、上記した一実施形態又は一実施形態の変形例に係る鋳型ＤＮＡの製造方法を実施するためのキットであって、該キットは、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ又は２Ｂ）、ＤＮＡ結合酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、増幅用プライマー及び４種類のデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【0074】
本実施形態及び変形例において、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ、２Ｂ）は、カセット２本鎖ＤＮＡ（２Ａ）又はカセット２本鎖ＤＮＡ（２Ｂ）のいずれかを好適に使用できる。また、ＤＮＡ結合酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（１１）は特に限定されないが、上述したものを好適に使用できる。
【0075】
本実施形態及び変形例において、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、増幅用プライマー及び４種類のデオキシリボヌクレオチドは特に限定されず、当業者に周知のものを適宜選択できる。
【実施例0076】
以下に、本発明に係る鋳型ＤＮＡの製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【0077】
［実施例１：鋳型ＤＮＡの調製］
実施例１では、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡと２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを用いてｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡの調製を以下のように行った。
実施例１では、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡと２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを用いてｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡの調製を以下のように行った。
【0078】
＜カセット２本鎖ＤＮＡの準備＞
初めに、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡの準備を以下のように行った。なお、実施形態において詳述したＣＡＩＯＳ法で調製を行った。
初めに、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡの準備を以下のように行った。なお、実施形態において詳述したＣＡＩＯＳ法で調製を行った。
【0079】
（オリゴヌクレオチドの準備）
実施例１において用いたオリゴヌクレオチドを表１に示し、スプリントオリゴヌクレオチドを表２に示す。また、オリゴヌクレオチド（bv2.1_1、bv4_2、sv2.1_1、sv2_2）を連結させて環状化した際のＤＮＡマップを図４に示す。当該オリゴヌクレオチドにおいて、Ｔ７プロモーター配列はオリゴヌクレオチドbv2.1_1中の「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ」の配列を指し、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列はオリゴヌクレオチドbv2.1_1及びbv4_2中の「ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ」の配列を指す。また、ＢｃｏＤＩサイトはオリゴヌクレオチドbv2.1_1中の「ＧＡＧＡＣ」と「ＧＴＣＴＣ」の配列を指す。
実施例１において用いたオリゴヌクレオチドを表１に示し、スプリントオリゴヌクレオチドを表２に示す。また、オリゴヌクレオチド（bv2.1_1、bv4_2、sv2.1_1、sv2_2）を連結させて環状化した際のＤＮＡマップを図４に示す。当該オリゴヌクレオチドにおいて、Ｔ７プロモーター配列はオリゴヌクレオチドbv2.1_1中の「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ」の配列を指し、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列はオリゴヌクレオチドbv2.1_1及びbv4_2中の「ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ」の配列を指す。また、ＢｃｏＤＩサイトはオリゴヌクレオチドbv2.1_1中の「ＧＡＧＡＣ」と「ＧＴＣＴＣ」の配列を指す。
【0080】
【表1】
【0081】
【表2】
【0082】
（バッファー溶液の調製）
１０×リン酸化バッファーは、1Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．９）を２ｍＬ、１Ｍ 酢酸マグネシウムを１ｍＬ、１ｍｇウシ血清由来のアルブミンを1ｍＬ、蒸留水６ｍＬをそれぞれ混合させて作製している。１０×アニーリングバッファーは、1Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．８）を２ｍＬ、１Ｍ酢酸マグネシウムを１ｍＬ、４Ｍグルタミン酸カリウムを２．５ｍＬ、５０ｍＭ ＮＡＤを０．２ｍＬ、１Ｍ硫酸アンモニウムを１ｍＬ、蒸留水３．３ｍＬをそれぞれ混合させて作製している。また、１０×ＲＣＡバッファーは、１Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．５）を２ｍＬ、４Ｍグルタミン酸カリウムを０．６２５ｍＬ、１Ｍ酢酸マグネシウムを２ｍＬ、１Ｍ硫酸アンモニウムを４ｍＬ、蒸留水１．３７５ｍＬをそれぞれ混合させて作製している。
１０×リン酸化バッファーは、1Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．９）を２ｍＬ、１Ｍ 酢酸マグネシウムを１ｍＬ、１ｍｇウシ血清由来のアルブミンを1ｍＬ、蒸留水６ｍＬをそれぞれ混合させて作製している。１０×アニーリングバッファーは、1Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．８）を２ｍＬ、１Ｍ酢酸マグネシウムを１ｍＬ、４Ｍグルタミン酸カリウムを２．５ｍＬ、５０ｍＭ ＮＡＤを０．２ｍＬ、１Ｍ硫酸アンモニウムを１ｍＬ、蒸留水３．３ｍＬをそれぞれ混合させて作製している。また、１０×ＲＣＡバッファーは、１Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．５）を２ｍＬ、４Ｍグルタミン酸カリウムを０．６２５ｍＬ、１Ｍ酢酸マグネシウムを２ｍＬ、１Ｍ硫酸アンモニウムを４ｍＬ、蒸留水１．３７５ｍＬをそれぞれ混合させて作製している。
【0083】
（オリゴヌクレオチドのリン酸化）
後のオリゴヌクレオチド同士の連結のために、配列番号１～４の各オリゴヌクレオチドにおける５’末端のリン酸化を以下のように行った。まず、配列番号１～４の各オリゴヌクレオチド（bv2.1_1、bv4_2、sv2.1_1、sv2_2）を１つの容器内で各オリゴヌクレオチドの濃度が１０ｐｍｏｌ／μＬとなるように混合させた溶液を４μＬ準備した。この溶液の他に、１０×リン酸化バッファー５μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰを５μＬ、１００ｍＭ ジチオトレイトールを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs)を２μＬ、３３．５μＬの蒸留水をそれぞれ加えて総量を５０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。得られたリン酸基含有オリゴヌクレオチド混合液中の各オリゴヌクレオチドの濃度は０．８ｐｍｏｌ／μＬであった。
後のオリゴヌクレオチド同士の連結のために、配列番号１～４の各オリゴヌクレオチドにおける５’末端のリン酸化を以下のように行った。まず、配列番号１～４の各オリゴヌクレオチド（bv2.1_1、bv4_2、sv2.1_1、sv2_2）を１つの容器内で各オリゴヌクレオチドの濃度が１０ｐｍｏｌ／μＬとなるように混合させた溶液を４μＬ準備した。この溶液の他に、１０×リン酸化バッファー５μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰを５μＬ、１００ｍＭ ジチオトレイトールを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs)を２μＬ、３３．５μＬの蒸留水をそれぞれ加えて総量を５０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。得られたリン酸基含有オリゴヌクレオチド混合液中の各オリゴヌクレオチドの濃度は０．８ｐｍｏｌ／μＬであった。
【0084】
（アニーリング）
上記リン酸化処理の後、リン酸基含有オリゴヌクレオチド混合液と表２に示したスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングするために以下の処理を行った。処理を行う前に、各スプリントオリゴヌクレオチド（splint v2.1_1 to v4_2、splint v4_2 to sv2.1_1、splint sv2_1 to sv2_2、splint sv2_2 to tv2_1）を１つの容器内で各スプリントオリゴヌクレオチドの濃度が５ｐｍｏｌ／μＬとなるように混合させたスプリントオリゴヌクレオチド混合液を１μＬ準備した。初めに、０．２ｍＬチューブに１０×アニーリングバッファー１μＬと蒸留水１．８μＬをそれぞれ加えて攪拌を行った。続いて、上記チューブに０．８ｐｍｏｌ／μＬリン酸基含有オリゴヌクレオチド混合液６．３μＬを加え、その後に５ｐｍｏｌ／μＬスプリントオリゴヌクレオチド混合液１μＬを加えて総量を１０μＬとした。この混合液を９５℃で１分間加熱した後に４℃まで急冷させて１０分間維持し、その後に１２℃で長時間維持させることでオリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
上記リン酸化処理の後、リン酸基含有オリゴヌクレオチド混合液と表２に示したスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングするために以下の処理を行った。処理を行う前に、各スプリントオリゴヌクレオチド（splint v2.1_1 to v4_2、splint v4_2 to sv2.1_1、splint sv2_1 to sv2_2、splint sv2_2 to tv2_1）を１つの容器内で各スプリントオリゴヌクレオチドの濃度が５ｐｍｏｌ／μＬとなるように混合させたスプリントオリゴヌクレオチド混合液を１μＬ準備した。初めに、０．２ｍＬチューブに１０×アニーリングバッファー１μＬと蒸留水１．８μＬをそれぞれ加えて攪拌を行った。続いて、上記チューブに０．８ｐｍｏｌ／μＬリン酸基含有オリゴヌクレオチド混合液６．３μＬを加え、その後に５ｐｍｏｌ／μＬスプリントオリゴヌクレオチド混合液１μＬを加えて総量を１０μＬとした。この混合液を９５℃で１分間加熱した後に４℃まで急冷させて１０分間維持し、その後に１２℃で長時間維持させることでオリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
【0085】
（連結反応）
続いて、スプリントオリゴヌクレオチドにアニーリングされたオリゴヌクレオチド同士を連結して環状化するために以下の処理を行った。アニーリング処理後の上記チューブに１０×アニーリングバッファー１μＬとＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）１μＬを加え、さらに蒸留水８μＬを加えて総量を１０μＬとし、上記液と混合して総量を２０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理して連結反応を完了した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却することでベース配列含有環状体ヌクレオチドである連結反応液を得た。
続いて、スプリントオリゴヌクレオチドにアニーリングされたオリゴヌクレオチド同士を連結して環状化するために以下の処理を行った。アニーリング処理後の上記チューブに１０×アニーリングバッファー１μＬとＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）１μＬを加え、さらに蒸留水８μＬを加えて総量を１０μＬとし、上記液と混合して総量を２０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理して連結反応を完了した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却することでベース配列含有環状体ヌクレオチドである連結反応液を得た。
【0086】
（増幅反応）
ＭＰＲＣＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｙ－ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ）法による増幅反応を行うために、新しい０．２ｍＬチューブに１００μＭ ６Ｒ５Ｓプライマーを２μＬ、１０×ＲＣＡバッファーを２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを２μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）を０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（関東化学株式会社）を１μＬ、蒸留水９．９μＬをそれぞれ加え、攪拌した。その後、上記チューブに上記連結反応液２μＬを加えて総量を２０μＬとした。この混合液を３０℃で１６時間反応させた後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却し、増幅反応を完了した。この反応の結果、増幅産物としてサポート配列とベース配列とからなる同一配列コンカテマーであるベース配列含有２本鎖ＤＮＡを得た。続いて、増幅産物に蒸留水１８０μＬを加えて適当な濃度に希釈し、希釈産物を得た。
ＭＰＲＣＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｙ－ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ）法による増幅反応を行うために、新しい０．２ｍＬチューブに１００μＭ ６Ｒ５Ｓプライマーを２μＬ、１０×ＲＣＡバッファーを２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを２μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）を０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（関東化学株式会社）を１μＬ、蒸留水９．９μＬをそれぞれ加え、攪拌した。その後、上記チューブに上記連結反応液２μＬを加えて総量を２０μＬとした。この混合液を３０℃で１６時間反応させた後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却し、増幅反応を完了した。この反応の結果、増幅産物としてサポート配列とベース配列とからなる同一配列コンカテマーであるベース配列含有２本鎖ＤＮＡを得た。続いて、増幅産物に蒸留水１８０μＬを加えて適当な濃度に希釈し、希釈産物を得た。
【0087】
（増幅産物の切断によるサイズ確認用切断反応液の調製）
オリゴヌクレオチド中に設けたＢａｍＨＩサイトで切断してサイズを確認するために以下の操作を行った。新しい０．２ｍＬチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を５μＬ、制限酵素ＢａｍＨＩを１μＬ、蒸留水２０μＬを加え、攪拌した。続いて、チューブに上記希釈産物のうち２５μＬを加えた。この混合液を３７℃で３０分間処理し、その後１２℃に冷却してＢａｍＨＩサイトでの切断反応を完了した。このようにして得られたサイズ確認用切断反応液は、後述する常法のアガロースゲル電気泳動法による生成物のサイズ確認のために用いた。結果は後述する。
オリゴヌクレオチド中に設けたＢａｍＨＩサイトで切断してサイズを確認するために以下の操作を行った。新しい０．２ｍＬチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を５μＬ、制限酵素ＢａｍＨＩを１μＬ、蒸留水２０μＬを加え、攪拌した。続いて、チューブに上記希釈産物のうち２５μＬを加えた。この混合液を３７℃で３０分間処理し、その後１２℃に冷却してＢａｍＨＩサイトでの切断反応を完了した。このようにして得られたサイズ確認用切断反応液は、後述する常法のアガロースゲル電気泳動法による生成物のサイズ確認のために用いた。結果は後述する。
【0088】
（制限酵素による切断）
上記希釈産物のうちの５０μＬが入ったチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を１０μＬ、制限酵素ＢｃｏＤＩを２μＬ、蒸留水３８μＬをそれぞれ加えて総量を１００μＬとした。この混合液を３７℃で１時間反応させて、制限酵素ＢｃｏＤＩでの切断反応を完了させ、その後１２℃に冷却した。上記サイズ確認用切断反応液と本工程で得られたＢｃｏＤＩ切断反応液を常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った結果を図５に示す。図５に示すように、サイズ確認用切断反応液（レーン１）では４種類のオリゴヌクレオチド（bv2.1_1、bv4_2、sv2.1_1、sv2_2）が接続された２８０ｂｐの長さの生成物（図４参照）の存在が認められた。これに対し、ＢｃｏＤＩ切断反応液（レーン２）ではこの２８０ｂｐの生成物から３０塩基程度少ないｂｐの生成物を確認することができた。従って、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡから可変領域の配列が切断され、カセット２本鎖ＤＮＡの生成を確認することができた。最後に、ＢｃｏＤＩ切断反応液をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製し、０．１ｐｍｏｌ／μＬカセット２本鎖ＤＮＡ溶液を得た。このカセット２本鎖ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイを用いて決定している。このカセット２本鎖ＤＮＡは、上述の通り、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含んでおり、以降の鋳型ＤＮＡの調製においても使用している。
上記希釈産物のうちの５０μＬが入ったチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を１０μＬ、制限酵素ＢｃｏＤＩを２μＬ、蒸留水３８μＬをそれぞれ加えて総量を１００μＬとした。この混合液を３７℃で１時間反応させて、制限酵素ＢｃｏＤＩでの切断反応を完了させ、その後１２℃に冷却した。上記サイズ確認用切断反応液と本工程で得られたＢｃｏＤＩ切断反応液を常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った結果を図５に示す。図５に示すように、サイズ確認用切断反応液（レーン１）では４種類のオリゴヌクレオチド（bv2.1_1、bv4_2、sv2.1_1、sv2_2）が接続された２８０ｂｐの長さの生成物（図４参照）の存在が認められた。これに対し、ＢｃｏＤＩ切断反応液（レーン２）ではこの２８０ｂｐの生成物から３０塩基程度少ないｂｐの生成物を確認することができた。従って、ベース配列含有２本鎖ＤＮＡから可変領域の配列が切断され、カセット２本鎖ＤＮＡの生成を確認することができた。最後に、ＢｃｏＤＩ切断反応液をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製し、０．１ｐｍｏｌ／μＬカセット２本鎖ＤＮＡ溶液を得た。このカセット２本鎖ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイを用いて決定している。このカセット２本鎖ＤＮＡは、上述の通り、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含んでおり、以降の鋳型ＤＮＡの調製においても使用している。
【0089】
＜片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡの準備＞
以降の鋳型ＤＮＡの調製では使用しないが、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つ片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡの準備を以下のように行った。
以降の鋳型ＤＮＡの調製では使用しないが、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つ片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡの準備を以下のように行った。
【0090】
（オリゴヌクレオチドの準備～増幅産物の切断によるサイズ確認）
上記と同様のベースオリゴヌクレオチド、サポートオリゴヌクレオチド、スプリントオリゴヌクレオチドを使用し、オリゴヌクレオチドの準備から増幅産物の切断によるサイズ確認までは上記の手順と同様にして行った。
上記と同様のベースオリゴヌクレオチド、サポートオリゴヌクレオチド、スプリントオリゴヌクレオチドを使用し、オリゴヌクレオチドの準備から増幅産物の切断によるサイズ確認までは上記の手順と同様にして行った。
【0091】
（制限酵素による１回目の切断と脱リン酸化）
上記希釈産物の残りの８８μＬが入ったチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を１０μＬ、制限酵素Ｅｓｐ３Ｉを２μＬ、脱リン酸化酵素ＣＩＡＰ（タカラバイオ株式会社）２μＬをそれぞれ加えた。この混合液を３７℃で１時間反応させて、制限酵素Ｅｓｐ３Ｉでの切断反応と切断部の脱リン酸化反応を完了させた。その後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却した。得られた溶液をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製し、脱リン酸化溶液を得た。
上記希釈産物の残りの８８μＬが入ったチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を１０μＬ、制限酵素Ｅｓｐ３Ｉを２μＬ、脱リン酸化酵素ＣＩＡＰ（タカラバイオ株式会社）２μＬをそれぞれ加えた。この混合液を３７℃で１時間反応させて、制限酵素Ｅｓｐ３Ｉでの切断反応と切断部の脱リン酸化反応を完了させた。その後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却した。得られた溶液をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製し、脱リン酸化溶液を得た。
【0092】
（制限酵素による２回目の切断）
上記脱リン酸化溶液５０μＬが入ったチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を１０μＬ、制限酵素ＢｓａＩを２μＬ、蒸留水３８μＬをそれぞれ加えて総量を１００μＬとした。この混合液を３７℃で１時間反応させてＢｓａＩサイトでの切断反応を完了させた。その後、１２℃に冷却し、得られた溶液をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製し、０．１ｐｍｏｌ／μＬカセット２本鎖ＤＮＡ溶液を得た。このカセット２本鎖ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイを用いて決定している。このカセット２本鎖ＤＮＡは、上述の通り、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つ片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を含んでいる。
上記脱リン酸化溶液５０μＬが入ったチューブに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（New England Biolabs）を１０μＬ、制限酵素ＢｓａＩを２μＬ、蒸留水３８μＬをそれぞれ加えて総量を１００μＬとした。この混合液を３７℃で１時間反応させてＢｓａＩサイトでの切断反応を完了させた。その後、１２℃に冷却し、得られた溶液をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製し、０．１ｐｍｏｌ／μＬカセット２本鎖ＤＮＡ溶液を得た。このカセット２本鎖ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイを用いて決定している。このカセット２本鎖ＤＮＡは、上述の通り、それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つ片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を含んでいる。
【0093】
＜標的配列含有オリゴヌクレオチドの調製＞
次に、２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドの調製を以下のように行った。
次に、２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドの調製を以下のように行った。
【0094】
（オリゴヌクレオチドの準備）
実施例１で用いたセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドを表３に示す。当該センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、標的配列は「ＣＡＴＴＡＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＣ」及び「ＴＴＧＡＴＡＧＡＴＣＣＡＧＴＡＡＴＧＡ」の配列を指し、互いに相補的な配列である。また、カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列は「ＴＡＧＧ」及び「ＡＡＡＣ」の配列を指す。
実施例１で用いたセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドを表３に示す。当該センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、標的配列は「ＣＡＴＴＡＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＣ」及び「ＴＴＧＡＴＡＧＡＴＣＣＡＧＴＡＡＴＧＡ」の配列を指し、互いに相補的な配列である。また、カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列は「ＴＡＧＧ」及び「ＡＡＡＣ」の配列を指す。
【0095】
【表3】
【0096】
（アンチセンスオリゴヌクレオチドのリン酸化）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（sgRNA for lambda_1 AS）における５’末端のリン酸化を以下のように行った。まず、新しいチューブに５０ｐｍｏｌ／μＬオリゴヌクレオチド溶液（カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と標的配列とからなる）を６μＬ、１０×リン酸化バッファーを５μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰを５μＬ、１００ｍＭ ジチオトレイトールを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs)を２μＬ、蒸留水３１．５μＬをそれぞれ加えて総量を５０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドをリン酸化した後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却してリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を得た。この溶液中のリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は６ｐｍｏｌ／μＬであった。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（sgRNA for lambda_1 AS）における５’末端のリン酸化を以下のように行った。まず、新しいチューブに５０ｐｍｏｌ／μＬオリゴヌクレオチド溶液（カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と標的配列とからなる）を６μＬ、１０×リン酸化バッファーを５μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰを５μＬ、１００ｍＭ ジチオトレイトールを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs)を２μＬ、蒸留水３１．５μＬをそれぞれ加えて総量を５０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドをリン酸化した後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却してリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を得た。この溶液中のリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は６ｐｍｏｌ／μＬであった。
【0097】
（アニーリング）
上記リン酸化処理の後、センスオリゴヌクレオチドとリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチドを２本鎖化するため、以下のアニーリング処理を行った。初めに、０．２ｍＬチューブに６ｐｍｏｌ／μＬリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を１０μＬ、５０ｐｍｏｌ／μＬセンスオリゴヌクレオチドを１．２μＬ、１０×アニーリングバッファーを２μＬ、蒸留水６．８μＬをそれぞれ加えて総量を２０μＬとした。この混合液を９５℃で１分間加熱した後に２５℃までゆっくり冷却して長時間維持させることでアニーリング工程を完了した。得られた標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液中の標的配列含有オリゴヌクレオチドの濃度は３ｐｍｏｌ／μＬであった。この標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液２０μＬに蒸留水１８０μＬを加えて混合させ、０．３ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を調製した。
上記リン酸化処理の後、センスオリゴヌクレオチドとリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチドを２本鎖化するため、以下のアニーリング処理を行った。初めに、０．２ｍＬチューブに６ｐｍｏｌ／μＬリン酸基含有アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を１０μＬ、５０ｐｍｏｌ／μＬセンスオリゴヌクレオチドを１．２μＬ、１０×アニーリングバッファーを２μＬ、蒸留水６．８μＬをそれぞれ加えて総量を２０μＬとした。この混合液を９５℃で１分間加熱した後に２５℃までゆっくり冷却して長時間維持させることでアニーリング工程を完了した。得られた標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液中の標的配列含有オリゴヌクレオチドの濃度は３ｐｍｏｌ／μＬであった。この標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液２０μＬに蒸留水１８０μＬを加えて混合させ、０．３ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【0098】
＜鋳型ＤＮＡの調製＞
それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡ溶液と２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を用いて、以下のように鋳型ＤＮＡの調製を行った。
それぞれの鎖の５’側に突出配列を有し且つそれぞれの鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡ溶液と２本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を用いて、以下のように鋳型ＤＮＡの調製を行った。
【0099】
（連結反応）
カセット２本鎖ＤＮＡと標的配列含有オリゴヌクレオチドを連結するために以下の処理を行った。新しいチューブに０．１ｐｍｏｌ／μＬカセット２本鎖ＤＮＡ溶液を２μＬ、０．３ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を２μＬ、１０×アニーリングバッファー２μＬとＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）１μＬ、蒸留水１３μＬをそれぞれ加えて総量を２０μＬとした。この混合液を１６℃で３０分間処理してカセット２本鎖ＤＮＡと標的配列含有オリゴヌクレオチドの連結反応を完了した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に２５℃に冷却した。得られた溶液に蒸留水１８０μＬを加えて混合させ、標的配列含有環状体ヌクレオチド溶液を得た。
カセット２本鎖ＤＮＡと標的配列含有オリゴヌクレオチドを連結するために以下の処理を行った。新しいチューブに０．１ｐｍｏｌ／μＬカセット２本鎖ＤＮＡ溶液を２μＬ、０．３ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を２μＬ、１０×アニーリングバッファー２μＬとＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）１μＬ、蒸留水１３μＬをそれぞれ加えて総量を２０μＬとした。この混合液を１６℃で３０分間処理してカセット２本鎖ＤＮＡと標的配列含有オリゴヌクレオチドの連結反応を完了した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に２５℃に冷却した。得られた溶液に蒸留水１８０μＬを加えて混合させ、標的配列含有環状体ヌクレオチド溶液を得た。
【0100】
（増幅反応）
ＭＰＲＣＡ法による増幅反応を行うために、新しい０．２ｍＬチューブに１００μＭ ６Ｒ５Ｓプライマーを２μＬ、１０×ＲＣＡバッファーを２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを２μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）を０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（関東化学株式会社）を１μＬ、蒸留水９．９μＬをそれぞれ加え、攪拌した。その後、上記チューブに標的配列含有環状体ヌクレオチド溶液２μＬを加えて総量を２０μＬとした。この混合液を３０℃で１６時間反応させて、増幅産物としてサポート配列とＴ７プロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる同一配列コンカテマーである標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得た。反応後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却し、増幅反応を完了した。続いて、蒸留水６２．５μＬが入っている別チューブに増幅産物を移して適当な濃度に希釈し、希釈産物を得た。
ＭＰＲＣＡ法による増幅反応を行うために、新しい０．２ｍＬチューブに１００μＭ ６Ｒ５Ｓプライマーを２μＬ、１０×ＲＣＡバッファーを２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを２μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）を０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（関東化学株式会社）を１μＬ、蒸留水９．９μＬをそれぞれ加え、攪拌した。その後、上記チューブに標的配列含有環状体ヌクレオチド溶液２μＬを加えて総量を２０μＬとした。この混合液を３０℃で１６時間反応させて、増幅産物としてサポート配列とＴ７プロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる同一配列コンカテマーである標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得た。反応後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却し、増幅反応を完了した。続いて、蒸留水６２．５μＬが入っている別チューブに増幅産物を移して適当な濃度に希釈し、希釈産物を得た。
【0101】
（増幅産物の切断によるサイズ確認用切断反応液の調製）
標的配列含有２本鎖ＤＮＡ中のバッファー配列に設けたＢａｍＨＩサイトで切断してサイズを確認するために以下の操作を行った。新しい０．２ｍＬチューブに１０×Ｋバッファー（New England Biolabs）を２．５μＬ、制限酵素ＢａｍＨＩを０．５μＬ、蒸留水９．５μＬをそれぞれ加え、攪拌した。続いて、チューブに上記希釈産物のうち１２．５μＬを加えて総量を２５μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理し、その後１２℃に冷却してＢａｍＨＩサイトでの切断反応を完了した。このようにして得られたサイズ確認用切断反応液は、後述する常法のアガロースゲル電気泳動法による生成物のサイズ確認のために用いた。結果は後述する。
標的配列含有２本鎖ＤＮＡ中のバッファー配列に設けたＢａｍＨＩサイトで切断してサイズを確認するために以下の操作を行った。新しい０．２ｍＬチューブに１０×Ｋバッファー（New England Biolabs）を２．５μＬ、制限酵素ＢａｍＨＩを０．５μＬ、蒸留水９．５μＬをそれぞれ加え、攪拌した。続いて、チューブに上記希釈産物のうち１２．５μＬを加えて総量を２５μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間処理し、その後１２℃に冷却してＢａｍＨＩサイトでの切断反応を完了した。このようにして得られたサイズ確認用切断反応液は、後述する常法のアガロースゲル電気泳動法による生成物のサイズ確認のために用いた。結果は後述する。
【0102】
（制限酵素による切断）
標的配列含有２本鎖ＤＮＡ中のｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端に含まれるＤｒａＩサイトで切断するために以下の操作を行った。新しい０．２ｍＬチューブに１０×Ｍバッファー（ニッポンジーン）を１０μＬ、制限酵素ＤｒａＩ（ニッポンジーン）を１μＬ、蒸留水３９μＬをそれぞれ加えて、攪拌した。続いて、チューブに上記希釈産物５０μＬを加えて総量を１００μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間反応させてＤｒａＩサイトでの切断反応を完了させ、その後１２℃に冷却した。上記サイズ確認用切断反応液と本工程で得られたＢｃｏＤＩ切断反応液を常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った（図示せず）。その結果、サポート配列とＴ７プロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる目的の長さの生成物の存在が認められた。従って、標的配列含有２本鎖ＤＮＡのｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端における制限酵素ＤｒａＩサイトで切断され、鋳型ＤＮＡの生成を確認することができた。最後に、ＤｒａＩ切断反応液をMonarch（登録商標） PCR & DNA Cleanup Kitを用いて精製し、１ｐｍｏｌ／μＬ鋳型ＤＮＡ溶液を得た。この鋳型ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイを用いて決定している。
標的配列含有２本鎖ＤＮＡ中のｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端に含まれるＤｒａＩサイトで切断するために以下の操作を行った。新しい０．２ｍＬチューブに１０×Ｍバッファー（ニッポンジーン）を１０μＬ、制限酵素ＤｒａＩ（ニッポンジーン）を１μＬ、蒸留水３９μＬをそれぞれ加えて、攪拌した。続いて、チューブに上記希釈産物５０μＬを加えて総量を１００μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間反応させてＤｒａＩサイトでの切断反応を完了させ、その後１２℃に冷却した。上記サイズ確認用切断反応液と本工程で得られたＢｃｏＤＩ切断反応液を常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った（図示せず）。その結果、サポート配列とＴ７プロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる目的の長さの生成物の存在が認められた。従って、標的配列含有２本鎖ＤＮＡのｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端における制限酵素ＤｒａＩサイトで切断され、鋳型ＤＮＡの生成を確認することができた。最後に、ＤｒａＩ切断反応液をMonarch（登録商標） PCR & DNA Cleanup Kitを用いて精製し、１ｐｍｏｌ／μＬ鋳型ＤＮＡ溶液を得た。この鋳型ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）アッセイを用いて決定している。
【0103】
上記の操作により、サポート配列とＴ７プロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する鋳型ＤＮＡを調製できることが分かった。
【0104】
［応用例１：ｓｇＲＮＡの調製］
実施例１で得られた鋳型ＤＮＡとＣＵＧＡ（登録商標）ｓｇＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ キットを用いてｓｇＲＮＡの調製を以下のように行った。
実施例１で得られた鋳型ＤＮＡとＣＵＧＡ（登録商標）ｓｇＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ キットを用いてｓｇＲＮＡの調製を以下のように行った。
【0105】
（転写反応）
鋳型ＤＮＡ中のＴ７プロモーターを起点とする転写反応でｓｇＲＮＡを調製するため、以下の操作を行った。０．２ｍＬチューブに５×ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎバッファーを４μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを２μＬ、ＮＴＰ Ｍｉｘを６μＬ、ＣＵＧＡ７酵素溶液１μＬをそれぞれ加え、攪拌した。続いて、上記チューブに１ｐｍｏｌ／μＬ鋳型ＤＮＡ溶液を２μＬ加えて総量を２０μＬとした。この混合液を３７℃で２時間処理し、その後１２℃に冷却して長時間維持した。これにより転写反応が完了し、ｓｇＲＮＡクルード溶液が得られた。最後に、キット付属のＲＮＡ精製システムを用いてｓｇＲＮＡクルード溶液を精製し、ｓｇＲＮＡの調製が完了した。
鋳型ＤＮＡ中のＴ７プロモーターを起点とする転写反応でｓｇＲＮＡを調製するため、以下の操作を行った。０．２ｍＬチューブに５×ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎバッファーを４μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを２μＬ、ＮＴＰ Ｍｉｘを６μＬ、ＣＵＧＡ７酵素溶液１μＬをそれぞれ加え、攪拌した。続いて、上記チューブに１ｐｍｏｌ／μＬ鋳型ＤＮＡ溶液を２μＬ加えて総量を２０μＬとした。この混合液を３７℃で２時間処理し、その後１２℃に冷却して長時間維持した。これにより転写反応が完了し、ｓｇＲＮＡクルード溶液が得られた。最後に、キット付属のＲＮＡ精製システムを用いてｓｇＲＮＡクルード溶液を精製し、ｓｇＲＮＡの調製が完了した。
【0106】
［実施例２：鋳型ＤＮＡの調製］
実施例２では、断片の一方の鎖の両端に突出配列を有し且つ両方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡと１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを用いてｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡの調製を行った。
実施例２では、断片の一方の鎖の両端に突出配列を有し且つ両方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡと１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを用いてｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡの調製を行った。
【0107】
＜カセット２本鎖ＤＮＡの準備＞
カセット２本鎖ＤＮＡの準備を行った。断片の片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡの準備方法からオリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドの組み合わせを変更した点、１回目の切断に用いる制限酵素をＭｗｏＩに変更し且つ脱リン酸化反応を行わなかった点及び２回目の切断に用いる制限酵素をＢｃｏＤＩに変更した点以外は実施例１と同様にして準備した。なお、制限酵素ＢｃｏＤＩは、制限酵素ＢｃｏＤＩサイトと制限酵素ＢｓａＩサイトの両方のサイトを切断できる。
カセット２本鎖ＤＮＡの準備を行った。断片の片方の鎖の５’末端にのみリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡの準備方法からオリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドの組み合わせを変更した点、１回目の切断に用いる制限酵素をＭｗｏＩに変更し且つ脱リン酸化反応を行わなかった点及び２回目の切断に用いる制限酵素をＢｃｏＤＩに変更した点以外は実施例１と同様にして準備した。なお、制限酵素ＢｃｏＤＩは、制限酵素ＢｃｏＤＩサイトと制限酵素ＢｓａＩサイトの両方のサイトを切断できる。
【0108】
実施例２において用いたオリゴヌクレオチドを表４に示し、スプリントオリゴヌクレオチドを表５に示す。また、オリゴヌクレオチド（bv4_1、bv4.1_2、sv2.1_1、sv2_2）を連結させて環状化した際のＤＮＡマップを図６に示す。当該オリゴヌクレオチドにおいて、Ｔ７プロモーター配列はオリゴヌクレオチドbv4_1中の「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ」の配列を指し、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列はオリゴヌクレオチドbv4_1及びbv4.1_2中の「ＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ」の配列を指す。また、ＢｃｏＤＩサイトはオリゴヌクレオチドbv4_1中の「ＧＡＧＡＣ」の配列を指し、ＭｗｏＩサイトはオリゴヌクレオチドbv4_1中の「ＧＣＴＴＴＴＡＧＡＧＣ」の配列を指す。
【0109】
【表4】
【0110】
【表5】
【0111】
＜標的配列含有オリゴヌクレオチドの調製＞
１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドの調製を以下のように行った。
１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドの調製を以下のように行った。
【0112】
（オリゴヌクレオチドの準備）
実施例２において用いたセンスオリゴヌクレオチドを表６に示す。当該センスオリゴヌクレオチドにおいて、標的配列は「ＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡ」の配列を指し、第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列は「ＴＡＧＧ」の配列を指し、及び第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列は「ＧＴＴＴＴＡ」の配列を指す。
実施例２において用いたセンスオリゴヌクレオチドを表６に示す。当該センスオリゴヌクレオチドにおいて、標的配列は「ＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡ」の配列を指し、第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列は「ＴＡＧＧ」の配列を指し、及び第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列は「ＧＴＴＴＴＡ」の配列を指す。
【0113】
【表6】
【0114】
（センスオリゴヌクレオチドのリン酸化）
センスオリゴヌクレオチド（sgRNA_scaffold_for v4）を実施例１と同様にしてリン酸化し、１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製した。調製した標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液は蒸留水で希釈して０．６ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液とした。
センスオリゴヌクレオチド（sgRNA_scaffold_for v4）を実施例１と同様にしてリン酸化し、１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製した。調製した標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液は蒸留水で希釈して０．６ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液とした。
【0115】
＜鋳型ＤＮＡの調製＞
断片の一方の鎖の両端に突出配列を有し且つ両方の鎖の５’末端にリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡ溶液と１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を用いて、鋳型ＤＮＡの調製を行った。連結反応において使用する標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液の濃度を０．６ｐｍｏｌ／μＬとし、０．６ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液の使用量を半分の容量である１μＬとした点以外は実施例１と同様にして調製した。
断片の一方の鎖の両端に突出配列を有し且つ両方の鎖の５’末端にリン酸基を有するカセット２本鎖ＤＮＡ溶液と１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液を用いて、鋳型ＤＮＡの調製を行った。連結反応において使用する標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液の濃度を０．６ｐｍｏｌ／μＬとし、０．６ｐｍｏｌ／μＬ標的配列含有オリゴヌクレオチド溶液の使用量を半分の容量である１μＬとした点以外は実施例１と同様にして調製した。
【0116】
上記の操作により、サポート配列とＴ７プロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する鋳型ＤＮＡを調製できることが分かった。従って、１本鎖の標的配列含有オリゴヌクレオチドを用いる場合でも実施例１と同様の手順により鋳型ＤＮＡが得られることが分かった。
【0117】
［応用例２：ｓｇＲＮＡの調製］
実施例２で得られた鋳型ＤＮＡを用いて、応用例１と同様にしてｓｇＲＮＡの調製を行った。その結果、実施例２の鋳型ＤＮＡに対応するｓｇＲＮＡを調製できることが分かった。
実施例２で得られた鋳型ＤＮＡを用いて、応用例１と同様にしてｓｇＲＮＡの調製を行った。その結果、実施例２の鋳型ＤＮＡに対応するｓｇＲＮＡを調製できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0118】
ｓｇＲＮＡの簡便な方法による製造は、ゲノム編集受託会社にとってはボトルネックの解決であり、広範囲に普及することが期待される。
【符号の説明】
【0119】
１ 鋳型ＤＮＡ
２Ａ、２Ｂ カセット２本鎖ＤＮＡ
３ ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列
４ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
５ サポート配列
６Ａ、６Ｂ、６Ｃ 突出配列
７Ａ、７Ｂ 標的配列含有オリゴヌクレオチド
８ 標的配列
９Ａ、９Ｂ カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列
１０ 標的配列含有環状体ヌクレオチド
１１ ＤＮＡポリメラーゼ
１２ 標的配列含有２本鎖ＤＮＡ
１３Ａ、１３Ｂ ベースオリゴヌクレオチド
１４Ａ、１４Ｂ サポートオリゴヌクレオチド
１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ スプリントオリゴヌクレオチド
１６ ベース配列含有環状体ヌクレオチド
１７ ベース配列
１８ 可変領域の配列
１９Ａ、１９Ｂ ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ
２０ ＢｃｏＤＩサイト
２１ ＭｗｏＩサイト
２２ 可変配列
２３ 第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列
２４ 第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列
２Ａ、２Ｂ カセット２本鎖ＤＮＡ
３ ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列
４ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
５ サポート配列
６Ａ、６Ｂ、６Ｃ 突出配列
７Ａ、７Ｂ 標的配列含有オリゴヌクレオチド
８ 標的配列
９Ａ、９Ｂ カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列
１０ 標的配列含有環状体ヌクレオチド
１１ ＤＮＡポリメラーゼ
１２ 標的配列含有２本鎖ＤＮＡ
１３Ａ、１３Ｂ ベースオリゴヌクレオチド
１４Ａ、１４Ｂ サポートオリゴヌクレオチド
１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ スプリントオリゴヌクレオチド
１６ ベース配列含有環状体ヌクレオチド
１７ ベース配列
１８ 可変領域の配列
１９Ａ、１９Ｂ ベース配列含有２本鎖ＤＮＡ
２０ ＢｃｏＤＩサイト
２１ ＭｗｏＩサイト
２２ 可変配列
２３ 第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列
２４ 第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】