特開 2023-71500 カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む電極

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023071500

(43)【公開日】2023-05-23

(54)【発明の名称】カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む電極

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/327 20060101AFI20230516BHJP

   G01N 27/30 20060101ALI20230516BHJP

【ＦＩ】

G01N27/327 353F

G01N27/30 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021184334

(22)【出願日】2021-11-11

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】辻 勝巳

(72)【発明者】

【氏名】岩佐 尚▲徳▼

(72)【発明者】

【氏名】米田 圭三

(72)【発明者】

【氏名】平塚 淳典

(72)【発明者】

【氏名】田中 丈士

(72)【発明者】

【氏名】六車 仁志

(57)【要約】

【課題】カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む電極の提供。
【解決手段】基板上にカーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層を有する電極が開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

基板上にカーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層を有する電極。

【請求項2】

前記カーボンナノチューブが単層カーボンナノチューブである、請求項１に記載の電極。

【請求項3】

前記カーボンナノチューブの直径中央値が１０ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の電極。

【請求項4】

前記層が分散剤を更に含む、請求項１～３のいずれかに記載の電極。

【請求項5】

前記分散剤がコール酸ナトリウム及びカルボキシメチルセルロースからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の電極。

【請求項6】

前記層が３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの補酵素を含まない、請求項１～５のいずれかに記載の電極。

【請求項7】

請求項１～６のいずれかに記載の電極を備えたセンサ。

【請求項8】

３－ヒドロキシ酪酸を測定するための、請求項７に記載のセンサ。

【請求項9】

３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの補酵素を用いることなく３－ヒドロキシ酪酸を測定するための、請求項７又は８に記載のセンサ。

【請求項10】

請求項１～６のいずれかに記載の電極又は請求項７に記載のセンサを用いて３－ヒドロキシ酪酸を測定する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む電極に関する技術が開示される。

【背景技術】

【0002】

ナノカーボンは電気の伝導率が高いことから他の物質との電子伝達を行う導電材料としての応用が進んでいる。例えばナノカーボンをカーボンと樹脂及び有機溶剤からなるインクに混合し基板上に印刷してバイオセンサ用の電極として用いることが提案されている（特許文献１）。また、ナノカーボンの一種であるカーボンナノチューブは過酸化物を測定するセンサに用いられたり（特許文献２）、酵素とともにフィルム状に成形し、センサや燃料電池の電極として用いられたりしている（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】WO 2005/088288

【特許文献2】WO 2011/007582

【特許文献3】WO 2012/002290

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む電極を提供することが１つの課題である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

斯かる課題を解決するため、下記を包含する発明が提供される。
項１．
基板上にカーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層を有する電極。
項２．
前記カーボンナノチューブが単層カーボンナノチューブである、項１に記載の電極。
項３．
前記カーボンナノチューブの直径中央値が１０ｎｍ以下である、項１又は２に記載の電極。
項４．
前記層が分散剤を更に含む、項１～３のいずれかに記載の電極。
項５．
前記分散剤がコール酸ナトリウム及びカルボキシメチルセルロースからなる群より選択される少なくとも一種である、項４に記載の電極。
項６．
前記層が３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの補酵素を含まない、項１～５のいずれかに記載の電極。
項７．
項１～６のいずれかに記載の電極を備えたセンサ。
項８．
３－ヒドロキシ酪酸を測定するための、項７に記載のセンサ。
項９．
３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの補酵素を用いることなく３－ヒドロキシ酪酸を測定するための、項７又は８に記載のセンサ。
項１０．
項１～６のいずれかに記載の電極又は項７に記載のセンサを用いて３－ヒドロキシ酪酸を測定する方法。

【発明の効果】

【0006】

主な効果として、３－ヒドロキシ酪酸を高感度で測定可能であることが挙げられる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】実施例で作製した電極の構造を示す。「１」はＰＥＴフィルムであり、「２」は粘着シートであり、「３」は金蒸着ＰＥＴフィルムであり、「４」は作用電極部位である。

【図2】直径中央値０．９ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【図3】直径中央値１．０ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【図4】直径中央値９．５ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【図5】カーボンナノチューブを用いないで測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【図6】直径中央値０．９ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【図7】直径中央値１．０ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【図8】カーボンナノチューブを用いないで測定したサイクリックボルタモグラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

電極は、基板上にカーボンナノチューブ（「ＣＮＴ」とも称する。）及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層を有することが好ましい。前記層は単一の層であっても２つ以上の層であってもよい。ＣＮＴと３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼは、単一の層に存在しても別々の層に存在してもよい。一実施形態において、ＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼは、２つの層に明確に分離できない層（実質的に単一の層）に存在することが好ましい。

【0009】

ＣＮＴの種類は特に制限されず、例えば、単層ＣＮＴ、二層ＣＮＴ、三層以上の多層ＣＮＴであってもよい。一実施形態において、ＣＮＴは、良好な測定感度を実現するため、単層ＣＮＴであることが好ましい。一実施形態において、ＣＮＴの直径及び直径中央値は、それぞれ、２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、又は５ｎｍ以下であることが好ましく、２ｎｍ以下、１．９ｎｍ以下、１．８ｎｍ以下、１．７ｎｍ以下、１．６ｎｍ以下、１．５ｎｍ以下、１．４ｎｍ以下、１．３ｎｍ以下、１．２ｎｍ以下、１．１ｎｍ以下、又は１ｎｍ以下であることも好ましい。一実施形態において、ＣＮＴの直径及び直径中央値は、それぞれ、０．１ｎｍ以上、０．５ｎｍ以上、０．６ｎｍ以上、０．７ｎｍ以上、又は０．８ｎｍ以上であることが好ましい。一実施形態において、ＣＮＴの長さは０．１～１０００μｍであることが好ましい。ＣＮＴは市販されているものを購入して使用してもよく、合成して使用してもよい。ＣＮＴの製造方法は公知である。ＣＮＴの直径、直径中央値、及び長さは、ラマン分光法（ＲＢＭ）、光吸収スペクトル、近赤外蛍光分光法、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）、又は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定することができる。

【0010】

３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．１．１．３０である以下の反応を触媒する酵素であることが好ましい。
３－ヒドロキシ酪酸＋ＮＡＤ^＋ ←→ アセト酢酸＋ＮＡＤＨ
上記の酵素が３－ヒドロキシ酪酸を酸化する際に生じる電子の量を測定することにより、試料中の３－ヒドロキシ酪酸を測定（例：検出、定量）することができる。上記の酵素としては、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、ロドスピリウム（Rhodospirillum）、リゾビウム（Rhizobium）、アルカリゲネス（Alcaligenes）等の微生物に由来するもの、当該微生物に由来する酵素遺伝子を他の微生物に組み込んだ改変微生物により製造されるもの、当該微生物に由来する酵素遺伝子を改変した遺伝子から発現されるもの等が挙げられる。

【0011】

ＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層において、ＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの含有量は任意であり、目的に応じて設定できる。ＣＮＴの量は、例えば、０．０１～１０μｇ／ｍｍ^２とすることができる。また、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの含有量は、例えば、０．１～１００Ｕ／ｍｍ^２とすることができる。ここで、１Ｕは１分間に１マイクロモルの３－ヒドロキシ酪酸が酸化される酵素量である。

【0012】

ＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層は、ＣＮＴが該層内で分散した状態で存在するように、分散剤を更に含有することが好ましい。分散剤は、ＣＮＴの凝集（bundling）を防止することができる限り特に限定されない。分散剤としては、例えば、アニオン系分散剤、カチオン系分散剤、及びノニオン系分散剤から選択される少なくとも一種を用いることができる。

【0013】

アニオン系分散剤としては、例えば、コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。カチオン系分散剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド等が挙げられる。ノニオン系分散剤としては、オクチルフェノールエトキシレート（例：ダウケミカル社製のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－３０５、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－４０５）、ポリソルベート類（例：ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０））等が挙げられる。一実施形態において、分散剤は、アニオン系分散剤が好ましく、コール酸ナトリウム及びカルボキシメチルセルロースから選択される少なくとも一種が好ましい。

【0014】

ＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層は、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの補酵素（例えば、ＮＡＤ^＋）を含んでいても含まなくてもよい。前記補酵素を含まない場合であっても、３－ヒドロキシ酪酸を高感度で測定することができる。また、前記層は、フェナントロリンキノンを含んでいても含まなくてもよい。

【0015】

基板は、絶縁性基板上に金属膜（例えば、金属薄膜）が形成されたものであることが好ましい。絶縁性基板は、例えば、ガラス基板又はプラスチック基板（例えば、ＰＥＴ基板）を用いることができる。金属膜を形成する金属の種類は、電極に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、金、白金、及びチタン等を挙げることができる。また、基板は、絶縁性基板上に金属膜の代わりに炭素膜（例えば、カーボンペーストによる炭素薄膜）が形成されたものであってもよい。

【0016】

基板上にＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層を形成することは、特に制限されない。例えば、これらの物質の各々を分散又は溶解させた液体を調製し、順次基板上の所定部位（基板が、絶縁性基板上に金属薄膜が形成されたものである場合、金属薄膜が形成された場所）に滴下し、乾燥させるという操作を繰り返す方法であってもよい。又は、これらの物質の各々を分散又は溶解させた液体を調製した後、これらを１つに混合し、基板上の所定部位に滴下し、乾燥させる方法であってもよい。分散媒又は溶媒としては、特に制限されず、例えば、水又はｐＨ２～ｐＨ１０の緩衝液、アルコール系溶媒（例えば、エタノール）、ケトン系溶媒（例えば、アセトン）等が挙げられる。分散剤又は溶媒は、水（例えば超純水）、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、又はトリス緩衝液であることが好ましい。ＣＮＴを分散又は溶解させた液体は、更に分散剤（例えば、コール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース）を含有することが好ましい。当該液体中のＣＮＴの濃度は、例えば、０．００２～２ｗ／ｖ％であり、当該液体中の分散剤の濃度は、例えば、０．２５～０．７５ｗ／ｖ％である。

【0017】

一実施形態において、ＣＮＴを分散媒又は溶媒（好ましくは、分散剤を含む）に添加し、超音波破砕機等を用いて分散させ、それを基板上に滴下し、乾燥させた後、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む液体をその上に滴下し、乾燥させて、ＣＮＴ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む層を形成することが好ましい。

【0018】

センサは上記の電極を備えることが好ましい。上記電極は、通常、センサ中の作用電極となる。センサは、更に、カウンター電極及び必要により参照電極を備えることが好ましい。このようなセンサの構成は、当該技術分野において公知である。また、センサは、ポテンショスタット及び電流検出回路等のバイオセンサが通常備える構成を備えることができる。

【0019】

上記の電極又はそれを備えたセンサを用いて３－ヒドロキシ酪酸を感度良く測定（例えば、検出、定量）することができる。また、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの補酵素を用いても又は用いなくても、３－ヒドロキシ酪酸を高感度で測定することができる。３－ヒドロキシ酪酸は任意の物質に由来し得る。センサは、通常測定器に装着されて使用される。測定器に装着されたセンサに試料（血液、特に糖代謝機能障害及び異常を伴う各種疾患（糖尿病等）を有する被験体の血液等）を供給すると、試料中の測定対象物質（３－ヒドロキシ酪酸）と３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼが反応し、電流が生じる。センサの作用極及び対極と電気的に接続された測定器により、この電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が可能である。作用極と対極の間に電圧を印加した際に流れる電流は、測定対象物濃度と相関がある。電流値と予め作成した検量線から測定対象物の濃度を決定することができる。

【実施例0020】

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

【0021】

［実施例１］
以下の（１）～（３）のカーボンナノチューブのそれぞれの粉末３０ｍｇを０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液に懸濁し３０ｍＬの懸濁液を３種類調製した。
（１）単層カーボンナノチューブ、直径：０．９ｎｍ（中央値），０．８－１．０ｎｍ（測定法：ＴＥＭ）（ＨｉＰｃｏ：ＮａｎｏＩｎｔｅｇｒｉｓ）
（２）単層カーボンナノチューブ、直径：１．０ｎｍ（中央値），０．５－１．５ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ１．０：（株）名城ナノカーボン）
（３）多層カーボンナノチューブ、直径：９．５ｎｍ（中央値），５－１５ｎｍ（測定法：ＴＥＭ）（ＮＣ７０００：Ｎａｎｏｃｙｌ）

【0022】

これらのカーボンナノチューブ懸濁液を１８℃でチップ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０Ｄ：日本エマソン株式会社）を用いて出力３０％、１時間処理することによりカーボンナノチューブを分散させた。これらの超音波処理液を２１０，０００ｇ、２時間の超遠心にかけ上清の８０％を回収した。これらの回収液をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット １００ｋ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮し、０．７５～１．５ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液を得た。

【0023】

ＰＥＴシートに金を蒸着させ、９ｍｍ^２の作用電極部位を持つ電極チップを作製した（図１）。上記（１）～（３）のカーボンナノチューブの分散液又は０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液を５μＬ作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡（株）製、２Ｕ／μＬ）５μＬを作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、作用電極部位に２％ナフィオン液を５μＬ滴下し、乾燥させ、カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを作用電極に固定化した。

【0024】

電気化学アナライザー（ＡＬＳ／ＣＨＩ ６６０Ｂ：ビー・エー・エス社）の作用極に上記で作製した電極チップ、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金線をセットした。この３電極を３－ヒドロキシ酪酸及び補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に浸漬し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を実施した。０ｍＭ、２．５ｍＭ、４．４ｍＭ、又は１０ｍＭの３－ヒドロキシ酪酸濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムは図２（直径０．９ｎｍのカーボンナノチューブ）、図３（直径：１．０ｎｍのカーボンナノチューブ）、図４（直径９．５ｎｍのカーボンナノチューブ）、図５（コール酸ナトリウム水溶液；カーボンナノチューブなし）に示すものとなった。このサイクリックボルタモグラムにおいて－０．８Ｖから＋０．８Ｖへ掃引する際の＋０．６Ｖの電流値は以下の通りであった。

【0025】

【表1】

【0026】

以上の結果より、カーボンナノチューブがある場合に３－ヒドロキシ酪酸の測定が可能で、かつ単層カーボンナノチューブである場合により精度良く３－ヒドロキシ酪酸の測定が可能であることが示された。

【0027】

［実施例２］
以下の（４）～（５）のカーボンナノチューブのそれぞれの粉末３０ｍｇを０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液に懸濁し３０ｍＬの懸濁液を２種類調製した。
（４）単層カーボンナノチューブ、直径：０．９ｎｍ（中央値），０．８－１．０ｎｍ（測定法：ＴＥＭ）（ＨｉＰｃｏ：ＮａｎｏＩｎｔｅｇｒｉｓ）
（５）単層カーボンナノチューブ、直径：１．０ｎｍ（中央値），０．５－１．５ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ１．０：（株）名城ナノカーボン）

【0028】

これらのカーボンナノチューブ懸濁液を１８℃でチップ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０Ｄ：日本エマソン株式会社）を用いて出力３０％、１時間処理することによりカーボンナノチューブを分散させた。これらの超音波処理液を２１０，０００ｇ、２時間の超遠心にかけ上清の８０％を回収した。これらの回収液をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット １００ｋ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮し、０．７５～１．５ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液を得た。

【0029】

ＰＥＴシートに金を蒸着させ、９ｍｍ^２の作用電極部位を持つ電極チップを作製した（図１）。上記（４）、（５）のカーボンナノチューブの分散液又は０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液を５μＬ作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡（株）製、２Ｕ／μＬ）５μＬを作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、作用電極部位に２％ナフィオン液を５μＬ滴下し、乾燥させ、カーボンナノチューブ及び３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを作用電極に固定化した。

【0030】

電気化学アナライザー（ＡＬＳ／ＣＨＩ ６６０Ｂ：ビー・エー・エス社）の作用極に上記で作製した電極チップ、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金線をセットした。この３電極を３－ヒドロキシ酪酸を含みニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含まない５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に浸漬し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を実施した。０ｍＭ、２．５ｍＭ、４．４ｍＭ、又は１０ｍＭの３－ヒドロキシ酪酸濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムは図６（直径０．９ｎｍのカーボンナノチューブ）、図７（直径：１．０ｎｍのカーボンナノチューブ）、図８（コール酸ナトリウム水溶液；カーボンナノチューブなし）に示すものとなった。このサイクリックボルタモグラムにおいて－０．８Ｖから＋０．８Ｖへ掃引する際の＋０．６Ｖの電流値は以下の通りであった。

【0031】

【表2】

【0032】

以上の結果より、補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドがなくても３－ヒドロキシ酪酸の測定が可能であることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】