特開 2023-812 悪性胸膜中皮腫バイオマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023000812

(43)【公開日】2023-01-04

(54)【発明の名称】悪性胸膜中皮腫バイオマーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221222BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20221222BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20221222BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221222BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

A61K45/06

A61P11/00

A61P35/00

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021101842

(22)【出願日】2021-06-18

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】武田 吉人

(72)【発明者】

【氏名】熊ノ郷 淳

(72)【発明者】

【氏名】安部 祐子

【テーマコード（参考）】

2G045

4C084

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CA25

2G045CA26

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB03

4C084AA20

4C084NA14

4C084ZA59

4C084ZB26

4C084ZC75

(57)【要約】      （修正有）

【課題】悪性胸膜中皮腫のバイオマーカー及びその利用方法を提供すること。
【解決手段】被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における特定のタンパク質群を検出する。該バイオマーカーを利用することにより、悪性胸膜中皮腫の検査、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング、悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性の評価等が可能になり得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

悪性胸膜中皮腫を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。

【請求項2】

検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）を含む場合、さらに、
（2a）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含む、請求項１に記載の検査方法。

【請求項3】

検出したタンパク質が、タンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2b）前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含む、請求項１又は２に記載の検査方法。

【請求項4】

検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）、及びタンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2c）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ／或いは前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含む、請求項１～３のいずれかに記載の検査方法。

【請求項5】

前記タンパク質群（A）が、
（A1）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、及びComplement component C8 alpha chainからなるタンパク質群、又は
（A2）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Prothrombin、Post-GPI attachment to proteins factor 6、Plexin domain-containing protein 2、Emerin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Nidogen-2、及びEndosomal/lysosomal potassium channel TMEM175からなるタンパク質群
である、請求項１～４のいずれかに記載の検査方法。

【請求項6】

前記タンパク質群（B）が、
（B1）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、及びBleomycin hydrolaseからなるタンパク質群、又は
（B2）Protein PRRC1、Dedicator of cytokinesis protein 2、G protein-coupled receptor kinase 5、Integrin alpha-9、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Afadin、Acyl-CoA-binding protein、Pro-interleukin-16、T-cell surface glycoprotein CD4、Interleukin-18、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、ADP-ribosylation factor-like protein 3、及び26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6からなるタンパク質群
である、請求項１～５のいずれかに記載の検査方法。

【請求項7】

前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～６のいずれかに記載の検査方法。

【請求項8】

前記被検体がヒトである、請求項１～７のいずれかに記載の検査方法。

【請求項9】

タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、悪性胸膜中皮腫の検査薬。

【請求項10】

タンパク質群（A）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群
より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤、並びに
タンパク質群（B）：
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
より選択される少なくとも1種のタンパク質の亢進剤
からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤を含有する、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤。

【請求項11】

被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。

【請求項12】

タンパク質群（A）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程、及び
タンパク質群（B）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む、請求項１１に記載のスクリーニング方法。

【請求項13】

被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性の評価方法。

【請求項14】

タンパク質群（A）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性があると判定する工程、及び
タンパク質群（B）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性があると判定する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む、請求項１３に記載の評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、悪性胸膜中皮腫バイオマーカー等に関する。

【背景技術】

【0002】

悪性胸膜中皮腫は、アスベスト曝露により発症率が増加すること、曝露後30～40年での発症が多いこと等が知られている。疫学的研究から、世界における悪性胸膜中皮腫患者の年間死亡数は1万人といわれており、また、今後も悪性胸膜中皮腫の罹患率は増加すると予測されている。

【0003】

悪性胸膜中皮腫の標準的治療法は未だ確立されていない。早期に発見することができれば、根治的手術が可能であり得るので、早期診断技術の開発が望まれる。また、悪性胸膜中皮腫は、気管支鏡では診断できず、胸腔鏡VATSによって漸く診断可能である。このためより簡便な検査方法が望まれる。

【0004】

非特許文献１では、悪性胸膜中皮腫のバイオマーカーの探索が試みられているものの、有用なバイオマーカーの同定には至っていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Regan EA, et al., AJRCMB 2019 Aug;61 (2) : 143.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、悪性胸膜中皮腫のバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、鋭意研究を進めた結果、被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における特定のタンパク質群が、悪性胸膜中皮腫のバイオマーカーとして有用であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。

【0008】

項１． 悪性胸膜中皮腫を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。

【0009】

項２． 検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）を含む場合、さらに、
（2a）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含む、項１に記載の検査方法。

【0010】

項３． 検出したタンパク質が、タンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2b）前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含む、項１又は２に記載の検査方法。

【0011】

項４． 検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）、及びタンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2c）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ／或いは前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含む、項１～３のいずれかに記載の検査方法。

【0012】

項５． 前記タンパク質群（A）が、
（A1）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、及びComplement component C8 alpha chainからなるタンパク質群、又は
（A2）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Prothrombin、Post-GPI attachment to proteins factor 6、Plexin domain-containing protein 2、Emerin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Nidogen-2、及びEndosomal/lysosomal potassium channel TMEM175からなるタンパク質群
である、項１～４のいずれかに記載の検査方法。

【0013】

項６． 前記タンパク質群（B）が、
（B1）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、及びBleomycin hydrolaseからなるタンパク質群、又は
（B2）Protein PRRC1、Dedicator of cytokinesis protein 2、G protein-coupled receptor kinase 5、Integrin alpha-9、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Afadin、Acyl-CoA-binding protein、Pro-interleukin-16、T-cell surface glycoprotein CD4、Interleukin-18、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、ADP-ribosylation factor-like protein 3、及び26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6からなるタンパク質群
である、項１～５のいずれかに記載の検査方法。

【0014】

項７． 前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～６のいずれかに記載の検査方法。

【0015】

項８． 前記被検体がヒトである、項１～７のいずれかに記載の検査方法。

【0016】

項９． タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、悪性胸膜中皮腫の検査薬。

【0017】

項１０． タンパク質群（A）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群
より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤、並びに
タンパク質群（B）：
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
より選択される少なくとも1種のタンパク質の亢進剤
からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤を含有する、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤。

【0018】

項１１． 被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。

【0019】

項１２． タンパク質群（A）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程、及び
タンパク質群（B）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む、項１１に記載のスクリーニング方法。

【0020】

項１３． 被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）：
（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群、並びに
（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性の評価方法。

【0021】

項１４． タンパク質群（A）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性があると判定する工程、及び
タンパク質群（B）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性があると判定する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む、項１３に記載の評価方法。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、悪性胸膜中皮腫のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、悪性胸膜中皮腫の検査、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング、悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性の評価等が可能になり得る。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。

【0024】

1．悪性胸膜中皮腫の検査方法
本発明は、その一態様において、悪性胸膜中皮腫を検査する方法であって、（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。

【0025】

1-1．工程（1）
検査対象である「悪性胸膜中皮腫」の種類は、特に制限されない。悪性胸膜中皮腫の進行度に関する各種分類基準における全てのクラス、グレード、ステージの悪性胸膜中皮腫が検査対象となり得る。また、悪性胸膜中皮腫の病変部位に関する各種分類における全ての種類（例えば上皮型、肉腫型、二相型等）の悪性胸膜中皮腫が検査対象となり得る。

【0026】

被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。

【0027】

被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば悪性胸膜中皮腫に罹患しているかどうか不明な検体、悪性胸膜中皮腫に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、悪性胸膜中皮腫に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、悪性胸膜中皮腫の治療中の検体、悪性胸膜中皮腫の治療後の検体等が挙げられる。

【0028】

工程（1）における検出試料は、好ましくは体液の細胞外小胞である。

【0029】

体液は、特に制限されない。体液としては、例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁などが挙げられ、好ましくは全血、血清、血漿、髄液が挙げられ、より好ましくは全血、血清、血漿が挙げられる。体液は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。

【0030】

体液は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。血清は、全血から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、全血から血球を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。

【0031】

本明細書においては、全血、血清、血漿等の血液そのもの又は血液由来の試料を「血液試料」と示す。

【0032】

細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。

【0033】

細胞外小胞は、体液から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えば超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。

【0034】

工程（1）の検出対象は、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（本明細書において、これらをまとめて「対象タンパク質」と示すこともある。）である。

【0035】

タンパク質群（A）は、（A）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、Complement component C8 alpha chain、Nidogen-2、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Periostin、Emerin、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit STT3A、Complement factor H-related protein 5、Kunitz-type protease inhibitor 2、Signal-regulatory protein beta-1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 5、Plexin domain-containing protein 2、Lanosterol synthase、Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1、Transmembrane emp24 domain-containing protein 4、Post-GPI attachment to proteins factor 6、C4b-binding protein alpha chain、Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5、ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3、Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c、Malectin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9、Prothrombin、Alpha-synuclein、Galectin-8、ELMO domain-containing protein 2、AP-2 complex subunit alpha-1、及びApoptosis regulator BAXからなるタンパク質群である。

【0036】

タンパク質群（A）は、悪性胸膜中皮腫検体における量が正常検体における量よりも高いタンパク質群である。

【0037】

タンパク質群（A）の中でも、正常検体に対する量比がより高いという観点から、好ましくは、タンパク質群（A1）：
（A1）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Protein FAM3C、Erlin-1、Trafficking protein particle complex subunit 9、Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9、Endosomal/lysosomal potassium channel TMEM175、Complement component C9、及びComplement component C8 alpha chainからなるタンパク質群が挙げられ、より好ましくは、タンパク質群（A11）：
（A11）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Biglycan、Decorin、及びImmunoglobulin kappa variable 1-27からなるタンパク質群が挙げられる。

【0038】

タンパク質群（A）の中でも、正常検体との有意差がより高いという観点から、好ましくは、タンパク質群（A2）：
（A2）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、Prothrombin、Post-GPI attachment to proteins factor 6、Plexin domain-containing protein 2、Emerin、Immunoglobulin kappa variable 1-27、Nidogen-2、及びEndosomal/lysosomal potassium channel TMEM175からなるタンパク質群が挙げられ、より好ましくは、タンパク質群（A21）：
（A21）Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein、及びProthrombinからなるタンパク質群が挙げられる。

【0039】

タンパク質群（B）は、（B）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、Bleomycin hydrolase、Acyl-CoA-binding protein、Band 4.1-like protein 2、Ankyrin-1、Glucosamine-6-phosphate isomerase 1、Rho family-interacting cell polarization regulator 1、Interleukin-18、Proteasome subunit beta type-3、Dedicator of cytokinesis protein 2、Band 4.1-like protein 3、WD repeat-containing protein 37、Keratin, type II cytoskeletal 1、Afadin、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Integrin alpha-9、1,4-alpha-glucan-branching enzyme、Protein 4.1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、SAM and SH3 domain-containing protein 3、ADP-ribosylation factor-like protein 3、Pleckstrin homology domain-containing family O member 2、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Deoxyribonuclease-1-like 1、Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13、Angiogenin、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform、及びSerine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoformからなるタンパク質群である。

【0040】

タンパク質群（B）は、悪性胸膜中皮腫検体における量が正常検体における量よりも低いタンパク質群である。

【0041】

タンパク質群（B）の中でも、正常検体に対する量比がより低いという観点から、好ましくは、タンパク質群（B1）：
（B1）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6、Dynein light chain 2, cytoplasmic、Protein PRRC1、Myotubularin-related protein 2、T-cell surface glycoprotein CD4、Guanylate-binding protein 1、Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3、及びBleomycin hydrolaseからなるタンパク質群が挙げられ、より好ましくはタンパク質群（B11）：
（B11）Pro-interleukin-16、Putative hydroxypyruvate isomerase、G protein-coupled receptor kinase 5、及びFERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1からなるタンパク質群が挙げられる。

【0042】

タンパク質群（B）の中でも、正常検体との有意差がより高いという観点から、好ましくは、タンパク質群（B2）：
（B2）Protein PRRC1、Dedicator of cytokinesis protein 2、G protein-coupled receptor kinase 5、Integrin alpha-9、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1、Methylthioribose-1-phosphate isomerase、Ubiquitin thioesterase OTUB1、Afadin、Acyl-CoA-binding protein、Pro-interleukin-16、T-cell surface glycoprotein CD4、Interleukin-18、Glutathione hydrolase 5 proenzyme、ADP-ribosylation factor-like protein 3、及び26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6からなるタンパク質群が挙げられ、より好ましくはタンパク質群（B21）：
（B21）Protein PRRC1、Dedicator of cytokinesis protein 2、G protein-coupled receptor kinase 5、Integrin alpha-9、及びCalcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1からなるタンパク質群が挙げられる。

【0043】

タンパク質群（A）～（B）のタンパク質は、ヒトの場合であれば、後述の実施例における表１～４に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質である。他の生物種の場合であれば、表１～４に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質のオーソログである。

【0044】

工程（1）における対象タンパク質の数は、1種のみでもよいが、2種以上の組み合わせであってもよい。より多く（例えば2種、5種、10種、20種、30種、40種、50種以上）の検出対象を組み合わせることにより、悪性胸膜中皮腫の検査等を、より正確に行うことが可能になる。

【0045】

検出は、通常は、対象タンパク質の量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。

【0046】

対象タンパク質を検出する方法としては、対象タンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、対象タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法、対象タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法等を挙げることができる。なお、対象タンパク質のアミノ酸配列情報は、UniProtKBアクセッション番号を基に、EBI（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。

【0047】

免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。

【0048】

質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、EI法、CI法、FD法、FAB法、MALDI法、ESI法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、2以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（MS／MS）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（LC）やHPLCにより、対象タンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて対象タンパク質を構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する対象タンパク質を構成するペプチドにおけるアミノ酸の1個以上が、15N，13C，18O，及び2Hのいずれか1以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてF-moc法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、iTRAQ（登録商標）試薬、ICAT（登録商標）試薬、ICPL（登録商標）試薬、NBS（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。

【0049】

工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、悪性胸膜中皮腫の検出指標である対象タンパク質の量及び／又は濃度を提供することができ、これにより悪性胸膜中皮腫の検出などを補助することができる。

【0050】

工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、悪性胸膜中皮腫の病態解明、悪性胸膜中皮腫の予後予測、被検体の層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）、悪性胸膜中皮腫における難治化や、リモデリングの評価、悪性胸膜中皮腫の組織型や表現型等の鑑別等に利用し得る。

【0051】

1-2．工程（2）
本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）を含む場合、さらに、
（2a）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2aを含む本発明の検査方法によれば、悪性胸膜中皮腫を判定することが可能となる。

【0052】

本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2b）前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2bを含む本発明の検査方法によれば、悪性胸膜中皮腫を判定することが可能となる。

【0053】

本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）、及びタンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2c）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ／或いは前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2cを含む本発明の検査方法によれば、悪性胸膜中皮腫を判定することが可能となる。

【0054】

カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、悪性胸膜中皮腫に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、悪性胸膜中皮腫に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば0.7～1.5倍の値とすることができる。また、受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲線の解析などに基づいた統計解析（より具体的には、Youden indexを用いた方法が例示される。）を行うことにより、設定することもできる。

【0055】

工程（2）の好ましい一態様においては、被検体が悪性胸膜中皮腫の治療中又は治療後の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。

【0056】

2．悪性胸膜中皮腫のより高い精度での診断
工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに悪性胸膜中皮腫の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で悪性胸膜中皮腫を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に悪性胸膜中皮腫を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「悪性胸膜中皮腫に罹患している」と診断できる。

【0057】

3．悪性胸膜中皮腫の治療
工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．悪性胸膜中皮腫のより高い精度での診断」に記載の様に悪性胸膜中皮腫に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）悪性胸膜中皮腫に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に悪性胸膜中皮腫を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、悪性胸膜中皮腫に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。

【0058】

悪性胸膜中皮腫の治療方法は、特に制限されないが、代表的には投薬治療が挙げられる。投薬治療に用いる医薬としては、各種抗がん剤等が挙げられる。抗がん剤としては、例えばペメトレキセド、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、ビノレルビン等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。

【0059】

また、本発明の検査方法を利用することにより、医薬、例えば上記で例示された医薬の中から、投薬治療に用いる適切な医薬を選択することもできる。

【0060】

悪性胸膜中皮腫の治療方法としては、上記以外にも、外科療法（手術）、放射線療法等が挙げられる。

【0061】

4．悪性胸膜中皮腫の検査薬、検査キット
本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、悪性胸膜中皮腫の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。

【0062】

タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、悪性胸膜中皮腫等については、上記「1．悪性胸膜中皮腫の検査方法」における定義と同様である。

【0063】

検出剤は、対象タンパク質を特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象タンパク質に対する抗体が挙げられる。

【0064】

検出剤は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、発光物質、色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、金コロイド、ビオチン等の付加、導入等が挙げられる。

【0065】

検出剤は、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、検出剤を固定化した基板（例えばプローブを固定化したマイクロアレイチップ等。別の例として、抗体を固定化したELISAプレート等）の形態として提供することができる。

【0066】

固定化に使用される固相は、抗体等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。

【0067】

抗体は、対象タンパク質を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法やELISA法において、対象タンパク質が特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が対象タンパク質に由来するものであると判断できるものであればよい。

【0068】

抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。対象タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。

【0069】

これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質、あるいは対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。

【0070】

抗体の作製に免疫抗原として使用される対象タンパク質は、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。

【0071】

具体的には、対象タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また対象タンパク質の部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。

【0072】

また本発明の抗体は、対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、対象タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ対象タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。

【0073】

かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。

【0074】

本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。

【0075】

本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の体液の細胞外小胞又は血液試料における対象タンパク質の検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば二次抗体、緩衝液等）、器具（例えば細胞外小胞の精製、分離、濃縮用器具（例えばカラム等））等が挙げられる。

【0076】

5．悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤
本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤、並びにタンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質の亢進剤からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤を含有する、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。

【0077】

タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、悪性胸膜中皮腫等については、上記「1．悪性胸膜中皮腫の検査方法」における定義と同様である。

【0078】

抑制剤としては、例えば対象タンパク質に対する抗体が挙げられる。該抗体については、上記「4．悪性胸膜中皮腫の検査薬、検査キット」で説明した抗体と同様のものを使用することができる。

【0079】

抑制剤の別の例としては、対象タンパク質の発現抑制剤が挙げられる。

【0080】

対象タンパク質の発現抑制剤としては、対象タンパク質、そのmRNA、その前駆体などの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば対象タンパク質の遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的microRNA（miRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター； 対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイム； CRISPR/Casシステムによる対象タンパク質の遺伝子遺伝子編集剤などが挙げられる。

【0081】

なお、発現抑制とは、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。

【0082】

亢進剤としては、例えば対象タンパク質の発現亢進剤が挙げられる。

【0083】

対象タンパク質の発現亢進剤としては、対象タンパク質、そのmRNA、その前駆体などの発現量を亢進し得るものである限り特に制限されず、例えば対象タンパク質の発現ベクターなどが挙げられる。

【0084】

なお、発現亢進とは、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を、例えば2、3、5、10、20、30、50、100、200、300、500、1000、10000倍に亢進させることを意味する。

【0085】

対象タンパク質の遺伝子siRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。

【0086】

siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45～60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となる対象タンパク質をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。

【0087】

対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2～4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0088】

siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。

【0089】

対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19－21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19－21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。

【0090】

siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。

【0091】

siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。

【0092】

対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このような対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。

【0093】

対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸とは、対象タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、対象タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、対象タンパク質の遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、対象タンパク質の遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。

【0094】

対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として対象タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、対象タンパク質の遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。

【0095】

対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質の遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。

【0096】

上記した対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH₃（2’-O-Me）、CH₂CH₂OCH₃（2’-O-MOE）、CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、CH₂CONHCH₃、又はCH₂CH₂CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。

【0097】

対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸などは、対象タンパク質の遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。

【0098】

対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の発現ベクター、対象タンパク質の発現ベクター等については、対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、対象タンパク質のmRNA等が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及び対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、又は対象タンパク質のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター； マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられる。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。

【0099】

対象タンパク質の遺伝子発現抑制剤の別の例としては、対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。対象タンパク質の遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。

【0100】

本発明の薬剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。

【0101】

本発明の薬剤の形態は、特に限定されず、本発明の薬剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。

【0102】

形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。

【0103】

形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。

【0104】

形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。

【0105】

本発明の薬剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。

【0106】

本発明の薬剤の対象タンパク質の抑制剤及び亢進剤の合計含有量は、抑制剤及び亢進剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。

【0107】

本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1～1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。

【0108】

6．悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分（又はその候補物質）のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。

【0109】

体液、細胞外小胞、血液試料、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、悪性胸膜中皮腫、対象タンパク質の量又は濃度の測定等については、上記「1．悪性胸膜中皮腫の検査方法」における定義と同様である。

【0110】

動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられる。

【0111】

被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。

【0112】

本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、タンパク質群（A）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程、及び
タンパク質群（B）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む。

【0113】

対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。

【0114】

「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。

【0115】

「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。

【0116】

7．悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性の評価方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。

【0117】

体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、悪性胸膜中皮腫、対象タンパク質の量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．悪性胸膜中皮腫の検査方法」及び「6．悪性胸膜中皮腫の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。

【0118】

本発明の毒性評価方法は、より具体的には、タンパク質群（A）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性があると判定する工程、及び
タンパク質群（B）に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を悪性胸膜中皮腫の誘発性又は増悪性があると判定する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む。

【0119】

対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。

【0120】

「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。

【0121】

「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。

【実施例0122】

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0123】

試験例1．細胞外小胞画分の調製
悪性胸膜中皮腫であると診断されたヒト被検体（6名）それぞれの血清、及び健常ヒト被検体（4名）それぞれの血清から細胞外小胞画分を調製した。細胞外小胞画分の調製は、各検体の血清の容量を揃えて、細胞外小胞調製キット（MagCaptur（商標） エクソソームアイソレーションキット PS、富士フイルム和光純薬社製）を用いて行った。

【0124】

続いて、得られた細胞外小胞画分について、細胞外小胞の粒子数及び粒子径を測定した。具体的には、ナノサイト（日本カンタム・デザイン株式会社、Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025）を使用して測定した。これは、粒子径ごとのブラウン運動速度の違いをもとに解析するものであり、画面に映る散乱光１つ１つの動きを追尾（トラッキング）し、各々の移動速度（拡散係数）から液中における粒子径（流体力学径）を算出することができる。

【0125】

さらに、細胞外小胞を免疫電子顕微鏡法によって観察した。具体的には、次のようにして行った。固定済み細胞外小胞溶液を5～8μLずつグリッドへ載せ15分静置して、グリッドのフォルムバールへ細胞外小胞を定着させた。PBSで3回洗浄した後、ブロッキング反応（1%BSA/PBS、10分）を行い、続いて一次抗体反応（Invitrogen AHS0902 Mouse (monoclonal) Anti-Human Leukemia and Platelet Associated Antigen CD9 Clone: MM2/57、100倍希釈、2時間半、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、二次抗体反応（CRL EMGMHL10 Anti-IgG (H＋L), Mouse, Goat-Poly, Gold 10 nm, EM、200倍希釈、1時間、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、1%GA/PBSで15分間処理し、さらにPBSで3回洗浄した。水洗し、0.5% UA（酢酸ウラニル）で処理して、乾燥させて、電子顕微鏡で観察した。

【0126】

またさらに、細胞外小胞画分について、エクソソームマーカーに対する抗体（抗CD9抗体及び抗CD63抗体）を用いて、ウェスタンブロットした。

【0127】

上記解析の結果、得られた画分にはエクソソームが存在していることが確認できた。

【0128】

試験例2．プロテオミクス解析（DIAプロテオーム解析）
試験例1で得られた細胞外小胞画分中のタンパク質の定量を、DIAプロテオーム解析により行った。具体的には以下のようにして行った。

【0129】

10%デオキシコール酸ナトリウムを含む1M Tris-HCl pH8.5をエクソソーム溶出液100μlに添加し、BIORUPTOR UCW-201（SonicBio Corporation）を用いて "High "で10分間ソニケートした。サンプルを10mMジチオスレイトールで50℃で30分間処理した後、30mMヨードアセトアミドを用いて室温で30分間暗所でアルキル化した。アルキル化したサンプルを室温で60mMシステインで10分間インキュベートし、次いで50mM重炭酸アンモニウムで200μL希釈し、37℃で一晩500 ng Trypsin/Lys-C Mixで消化した。消化したペプチドを沈殿させ、5％トリフルオロ酢酸30μLで酸性化して洗浄剤を除去し、サンプルを17,400×gで15分間遠心分離した。上清をC18-StageTipを用いて脱塩し、遠心エバポレーターを用いて乾燥し、乾燥したペプチドを3％ACNおよび0.1％FAに溶解した。

【0130】

ショットガンプロテオーム解析の前処理は、以前に報告されているように行った(PMID: 31779068)。ペプチドは、C18コアシェル粒子（CAPCELL CORE MP 2.7μm、160Å材料；大阪曹達株式会社）を充填した75μm×20cmのPicoFritエミッター（New Objective）に50℃で直接注入し、UltiMate 3000 RSLCnano LCシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いて100nl/minの流速で90分間のグラジエントで分離した。カラムから溶出したペプチドは、Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)を用いてオーバーラップウィンドウDIA-MS (PMID: 30671891, PMID: 31779068)で分析した。MS1 スペクトルは、3e6 の自動ゲイン制御ターゲットと最大注入時間 55 を設定するために、495-785 m/z の範囲で 30,000 の分解能で収集された。MS2は、自動利得制御目標を3e6、最大入射時間を "auto"、ステップ付き正規化衝突エネルギーを24, 26, 28%に設定するために、15,000の分解能で200m/z以上のスペクトルを収集した。MS2 のアイソレーション幅は 4 m/z に設定し、500-780 m/z の重なり合うウィンドウパターンは、Skyline (PMID: 20147306) で最適化されたウィンドウ配置を使用した。

【0131】

MSファイルは、Scaffold DIA (Proteome Software, Inc., Portland, OR)を用いてマウススペクトルライブラリに対して検索した。マウスのスペクトルライブラリは、Prosit (PMID: 32214105, PMID: 31133760) によるヒトタンパク質配列データベース (UniProt id UP000005640, reviewed, canonical) から生成した。Scaffold DIAの検索パラメータは、実験データ検索酵素、トリプシン、最大欠失開裂部位、1、前駆体質量許容値、8ppm、フラグメント質量許容値、10ppm、静的修飾、システインカルバミドメチル化とした。タンパク質同定閾値は、ペプチドおよびタンパク質の偽発見率の両方を1％未満に設定した。ペプチドの定量は、Scaffold DIAのEncyclopeDIAアルゴリズム(PMID: 30510204)で計算した。各ペプチドについて、最高品質のフラグメントイオンを4つ選択して定量した。蛋白質の定量は、ペプチドの定量を合計したものから推定した。

【0132】

悪性胸膜中皮腫被検体と健常被検体とを比較し、t-検定により、2つの群間で有意に（P<0.05）離れた発現レベルを示すタンパク質を、78個、抽出した。

【0133】

（結果）
抽出した悪性胸膜中皮腫バイオマーカーの内、悪性胸膜中皮腫被検体の発現レベルが健常被検体の発現レベルよりも高かったタンパク質を、表１及び表２に示す。表１及び表２中、「Fold change」は、悪性胸膜中皮腫被検体の発現量平均値を健常被検体の発現量平均値で除した値（悪性胸膜中皮腫被検体の発現量平均値／健常被検体の発現量平均値）を示す。表１は、タンパク質をFold changeの降順で並べた表であり、表２は、タンパク質をp valueの昇順で並べた表である。

【0134】

【表1】

【0135】

【表2】

【0136】

抽出した悪性胸膜中皮腫バイオマーカーの内、悪性胸膜中皮腫被検体の発現レベルが健常被検体の発現レベルよりも低かったもタンパク質を、表３及び表４に示す。表３及び表４中、「Fold change」は、悪性胸膜中皮腫被検体の発現量平均値を健常被検体の発現量平均値で除した値（悪性胸膜中皮腫被検体の発現量平均値／健常被検体の発現量平均値）を示す。表３は、タンパク質をFold changeの昇順で並べた表であり、表４は、タンパク質をp valueの昇順で並べた表である。

【0137】

【表3】

【0138】

【表4】