特開 2023-81898 多重特異性抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023081898

(43)【公開日】2023-06-13

(54)【発明の名称】多重特異性抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230606BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230606BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20230606BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230606BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20230606BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/46 ZNA

A61P35/00

A61K39/395 U

A61K39/395 N

A61P37/04

C07K16/28

C12N15/13

C12P21/08

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023028123

(22)【出願日】2023-02-27

(62)【分割の表示】P 2020557212の分割

【原出願日】2019-04-17

(31)【優先権主張番号】18168053.9

(32)【優先日】2018-04-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】デングル， シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】フェン， セバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】フィッシャー， イェンス

(72)【発明者】

【氏名】キルステンプファート， クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】クロスターマン， シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】メレケン， イェルク

(72)【発明者】

【氏名】ティーフェンタラー， ゲオルク

(72)【発明者】

【氏名】ブジョツェク， アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】マジェティ， メヘル

(72)【発明者】

【氏名】キルヒナー， シルケ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＨＬＡ－Ｇ及びＴ細胞活性化抗原に結合する多重特異性抗体、それらの調製、製剤、及びそれらを使用する方法を提供する。
【解決手段】ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する多重特異性抗体であって、特定の配列を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇβ２Ｍ ＭＨＣＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている）と交差反応しない、多重特異性抗体を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する多重特異性抗体であって、
配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている）と交差反応しない、多重特異性抗体。

【請求項2】

抗体が二重特異性であり；
ここで、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分抗体が、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；
を含み；Ｔ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分が、ヒトＣＤ３に結合し、かつ
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項3】

第１の抗原結合部分が、
Ａ）
ｖｉｉ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｖｉｉｉ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含むか；あるいは
ｉｘ） 配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｃ）
配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｄ）
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分が、
Ｅ）
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む、
請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

第１の抗原結合部分が、ｉ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含むか；あるいはｉｉ）配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分が、
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む、
請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

抗体が、
ａ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｅ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し；かつ／あるいは
ｆ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し；かつ／あるいは
ｇ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し；かつ／あるいは
ｉ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し；かつ／あるいは
ｊ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答を回復し；かつ／あるいは
ｋ）ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞（例えば、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６））の存在下で、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導する
請求項１から４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項6】

第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項7】

第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、ここで、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置換されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項8】

第１の抗原結合部分が、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項9】

第１及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項１から８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項10】

第１及び第２の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ分子であり、ここで、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、あるいは（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１から９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項11】

第３の抗原結合部分を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項12】

第３の抗原部分が第１の抗原結合部分と同一である、請求項１１に記載の多重特異性抗体。

【請求項13】

請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、単離された核酸。

【請求項14】

請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。

【請求項15】

がんの治療における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＬＡ－Ｇ及びＴ細胞活性化抗原に結合する多重特異性抗体、それらの調製、製剤、及びそれらを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）としても知られるヒト主要組織適合複合体、クラスＩ、６は、ヒトにおいてＨＬＡ－Ｇ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡの非古典的なクラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖（ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。重鎖は、膜内に固定されるが、脱落／分泌されることがある。
・ 重鎖は３つのドメイン、すなわちアルファ１、アルファ２及びアルファ３からなる。アルファ１及びアルファ２ドメインは、２つのアルファヘリックスが隣接するペプチド結合溝を形成する。小さなペプチド（およそ９－ｍｅｒｓ）は、他のＭＨＣ Ｉタンパク質と同様にこの溝に結合することができる。
・ 第２の鎖は、他のＭＨＣ Ｉタンパク質と同様に重鎖に結合するベータ２ミクログロブリンである。

【0003】

ＨＬＡ－Ｇの場合、７つのアイソフォームが存在し、そのうちの３つは分泌形態であり、４つは膜結合形態である（図１に模式的に示す）。

【0004】

ＨＬＡ－Ｇは、機能的に活性な複合オリゴマー構造を形成することができる（Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729）。ジスルフィド結合二量体は、２つのＨＬＡ－Ｇ分子のＣｙｓ４２間に形成される。（Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三量体及び四量体複合体は、例えばKuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729, Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50及びT Gonen-Gross et al., J Immunol 171 (2003)1343-1351にも記載されている）。

【0005】

ＨＬＡ－Ｇは、胎盤の栄養膜細胞層に優勢に発現される。複数の腫瘍（膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃、及び卵巣を含む）は、ＨＬＡ－Ｇを発現する（Lin, A. et al., Mol Med. 21 (2015) 782-791; Amiot, L., et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417-431）。この発現はまた、炎症性疾患、ＧｖＨＤ及びがんのような病的状態に関連付けられることが報告されている。ＨＬＡ－Ｇの発現は、がんの予後不良と関連していると報告されている。腫瘍細胞は、ＨＬＡ－Ｇの発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することにより、宿主の免疫監視から逃れる。

【0006】

ＨＬＡ－Ｇは他のＭＨＣ Ｉ分子と高い相同性（＞９８％）を共有しており、したがって、他のＭＨＣ Ｉ分子との交差反応性を有しない真のＨＬＡ－Ｇ特異的抗体を生成することは困難である。

【0007】

ＨＬＡ－Ｇと異なる方法で相互作用する特定の抗体は以前に記載されている：Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518は、モノクローナル抗体、例えば８７Ｇ、及びＭＥＭ－Ｇ／９に関し；Neoplasma 50 (2003) 331-338は、インタクトなＨＬＡ－Ｇオリゴマー複合体（例えば８７Ｇ及びＭＥＭ－Ｇ９）、及びＨＬＡ－Ｇを有しない重鎖（例えば４Ｈ８４、ＭＥＭ－Ｇ／１及びＭＥＭ－Ｇ／２）の両方を認識する特定のモノクローナル抗体に関し；Hum Immunol. 64 (2003) 315-326は、ＨＬＡ－Ｇ発現ＪＥＧ３腫瘍細胞上で試験される複数の抗体（例えば天然ＨＬＡ－Ｇ１分子のみと反応するＭＥＭ－Ｇ／０９及び－Ｇ／１３）に関する。ＭＥＭ－Ｇ／０１は（４Ｈ８４ ｍＡｂと同様に）すべてのアイソフォームの変性されたＨＬＡ－Ｇ重鎖を認識するが、ＭＥＭ－Ｇ／０４は選択的に変性されたＨＬＡ－Ｇ１、－Ｇ２、及び－Ｇ５アイソフォームを認識する；Wiendl et al Brain 2003 176-85は、異なるモノクローナルＨＬＡ－Ｇ抗体、例えば８７Ｇ、４Ｈ８４、ＭＥＭ－Ｇ／９に関する。

【0008】

上記の論文は、ヒトＨＬＡ－Ｇ又はヒトＨＬＡ－Ｇ／β２Ｍ ＭＨＣ複合体に結合する抗体を報告している。しかしながら、ＨＬＡファミリーの高い多型性及び高い相同性に起因して、多くの抗体は、いずれかの真に特異的なＨＬＡ－Ｇ結合特性を欠き、さらにはしばしば他のＨＬＡファミリーメンバー（β２ＭとのＭＨＣ複合体として、又はそのβ２Ｍを有しない形態として）と結合又は交差反応するか、又は単純にＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ複合体のその受容体ＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４への結合を阻害しない（そして非アンタゴニスト抗体とみなされる）。

【0009】

標的細胞上の表面抗原とＴ細胞上のＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗体（本明細書ではＴ細胞二重特異性抗体又は「ＴＣＢ」とも呼ばれる）は、様々ながんの治療に大きな可能性を秘めている。そのような抗体がその両方の標的に同時に結合すると、標的細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が強制され、Ｔ細胞受容体の架橋とそれに続く細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及びその後の標的細胞の溶解が引き起こされる。標的細胞の殺傷におけるそれらの効力を考えると、Ｔ細胞二重特異性抗体にとって、標的上の及びオフターゲットの毒性を回避するために、標的の選択及び標的特異性が最も重要である。ＷＴ１などの細胞内タンパク質は魅力的な標的を表しているが、細胞表面の細胞内タンパク質に由来するペプチド抗原を提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体にのみアクセス可能である。ＴＣＲ様抗体の固有の問題は、ＭＨＣ分子自体、又は所望のペプチド以外のペプチドを提示するＭＨＣ分子との潜在的な交差反応性であり、これは臓器又は組織の選択性を損なう可能性がある。

【発明の概要】

【0010】

本発明は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化抗原（特にヒトＣＤ３）に結合する第２の抗原結合部分とを含む、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びＴ細胞活性化抗原（特にヒトＣＤ３）に結合する多重特異性抗体を提供する。

【0011】

一態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する多重特異性抗体は、配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている）と交差反応しない。

【0012】

本発明の一実施態様では、多重特異性抗体は二重特異性であり；かつ
ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分抗体は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；
を含み、Ｔ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分は、ヒトＣＤ３に結合し、かつ
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含む。

【0013】

本発明の一実施態様では、第１の抗原結合部分は、
Ａ）
ｉ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｉｉ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含むか；あるいは
ｉ） 配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｃ）
配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｄ）
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分は、
Ｅ）
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。

【0014】

本発明の一実施態様では、
第１の抗原結合部分は、ｉ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含み；又はｉｉ）配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分は、
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。

【0015】

本発明の一実施態様では、多重特異性抗体は、
ａ）配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｅ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｆ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｉ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｊ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し（例えば実施例４ｃを参照）；かつ／あるいは
ｋ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答（例えば、抑制された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ放出）を回復し；かつ／あるいは
ｌ）ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞（例えば、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６））の存在下で、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導する（実施例１２を参照）。

【0016】

本発明の一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である（それぞれがＦａｂ分子である）。

【0017】

本発明の一実施態様では、第２の抗原結合部分はＦａｂ分子であり、ここで、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置換されている。

【0018】

本発明の一実施態様では、第１の抗原結合部分は、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である。

【0019】

本発明の一実施態様では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。

【0020】

本発明の一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、ここで、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、あるいは（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。

【0021】

本発明の一実施態様では、多重特異性抗体は、第３の抗原結合部分を含む。

【0022】

本発明の一実施態様では、そのような第３の抗原部分は、第１の抗原結合部分と同一である。

【0023】

本発明の一実施態様では、多重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。

【0024】

本発明の一実施態様では、第１の、第２の、及び存在する場合は第３の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり；ここで、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、あるいは（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に結合しており；ここで、第３の抗原結合部分は、存在する場合は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。

【0025】

本発明は、前述の請求項（ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ ｃｌａｉｍｓ）のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸を提供する。

【0026】

本発明は、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0027】

本発明は、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。

【0028】

本発明は、抗体を産生するこのような方法を提供し、宿主細胞から該抗体を回収することをさらに含む。

【0029】

本発明は、本明細書に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤を提供する。

【0030】

本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の抗体を提供する。

【0031】

本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書に記載の抗体を提供する。

【0032】

本発明は、医薬の製造における、本明細書に記載の抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療を目的とする。

【0033】

本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、本明細書に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む方法を提供する。

【0034】

本明細書に記載のスクリーニング方法により、新規の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を選択することができた。このような抗体は、ＪＥＧ３細胞上に発現されるＨＬＡ－Ｇに対するＩＬＴ２の結合の強い阻害、又は単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合の阻害のような、高度に有用な特性を示す。

【0035】

さらに、本発明による抗体は、ＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答を回復することができ、すなわち、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞との共培養における単球によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生を回復することができる。

【0036】

加えて、本抗体は、高度に特異性であり、マウス又はラット起源のＨＬＡ－Ａ ＭＨＣ Ｉ複合体又はＭＨＣ Ｉ複合体との交差反応性を示さない。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】ＨＬＡ－Ｇの異なるアイソフォーム

【図2A】β２Ｍと会合した分子を含むＨＬＡ－Ｇの模式図

【図2B】特定の受容体と会合したＨＬＡ－Ｇ分子の構造：ＩＬＴ４及びＫＩＲ２ＤＬ１といった所与の受容体と複合体を形成しているＨＬＡ－Ｇ構造。ＩＬＴ４構造（ＰＤＢコード：２ＤＹＰ）。ＫＩＲ２ＤＬ１構造は、ＰＤＢコード１ＩＭ９（ＫＩＲ２ＤＬ１：ＨＬＡ－Ｃｗ４複合体構造）から取得され、ＨＬＡ－Ｃｗ４とＨＬＡ－Ｇ構造とを重ね合わせることによりＨＬＡ－Ｇの上に配置された。受容体は、リボンで表されており、ＨＬＡ－Ｇは分子表面で表されている。他のＨＬＡパラログに特有の又はそのようなパラログに保存されているＨＬＡ－Ｇ残基は、それぞれ白及びグレーで示されている。特有の表面残基が、キメラカウンター抗原中のＨＬＡコンセンサス配列よって置き換えられた。

【図3A】ＨＬＡ－ＧのＩＬＴ２及びＩＬＴ４並びにＣＤ８との相互作用／結合を阻害する（又は刺激する）ＨＬＡ－Ｇ抗体：ＩＬＴ２阻害

【図3B】ＨＬＡ－ＧのＩＬＴ２及びＩＬＴ４並びにＣＤ８との相互作用／結合を阻害する（又は刺激する）ＨＬＡ－Ｇ抗体：ＩＬＴ４阻害

【図3C】ＨＬＡ－ＧのＩＬＴ２及びＩＬＴ４並びにＣＤ８との相互作用／結合を阻害する（又は刺激する）ＨＬＡ－Ｇ抗体：ＣＤ８阻害

【図4A】ＪＥＧ３（ＨＬＡ－Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ－３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ－ＴＵ－８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））におけるＨＬＡ－Ｇ抗体を使用したＨＬＡ－Ｇの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析：ＨＬＡ－Ｇ－００３１（＃００３１）

【図4B】ＪＥＧ３（ＨＬＡ－Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ－３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ－ＴＵ－８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））におけるＨＬＡ－Ｇ抗体を使用したＨＬＡ－Ｇの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析：ＨＬＡ－Ｇ－００３９（＃００３９）

【図4C】ＪＥＧ３（ＨＬＡ－Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ－３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ－ＴＵ－８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））におけるＨＬＡ－Ｇ抗体を使用したＨＬＡ－Ｇの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析：ＨＬＡ－Ｇ－００４１（＃００４１）

【図4D】ＪＥＧ３（ＨＬＡ－Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ－３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ－ＴＵ－８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））におけるＨＬＡ－Ｇ抗体を使用したＨＬＡ－Ｇの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析：ＨＬＡ－Ｇ－００９０（＃００９０）

【図5A】抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（００３１、００３９、００４１及び００９０）は、ＪＥＧ３細胞上に発現されるＨＬＡ－ＧとヒトＩＬＴ２ Ｆｃキメラとの相互作用をブロック／調節する。新規抗ＨＬＡ－Ｇ抗体による細胞表面ＨＬＡ－Ｇの染色を、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートした抗ラットＩｇＧ二次抗体を使用することにより評価した（上段）。ＦＡＣＳヒストグラムに示されているのは、二次抗体のみで染色された細胞（グレーの点線）及び抗ＨＬＡ－Ｇ抗体で染色された細胞（黒の実線）である。下段には、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ－Ｇに結合したヒトＩＬＴ２－Ｆｃが、二次抗体のみで染色された細胞（グレーの点線）と比較して示されている（黒い点線）。ＪＥＧ３細胞をＨＬＡ－Ｇ抗体とプレインキュベートした場合のＩＬＴ２Ｆｃキメラ結合に対する影響を見ることができる（黒の実線）：ＨＬＡ－Ｇ－００３１及びＨＬＡ－Ｇ－００９０は、ＩＬＴ２－ＦｃキメラのＪＥＧ３細胞への結合のほぼ完全な阻害を示した。興味深いことに、２つの抗体００３９及び００４１は、細胞へのＩＬＴ２：ｆｃの結合を増加させることさえある。

【図5B】ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２ Ｆｃキメラの結合に対する市販／参照抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の影響：市販／参照抗ＨＬＡ－Ｇ抗体による細胞表面ＨＬＡ－Ｇの染色を、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートした種特異的二次抗体を使用することにより評価した（上段）。ＦＡＣＳヒストグラムに示されているのは、二次抗体のみで染色された細胞（グレーの点線）及び抗ＨＬＡ－Ｇ抗体で染色された細胞（黒の実線）である。下段には、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ－Ｇに結合したヒトＩＬＴ２Ｆｃキメラ（黒の点線）が、二次抗体のみで染色された細胞（グレーの点線）と比較して示されている。ＪＥＧ３細胞を参照抗体とプレインキュベートすることによるＩＬＴ２Ｆｃキメラ結合への影響を見ることができる（黒の実線）。試験された参照抗体はいずれも、ＩＬＴ２ＦｃキメラとＪＥＧ３細胞上の細胞表面ＨＬＡ－Ｇとの相互作用をブロックできなかった。

【図6A】異なるドナーで評価されたＴＮＦα産生の回復に対する抑制性抗ＨＬＡ－Ｇ抗体によるＨＬＡ－Ｇの遮断の影響。代表的な単球ドナーで評価された抗ＨＬＡＧ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００３１（＃００３１）、ＨＬＡ－Ｇ－００３９（＃００３９）、及びＨＬＡ－Ｇ－００４１（＃００４１）。

【図6B】異なるドナーで評価されたＴＮＦα産生の回復に対する抑制性抗ＨＬＡ－Ｇ抗体によるＨＬＡ－Ｇの遮断の影響。別の単球ドナーで評価された抗ＨＬＡＧ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０（＃００９０）］。

【図6C】異なるドナーで評価されたＴＮＦα産生の回復に対する抑制性抗ＨＬＡ－Ｇ抗体によるＨＬＡ－Ｇの遮断の影響。野生型ＪＥＧ－３細胞及びノックダウン変異体におけるＨＬＡＧ発現のウエスタンブロット分析。

【図7】抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４）の、細胞上に発現する天然又は組換えＨＬＡ－ＧへのＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ抗体の結合（ＦＡＣＳ分析による評価）

【図8】ＨＬＡＧ ＴＣＢを介したＴ細胞活性化（抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性ＴＣＢ抗体（Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４））

【図9】ＨＬＡＧ ＴＣＢを介したＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌（抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性ＴＣＢ抗体Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４）

【図10】抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性ＴＣＢ抗体（Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４）によるＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞死滅の誘導

【図11A-F】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な配置。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、代替的にＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含む場合がある。

【図11G-N】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な配置。（Ｇ、Ｋ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有し、かつ別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、代替的にＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含む場合がある。

【図11O-V】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な配置。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、代替的にＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含む場合がある。

【図11W-Z】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な配置。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図。黒い点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、代替的にＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含む場合がある。

【図12】抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性ＴＣＢ抗体（Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果

【発明を実施するための形態】

【0038】

発明の詳細な説明
本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ－Ｇ」、「ヒトＨＬＡ－Ｇ」は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）としても知られるＨＬＡ－Ｇヒト主要組織適合複合体、クラスＩ、Ｇを指す（例示的な配列番号３５）。典型的には、ＨＬＡ－Ｇは、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ又はβ２ｍ）と共にＭＨＣクラスＩ複合体を形成する。一実施態様では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇとβ２ミクログロブリンのＭＨＣクラスＩ複合体を指す。

【0039】

本明細書において使用される場合、「ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する」、「ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する」、「ヒトＨＬＡ－Ｇに対して結合する」抗体又は「抗ＨＬＡ－Ｇ抗体」は、ヒトＨＬＡ－Ｇ抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対し、５．０ｘ１０^－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫ_Ｄ値、一実施態様では、１．０ｘ１０^－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫ_Ｄ値、一実施態様では、５．０ｘ１０^－８ｍｏｌ／ｌから１．０ｘ１０^－１３ｍｏｌ／ｌのＫ_Ｄ値の結合親和性で特異的に結合する抗体を指す。一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する。

【0040】

結合親和性は、例えばＨＬＡ－Ｇ細胞外ドメイン（例えばその天然に存在する３次元構造において）を含むコンストラクトを使用する、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。一実施態様では、結合親和性は、配列番号４３を含むＭＨＣクラスＩ複合体を含む例示的な可溶性ＨＬＡ－Ｇを使用する標準的な結合アッセイにより決定される。

【0041】

ＨＬＡ－Ｇは、規則的なＭＨＣ Ｉの折り畳みを有し、２つの鎖からなる：鎖１は３つのドメイン、すなわちアルファ１、アルファ２及びアルファ３からなる。アルファ１及びアルファ２ドメインは、２つのアルファヘリックスが隣接するペプチド結合溝を形成する。小さなペプチド（およそ９ｍｅｒｓ）は、他のＭＨＣ Ｉタンパク質と同様にこの溝に結合することができる。鎖２は、種々の他のＭＨＣ Ｉタンパク質と共有されるベータ２ミクログロブリンである。

【0042】

ＨＬＡ－Ｇは、機能的に活性な複合オリゴマー構造を形成することができる（Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729）。ジスルフィド結合二量体は、２つのＨＬＡ－Ｇ分子のＣｙｓ４２間に形成される。（Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三量体及び四量体複合体は、例えばKuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729, Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50及びT Gonen-Gross et al., J Immunol 171 (2003)1343-1351にも記載されている。）ＨＬＡ－Ｇは、他のほとんどのＭＨＣクラスＩ分子とは異なり、いくつかの遊離システイン残基を有する。Boyson et al., Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002)は、ＨＬＡ－Ｇ５の組換え可溶性形態が、分子間Ｃｙｓ４２－Ｃｙｓ４２ジスルフィド結合を有するジスルフィド結合した二量体を形成することができることを報告した。さらに、ＨＬＡ－Ｇ１の膜結合形態は、ＨＬＡ－Ｇを内因的に発現するＪｅｇ３細胞株の細胞表面上にジスルフィド結合二量体を形成することもできる。ＨＬＡ－Ｇ１及びＨＬＡ－Ｇ５のジスルフィド結合二量体形態は、栄養膜細胞の細胞表面にも見出されている（Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006)）。

【0043】

ＨＬＡ－Ｇは、胎盤の栄養膜細胞層に優勢に発現される。複数の腫瘍（膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃、及び卵巣を含む）は、ＨＬＡ－Ｇを発現する（Lin, A. et al., Mol Med. 21 (2015) 782-791; Amiot, L., et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417-431）。この発現はまた、炎症性疾患、ＧｖＨＤ及びがんのような病的状態に関連付けられることが報告されている。ＨＬＡ－Ｇの発現は、がんの予後不良と関連していると報告されている。腫瘍細胞は、ＨＬＡ－Ｇ発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することにより、宿主の免疫監視から逃れる。

【0044】

ＨＬＡ－Ｇの場合、７つのアイソフォームが存在し、そのうちの３つは分泌形態であり、４つは膜結合形態である（図１に模式的に示す）。ＨＬＡ－Ｇの最も重要な機能的アイソフォームには、ｂ２－ミクログロブリン結合ＨＬＡ－Ｇ１及びＨＬＡ－Ｇ５が含まれる。しかしながら、これらのアイソフォームの免疫寛容原性の免疫学的効果は異なっており、かつリガンドの形態（単量体、二量体）及びリガンド－受容体相互作用の親和性に依存する。

【0045】

ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、標準の分子生物学の技術を用いて生成することができる。ＨＬＡ－Ｇアイソフォームの核酸配列は当技術分野で知られている。例えばＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ３５９８１８を参照されたい。

【0046】

ＨＬＡ－Ｇ異性型は、ＩＬＴ、特にＩＬＴ２、ＩＬＴ４、又はこれらの組み合わせを介したシグナル伝達を促進する。

【0047】

ＩＬＴ：ＩＬＴは、免疫細胞の活性化の調節に関与し、免疫細胞の機能を制御する活性化及び抑制性受容体のＩｇ型を表す（Borges, L., et al., Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999)）。ＩＬＴは、以下の３つのグループに分類される：（ｉ）細胞質の免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、抑制性シグナルを伝達する抑制性のもの（ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、及びＬＩＲ８）；（ｉｉ）膜貫通ドメインに短い細胞質尾部と荷電アミノ酸残基とを含み（ＩＬＴ１、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、及びＬＩＲ６アルファ）、Ｆｃ受容体の結合共通ガンマ鎖の細胞質免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を通して活性化シグナルを送達する活性化型のもの；及び（ｉｉｉ）膜貫通ドメインを欠く可溶性分子ＩＬＴ６。最近の研究の多くは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＩＬＴの免疫調節性の役割を強調している。ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、及びＩＬＴ４受容体といった、最も特徴づけられた免疫抑制性受容体は、骨髄及び形質細胞腫ＤＣに優勢に発現される。ＩＬＴ３及びＩＬＴ４は、未成熟ＤＣを、ＩＬ－１０、ビタミンＤ３、又はサプレッサーＣＤ８ Ｔ細胞を含む既知の免疫抑制因子に曝露することにより上方制御される（Chang, C. C., et al., Nat Immunol, 3:237-243 (2002)）。ＤＣ上におけるＩＬＴの発現は、炎症刺激、サイトカイン、及び増殖因子によって厳密に制御され、ＤＣ活性化に続いて下方制御される（Ju, X. S., et al., Gene, 331:159-164 (2004)）。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体の発現は、ヒストンアセチル化によって高度に調節され、このことは、細胞の骨髄細胞系列に限定的な、厳密に制御された遺伝子発現に寄与している（Nakajima, H., J Immunol, 171:6611-6620 (2003)）。

【0048】

抑制性受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４の関与は、単球のサイトカイン及びケモカイン分泌／放出プロファイルを変化させ、Ｆｃ受容体シグナル伝達を阻害することができる（Colonna, M., et al. J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999)）。ＤＣ上でのＩＬＴ３の役割及び機能は、Ｓｕｃｉｕ－Ｆｏｃａのグループにより詳細に記載されている（Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005)）。ＩＬＴ３のリガンドは未知であるが、ＩＬＴ４は、ＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－Ｇ）の第３のドメインに結合し、ＭＨＣクラスＩの結合についてＣＤ８と競合することが知られている（Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003)）。複数の阻害性ＩＬＴ受容体の優先的リガンドは、ＨＬＡ－Ｇである。ＨＬＡ－Ｇは、母胎胎児間免疫寛容性と、免疫認識及び破壊から腫瘍細胞が逃れる機序とに潜在的な役割を果たしている（Hunt, J. S., et al., Faseb J, 19:681-693 (2005)）。ＨＬＡ－Ｇ－ＩＬＴ相互作用によるＤＣ機能の調節は、ＤＣの生物学における重要な経路である可能性が極めて高い。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を高度に発現するヒト単球由来のＤＣは、ＨＬＡ－Ｇで処理し、同種異系のＴ細胞で刺激したとき、依然として安定な免疫寛容原性様表現型を維持し（ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６ｌｏｗ、ＨＬＡ－ＤＲｌｏｗ）、Ｔ細胞アネルギーを誘導する能力を有することが決定された（Ristich, V., et al., Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005)）。さらに、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を高度に発現するＨＬＡ－ＧとＤＣとの相互作用は、ＭＨＣクラスＩＩの提示経路に関与する複数の遺伝子の下方制御をもたらした。リソソームのチオール還元酵素である、プロフェッショナルなＡＰＣにより豊富に発現されるＩＦＮ－ガンマ誘導型リソソームチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）は、ＨＬＡ－Ｇ－修飾ＤＣにおいて大幅に減少した。選択抗原に対するｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞応答が、標的遺伝子破壊後にＧＩＬＴを欠く動物において減少したため、プライムされたＣＤ４＋Ｔ細胞のレパートリーはＧＩＬＴのＤＣ発現により影響され得る（Marie, M., et al., Science, 294:1361-1365 (2001)）。ＤＣ上でのＨＬＡ－Ｇ／ＩＬＴ相互作用は、細胞表面へのＭＨＣクラスＩＩ分子の集合と輸送を妨害し、このことは、構造的に異常なＭＨＣクラスＩＩ分子の提示又は発現の効率を低下させ得る。ＨＬＡ－Ｇは、ＩＬＴ阻害性受容体を高度に発現するヒト単球由来のＤＣ上での不変鎖（ＣＤ７４）、ＨＬＡ－ＤＭＡ、及びＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子の転写を著しく減少させることが決定された（Ristich, V., et al; Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005)）。

【0049】

ＫＩＲ２ＤＬ４はＨＬＡ－Ｇを発現する細胞に結合するため、ＨＬＡ－Ｇの別の受容体はＫＩＲ２ＤＬ４である（米国特許出願公開第２００３２３２０５１号；Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28 (1998) 1980; Rajagopalan, S. and E. O. Long. ［Ｊ Exp Med 191 (2000) 2027に正誤表］ J Exp Med 189 (1999) 1093; Ponte, M. et al. PNAS USA 96 (1999) 5674）。ＫＩＲ２ＤＬ４（２ＤＬ４とも呼ぶ）は、活性化受容体及び抑制性受容体の両方と構造的特徴を共有するＫＩＲのファミリーメンバー（ＣＤ１５８ｄとも命名される）である（Selvakumar, A. et al. Tissue Antigens 48 (1996) 285）。２ＤＬ４は、抑制機能を示唆する細胞質ＩＴＩＭと、活性化ＫＩＲに典型的な特徴である、膜貫通領域において正に荷電したアミノ酸とを有する。他のクローン的に分布したＫＩＲとは異なり、２ＤＬ４はすべてのＮＫ細胞によって転写される（Valiante, N. M. et al. Immunity 7 (1997) 739; Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28 (1998) 1980; Rajagopalan, S. and E. O. Long. ［J Exp Med 191 (2000) 2027に正誤表］ J Exp Med 189 (1999) 1093）。

【0050】

ＨＬＡ－Ｇは、細胞傷害性Ｔ細胞上のＣＤ８（Sanders et al, J. Exp. Med., 1991）と相互作用し、活性化されたＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞においてＣＤ９５を介したアポトーシスを誘導することも示されている（Fournel et al, J. Immun., 2000）。細胞傷害性Ｔ細胞の除去のこのメカニズムは、妊娠、炎症性疾患、及びがんにおける免疫逃避及び寛容の誘導のメカニズムの１つに報告されている（Amodio G. et al, Tissue Antigens, 2014）。

【0051】

本明細書において使用されるとき、配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体；配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体、配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体、配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体「と交差反応しない」又は「に特異的に結合しない」抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、これらのカウンター抗原のいずれにも実質的に結合しない抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を指す。一実施態様では、配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体；配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体、配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体、及び／又は配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体「と交差反応しない」又は「に特異的に結合しない」抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、５．０ｘ１０^－６ｍｏｌ／ｌ以上（それ以上の結合親和性が検出できなくなるまで）のＫ_Ｄ値の結合親和性での非特異的結合しか示さない抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を指す。結合親和性は、それぞれの抗原、すなわち、配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体；配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体、配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体、及び／又は配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に対して、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）といった標準の結合アッセイを用いて決定される。アッセイの設定並びに抗原の構築／調製は、実施例に記載する。

【0052】

用語「ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）上のＨＬＡＧに対するＩＬＴ２の結合を阻害する」とは、例えば実施例６に記載されているようなアッセイにおける組換えＩＬＴ２の結合相互作用の阻害を指す。

【0053】

用語「ＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答の回復」又は「ＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答を回復する」とは、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞、特にＪＥＧ－３細胞との共培養における単球によるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性ＴＮＦアルファ産生の回復を指す。したがって、本発明の抗体は、未処理の共培養されたＪＥＧ－３細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｇ発現ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）及び単球のリポ多糖（ＬＰＳ）刺激共培養物におけるＴＮＦアルファのＨＬＡＧ特異的放出を回復する（未処理の共培養物を０％陰性基準とし、単球のみの培養物を１００％陽性基準とし、ＴＮＦアルファセクションがいかなるＨＬＡ－Ｇ／ＩＬ－Ｔ２特異的効果によっても抑制されていないものとする（実施例７を参照のこと））。この文脈において、「ＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答」は、ＪＥＧ－３細胞におけるＨＬＡ－Ｇ発現に起因する単球の免疫抑制を指す。対照的に、本発明の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＨＬＡ－Ｇノックアウトを伴うＪＥＧ３細胞と共培養された単球による免疫応答を回復することができない。他の市販の抗ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇノックアウトを伴うＪＥＧ３細胞と共培養された単球によってＴＮＦアルファを誘導できるため、これらの抗体による非ＨＬＡ－Ｇ特異的ＴＮＦアルファ放出がある。

【0054】

本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗体との相互作用時にＴ細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗体とＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４、配列番号７６；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号７７を参照）。

【0055】

「ＣＤ３」は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ３を指す。用語は、「完全長」の、未処理のＣＤ３と、細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３とを包含する。この用語はまた、ＣＤ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。一実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の受入番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４に示されている。配列番号７６も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号７７も参照のこと。

【0056】

本明細書において使用される場合、「ヒトＣＤ３に結合する」、「ヒトＣＤ３に特異的に結合する」、「ヒトｖに対して結合する」抗体又は「抗ＨＬＡ－Ｇ抗体」は、ヒトＣＤ３抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対し、５．０ｘ１０^－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫ_Ｄ値、一実施態様では、１．０ｘ１０^－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫ_Ｄ値、一実施態様では、５．０ｘ１０^－８ｍｏｌ／ｌから１．０ｘ１０^－１３ｍｏｌ／ｌのＫ_Ｄ値の結合親和性で特異的に結合する抗体を指す。一実施態様では、抗体は、配列番号７６を含むＣＤ３に結合する。

【0057】

結合親和性は、例えばＨＬＡ－Ｇ細胞外ドメイン（例えばその天然に存在する３次元構造において）を含むコンストラクトを使用する、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。一実施態様では、結合親和性は、配列番号７６を含む例示的なＣＤ３を使用する標準的な結合アッセイにより決定される。

【0058】

本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で知られており、本明細書に記載される。

【0059】

本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。得られた抗体ＨＬＡＧ－００３１のヒト化変異体のための好ましいＶＨアクセプターヒトフレームワークは、ＨＵＭＡＮ＿ＩＧＨＶ１－３である。得られた抗体ＨＬＡＧ－００３１のヒト化変異体に好ましいＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＨＵＭＡＮ＿ＩＧＫＶ１－１７である（Ｖドメイン、位置Ｒ４６Ｆに１つの追加の逆突然変異、Ｋａｂａｔ番号付け）。

【0060】

本明細書での用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

【0061】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。

【0062】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックする。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。

【0063】

用語「二重特異性」は、抗体が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗体は２つの抗原結合部位を含み、それらの各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。

【0064】

本明細書において使用される場合、用語「価」は、抗体中における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、用語「抗原に対する一価の結合」は、抗体中の抗原に対して特異性である１つの（かつ１つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。

【0065】

「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗体の部位、すなわち、１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。

【0066】

本明細書において使用される場合、用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合している実体（例えば、第２の抗原結合部分）を、標的部位、例えば、抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞に向けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原を介したシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、後述でさらに定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、当技術分野で知られている抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかを含む。

【0067】

本明細書において使用される場合、用語「抗原決定基」又は「抗原」は、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。

【0068】

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。

【0069】

抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩＧＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0070】

薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。

【0071】

本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶと定義される。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現によって宿主細胞によって産生される抗体は、完全長重鎖を含み得るか、又は完全長重鎖の切断された変異体（本明細書では「切断された変異型重鎖」とも呼ぶ）を含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とリジン（Ｋ４４７）は、存在することもしないこともあり得る。Ｆｃドメイン（又は本明細書で定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、他に示されない限り、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドなしで示される。本発明の一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗体に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗体に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載される薬学的組成物などの本発明の組成物は、本発明の抗体又は二重特異性抗体の集団を含む。抗体又は二重特異性抗体の集団は、完全長重鎖を有する分子及び切断された変異型重鎖を有する分子を含み得る。抗体又は二重特異性抗体の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異型重鎖を有する分子との混合物からなることができ、ここで、抗体又は二重特異性抗体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断された変異型重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗体の集団を含む組成物は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗体を含む。本発明の一実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗体の集団を含む組成物は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗体を含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子から構成される抗体又は二重特異性抗体の集団；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；及び追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子を含む。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991（上記参照）に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

【0072】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４に現れる。

【0073】

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0074】

「融合した」とは、成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されていることを意味する。

【0075】

「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。

【0076】

「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置換されている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成されるペプチド鎖とを含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。

【0077】

それとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットのＦａｂ分子を意味し、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成される重鎖と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成される軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異型子孫が含まれる。

【0078】

「ヒト」抗体は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0079】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行われる。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3のサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループＩＩＩである。

【0080】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定数領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。

【0081】

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／又は抗原に接触する残基（「抗原コンタクト（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｔａｃｔ）」を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５（Ｈ１）、５０－６３（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。

【0082】

特に明記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上記のＫａｂａｔら（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従って番号付けされている。

【0083】

「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。

【0084】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。

【0085】

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％以上又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman, S., et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。

【0086】

「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。

【0087】

「抗ＨＬＡ－Ｇ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するこのような核酸分子が含まれる。

【0088】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般に少量で存在する可能性のある変異体抗体を除いて、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。

【0089】

「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、特に、会合が望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）のそれぞれに対して行われる別個の修飾を含み、ここで、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電的に有利にすることができる。したがって、各サブユニットに融合したさらなる成分（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で非同一である可能性がある、（ヘテロ）二量体化が、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こる。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。

【0090】

「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちのいずれかに割り当てることができる。

【0091】

「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。

【0092】

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。

【0093】

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定の％アミノ酸配列同一性を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。

【0094】

用語「薬学的製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。

【0095】

「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中の活性成分以外の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、バッファー、添加剤、安定剤又は保存剤を含む。

【0096】

本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0097】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えばKindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol.150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628)を参照。

【0098】

本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と言う。

【0099】

Ｉ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、本明細書に記載の多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を第１の抗原結合部位／部分として使用するという知見に部分的に基づいている。これらの抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＨＬＡ－Ｇの特定のエピトープに高い特異性で結合し（他の種やヒトＨＬＡ－Ａコンセンサス配列との交差反応性はない）、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＨＬＡ－Ｇへの結合を特異的に阻害する能力を有する。それらは、例えば、ＩＬＴ２のＨＬＡ－Ｇへの結合を阻害し、適切な刺激（リポ多糖（ＬＰＳ）など）でＴＮＦアルファなどの免疫調節性サイトカインの分泌を増加させることにより、ＨＬＡ－Ｇ媒介性の単球の免疫抑制を特異的に元に戻し、ＨＬＡＧノックアウト細胞に対する影響を示さない。

【0100】

同時に、本明細書に記載の多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、第２の抗原結合部位（部分）とＴ細胞活性化抗原（特にＣＤ３、特にＣＤ３イプシロン）に結合する。

【0101】

Ａ．例示的な多重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体
本発明の一実施態様では、多重特異性抗体は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であり、これは、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む。

【0102】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分抗体は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；
を含み、Ｔ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分は、ヒトＣＤ３に結合し、かつ
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含む。

【0103】

本発明の一実施態様では、第１の抗原結合部分は、
Ａ）
配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分は、
Ｃ）
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。

【0104】

本発明の一実施態様では、
第１の抗原結合部分は、配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分は、
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。

【0105】

本発明の一実施態様では、
第１の抗原結合部分は、配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分は、
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。

【0106】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含む。

【0107】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含み；かつ
ここで、抗体は、配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）。

【0108】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含み；
ここで、抗体は、配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合し（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）；かつ／又は
該抗体は以下の特性によって独立して特徴づけられる：
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、
ａ）配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｅ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｆ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｉ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｊ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し（例えば実施例４ｃを参照）；かつ／あるいは
ｋ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答（例えば、抑制された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ放出）を回復する。

【0109】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0110】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み；かつ
ここで、抗体は、配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）。

【0111】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含み；
ここで、抗体は、配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合し（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）；かつ／又は
該抗体は以下の特性によって独立して特徴づけられる：
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、
ａ）配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｅ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｆ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｉ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｊ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し（例えば実施例４ｃを参照）；かつ／あるいは
ｋ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答（例えば、抑制された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ放出）を回復する。

【0112】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0113】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含み；かつ
ここで、抗体は、配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）。

【0114】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含み；
ここで、抗体は、配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合し（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）；かつ／又は
該抗体は以下の特性によって独立して特徴づけられる：
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、
ａ）配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｅ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｆ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｉ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｊ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し（例えば実施例４ｃを参照）；かつ／あるいは
ｋ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答（例えば、抑制された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ放出）を回復する。

【0115】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0116】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含み；かつ
ここで、抗体は、配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）。

【0117】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含み；
ここで、抗体は、配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合し（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）；かつ／又は
該抗体は以下の特性によって独立して特徴づけられる：
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、
ａ）配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｅ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｆ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｉ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｊ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し（例えば実施例４ｃを参照）；かつ／あるいは
ｋ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答（例えば、抑制された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ放出）を回復する。

【0118】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0119】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に（一実施態様では、配列番号７６を含むＣＤ３に）結合する第２の結合部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。

【0120】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に（一実施態様では、配列番号７６を含むＣＤ３に）結合する第２の結合部分は、
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む。

【0121】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含む。

【0122】

一実施態様では、ヒトＨＬＡ－Ｇに（一実施態様では、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に）結合する第１の結合部分は、
ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含み；
ここで、抗体は、配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む抗体と実質的に同じ結合親和性で（一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で１０分の１に減少し、一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、該抗体と比較して最大で５分の１に減少する）、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する（表面プラズモン共鳴アッセイで決定された）；

【0123】

多重特異性抗体
好ましい実施態様では、本明細書で提供される多重特異性抗体は二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の１つはＨＬＡ－Ｇに対してであり、その他（２つ以上）の特異性はＣＤ３に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇの２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0124】

多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature305: 537 (1983)を参照）及び「ノブ・イン・ホール」工学（例えば米国特許第５７３１１６８号及びAtwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号参照）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖の誤対合の問題を回避するための共通軽鎖技術を使用すること（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。

【0125】

例えば「オクトパス抗体」又はＤＶＤ－Ｉｇなど、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば国際公開第２００１／７７３４２号及び同第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。また、二重特異性抗体又はその抗原結合断片には、ＨＬＡ－Ｇ及び別の異なる抗原、又はＨＬＡ－Ｇの２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」が含まれる（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照）。

【0126】

多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）、又は完全なＦａｂアーム（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号、並びにSchaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191及びKlein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20を参照）を交換することによっても提供され得る。非対称のＦａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン接触面に導入して正確なＦａｂペアリングを導くことによって設計することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照のこと。

【0127】

多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれている（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106を参照）。

【0128】

本明細書にも含まれる特定の型の多重特異性抗体は、標的細胞を死滅するためにＴ細胞を再標的化するための、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のインバリアントな活性化成分、例えばＣＤ３と、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原とに同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、特に結合特異性の一方がＨＬＡ－Ｇに対するものであり、他方がＣＤ３に対するものである二重特異性抗体である。

【0129】

この目的に有用である可能性のある二重特異性抗体フォーマットの例には、限定されないが、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合される、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号、Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011))；ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)）；ダイアボディフォーマットに基づくがさらなる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴として有する「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)）、及び全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に概説）が含まれる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、同第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498に記載されている。

【0130】

ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体
本発明はまた、二重特異性抗体、すなわち、２つの異なるの抗原決定基（第１及び第２の抗原）に特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗体を提供する。

【0131】

彼らが開発したＨＬＡ－Ｇ抗体に基づいて、本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ及びさらなる抗原、特にＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗体を開発した。

【0132】

実施例に示されるように、これらの二重特異性抗体は、良好な効力及び低い毒性を含む、多くの注目すべき特性を有する。

【0133】

したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原がＨＬＡ－Ｇである第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分とを含む二重特異性抗体を提供し、ここで、二重特異性抗体は以下の特徴のいずれかを有する。

【0134】

本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を特異的に誘導する。いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を特異的に誘導する。より具体的な実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を特異的に誘導する。

【0135】

一実施態様では、二重特異性抗体によるＴ細胞媒介性死滅の誘導は、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞を使用して決定される。

【0136】

一実施態様では、二重特異性抗体によるＴ細胞の活性化は、特にフローサイトメトリーによって、特にＨＬＡ－Ｇ発現細胞の存在下での二重特異性抗体とのインキュベーション後のＴ細胞、特にペプチドパルスＴ２細胞によるＣＤ２５及び／又はＣＤ６９の発現を測定することによって決定される。

【0137】

特定の実施態様では、二重特異性抗体によるＴ細胞媒介性死滅の誘導は、以下のように決定される。

【0138】

ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を活性化する抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡＧ（ＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ）でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞で試験する。Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞上の細胞表面活性化マーカーＣＤ２５及び初期活性化マーカーＣＤ６９のＦＡＣＳ分析によって評価する。簡潔には、ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地チューブ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用した密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離する。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ細胞を、９６ウェルのＵ底プレートに１０：１の比率で播種する。次に、共培養物を、実施例１０に記載されるように異なる濃度のＨＬＡＧ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％のＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートする。翌日、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーによって測定する。

【0139】

フローサイトメトリー分析において、細胞を、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５６５３１０）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃９０１２－０２５７）、及びＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５５５３３）により４℃で染色する。簡潔には、抗体を２分の１の濃度に希釈し、２５μｌの抗体希釈液を２５μｌの予め洗浄された共培養液と共に各ウェルに添加する。細胞を４℃で３０分間染色し、２００μｌ／ウェルの染色バッファーで２回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレットを２００μｌの染色バッファーに再懸濁し、２μｇ／ｍｌの最終濃度で、生死識別のためにＤＡＰＩで染色する。次に、試料を、ＢＤ ＬＳＲフローサイトメーターを使用して測定する。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ．１０．１ソフトウェアを使用して行われる。平均蛍光強度の幾何平均がエクスポートされ、アイソタイプと抗体の幾何平均の比率が計算される。

【0140】

本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。より具体的な実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。

【0141】

一実施態様では、二重特異性抗原結合は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下で、Ｔ細胞媒介性死滅を有意に誘導しないか、又はＴ細胞を活性化しない。一実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でのＴ細胞媒介性死滅の誘導又はＴ細胞の活性化のためのＥＣ５０よりも、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも１５分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも７５分の１、又は少なくとも１００分の１のＥＣ５０で、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下で、Ｔ細胞媒介性死滅を誘導し、及び／又はＴ細胞を活性化する。

【0142】

本発明の特定の実施態様によれば、二重特異性抗体に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子（すなわち、それぞれ可変及び定常ドメインを含む重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトの分子である。特定の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。さらに別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。

【0143】

好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つはクロスオーバーＦａｂ分子である。そのような修飾は、異なるＦａｂ分子からの重鎖及び軽鎖の誤対合を減少させ、それにより、組換え生産における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を向上させる。本発明の二重特異性抗体に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換によっても、二重特異性抗体の調製には、誤対合した重鎖と軽鎖の間のいわゆるベンスジョーンズ型相互作用に起因する特定の副産物を含み得る（Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191）を参照）。異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させ、したがって所望の二重特異性抗体の純度及び収率を向上させるために、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＨＬＡ－Ｇ）に結合するＦａｂ分子（複数可）、又は第２の抗原（ＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合するＦａｂ分子の、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入することができる。これについては後述する。荷電修飾は、二重特異性抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば図１１Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｊに示される）、又は二重特異性抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ｄ－Ｆ、Ｋ－Ｎに示される）において行われる（ただし両方ではない）。特定の実施態様では、荷電修飾は、二重特異性抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（特定の実施態様では、第１の抗原、すなわちＨＬＡ－Ｇに結合するもの）において行われる。

【0144】

本発明による特定の実施態様では、二重特異性抗体は、第１の抗原（すなわち、ＨＬＡ－Ｇ）、及び第２の抗原（例えば、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３）に同時に結合することができる。一実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－ＧとＴ細胞活性化抗原を同時に結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらに特定の実施態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特にＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様では、ＨＬＡ－Ｇへの同時結合なしに、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３への二重特異性抗体の結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。

【0145】

一実施態様では、二重特異性抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞へ再指向することができる。特定の実施態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。

【0146】

特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞、特にＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

【0147】

第１の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇ（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇに結合する２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定のそのような実施態様では、これらの抗原結合部分のそれぞれは、同じ抗原決定基に結合する。さらに特定の実施態様では、これらの抗原結合部分はすべて同一であり、すなわち、それらは、本明細書に記載されるようにＣＨ１及びＣＬドメインにおける同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む（もしあれば）。一実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇに結合する２つ以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。

【0148】

特定の実施態様では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。

【0149】

代替の実施態様では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。そのような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。

【0150】

ＨＬＡ－Ｇ結合部分は、二重特異性抗体を標的部位に、例えばＨＬＡ－Ｇを発現する特定の型の腫瘍細胞に指向させることができる。

【0151】

二重特異性抗体の第１の抗原結合部分は、科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。

【0152】

したがって、一態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供し、ここで、第１の抗原はＨＬＡ－Ｇである。

【0153】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含む。

【0154】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する単離された抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
Ａ）
ｉ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｉｉ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含むか；あるいは
ｉｉｉ） 配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｃ）
ｉ） 配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｄ）
ｉ） 配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む。

【0155】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。

【0156】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。

【0157】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。

【0158】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。

【0159】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
ｉ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｉｉ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。

【0160】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
ｉ）配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含む。

【0161】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む。

【0162】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含む。

【0163】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む。

【0164】

本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する（単離された）抗体であり（一実施態様では、抗体は、配列番号４３を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）、ここで、抗体は
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含む。

【0165】

一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号５１及び５２（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号５３（ヒトＩｇＧ_１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列、特に配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子においては、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含み得る。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５３のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得る。

【0166】

Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。

【0167】

特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原、特にヒトＣＤ３に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。そのような実施態様では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。二重特異性抗体に含まれる、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に結合する２つ以上の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。

【0168】

代替的な実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様では、第１の抗原（すなわち、ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。二重特異性抗体に含まれる第２の抗原に結合する２つ以上の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＣＤ３に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。

【0169】

いくつかの実施態様では、第２の抗原は、Ｔ細胞活性化抗原（本明細書では「Ｔ細胞活性化抗原結合部分、又はＴ細胞活性化抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）である。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる１つを超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化抗原に対する一価の結合を提供する。

【0170】

特定の実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号７６）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号７７）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に交差反応性（すなわち、特異的に結合する）である。いくつかの実施態様では、２番目の抗原は、ＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。

【0171】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。

【0172】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメインを含む。

【0173】

いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分はヒト化抗体である（に由来する）。一実施態様では、ＶＨはヒト化ＶＨであり、かつ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、上記の実施態様のいずれかにあるようなＣＤＲを含み、さらに、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。

【0174】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。

【0175】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0176】

一実施態様では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号５１及び５２（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号５３（ヒトＩｇＧ_１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列、特に配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子においては、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含み得る。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号５３のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得る。

【0177】

いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子である（すなわち、そのような実施態様によれば、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。そのような一実施態様では、第１の（及び存在する場合は第３の）抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、第２の抗原（例えば、ＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する１つを超えない抗原結合部分が二重特異性抗体に存在する（すなわち、二重特異性抗体は、第２の抗原に対する一価の結合を提供する）。

【0178】

荷電修飾
本発明の二重特異性抗体は、その中に含まれるＦａｂ分子に、特にそれらの結合アームの１つ（又は３つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合、２つ以上）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重特異性抗体の生成において生じ得る、適合しない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンスジョーンズ型副産物）を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１５０４４４７、特にその中の例も参照されたい）。望ましくない副産物、特にそれらの結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗体において生じるベンスジョーンズ型副産物と比較した場合の所望の二重特異性抗体の比率は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって（本明細書では「荷電修飾」と呼ばれることもある）改善することができる。

【0179】

したがって、二重特異性抗体の第１及び第２の抗原結合部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分の一方（特に第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き替えられているいくつかの実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に帯電したアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負に帯電したアミノ酸により置換されるているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；或いは
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に帯電したアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負に帯電したアミノ酸により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0180】

二重特異性抗体は、ｉ）及びｉｉ）で述べた両方の修飾を含まない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合部位の定数ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置換されていない（すなわち、未交換のままである）。

【0181】

より具体的な実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；或いは
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0182】

１つのそのような実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0183】

さらなる実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0184】

特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0185】

より特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0186】

さらに特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0187】

特定の実施態様では、上記実施態様によるアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われる場合、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。

【0188】

代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。このような特定の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。

【0189】

したがって、一実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0190】

さらなる実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0191】

さらに別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0192】

一実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0193】

別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0194】

特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、
Ｉ） ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ＩＩ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって、
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含み；かつ
ここで、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって（特定の実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）
第２の抗原結合部分を含む。

【0195】

特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、
Ｉ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分は、
Ａ）
ｉ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｉｉ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含むか；あるいは
ｉｉｉ） 配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｃ）
配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｄ）
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む
Ｆａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ＩＩ） ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含み；かつ
ここで、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって（特定の実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）
第２の抗原結合部分を含む。

【0196】

二重特異性抗体フォーマット
本発明による二重特異性抗体の成分は、様々な構成で互いに融合させることができる。例示的な配置を図１１に示す。

【0197】

特定の実施態様では、二重特異性抗体に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。そのような実施態様では、第１、第２、第３などの抗原結合部分は、本明細書では、それぞれ、第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ばれ得る。

【0198】

一実施態様では、二重特異性抗体の第１及び第２の抗原結合部分は、任意にペプチドリンカーを介して互いに融合される。特定の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。１つのそのような実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。別のそのような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、あるいは（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施態様において、さらに第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、任意選択でペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。

【0199】

ＨＬＡ－Ｇなどの標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を有する二重特異性抗体（例えば、図１１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示される）は、特に、高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それにより、その利用可能性を低下させ得る。

【0200】

しかしながら、他の場合には、例えば、標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を含む二重特異性抗体であることが有利であろう（図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｉ、１１Ｊ、１１Ｍ、又は１１Ｎに示されている例を参照）。

【0201】

したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第３の抗原結合部分を含む。

【0202】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第１の抗原、すなわち、ＨＬＡ－Ｇに結合する。一実施態様では、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。

【0203】

特定の実施態様では、第３の抗原部分は、第１の抗原結合部分と同一である。

【0204】

二重特異性抗体の第３の抗原結合部分は、科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、第１の抗原結合部分及び／又はＨＬＡ－Ｇに結合する抗体に関して、本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。

【0205】

一実施態様では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第３の抗原結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含む。

【0206】

一実施態様では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第３の抗原結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって；ここで、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって；ここで、ＶＬドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（１つの好ましい実施態様では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン
を含む。

【0207】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
Ａ）
ｉｖ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｖ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含むか；あるいは
ｖｉ） 配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｃ）
配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｄ）
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む。

【0208】

いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分はヒト抗体である（に由来する）。一実施態様では、ＶＨはヒトＶＨであり、かつ／又はＶＬはヒトＶＬである。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、上記の実施態様のいずれかにあるようなＣＤＲを含み、さらに、ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークを含む。

【0209】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。

【0210】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。

【0211】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0212】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0213】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0214】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0215】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、
配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0216】

一実施態様では、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号５１及び５２２（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号５３（ヒトＩｇＧ_１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列、特に配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子においては、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含み得る。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号５１のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得る。

【0217】

特定の実施態様では、第３及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。したがって、これらの実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、ドメインの同じ配置（すなわち、従来型又はクロスオーバー）を有する。さらに、これらの実施態様では、第３の抗原結合部分は、存在する場合、第１の抗原結合部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書で「電荷修飾」として記載されるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分のそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われるであろう。あるいは、前記アミノ酸置換は、第２の抗原結合部分（特定の実施態様ではＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされ得るが、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１ではなされないであろう。

【0218】

第１の抗原結合部分と同様に、第３の抗原結合部分は特に従来のＦａｂ分子である。しかしながら、第１及び第３の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（かつ第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）実施態様も考慮される。したがって、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。

【0219】

第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原部分は、ＨＬＡ－Ｇに結合し、かつ第２の抗原結合部分は、第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より具体的にはＣＤ３、最も具体的にはＣＤ３イプシロンに結合する。

【0220】

特定の実施態様では、二重特異性抗体は、第１サブユニットと第２サブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットは安定した会合が可能である。

【0221】

本発明による二重特異性抗体は、異なる配置を有することができ、すなわち、第１、第２（及び任意選択的に第３）の抗原結合部分は、異なる方法で互いに及びＦｃドメインに融合され得る。成分は、直接、又は好ましくは１つ若しくは複数の適切なペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。Ｆａｂ分子の融合がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に対してである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介する。

【0222】

いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、又はＦｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に融合され得る。特定のそのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。

【0223】

一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｇ及び１１Ｋに模式的に示されている（これらの例における第２の抗原結合ドメインは、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。

【0224】

別の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ａ及び１１Ｄに模式的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。特定の実施態様では、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ_１ヒンジ領域である。

【0225】

いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、又は（上記のように）Ｆｃドメインサブユニットの他の１つのＮ末端に融合され得る。特定のそのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。

【0226】

一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｈ及び１１Ｌに模式的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。

【0227】

いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、前記第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。

【0228】

特定のそのような実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、ここで、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｂ及び１１Ｅ（これらの例では、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）、図１１Ｊ及び１１Ｎ（これらの例では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。特定の実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ_１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。

【0229】

別のそのような実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、ここで、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｃ及び１１Ｆ（これらの例では、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）、及び図１１Ｉ及び１１Ｍ（これらの例では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ_１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。

【0230】

Ｆａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインの各サブユニットのＮ末端に融合している、二重特異性抗体の配置において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらに特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_４サブクラスの免疫グロブリンである。さらに特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様では、免疫グロブリンはヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。

【0231】

本発明の二重特異性抗体のいくつかでは、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の配置に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合し得るか、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合し得る。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、適合しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに減少させ、また、本発明のいくつかの二重特異性抗体の発現に必要なプラスミドの数を減少させる。

【0232】

抗原結合部分は、Ｆｃドメインに対して、又は直接に、又は１つ若しくは複数のアミノ酸（通常は約２～２０アミノ酸）を含むペプチドリンカーを介して互いに融合させることができる。ペプチドリンカーは当技術分野において知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又は_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、一実施態様では５から１００アミノ酸の長さ、さらなる実施態様では１０から５０アミノ酸の長さを有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）_ｎ又は（ＧｘＳ）_ｎＧ_ｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ_４Ｓ）_２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するための特に適切なペプチドリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を連結するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号１１０及び１１１）を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ_４Ｓ）_４を含む。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合される場合、それは、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに融合され得る。

【0233】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合している。

【0234】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合している。

【0235】

いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。

【0236】

これらの実施態様のいくつかにおいて、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。これら実施態様のその他では、二重特異性抗体は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））をさらに含む。

【0237】

これらの実施態様による二重特異性抗体はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））を含み得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合している。

【0238】

いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。

【0239】

これらの実施態様のいくつかにおいて、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。これら実施態様のその他では、二重特異性抗体は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））をさらに含む。

【0240】

これらの実施態様による二重特異性抗体はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））を含み得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合している。

【0241】

特定の実施態様では、二重特異性抗体はＦｃドメインを含まない。特定のそのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子、及び存在する場合は第３のＦａｂ分子はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子、及び存在する場合は第３のＦａｂ分子はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。

【0242】

そのような一実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１及び第２の抗原結合部分、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第１及び第２の抗原結合部分は両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｏ及び１１Ｓに模式的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。

【0243】

別のそのような実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１及び第２の抗原結合部分、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第１及び第２の抗原結合部分は両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｐ及び１１Ｔに模式的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。

【0244】

いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、二重特異性抗体は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、ここで、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｑ及び１１Ｕ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び抗原結合部分はそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１１Ｘ及び１１Ｚ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。

【0245】

いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、二重特異性抗体は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、ここで、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、二重特異性抗体は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような配置は、図１１Ｒ及び１１Ｖ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び抗原結合部分はそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１１Ｗ及び１１Ｙ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。

【0246】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。

【0247】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。

【0248】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。

【0249】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。

【0250】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）（ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））をさらに含む。

【0251】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）（ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））をさらに含む。

【0252】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））をさらに含む。

【0253】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））をさらに含む。

【0254】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＬ_（３）－ＣＨ１_（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１））、及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（３）－ＣＬ_（３））を含む。

【0255】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＶＨ_（３）－ＣＬ_（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１））、及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＨ１_（３））を含む。

【0256】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＨ１_（３）－ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１））、及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（３）－ＣＬ_（３））を含む。

【0257】

特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、ここで、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、これが次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ_（３）－ＣＬ_（３）－ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１））、及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体はさらに、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＨ１_（３））を含む。

【0258】

一実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１及び第２のサブユニットサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、あるいは
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0259】

特定の実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；及び
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0260】

別の実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１及び第２のサブユニットサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで
ａ）による第１の抗原結合部分及びｂ）による第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0261】

本発明による二重特異性抗体の異なる配置のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインのいずれかに存在し得る。好ましくは、そのような置換は、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われない。アミノ酸置換は、特に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ１が互いに置換されているＦａｂ分子を含む二重特異性抗体において行われる。

【0262】

特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる、本発明による二重特異性抗体の特定の実施態様では、第１（及び存在する場合、第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる、本発明による二重特異性抗体の他の実施態様では、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。いくつかの実施態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。

【0263】

一実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１及び第２のサブユニットサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで、ａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も具体的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、あるいは
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0264】

特定の実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；及び
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで、ａ）による第１の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も具体的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0265】

別の実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで、ａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も具体的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分及びｂ）による第２の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0266】

一実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＬＡＧに結合する第１の抗原結合部分であって、ここで、第１の抗原結合部分が、
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
及び
ｂ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって
ここで、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、
Ｅ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む第２の抗原結合部分；及び
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗体であって；
ここで、ａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も具体的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、あるいは
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、二重特異性抗体を提供する。

【0267】

特定の実施態様では、本発明は、以下を含む二重特異性抗体を提供する。

【0268】

特定の態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する、第１及び第３の抗原結合部分であって；ここで、第１の抗原はＨＬＡ－Ｇであり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって；ここで、第２の抗原はＣＤ３であり、かつ第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているＦａｂ分子であり、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗体であって、
ここで
ａ）による第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も具体的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつａ）による第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、
ａ）による第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分及びａ）による第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している
二重特異性抗体を提供する。

【0269】

本発明のこれらの態様による一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換され（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0270】

本発明のこれらの態様によるさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置換され（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換される）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置換される（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0271】

本発明のこれらの態様によるまた別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置換され（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置換され（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基によって置換される（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0272】

本発明のこれらの態様によるさらに別の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。

【0273】

本発明の特定の実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であり、ここで、該抗体は、配列番号６４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0274】

さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0275】

本発明の特定の実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であり、ここで、該抗体は、配列番号６８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0276】

さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0277】

本発明の特定の実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であり、ここで、該抗体は、配列番号７２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0278】

さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0279】

Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗体に関連して本明細書に記載されるＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく当てはまる。

【0280】

二重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、１つを超えないＦｃドメインを含む。

【0281】

一実施態様では、二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）におけるアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ_４抗体のＦａｂアームの交換をｉｎ ｖｉｖｏで減少させる（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。さらなる特定の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。

【0282】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明による二重特異性抗体は異なる抗原結合部分を含み、これらはＦｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合することができ、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは通常、２つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え生産における二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、二重特異性抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。

【0283】

したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。

【0284】

ヘテロ二量体化を実行するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のための複数の手法が存在し、それらについては例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に詳細な記載がある。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを構成する重鎖）が、それ自体とホモ二量体化できなくなるが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することを強制されるように（よって、第１と第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間にホモ二量体が形成されないように）両方とも相補的に操作される。重鎖ヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合及びベンスジョーンズ型副産物を低減する二重特異性抗体における重鎖－軽鎖修飾（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置換、及びＣＨ１／ＣＬ接触面における反対の電荷を持つ荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる代替法として考えられる。

【0285】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む。

【0286】

ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)、及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)に記載されている。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一か又は類似のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。

【0287】

したがって、特定の実施態様では、二重特異性抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。

【0288】

好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。

【0289】

好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。

【0290】

隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により改変することにより作り出すことができる。

【0291】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0292】

さらに別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置換され（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換される）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置換される（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。

【0293】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0294】

特定の実施態様では、第２の抗原（例えばＴ細胞活性化抗原）に結合する抗原結合部分は、（任意選択的に、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合する。理論に拘束されることを望まないが、Ｔ細胞活性化抗原などの第２の抗原に結合する抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、（さらに）Ｔ細胞活性化抗原に結合する２つの抗原結合部分を含む抗体の生成を最小化するであろう（２つのノブを含むポリペプチドの立体衝突）。

【0295】

ヘテロ二量体化を実行するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮されており、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。

【0296】

一実施態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン接触面内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することに基づいている。本発明の二重特異性抗体の１つの好ましい実施態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異体Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異体Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0297】

別の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらに、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0298】

別の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、さらにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0299】

一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅより選択されるアミノ酸変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0300】

一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２の位置に、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択される、さらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0301】

一実施態様では、例えば３６８及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸修飾を用いる、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されたヘテロ二量体化の手法が代替的に使用される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0302】

一実施態様では、上述のノブ・イントゥー・ホール技術をやはり使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0303】

一実施態様では、二重特異性抗体又はそのＦｃドメインはＩｇＧ_２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。

【0304】

別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面において、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。１つのそのような実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）によるアミノ酸置換を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換をさらに含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、さらに又は代替的に、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるアミノ酸置換を含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0305】

さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0306】

さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。

【0307】

一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0308】

Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、二重特異性抗体（又は抗体）に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び良好な組織－血液分布比を含む好ましい薬物動態特性を付与する。しかし同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、二重特異性抗体（又は抗体）の望ましくない標的化をもたらす可能性があるさらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、サイトカイン放出を引き起こす可能性があり、Ｔ細胞活性化特性（例えば、第２の抗原結合部分がＴ細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗体の実施態様において）及び二重特異性抗体の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化をもたらし、全身投与されると重篤な副作用をを引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の潜在的な破壊のため、二重特異性抗体（特に、第２の抗原結合部分がＴ細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗体）の有効性を低下させることすらある。

【0309】

したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。１つのそのような実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）は、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性を示し、かつ／又は、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を示す。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）が、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）の結合親和性の約７０％超、具体的には約８０％超、より具体的には約９０％超を示すときに達成される。

【0310】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減し、かつ／又はエフェクター機能が低減するように操作される。特定の実施態様では、二重特異性抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同一の１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１まで低減させ得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含む二重特異性抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より具体的には５％未満を示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は、Ｆｃドメインの前記非操作形態を含む二重特異性抗体）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を示すときに達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。特定の実施態様では、二重特異性抗体のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低減するように操作されている。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低減からなる群より選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、非操作Ｆｃドメイン（又は非操作Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。

【0311】

一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５，及びＰ３２９の群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。１つのそのような実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換、及びＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置でのさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５位におけるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的に、特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置換されており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置換されており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基によって置換されている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0312】

１つのそのような実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１のＦｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ_１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号はまた、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法を記載している。

【0313】

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低減させるために、一実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９におけるアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのようなＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されている。

【0314】

特定の実施態様では、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0315】

特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮグリコシル化は除かれている。１つのそのような実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７位におけるアミノ酸置換、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）酸によってアスパラギンを置換するアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0316】

上記及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されているＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものも含まれる（米国特許第６７３７０５６号及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。

【0317】

変異体Ｆｃドメインは、当技術分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。

【0318】

Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に測定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗体の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価することができる。

【0319】

Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗体のエフェクター機能は、当技術分野で知られている方法により測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。

【0320】

いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと）。

【0321】

ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で知られている方法を用いて行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照のこと）。

【0322】

さらなる態様では、上記の実施態様のいずれかによる抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、以下のセクション１～６に記載されるように、単独で又は組み合わせて、その特徴のいずれかを組み込むことができる。

【0323】

１．抗体親和性
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍから１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍから１０^－１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。

【0324】

１つの好ましい実施態様では、ＫＤは、２５℃で、約１０の反応単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（～０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃、及び約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０^ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）及び解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッテイングさせることによって計算される。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｄ／ｋａ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）比として計算する。例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０^６Ｍ^－１ｓ^－１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ^ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下において、２５℃、及びＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。

【0325】

２．抗体断片
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに以下に記載される他の断片が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 1299 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0326】

ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson, P.J. et al., Nat. Med.9 (20039 129-134)に記載されている。

【0327】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。

【0328】

抗体断片は、様々な技術により作製することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。

【0329】

３．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類（サルなど）由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片も含まれる。

【0330】

特定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。

【0331】

ヒト化抗体及びそれらの製造方法については、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説されており、さらに、例えばRiechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェイシング」を記述）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」を記述）；並びにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。

【0332】

ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られたフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照）を含む。

【0333】

４．ヒト抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に概説がある。

【0334】

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照のこと。例えばＸＥＮＯマウス^ＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号、Ｋ－Ｍ マウス（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物により生成される、インタクトな抗体のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変され得る。

【0335】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor, D., J. Immunol.133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P. et al.,J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体はまた、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental及びClinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。

【0336】

ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。その後、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。

【0337】

５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に総説され、さらに例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に記載される。

【0338】

特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローン化され、ファージライブラリーでランダムに再結合され、次いでWinter, G. et al。 Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されているように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734により記述されるように、ナイーブレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、免疫化することなく、広範囲の非自己及び自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーは、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して非常に可変性の高いＣＤＲ３領域をコード化し、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列を達成することによって合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第２００９／０００２３６０号を含む。

【0339】

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。

【0340】

６．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件として、最終構築物に到達させるために行うことができる。

【0341】

ａ）置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ又は複数アミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。例示的な変更を「例示的置換」と題して表１に示し、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記にさらに説明する。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

【0342】

【0343】

アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．

【0344】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。

【0345】

１つの種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0346】

改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされた残基（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、多様性が、様々な方法（例えば、エラーが発生しやすいＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーは、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向の手法を含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が多くの場合標的とされる。

【0347】

特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）を、ＨＶＲにおいて行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上で提供されている変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは変化しないか、又はわずか１つ、２つ若しくは３つのアミノ酸置換を含む。

【0348】

突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定されて、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代替的に又は追加的には、抗体と抗原の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを判定するためにスクリーニングされ得る。

【0349】

アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を延ばす酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。

【0350】

ｂ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。

【0351】

エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。

【0352】

ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。

【0353】

本発明の一実施態様では、このような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１である。別の実施態様では、このような抗体は、変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ又は／及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４である（番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックス、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991による）。

【0354】

増加した半減期を有し、胎児への母性ＩｇＧの移動を担う（Guyer et al., J. Immunol. et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記述されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ又は複数における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。

【0355】

また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関するDuncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0356】

ｃ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを生成するために、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせるために使用される。特定の実施態様では、次の残基のうちのいずれか１つ又は複数がシステインと置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。

【0357】

ｄ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってよい。抗体に結合しているポリマーの数は変化してよく、１つを超えるポリマーが結合している場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかを含めた（ただしこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。

【0358】

別の実施態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質性部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが抗体－非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。

【0359】

Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような実施態様では、宿主細胞は：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、同ベクターで形質転換されている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を作製する方法が提供される。

【0360】

抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

【0361】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は細菌内で産生され得る。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照のこと。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton, K.A., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), p. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され、さらに精製され得る。

【0362】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母の株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。

【0363】

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。

【0364】

植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。

【0365】

脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載された２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えばYazaki, P. 及びWu, A.M., Methods in Molecular Biology, 248巻, Lo, B.K.C. （編）, Humana Press, Totowa, NJ (2004), p. 255-268を参照。

【0366】

Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が同定されて、当技術分野で知られている様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性についてスクリーニング、又は特徴づけることができる。

【0367】

１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの既知の方法により、その抗原結合活性について試験される。

【0368】

別の態様では、ＨＬＡ－Ｇに対する結合についてＨＬＡ－Ｇ－００３２（配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含む）と競合する抗体を同定するために競合アッセイを使用することができる。本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに対する結合について、配列番号７のＶＨ配列の３つすべてのＨＶＲと配列番号８のＶＬ配列の３つすべてのＨＶＲとを含む抗ＨＬＡ－Ｇ抗体と競合する抗体である。特定の実施態様では、このような競合抗体は、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００３２によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。一実施態様では、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗体と同じＨＬＡ－Ｇ上のエピトープに結合する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。別の態様では、ＨＬＡ－Ｇに対する結合についてＨＬＡ－Ｇ－００３７（配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む）と競合する抗体を同定するために競合アッセイを使用することができる。本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ－Ｇに対する結合について、配列番号１５のＶＨ配列の３つすべてのＨＶＲと配列番号１６のＶＬ配列の３つすべてのＨＶＲとを含む抗ＨＬＡ－Ｇ抗体と競合する抗体である。特定の実施態様では、このような競合抗体は、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００３７によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。一実施態様では、配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗体と同じＨＬＡ－Ｇ上のエピトープに結合する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。抗体が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供されている。

【0369】

例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の標識された抗体（例えば、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００３２又はＨＬＡ－Ｇ．００３７）と、ＨＬＡ－Ｇに対する結合について第１の抗体と競合する能力について試験されている第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマの上清中に存在し得る。コントロールとして、固定化されたＨＬＡ－Ｇが、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＨＬＡ－Ｇへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＨＬＡ－Ｇに結合した標識の量が測定される。固定化されたＨＬＡ－Ｇに結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体が、ＨＬＡ－Ｇに対する結合について第１の抗体と競合していることを示す。Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照のこと。別の例示的競合アッセイに関し、実施例２（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競合アッセイ）を参照されたい。

【0370】

２．活性のアッセイ
一態様では、生物活性を有するその抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性は、例えば、Ｔ細胞を含む様々な免疫細胞の活性化及び／又は増殖を亢進させる能力を含み得る。例えばそれは、免疫調節性サイトカイン（例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）及び／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ））の分泌を高める。亢進される又は亢進され得る他の免疫調節性サイトカインは、例えば様々な細胞型に結合するＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２、グランザイムＢなどである。また、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような生物活性を有する抗体が提供される。

【0371】

特定の実施態様では、本発明の抗体は、例えば以下の実施例に記載されるような生物活性について試験される。

【0372】

Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のいずれもが、生物学的試料中のＨＬＡ－Ｇの存在を検出するために有用である。本明細書において使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的試料は、免疫細胞又はＴ細胞浸潤物及び／又は腫瘍細胞といった細胞又は組織を含む。

【0373】

一実施態様では、診断又は検出方法に使用される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中におけるＨＬＡ－Ｇの存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、本方法は、生物学的試料を、ＨＬＡ－Ｇに対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合を許容する条件下において本明細書に記載される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体と接触させること、及び抗ＨＬＡ－Ｇ抗体とＨＬＡ－Ｇとの間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。このような方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの方法とすることができる。一実施態様では、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を用いた療法に適した対象を選択するために使用され、例えばＨＬＡ－Ｇは患者の選択のためのバイオマーカーである。

【0374】

特定の実施態様では、標識された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。標識には、限定されないが、（例えば蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識等の）直接検出される標識又は部分、及び、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、ラジオアイソトープ^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３－ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、色素前駆体（例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼ等）を酸化させるため過酸化水素を利用し、酵素とカップリングさせた複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカル等が含まれる。

【0375】

Ｅ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の薬学的製剤は、所望の度合いの純度を有するこのような抗体を、１つ又は複数の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度で受容者に対して非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

【0376】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン－酢酸バッファーが含まれる。

【0377】

本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２種以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。例えば、さらに提供することが望ましい。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。

【0378】

活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

【0379】

徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0380】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。

【0381】

Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書において提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（又は抗原結合タンパク質）はいずれも、治療法に使用することができる。

【0382】

一態様において、医薬としての使用のための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。さらなる態様では、がんの治療における抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は使用が提供される。特定の実施態様では、治療法における使用のための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、がんを有する個体の治療方法における使用のための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を提供し、この方法は、そのような個体に対して有効量の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を投与することを含む。

【0383】

さらなる実施態様では、本発明は、免疫調節剤としての使用／例えばＴＮＦアルファ（ＴＮＦａ）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮｇ）のような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員による、免疫細胞の増殖、活性化を直接的又は間接的に誘導するための、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における、免疫調節剤の方法／例えばＴＮＦａ及びＩＦＮガンマのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員による、免疫細胞の増殖、活性化を直接的又は間接的に誘導するための方法であって、個体に対し、免疫調節のための／又は例えばＴＮＦａ及びＩＦＮガンマのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員により、直接的又は間接的に免疫細胞の増殖、活性化を誘導するための、有効量の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を投与することを含む方法における使用のための、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を提供する。

【0384】

さらなる実施態様では、本発明は、免疫刺激性剤としての使用／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮｇのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員による、増殖、活性化を直接的又は間接的に誘導するための免疫調節の方法であって、個体に対し、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮｇのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員により、直接的又は間接的に増殖、活性化を誘導するための、有効量の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体免疫調節を投与することを含む方法における使用のための、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を提供する。

【0385】

腫瘍の免疫抑制を阻害するように。

【0386】

上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、好ましくはヒトである。さらなる実施態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療を目的とする。さらなる実施態様では、医薬は、がんを有する個体に該医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、がん細胞の細胞媒介性溶解を誘導することを目的としている。さらなる実施態様では、医薬は、がんに罹患した個体に対し、がん細胞にアポトーシスを誘導する／又はがん細胞の増殖を阻害するための有効量の医薬を投与することを含む、前記個体にがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導する方法における使用を目的としている。上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、ヒトであってよい。

【0387】

さらなる態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、がんを有する個体に対し、有効量の抗ＨＬＡ－Ｇを投与することを含む。上記いずれの実施態様に記載の「個体」も、ヒトであってよい。

【0388】

さらなる態様では、本発明は、がんに罹患している個体におけるがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、がんに罹患した個体にがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するために、前記個体に対して有効量の抗ＨＬＡ－Ｇを投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。

【0389】

さらなる態様では、本発明は、例えば上述の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書において提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書において提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。

【0390】

本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段により投与することができ、また、局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与であってもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。

【0391】

本発明の抗体は、医療実施基準に合致した様式で製剤化され、投薬され、投与される。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者が知るその他の要因が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％～９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。

【0392】

疾患の予防又は治療に関し、本発明の抗体の（単独での使用又は１種以上の他の追加的治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療のどちらの目的で投与されるか、従前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。本発明の抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の個別投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態にもよるが、治療は一般に疾患症状の望ましい抑制が起こるまで継続されることになる。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組み合わせ）のうちの１つ又は複数の用量が患者に投与され得る。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が約２～約２０用量の抗体、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）投与してもよい。初回のより高い負荷用量、続いて１つ又は複数のより低い用量を投与してもよい。例示的な投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量を投与し、続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持量を投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合もある。この治療の経過は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

【0393】

上記の製剤又は治療方法のいずれかが、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の代わりに、又は抗ＨＬＡ－Ｇ抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。

【0394】

上記の製剤又は治療方法のいずれかが、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の代わりに、又は抗ＨＬＡ－Ｇ抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。

【0395】

ＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、病状の治療、予防及び／又は診断に効果的である、単独の又は別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備え得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器をさらに備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。

【0396】

以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順に改変を加えることができることが理解される。

【0397】

アミノ酸配列の説明
抗ＨＬＡＧ抗原結合部位（可変領域及び超可変領域（ＨＶＲ））：
配列番号１ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号２ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号３ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ３、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号４ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号５ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号６ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ３、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号７ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１
配列番号９ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１０ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１１ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ３、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１２ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１３ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１４ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ３、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１５ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１６ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００３９
配列番号１７ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号１８ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号１９ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ３、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号２０ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号２１ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号２２ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ３、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号２３ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号２４ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００４１
配列番号２５ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号２６ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号２７ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ３、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号２８ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号２９ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号３０ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ３、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号３１ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号３２ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号３３ ヒト化変異体重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４（ＨＬＡ－Ｇ－０１０４）
配列番号３４ ヒト化変異体軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４（ＨＬＡ－Ｇ－０１０４）

【0398】

さらなる配列
配列番号３５ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ
配列番号３６ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号３７ 例示的なヒトβ２Ｍ
配列番号３８ 修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ－Ｇ、図１も参照）のＥＣＤ）
配列番号３９ 例示的なヒトＨＬＡ－Ａ２
配列番号４０ 例示的なヒトＨＬＡ－Ａ２のＥＣＤ
配列番号４１ 例示的なマウスＨ２ＫｄのＥＣＤ
配列番号４２ 例示的なラットＲＴ１ＡのＥＣＤ
配列番号４３ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４４ 例示的な修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ－Ｇ）図１も参照）
配列番号４５ 例示的なマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４６ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワーク上に移植されている）
配列番号４７ 例示的なラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４８ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワーク上に移植されている）
配列番号４９ リンカー及びｈｉｓタグ
配列番号５０ ペプチド
配列番号５１ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号５２ ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号５３ ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５４ 変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有する、ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５５ ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域

【0399】

抗ＣＤ３抗原結合部位（可変領域及び超可変領域（ＨＶＲ））：
配列番号５６ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ１、ＣＨ２５２７
配列番号５７ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ２、ＣＨ２５２７
配列番号５８ 重鎖ＨＶＲ－Ｈ３、ＣＨ２５２７
配列番号５９ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ１、ＣＨ２５２７
配列番号６０ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ２、ＣＨ２５２７
配列番号６１ 軽鎖ＨＶＲ－Ｌ３、ＣＨ２５２７
配列番号６２ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＣＨ２５２７
配列番号６３ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＣＨ２５２７

【0400】

二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体：
Ｐ１ＡＡ１１８５（ＨＬＡ－Ｇ－００３１及びＣＨ２５２７に基づく）：
配列番号６４ 軽鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５
配列番号６５ 軽鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５
配列番号６６ 重鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５
配列番号６７ 重鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５
Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４（ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４及びＣＨ２５２７に基づく）
配列番号６８ 軽鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
配列番号６９ 軽鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
配列番号７０ 重鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
配列番号７１ 重鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
Ｐ１ＡＤ９９２４（ＨＬＡ－Ｇ－００９０及びＣＨ２５２７に基づく）
配列番号７２ 軽鎖１ Ｐ１ＡＤ９９２
配列番号７３ 軽鎖２ Ｐ１ＡＤ９９２
配列番号７４ 重鎖１ Ｐ１ＡＤ９９２
配列番号７５ 重鎖２ Ｐ１ＡＤ９９２

【0401】

さらなる配列
配列番号７６ 例示的なヒトＣＤ３
配列番号７７ 例示的なカニクイザルＣＤ３

【0402】

抗ＨＬＡＧ結合部分（下線が引かれた太字の超可変領域（ＨＶＲ）を有する可変領域）のアミノ酸配列：
配列番号７：重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１：

配列番号８：軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１：

配列番号３３：ヒト化変異体重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４（ＨＬＡ－Ｇ－０１０４）：

配列番号３４：ヒト化変異体軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４（ＨＬＡ－Ｇ－０１０４）：

配列番号１５：重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００３９：

配列番号１６：軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００３９

配列番号２３：重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００４１：

配列番号２４：軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００４１

配列番号３１：重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０：

配列番号３２：軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０

【0403】

抗ＣＤ３結合部分（下線が引かれた太字の超可変領域（ＨＶＲ）を有する可変領域）のアミノ酸配列：

配列番号６２ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＣＨ２５２７

配列番号６３ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＣＨ２５２７

【0404】

抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のアミノ酸配列：
Ｐ１ＡＡ１１８５（ＨＬＡ－Ｇ－００３１及びＣＨ２５２７に基づく）：
配列番号６４ 軽鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６５ 軽鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５
ＡＩＶＬＮＱＳＰＳＳＩＶＡＳＱＧＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＮＨＬＨＷＹＱＱＫＰＧＡＦＰＫＦＶＩＹＳＴＳＱＲＡＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＦＴＩＳＲＶＥＡＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＳＳＮＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６６ 重鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５
ＱＶＫＬＭＱＳＧＡＡＬＶＫＰＧＴＳＶＫＭＳＣＮＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＶＳＷＶＫＱＳＨＧＫＲＬＥＷＶＧＥＩＳＰＮＳＧＡＳＮＦＤＥＮＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＴＲＳＳＨＧＳＦＲＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
配列番号６７ 重鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５
ＱＶＫＬＭＱＳＧＡＡＬＶＫＰＧＴＳＶＫＭＳＣＮＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＶＳＷＶＫＱＳＨＧＫＲＬＥＷＶＧＥＩＳＰＮＳＧＡＳＮＦＤＥＮＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＴＲＳＳＨＧＳＦＲＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ

【0405】

Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４（ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４及びＣＨ２５２７に基づく）
配列番号６８ 軽鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６９ 軽鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＮＨＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＳＴＳＱＲＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＳＳＮＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７０ 重鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＥＩＳＰＮＳＧＡＳＮＦＤＥＮＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＳＳＨＧＳＦＲＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
配列番号７１ 重鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＥＩＳＰＮＳＧＡＳＮＦＤＥＮＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＳＳＨＧＳＦＲＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ

【0406】

Ｐ１ＡＤ９９２４（ＨＬＡ－Ｇ－００９０及びＣＨ２５２７に基づく）
配列番号７２ 軽鎖１ Ｐ１ＡＤ９９２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７３ 軽鎖２ Ｐ１ＡＤ９９２
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＮＳＳＮＮＫＮＮＬＡＷＹＱＱＱＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＹＹＲＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７４ 重鎖１ Ｐ１ＡＤ９９２
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
配列番号７５ 重鎖２ Ｐ１ＡＤ９９２
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ

【0407】

以下に、本発明の特定の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化抗原（特にヒトＣＤ３）に結合する第２の抗原結合部分とを含む、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びＴ細胞活性化抗原（特にヒトＣＤ３）に結合する多重特異性抗体。
２．抗体が二重特異性であり；
ここで、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分抗体が、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと；
を含み；Ｔ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分が、ヒトＣＤ３に結合し、かつ
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、ＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ＶＬドメインと
を含む、実施態様１に記載の多重特異性抗体。
３．第１の抗原結合部分が、
Ａ）
ｉｖ） 配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｖ） 又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含むか；あるいは
ｖｉ） 配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｂ）
配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｃ）
配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含むか；あるいは
Ｄ）
配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分が、
Ｅ）
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む、
実施態様２に記載の二重特異性抗体。
４．第１の抗原結合部分が、ｉ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含むか；あるいはｉｉ）配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列を含み；
かつ、第２の抗原結合部分が、
配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号６３のＶＬ配列を含む、
実施態様３に記載の二重特異性抗体。
５．抗体が、
ａ）配列番号４４を含む修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｂ）配列番号３９及び配列番号３７を含むヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｃ）配列番号４５を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｄ）配列番号４７を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず；かつ／あるいは
ｅ）単量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害し；かつ／あるいは
ｆ）三量体ＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では６０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体のＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体（配列番号４３を含む）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害し（実施例４ｂを参照）；かつ／あるいは
ｈ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｉ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に結合し（実施例５を参照）、かつＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（上のＨＬＡ－Ｇ）に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））阻害し（実施例６を参照）；かつ／あるいは
ｊ）ＨＬＡＧに対するＣＤ８ａの結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）８０％を超えて阻害し（例えば実施例４ｃを参照）；かつ／あるいは
ｋ）ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）と共培養された単球によるＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答（例えば、抑制された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ放出）を回復し；かつ／あるいは
ｌ）ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞（例えば、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６））の存在下で、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導する（実施例１２を参照）
実施態様１から４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
６．第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、実施態様１から５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
７．第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、ここで、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置換されている、実施態様１から６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
８．第１の抗原結合部分が、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である、実施態様１から７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
９．第１及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、実施態様１から８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
１０．第１及び第２の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ分子であり、ここで、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、あるいは（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、実施態様１から９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
１１．第３の抗原結合部分を含む、実施態様１から１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
１２．第３の抗原部分が第１の抗原結合部分と同一である、実施態様１１に記載の多重特異性抗体。
１３．第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、実施態様１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
１４．第１の、第２の、及び存在する場合は第３の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり；ここで、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、あるいは（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に結合しており；ここで、第３の抗原結合部分は、存在する場合は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、実施態様１３に記載の多重特異性抗体
１５．ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメイン、特にＩｇＧ_１のＦｃドメインである、実施態様１３又は１４に記載の多重特異性抗体。
１６．ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、実施態様１３から１５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
１７．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、実施態様１３から１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
１８．抗体が、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１アイソタイプのものである、実施態様１７に記載の多重特異性抗体。
１９．Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を収容可能な空洞が生成される、実施態様１３から１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
２０．抗体が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに変異Ｔ３６６Ｗを有し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに変異Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａを有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、実施態様１９に記載の多重特異性抗体。
２１．抗体が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに追加の変異Ｓ３５４Ｃを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに追加の変異Ｙ３４９Ｃを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、実施態様２０に記載の多重特異性抗体。
２２．抗体が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに追加の変異Ｙ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに追加のＳ３５４Ｃ変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、実施態様２０に記載の多重特異性抗体。
２３．実施態様１から２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、単離された核酸。
２４．実施態様２３の核酸を含む宿主細胞。
２５．抗体が産生されるように実施態様２４に記載の宿主細胞を培養することを含む、多重特異性抗体を産生する方法。
２６．宿主細胞から多重特異性抗体を回収することをさらに含む、実施態様２５に記載の方法。
２７．実施態様１から２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
２８．医薬としての使用のための、実施態様１から２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
２９．がんの治療における使用のための、実施態様１から２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
３０．医薬の製造における、実施態様１から２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体の使用。
３１．医薬が、がんの治療のためのものである、実施態様３０の使用。
３２．がんを有する個体を治療する方法であって、実施態様１から２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む方法。

【実施例0408】

実施例
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。

【0409】

遺伝子とオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、伝播／増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。

【0410】

基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、又はＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ－Ｇ、又はペプチド及びベータ－２ミクログロブリンに融合したＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ－Ｇ結合ペプチド及び／又はベータ－２ミクログロブリンに融合したＨＬＡ－Ｇ）の発現のために、以下の機能的要素を含む転写ユニットが使用される：
－ イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ 発現される遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖又はＭＨＣクラスＩ分子）、及び
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0411】

発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。

【0412】

タンパク質定量
精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。

【0413】

実施例１
スクリーニング及びカウンタースクリーニングのためのＨＬＡ－Ｇキメラ分子の生成
他のＭＨＣ Ｉ分子との高い相同性（＞９８％）に起因して、ＨＬＡ－Ｇ分子による免疫化の結果、ＭＨＣ－Ｉ交差反応性抗体と真のＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の混合物から構成されるポリクローナル血清が生成される。

【0414】

これまでのところ、他のヒトＭＨＣ－Ｉ（例えばＨＬＡ－Ａ）に対する交差反応性を有しない真にＨＬＡ－Ｇ特異的抗体を選択し、さらには受容体遮断機能を有するものを選択するためのツールは提供されていない。

【0415】

本発明者らは、構造的適合性と受容体相互作用に必要な位置と組み合わせて、特有のＨＬＡ－Ｇ位置を同定した（ＩＬＴ２／４及びＫＩＲ２ＤＬ４）。

【0416】

次いで、ヒトＨＬＡ－Ｇの特有かつ近位の位置を、異なるげっ歯類種由来のＭＨＣクラスＩ複合分子（例えばラットＲＴ１Ａ及びマウスＨ２ｋｄ）上に「移植」し、「キメラ」免疫原／スクリーニング抗原を生成した。

【0417】

生成された抗体は、結合／特異性に関して（及びカウンター抗原に対する結合／特異性がないことに関して）ストリンジェントなスクリーニングに供された。

【0418】

スクリーニング抗原：
－ 配列番号４３を含むヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ複合体として発現されたｒｅｃ．ＨＬＡ－Ｇ
－ ラットＲＴ－１及びマウスＨ２ｋｄ上に移植されたＨＬＡ－Ｇ特異性配列（配列番号４６：ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワーク上に移植されている、ヒトＨＬＡ－Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体、及び配列番号４８：ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワーク上に移植されている、ヒトＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体）
－ 天然ＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩ複合体発現細胞（例えばＪｅｇ３細胞）、又はヒトＨＬＡ－Ｇトランスフェクト細胞株ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ＋及びＰＡ－ＴＵ－８９０２ＨＬＡ－Ｇ＋

【0419】

－ 異なるペプチドと組み合わされた他のＨＬＡ－Ａ配列（ＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ｇ^{ＨｌＡ－Ａコンセンサス配列によるデグラフト}）を含むカウンター抗原（ＭＨＣクラスＩ複合体）（例えばＨＬＡ－Ｇフレームワーク上の配列番号４０（ＨＬＡ－Ａ２）及び配列番号４４のＨＬＡ－Ａコンセンサス配列を参照）
－ ラットＲＴ－１及びマウスＨ２ｋｄ（配列番号４５及び配列番号４７）といった他の種由来のカウンター抗原（ＭＨＣクラスＩ複合体）
－ ＨＬＡ－Ｇ発現が存在しないことを特徴とする、非修飾腫瘍細胞株であるＳＫＯＶ３及びＰＡ－ＴＵ－８９０２。

【0420】

ＨＬＡ特異的抗体の生成のための免疫化及びスクリーニングにおける使用のためのキメラＨＬＡ－Ｇ抗原の設計（図１を参照）：
野生型（ｗｔ）及びトランスジェニックラット、又はウサギ及びマウスなどの免疫化における使用のため、及び／又はスクリーニングアッセイにおける使用のためのＨＬＡ－Ｇ特有の位置を有するキメララットＭＨＣ Ｉ分子（ＲＴ１－Ａ）（配列番号４８）の設計：

【0421】

ＨＬＡ－Ｇ特有の位置を、ＩＭＧＴ（２０１４年２月６日に入手可能であったもの）からの２５７９ ＨＬＡ－Ａ、３２８３ ＨＬＡ－Ｂ、２１３３ ＨＬＡ－Ｃ、１５ ＨＬＡ－Ｅ、２２ ＨＬＡ－Ｆ、及び５０ ＨＬＡ－Ｇ配列のアラインメントにより同定した。３つの配列セットＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ＋ＨＬＡ－Ｅ＋ＨＬＡ－Ｆを組み合わせたセットのいずれかの配列の１％未満（多くの場合～０％）に存在するＨＬＡ－Ｇのそれら残基を、ＨＬＡ－Ｇ特有の位置と呼ぶ。

【0422】

４つのコアとなるＨＬＡ－Ｇ特有の位置（アルファ－１に２つ、及びアルファ－３に２つ）は、ＨＬＡ－Ｇ配列のセットに多型を示さず、他のＨＬＡ遺伝子でこれらの位置にＨＬＡ－Ｇ特異的残基を含むものはない（Ｍ１００の場合１×ＨＬＡ－Ａ、Ｑ１０３の場合１×ＨＬＡ－Ｂ、及びＱ１０３の場合１×ＨＬＡ－Ｃを除く）。

【0423】

ラットＲＴ１－Ａの結晶構造（Rudolph, M.G. et al. J.Mol.Biol. 324: 975-990 (2002)；ＰＤＢコード：１ＫＪＭ）を、ヒトＨＬＡ－Ｇの結晶構造に重ね合わせた（Clements, C.S. et al. PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 102: 3360-3365 (2005)；ＰＤＢコード：１ＹＤＰ）。アルファ鎖及び会合したベータ－２－ミクログロブリンの全体構造は保存されている。

【0424】

ＨＬＡ－Ｇ特有の位置を、配列と構造アラインメントの比較により、ＲＴ１－Ａ構造において同定した。第１の工程では、ＨＬＡ－Ｇ及びＲＴ１－Ａの分子表面に露出しているために抗体がアクセス可能である特有のＨＬＡ－Ｇ位置を同定した。タンパク質の折り畳み内に埋もれている特有の位置は、エンジニアリングから除外された。第２の工程では、対応する領域「ＨＬＡ－Ｇ様」を作製するため、すなわち、人工的であろうＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１－Ａキメラエピトープを生成するのではなく、特有の位置を含む本物のＨＬＡ－Ｇエピトープを生成するためにはやはり交換されなければならない、構造的に近位の残基を同定した。変異のためにこのように選択されたすべての位置を、変異に伴う分子構造の起こり得る局所的な乱れを避けるために、ＨＬＡ－Ｇのそれぞれの残基の構造的な一致について分析した。

【0425】

免疫化における使用のため及び／又はスクリーニングアッセイにおける使用のためのＨＬＡ－Ｇ特有の位置を有するキメラマウスＭＨＣ Ｉ分子（Ｈ２Ｋｄ）（配列番号４６）を同様に生成した。

【0426】

スクリーニングにカウンター抗原として使用されるＨＬＡ－Ａコンセンサス配列（配列番号４４）に向けてＨＬＡ－Ｇ特有の位置を「デグラフトすること（ｄｅ－ｇｒａｆｔｉｎｇ）」による、ＨＬＡ－Ａベースのカウンター抗原の設計
多重配列アライメントに由来する特有の位置を、ヒトＨＬＡ－Ｇの結晶構造（ＰＤＢコード：１ＹＤＰ）において分析した。まず、ＨＬＡ－Ｇ表面上に露出しておらず、したがって抗体がアクセスできない位置を、エンジニアリングのために除外した。次に、表面に露出した残基を、アミノ酸交換の実現可能性について分析した（すなわち、関連する位置が変異した時に分子構造に起こり得る局所的乱れの排除）。合計で、１４の位置を交換について検証した。検証された位置におけるアミノ酸を、ＩＭＧＴ（２０１４年２月６日に入手可能であったもの）からダウンロードされた、２５７９個のＨＬＡ－Ａ配列の多重配列アライメントから導かれるＨＬＡ－Ａコンセンサス配列へと変異させた。

【0427】

可溶性古典的及び非古典的ＭＨＣクラスＩ分子の発現プラスミドの生成
組換えＭＨＣクラスＩ遺伝子は、それぞれのＭＨＣクラスＩ分子、ベータ－２ミクログロブリン、及びそれぞれのＭＨＣクラスＩ分子が結合することが知られているペプチドからなるＮ末端伸長融合分子をコードする。

【0428】

可溶性ＭＨＣクラスＩ分子の一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ＭＨＣクラスＩ分子の発現カセットに加えて、大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。

【0429】

可溶性ＭＨＣクラスＩ分子の転写ユニットは、以下の機能的要素を含んでいた：
－ イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ Ｎ末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼＡコード化核酸、及び
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0430】

様々な種に由来する成熟した可溶性ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列は以下の通りである：
配列番号４３：例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４４：例示的な修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ－Ｇ）図１も参照）
配列番号４５：例示的なマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４６：例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ複合体（ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワーク上に移植されている）
配列番号４７：例示的なラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４８：例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ複合体（ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワーク上に移植されている）

【0431】

スクリーニングに使用される例示的なＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体のために、以下の成分が使用され、複合体が大腸菌に発現され、精製された。

【0432】

ＭＨＣ Ｉ複合体ＨＬＡ－Ａ２／ｂ２Ｍ（配列番号４０及び３７）（両方とも追加のＮ末端メチオニンを含む）＋ＶＬＤＦＡＰＰＧＡペプチド（配列番号５０）＋リンカー及びｈｉｓタグ（配列番号４９）

【0433】

実施例２
免疫化キャンペーン
Ａ）マウス及びラットの免疫化
ａ．キメラタンパク質（非特異的ＭＨＣ－Ｉ／ＨＬＡに対する耐性及び特有のＨＬＡ－Ｇ位置への方向性のため）
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号５５．２－１－５４－２５３１－１９－１０及び５５．２－１－５４－２５３２－５１－１１）、ドイツ動物保護法及び欧州議会及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。

【0434】

Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）（週齢６～８）は、４週間の過程にわたって、キメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ－Ｇ分子（配列番号４６（「ＨＬＡ－Ｇ－０００６」））による５回の免疫化を受けた。各免疫化の前に、マウスを酸素とイソフルランの混合ガスで麻酔した。１回目の免疫化では、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に溶解した１５μｇのタンパク質を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、マウスの背中に沿って、流入領域リンパ節の近位の６つの部位、すなわち首筋の２つの部位と鼠径部及び腓腹の両側のそれぞれ２つの部位とに皮下（ｓ．ｃ．）投与した。ＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｓ６３２２）で乳化された別の１５μｇのタンパク質を、腹部に沿った６つの並置部位に、すなわち腋窩、鼡径部、及び大腿部の両側のそれぞれ２部位に投与した。追加免疫の抗原を、用量を漸減させながら、７日目（１０μｇ）、１４日目（５μｇ）、２１日目（５μｇ）、及び２８日目（５μｇ）に同じように与え、ただし、ＲＩＢＩアジュバントを、全体を通して、腹部に沿ってのみ使用した。最後の免疫化の３日後、マウスを安楽死させ、両側の膝窩、浅鼠径、腋窩、及び鰓器官のリンパ節を無菌的に単離し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、３回目及び５回目の免疫化後にＥＬＩＳＡによって組換えヒトＨＬＡ－Ｇ及び免疫原特異的総ＩｇＧ抗体産生について試験した。

【0435】

６～８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの別のセット（ｎ＝５）は、３か月の過程にわたってキメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ－Ｇ分子（ＨＬＡ－Ｇ－０００６）による３回の免疫化を受けた。１回目の免疫化では、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に溶解した１００μｇのタンパク質を等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。追加免疫が、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ ＤｉｆｃｏのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）を使用したことを除いて、同様の方法で２８日目と５６日目に与えられた。最終免疫化の４～５週間後に、マウスに約２５μｇの免疫原を滅菌ＰＢＳ中で静脈内投与（ｉＶ）し、７２時間後に脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、組換えヒトＨＬＡ－Ｇ（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））、及び免疫原特異的キメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ－Ｇ分子（配列番号４６（「ＨＬＡ－Ｇ－０００６」））について試験し、３回目の免疫化後、コンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））及びマウスＨ２ｋｄタンパク質（配列番号４５「ＨＬＡ－Ｇ－０００９」））を含む「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇを用いて、総ＩｇＧ抗体産生を、ＥＬＩＳＡによりカウンタースクリーニングした。

【0436】

ｂ．野生型ＨＬＡ－Ｇタンパク質
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＣＤラットを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号５５．２－１－５４－２５３２－５１－１１）、ドイツ動物保護法及び欧州議会及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。

【0437】

６～８週齢のＣＤラット（ｎ＝４）は、４ヶ月の過程にわたって、組換えヒトＨＬＡ－Ｇタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））による４回の免疫化を受けた。１回目の免疫化では、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に溶解した１００μｇのタンパク質を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内投与した。追加免疫が、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ ＤｉｆｃｏのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）が全体を通して使用されたことを除いて、同様の方法で２８、５６、及び８４日目に与えられた。最終免疫化の３～４週間後、ラットに約７５μｇの免疫原を滅菌ＰＢＳ中で静脈内投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、３回目及び４回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって組換えＨＬＡ－Ｇ（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体産生について試験し、コンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。

【0438】

ｃ．ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（ＨＬＡ－Ｇを天然に発現する）
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＣＤラットを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号ＡＺ．５５．２－１－５４２５３１－８３－１３）、ドイツ動物保護法及び欧州議会及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。

【0439】

６～８週齢のＣＤラットの２つのグループ（ｎ＝２）は、それぞれ５カ月（Ａ）から７カ月（Ｂ）の過程にわたって、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）を使用して５回（Ａ群）又は７回（Ｂ群）の免疫化を受けた。１回目の免疫化では、滅菌ＰＢＳに溶解した１ｘ１０＾７個の細胞を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内投与した。追加免疫が、不完全フロイントのアジュバント（ＢＤ ＤｉｆｃｏのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）が全体を通して使用されたことを除いて、２８日目、５６日目、８４日目、１１２日目、１４０日目（Ｂのみ）、及び１６８日目（Ｂのみ）に、同様の方法でＡ及びＢに与えられた。最終免疫化の３週間後、ラットに、１００μｇの組換えヒトＨＬＡ－Ｇタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））を滅菌ＰＢＳ中で静脈内投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、それぞれ３回目、５回目及び７回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって、組換えＨＬＡ－Ｇ（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体産生－特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体産生について試験し、コンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。

【0440】

ｄ．ＪＥＧ３／ＤＮＡ ＩＭＳ（追加免疫効果のため）
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＣＤラットを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号ＡＺ．５５．２－１－５４２５３１－８３－１３）、ドイツ動物保護法及び欧州議会及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。

【0441】

６～８週齢のＣＤラット（ｎ＝５）は、プラスミドＤＮＡと細胞ベースの免疫化を３か月の過程にわたって交互に受けた。単鎖分子としてヒトＨＬＡ－ＧをコードするプラスミドＤＮＡ ＨＬＡ－Ｇ－００３０（ｐ１７７４７）と、天然にＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）を、それぞれこの目的のために使用した。

【0442】

１回目の免疫化のために、動物を、イソフルラン麻酔し、動物の尾部近傍の、背中の毛を剃った一の部位に適用した滅菌Ｈ２Ｏ中１００μｇのプラスミドＤＮＡで皮内（ｉ．ｄ．）免疫した。皮内に適用後、その部位を、ＥＣＭ ８３０エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で次のパラメータを使用して電気穿孔した：それぞれ０．１ｍｓにわたり１０００Ｖ／ｃｍで、１２５ｍｓの間隔を空けて２回、続いて１０ｍｓにわたり２８７．５Ｖ／ｃｍで、やはり１２５ｍｓの間隔を空けて４回。１４日目の２回目の免疫化のために、動物に、滅菌ＰＢＳに溶解した１ｘ１０＾７個の細胞を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、安定したエマルションの生成後、腹腔内投与した。追加免疫が、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ ＤｉｆｃｏからのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）が全体を通して細胞免疫化に使用されたことを除いて、同様の方法で２８日目（ＤＮＡ）、４２日目（細胞）、５６日目（ＤＮＡ）、７０日目（細胞）に与えられた。最終免疫化の４週間後、ラットに、１００μｇの可溶性組換えヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））を滅菌ＰＢＳ中で静脈内投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、それぞれ３回目、５回目及び６回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって可溶性組換えヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体産生について試験し、コンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。

【0443】

すべての免疫化戦略において、高度に多反応性の体液性免疫反応が誘導され、免疫化された動物からのポリクローナル血清を使用してＥＬＩＳＡフォーマットにおいて分析したところ、ＨＬＡ－Ｇ、並びにカウンタースクリーニングに使用されたタンパク質（例えば、組換え「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇ、キメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ－Ｇ分子又は関連するヒトＨＬＡ－Ａ２分子）を認識した（データは示さない）。

【0444】

Ｂ）ヒト化ＯＭＮＩＲＡＴ ｌｉｎｅ ７ラットの免疫化
ＯｍｎｉＲａｔ Ｌｉｎｅ ７ラットは、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（２７４７ Ｒｏｓｓ Ｒｏａｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ ９４３０３、ＵＳＡ）と提携し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．で飼育され、入手した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号５５．２－１－５４－２５３２－５１－１１及び５５．２－１－５４－２５３１－８３－１３）、ドイツ動物保護法及び欧州議会及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。

【0445】

６～８週齢のＯｍｎｉＲａｔ Ｌｉｎｅ ７ラット（ｎ＝４）は、４ヶ月の過程にわたって、組換えキメラＨＬＡ－Ｇタンパク質（配列番号４８（「ＨＬＡ－Ｇ－００１１」））による４回の免疫化を受けた。１回目の免疫化では、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に溶解した１００μｇのタンパク質を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内投与した。追加免疫が、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ ＤｉｆｃｏのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）が全体を通して使用されたことを除いて、同様の方法で２８、５６、及び８４日目に与えられた。最終免疫化の３～４週間後、ラットに、滅菌ＰＢＳ中で、約５０μｇの免疫原を静脈内投与し、２５μｇの免疫原を腹腔内に投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、３回目及び４回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって組換えＨＬＡ－Ｇ（配列番号４８（「ＨＬＡ－Ｇ－００１１」））特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体産生について試験し、コンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。

【0446】

あるいは、６～８週齢のＯｍｎｉＲａｔ Ｌｉｎｅ７ラット（ｎ＝５）は、プラスミドＤＮＡと細胞ベースの免疫化を３か月の過程にわたって交互に受けた。単鎖分子としてヒトＨＬＡ－Ｇ（ヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」）））をコードするプラスミドＤＮＡと、天然にＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）を、それぞれこの目的のために使用した。

【0447】

１回目の免疫化のために、動物を、イソフルラン麻酔し、動物の尾部近傍の、背中の毛を剃った一の部位に適用した滅菌Ｈ２Ｏ中１００μｇのプラスミドＤＮＡで皮内（ｉ．ｄ．）免疫した。皮内に適用後、その部位を、ＥＣＭ ８３０エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で次のパラメータを使用して電気穿孔した：それぞれ０．１ｍｓにわたり１０００Ｖ／ｃｍで、１２５ｍｓの間隔を空けて２回、続いて１０ｍｓにわたり２８７．５Ｖ／ｃｍで、やはり１２５ｍｓの間隔を空けて４回。１４日目の２回目の免疫化のために、動物に、滅菌ＰＢＳに溶解した１ｘ１０＾７個の細胞を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、安定したエマルションの生成後、腹腔内投与した。追加免疫が、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ ＤｉｆｃｏからのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）が全体を通して細胞免疫化に使用されたことを除いて、同様の方法で２８日目（ＤＮＡ）、４２日目（細胞）、５６日目（ＤＮＡ）、７０日目（細胞）に与えられた。最終免疫化の４週間後、ラットに、１００μｇの可溶性組換えヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））を滅菌ＰＢＳ中で静脈内投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、それぞれ３回目、５回目及び６回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって可溶性組換えヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体産生について試験し、コンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。

【0448】

すべての免疫化戦略において、高度に多反応性の体液性免疫反応が誘導され、免疫化された動物からのポリクローナル血清を使用してＥＬＩＳＡフォーマットにおいて分析したところ、ＨＬＡ－Ｇ、並びにカウンタースクリーニングに使用されたタンパク質（例えば、組換え「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇ、キメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ－Ｇ分子又は関連するヒトＨＬＡ－Ａ２分子）を認識した（データは示さない）。

【0449】

得られた抗体
上記の方法を使用して、ヒト抗ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する以下の抗体が得られた：ＣＤラットからのラットＨＬＡ－Ｇ ００３１、ヒト化ラットからのヒトＨＬＡＧ ００３９、ＨＬＡ－Ｇ ００４１及びＨＬＡ－Ｇ ００９０

【0450】

得られた抗ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の結合特性及び生物活性を、以下の実施例に記載されるように決定し、既知の参照抗体と比較した。抗体ＨＬＡ－Ｇ－００３１は、そのＨＶＲ及びＨＵＭＡＮ＿ＩＧＨＶ１－３のＶＨアクセプターヒトフレームワークとＨＵＭＡＮ＿ＩＧＫＶ１－１７のＶＬアクセプターヒトフレームワークを使用してヒト化された（Ｖドメイン、位置Ｒ４６Ｆに１つの追加の逆突然変異、Ｋａｂａｔ番号付け）。

【0451】

ＨＬＡＧバインダーＨＬＡＧ－００３１のヒト化の際の適切なヒトアクセプターフレームワークの同定のために、２つの方法論の組み合わせが使用された。一方では、親抗体と高い配列相同性を持つアクセプターフレームワークを探索し、続いてこのアクセプターフレームワークにＣＤＲ領域をインシリコで移植するという古典的なアプローチが採用された。親抗体に対する同定されたフレームワークの各アミノ酸の違いは、バインダーの構造的完全性に与える影響について判断され、適切な場合には親配列への逆変異がいつでも考慮された。

【0452】

他方、国際公開第２０１６／０６２７３４号に記載されているインシリコツールを使用して、ヒト化バージョンのＶＨドメイン及びＶＬドメインの互いに対する配向を予測した。これは、すべての可能なヒト生殖細胞系列の組み合わせについてのＣＤＲの仮想移植片に対して実施された。その結果を親バインダーのＶＨ ＶＬドメイン配向と比較して、出発抗体に形状が近いフレームワークの組み合わせを選択した。

【0453】

【0454】

実施例３
Ａ）可溶性ヒトＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ａ特異的配列を有する可溶性デグラフトヒトＨＬＡ－Ｇ、ヒトＨＬＡ－Ａ２、及びラット／マウスＨ２－Ｋｄに対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合
免疫化から得られた抗体を、ヒト、ＨＬＡ－Ｇ、キメラ、デグラフトＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ａ２及びラット／マウスＨ２－Ｋｄに対するそれらの結合特性についてスクリーニングした。それぞれのアッセイを以下に説明する。ヒトＨＬＡ－Ｇの試験のために、単量体、二量体、三量体のいずれかの形態を使用した（以下の調製を参照）。

【0455】

ヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質の二量体化／三量体化
単量体のＨｉｓタグ付き可溶性ヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号２３）を含む上清を、ＡＫＴＡ－ＦＰＬＣを使用して、５ｍｌのＮｉ－セファロースを含むＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃１７－５２４８－０２）に０．２ｍｌ／分の流速で一晩室温でロードした。次いでカラムを０．５Ｍのイミダゾールを含む２％のＤＰＢＳ（Ｍｅｒｃｋ ＃８．１４２２３．０２５）で、ベースラインに到達するまで洗浄した。次いでカラムを、０．５Ｍのイミダゾールを含む２％のＤＰＢＳ中１０ｍＭのＤＴＴで平衡化し、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／１０ｍＭのイミダゾールを用いてカラムからＤＴＴを洗い流し、０．５ｍＭのイミダゾールを含む２～１００％の勾配のＤＰＢＳでタンパク質を溶出した。Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ １５ Ｍ／Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０Ｋを使用して溶出液を濃縮した後、タンパク質を室温で２４時間、続いて４℃で４８時間インキュベートして、二量体化／多量体化させた。次いで、二量体と三量体の分離をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃１７－５１７５－０１）で実施し、０．５ＭのＮａＯＨで一晩洗浄した。カラムをＰＢＳで平衡化した後、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで飽和させた。次に、二量体（画分Ａ９）及び三量体（画分Ａ８）を収集し、等分して、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

【0456】

ヒト野生型ＨＬＡ－Ｇ結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト野生型ＨＬＡ－Ｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌの抗ＨＬＡ－Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又は参照抗体（Ｇ２３３、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ ＃ＭＡ１－１９４４９、５００ｎｇ／ｍｌ）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗マウスＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（Ｂｉｏｒａｄ ＃１７０－６５６１、ＯＳＥＰ中１：２０００）又はロバ－抗ウサギＩｇＧ ＰＯＤ（ＧＥ ＃ＮＡ９３４０Ｖ、ＯＳＥ中１：５０００）を加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。ラットＩｇＧの検出のために、ヤギ－抗ラットＩｇＧ１－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ－抗ラットＩｇＧ２ａ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）及びヤギ－抗ラットＩｇＧ２ｂ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）をＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２～３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。

【0457】

ＨＬＡ－Ａ特異的配列を有するヒトデグラフトＨＬＡ－Ｇ結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトデグラフトＨＬＡ－Ｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌの抗ＨＬＡ－Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又はラット血清（ＯＳＥＰ中で１：６００に希釈）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、ヤギ－抗ラットＩｇＧ１－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ－抗ラットＩｇＧ２ａ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）及びヤギ－抗ラットＩｇＧ２ｂ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）の混合物２５μｌ／ウェルを、ＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２～３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。

【0458】

ラットＭＨＣ Ｉ（ＲＴ１－Ａ）結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ラットＭＨＣ Ｉ（ＲＴ１－Ａ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌの抗ＨＬＡ－Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又はラット血清（ＯＳＥＰ中で１：６００に希釈）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、ヤギ－抗ラットＩｇＧ１－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ－抗ラットＩｇＧ２ａ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）及びヤギ－抗ラットＩｇＧ２ｂ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）の混合物２５μｌ／ウェルを、ＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２～３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。

【0459】

ＨＬＡ－Ａ２結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＨＬＡ－Ａ２でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌの抗ＨＬＡ－Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又はラット血清（ＯＳＥＰ中で１：６００に希釈）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、ヤギ－抗ラットＩｇＧ１－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ－抗ラットＩｇＧ２ａ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）及びヤギ－抗ラットＩｇＧ２ｂ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）の混合物２５μｌ／ウェルを、ＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２～３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。

【0460】

抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合キネティクス
ヒトＨＬＡ－Ｇ、ヒトＨＬＡ－Ｇデグラフト及びヒトＨＬＡ－Ａ２に対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合キネティクスを、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によって調査した。すべての実験は、ランニングバッファーとしてＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を使用し、希釈バッファーとしてＰＢＳバッファー（＋０．１％のＢＳＡ）を使用して、２５℃で実施した。抗ヒトＦｃ（ＪＩＲ００９－００５－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗ラットＦｃ（ＪＩＲ１１２－００５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗マウスＦｃ（ＪＩＲ１１５－００５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）抗体を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にｐＨ５．０で固定化した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は表面上に捕捉され、５０～２００ＲＵの捕捉応答をもたらした。ＨＬＡ－Ｇ分子を、２．５から８００ｎＭの濃度で（２ｘ１：２及び４ｘ１：３の希釈系列）表面上に１８０秒間にわたって３０μｌ／分で注入した（会合相）。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を３００～６００秒間監視した。表面を、抗ヒトＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を６０＋３０秒間にわたって注入することにより、抗ラットＦｃ捕捉抗体についてはグリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって及びグリシン（ｐＨ２．０）を６０秒間にわたって注入することにより、抗マウスＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を８０＋６０秒間にわたって注入することにより、再生した。バルク屈折率の差異は、モック面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入が差し引かれた（二重参照）。得られた曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした。

【0461】

抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のクロスブロッキング
ヒトＨＬＡ－Ｇに対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合のクロスブロッキング実験を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００又はＢ４０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。すべての実験を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして使用して、２５℃で実施した。

【0462】

抗ヒトＦａｂ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９５８３－２５）抗体を、供給者のプロトコールに従ってＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化し、ヒトＣｋドメインを含むＯＭＴラットから抗体を捕捉した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を、１５μｇ／ｍｌの濃度で７０秒間捕捉した。野生型ＨＬＡ－Ｇを、５００又は１０００ｎＭの濃度で６０秒間注入した（３０μｌ／分）。次いで野生型ラット抗体を、３０μｇ／ｍｌの濃度で９０秒間注入した。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を６０又は２４０秒間監視した。グリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって注入し、追加の安定化期間を９０秒間おくことにより、表面を再生した。

【0463】

別のアッセイ設定では、抗ヒトＦａｂ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９５８３－２５）抗体を、供給者のプロトコールに従ってＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化し、ヒトＣｋドメインを含むＯＭＴラットから抗体を捕捉した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を、３０μｇ／ｍｌの濃度で９０秒間捕捉した。捕捉抗体上の占有されていない結合部位を、４ｘ１２０秒間にわたり濃度５００μｇ／ｍｌ及び流速３０μｌ／分でヒトＩｇＧ（ＪＩＲ００９－０００－００３）を注入することによりブロックした。野生型ＨＬＡ－Ｇを、５００ｎＭの濃度で９０秒間注入した（３０μｌ／分）。次いでＯＭＴラット（ヒトＣｋドメイン）からの第２の抗体を、３０μｇ／ｍｌの濃度で９０秒間注入した。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を２４０秒間監視した。グリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって注入し、追加の安定化期間を９０秒間おくことにより、表面を再生した。

【0464】

【0465】

上の表は、野生型タンパク質ＩＭＳ由来の異なるラット抗ヒトＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体の結合をまとめたものである。ＥＬＩＳＡによって評価された、ｒｅｃ野生型単量体、二量体及び三量体のＨＬＡ－Ｇタンパク質に対するそれぞれの結合の相対的なＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］が示されている。ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）プレートにビオチン化野生型ＨＬＡ－Ｇ抗原をコーティングすることにより設定された。インキュベーション及び洗浄工程の後、１：２の希釈工程においてそれぞれの抗体を１０から０μｇの濃度範囲で結合させた。結合した抗体の検出を、抗Ｆｃ－抗体－ＰＯＤコンジュゲートにより実施した。その結果得られた結合曲線から、最大半量シグナルを生成する抗体濃度においてＥＣ５０値を決定した。非ビオチン化ＨＬＡ－Ｇ二量体及び三量体抗原の場合、固定化は、アッセイプレート上をランダムにコーティングすることにより実施した。

【0466】

【0467】

上記の表は、野生型及びＯＭＴラットの両方の野生型タンパク質ＩＭＳに由来する、異なるラット抗ヒトＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体の結合をまとめたものである。ＥＬＩＳＡによって評価されたｒｅｃ．野生型単量体ＨＬＡ－Ｇタンパク質又はいわゆるデグラフトＨＬＡ－Ｇ（ＨＬＡ－ＨＬＡ－Ｇバックボーンのコンセンサス配列）タンパク質に対するそれぞれの結合の相対ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］及び最大ＯＤが示されている。ＥＬＩＳＡは、ビオチン化野生型ＨＬＡ－Ｇ又はコンセンサス抗原をストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）プレートにコーティングすることによって設定された。インキュベーション及び洗浄工程の後、１：２の希釈工程においてそれぞれの抗体を１０から０μｇの濃度範囲で結合させた。結合した抗体の検出を、抗Ｆｃ－抗体－ＰＯＤコンジュゲートにより実施した。その結果得られた結合曲線から、最大半量シグナルを生成する抗体濃度においてＥＣ５０値を決定した。

【0468】

ＨＬＡ－Ｇ野生型対ＨＬＡ－Ｇデグラフトの結合－表面プラズモン共鳴
ＨＬＡ－Ｇ抗体の、組換えＨＬＡ－Ｇ（配列番号４３）及びコントロール修飾ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ－Ｇ、配列番号４４））に対する結合親和性。（「－」は検出可能な結合が存在しないことを示す）

【0469】

上の表は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析によって評価された、野生型及びデグラフトＨＬＡ－Ｇに対する抗体親和性及びｔ１／２値をまとめたものである。
ヒトＨＬＡ－Ｇ、及びヒトＨＬＡ－Ｇデグラフトに対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合キネティクスを、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によって調査した。すべての実験は、ランニングバッファーとしてＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を使用し、希釈バッファーとしてＰＢＳバッファー（＋０．１％のＢＳＡ）を使用して、２５℃で実施した。抗ヒトＦｃ（ＪＩＲ００９－００５－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗ラットＦｃ（ＪＩＲ１１２－００５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗マウスＦｃ（ＪＩＲ１１５－００５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）抗体を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にｐＨ５．０で固定化した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は表面上に捕捉され、５０～２００ＲＵの捕捉応答をもたらした。非ビオチン化ＨＬＡ－Ｇ分子を、２．５から８００ｎＭの濃度で（２ｘ１：２及び４ｘ１：３の希釈系列）表面上に１８０秒間にわたって３０μｌ／分で注入した（会合相）。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を３００～６００秒間監視した。表面を、抗ヒトＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を６０＋３０秒間にわたって注入することにより、抗ラットＦｃ捕捉抗体についてはグリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって及びグリシン（ｐＨ２．０）を６０秒間にわたって注入することにより、抗マウスＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を８０＋６０秒間にわたって注入することにより、再生した。バルク屈折率の差異は、モック面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入が差し引かれた（二重参照）。得られた曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした（－上の表は、検出可能な結合が存在しなかったことを示している）。

【0470】

さらなる実験において、以下の参照抗体（様々な商業的ベンダーから取得）を、単量体のヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣ Ｉ（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））及びコンセンサスＨＬＡ－Ａ特異的位置を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ－Ｇ（配列番号４４（「ＨＬＡ－Ｇ－０００７」））に対する結合について比較した：
ＭＥＭ／Ｇ９、８７Ｇ、Ｇ２３３、２Ａ１２、４Ｈ８４、５Ａ６Ｇ７、６Ｄ４６３、９－１Ｆ１０、ＭＥＭ－Ｇ／１、ＭＥＭ－Ｇ／１１、ＭＥＭ－Ｇ／２及びＭＥＭ－Ｇ／４（「－」は検出可能な結合が存在しないことを示す）。

【0471】

興味深いことに、測定された抗体の多くは、抗体８７Ｇも含めて、単量体のヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣ Ｉ（配列番号４３（「ＨＬＡ－Ｇ－０００３」））に対する特異的結合をまったく示さなかった。文献に記載されているようなオリゴマー形態のＨＬＡ－Ｇに対する結合は、オリゴマー形態の結合部位の増加に起因して生じた結合活性であり得る。

【0472】

７．７Ｅ^－０９Ｍの結合親和性のＫＤ値を有する抗体ＭＥＭ／Ｇ９、２．０Ｅ^－０８ＭのＫＤ値を有する抗体Ｇ２３３及び１．２Ｅ^－０８Ｍの結合親和性のＫＤ値を有するＭＥＭ－Ｇ／１１のみが、単量体の野生型ヒトＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣ Ｉ複合体に対する結合を示した。しかしながら、これらの抗体の１つであるＭＥＭ－Ｇ／１１は、ＨＬＡ－Ｇデグラフト（配列番号４４）上のＨＬＡ－Ａコンセンサスに対してもいくらかの結合／交差反応性を示した。加えて、別の抗体（ＭＥＭ／Ｇ９）も、ＨＬＡ－Ｇデグラフト（配列番号４４）上のＨＬＡ－Ａコンセンサスに対するより強い非特異的結合を示した。

【0473】

実施例４
ａ）受容体結合阻害（単量体、二量体、及び三量体のＨＬＡ－Ｇによる）：ＩＬＴ－２及びＩＬＴ－４ブロッキングＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度５００－１０００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト野生型ＨＬＡ－Ｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌの抗ＨＬＡ－Ｇ試料を１０又は３μｇ／ｍｌから濃度を徐々に低下させながら加え、次いで１：３又は１：２に段階希釈し、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのｃ－ｍｙｃ－タグ付き組換えＩＬＴ－２受容体を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗ｃ－ｍｙｃ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１９０－１０４Ｐ、ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ中で１：７０００）又は抗ヒトＦｃｇＰＯＤ（ＪＩＲ、１０９－０３６－０９８、ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ中で１：８０００）を加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２～３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。

【0474】

上記の表は、ブロックされていないＨＬＡ－Ｇ：受容体相互作用と比較して、３μｇ／ｍｌの濃度で、ＨＬＡ－Ｇに結合した異なる抗体のＩＬＴ－２及びＩＬＴ－４ブロッキングの程度をまとめたものである。ＨＬＡ－Ｇ－００９０は、ＩＬＴ２遮断の別の実験で試験され、ＩＬＴ４ブロッキングは評価されなかった。

【0475】

ｂ）異なるアッセイ設定を使用した、ＩＬＴ２及び－４結合阻害特性に関する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の生化学的比較
Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートに対してＦｃタグ付きＩＬＴ２及びＩＬＴ４をそれぞれコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡを設定した。インキュベーション及び洗浄工程の後、それぞれの抗体を１００ｎＭの濃度で加えた。可溶性Ｈｉｓタグ付き単量体、二量体又は三量体のＨＬＡ－Ｇをウェルに加えた。インキュベーション及び洗浄工程の後、結合した受容体の検出を、抗Ｈｉｓ－抗体－ＰＯＤコンジュゲートにより実施した。阻害率（％）は、ＩＬＴ２／４＋ＨＬＡ－Ｇ（単量体、二量体、又は三量体）を含み、抗ＨＬＡ－Ｇ又はＩＬＴ２／４抗体を含まないウェルから得られた値との比較において計算された（１００％結合＝０％阻害）。

【0476】

上の表は、ＥＬＩＳＡによって評価した、１１０ｎＭの濃度の記載されたＨＬＡＧ抗体による（^＊ＨＬＡ－Ｇ－００９０は４４ｎＭの濃度で試験された）、ｒｅｃＨＬＡ－Ｇタンパク質（単量体及びオリゴマー）とその受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４との間の相互作用のブロッキングをまとめたものである。ＨＬＡ－Ｇ／受容体の相互作用の％阻害が示されている（ＩＬＴ２及びＩＬＴ４に関して）。それほど顕著でないＩＬＴ４の阻害は、この受容体の主要なβ２Ｍ依存的相互作用によるものである。

【0477】

図４ａ及びｂの棒グラフは、市販の抗体と比較して、記載されている抗ＨＬＡ－Ｇ抗体によって達成された阻害％を示している。市販のＨＬＡ－Ｇ抗体８７Ｇ、ＭＥＭ／Ｇ０９及びＧ２３３は、本明細書に記載の抗体ほど効率的にはＨＬＡ－Ｇ／ＩＬＴ２又はＩＬＴ４の相互作用をブロックしない。

【0478】

さらに、市販の抗体は、場合によっては、結合時にＨＬＡ－ＧのＩＬＴ２又はＩＬＴ４に対する結合の増加を導く。

【0479】

ｃ）抗ＨＬＡＧ抗体によるＨＬＡＧに対するＣＤ８ａ結合の阻害
ストレプトアビジンでコーティングされた３８４ウェルプレートは、３０μｌ／ウェルのブロッキング溶液でブロックされた。ブロッキング溶液を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３７５４３）中で、５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ８１３６）及び８％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｓｉｇｍａ ＃ＰＶＰ３６０）を、３．５ｍｌのＰＶＡ＋３．５ｍｌのＰＶＰを３５ｍｌのＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０に加えることによって、１：１０に希釈して調製した。ブロッキング溶液で希釈した３０μｌのビオチン化ＨＬＡＧ（３μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、シェーカー上で室温で１時間インキュベートした。ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（Ｍｅｒｃｋ＃８．２２１８４．５００）を含む１００μｌのＰＢＳ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ＃Ｐ０４－３６５００）で３回洗浄した。次に、ウェルを、三連でブロッキングバッファーで希釈した３０μｌの抗ＨＬＡＧ抗体とともに、シェーカー上で室温で１時間インキュベートし、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含む１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。組換えＣＤ８ａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＃１０９８０－Ｈ０８Ｈ、４℃で１週間保存して再構成）をブロッキング溶液（１．２５μｇ／ｍｌ）で希釈し、３０μｌをすべてのウェルに加え、シェーカー上で室温で２時間インキュベートした。ウェルを０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含む１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰ結合ポリクローナル抗ＣＤ８ａラットＩｇＧ抗体（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＃０３３５４７－ＨＲＰ）を３％ウシ血清アルブミン画分Ｖ（Ｒｏｃｈｅ ＃１０７３５０８６００１）／ＰＢＳ ０．２％のＴｗｅｅｎ２０で希釈し、この希釈液の３０μｌを各ウェルに加えた。次に、プレートをシェーカー上で室温で１時間インキュベートし、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含む１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に、３０μｌのＴＭＢ基質（ＢＭ－Ｂｌｕｅ、可溶性ＨＲＰ基質、Ｒｏｃｈｅ ＃１１４８４２８１００１）を各ウェルに加え、続いてシェーカー上で室温で２５分間インキュベートした。次いで、２５μｌの硫酸を各ウェルに加え、プレートリーダーで４５０ｎＭで吸光度を測定することにより反応を停止させた。ＣＤ８ａのＨＬＡＧへの特異的結合は、結合値の平均からバックグラウンド値の平均を差し引くことによって計算された。抗体の非存在下でのＣＤ８のＨＬＡＧへの全結合は、１００％結合又は０％阻害と見なされた。

【0480】

図４ｃの棒グラフは、市販の抗体と比較して、記載されている抗ＨＬＡ－Ｇ抗体によって達成された阻害％を示している。市販のＨＬＡ－Ｇ抗体８７Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ８ａの相互作用をブロックしないが、ＭＥＭ／Ｇ０９及びＧ２３３は、この設定で説明されている抗体と比較して、ＣＤ８ａとのＨＬＡＧの相互作用を部分的に阻害する。

【0481】

実施例５
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の細胞への結合
ａ）細胞表面ＨＬＡ－Ｇ結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＪＥＧ３細胞（ＨＬＡ－Ｇを天然に発現、２００００細胞／ウェル）、Ｓｋｏｖ－３細胞、又は細胞表面上に組換えＨＬＡ－Ｇを発現するＳｋｏｖ－３細胞（共に１００００個の細胞／ウェル）を、組織培養処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１２．５μｌの抗ＨＬＡ－Ｇ試料（最終希釈１：３）を加え、２時間にわたり４℃でインキュベートした。５０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｇ５８８２；Ｌｏｔ Ｎｏ．：０５６Ｋ５３１８）になるように加えることにより細胞を固定した。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗マウスＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（Ｂｉｏｒａｄ ＃１７０－６５６１、ＯＳＥＰ中１：２０００）又はロバ－抗ウサギＩｇＧ ＰＯＤ（ＧＥ ＃ＮＡ９３４０Ｖ、ＯＳＥ中１：５０００）を加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。ラットＩｇＧの検出のために、ヤギ－抗ラットＩｇＧ１－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ－抗ラットＩｇＧ２ａ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）及びヤギ－抗ラットＩｇＧ２ｂ－ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）をＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（４ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２～３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。

【0482】

上記の表は、ＦＡＣＳ分析によって評価された、異なる細胞及び細胞株で発現されたＨＬＡ－Ｇに対する異なるラット抗ヒトＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体の結合をまとめたものである。天然にＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３腫瘍細胞又はＳｋｏｖ３若しくはＰＡ－ＴＵ－８９０２トランスフェクタント及びそれぞれの親の、トランスフェクトされていない細胞に対するいずれかの結合が記載されている。

【0483】

ｂ）細胞上に発現される天然又は組換えＨＬＡ－Ｇに対するＨＬＡ－Ｇ抗体の結合（ＦＡＣＳ分析により評価）
フローサイトメトリー分析のために、細胞を、４℃において抗ＨＬＡ－Ｇ ｍＡｂｓで染色した。簡潔には、２５μｌ／ウェルの各細胞懸濁液（５ｘ１０^４細胞／ウェル）を、ポリプロピレンの９６ウェルＶ底プレートに移し、冷蔵庫内において５℃で１０分間事前冷却した。抗ＨＬＡ－Ｇ試料を染色バッファーで２倍の開始濃度８０μｇ／ｍｌに希釈した。抗体の４倍の段階希釈を実施し、２５μｌ／ウェルの抗体溶液を調製された細胞に加え、１時間にわたり５℃でインキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色バッファーで２回洗浄し、３００ｇで３分間遠心分離した。検出のために、蛍光標識抗種抗体（Ａｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ１１００６；又はヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ１１００１）又はＡｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ１１０１３）を染色バッファーで２０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞ペレットを５０μｌ／ウェルの検出抗体に再懸濁した。５℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を再び染色バッファーで２回洗浄し、７０μｌの染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで測定した。

【0484】

抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ ００３１、ＨＬＡＧ ００３９、ＨＬＡ－Ｇ ００４１及びＨＬＡ－Ｇ ００９０の例示的なＦＡＣＳ染色は、図４のＦＡＣＳオーバーレイに示されている。

【0485】

実施例６
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＪＥＧ３細胞で発現するＨＬＡ－Ｇに対するＩＬＴ２の結合を阻害／調節する
分析のために、ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）を、異なる抗ＨＬＡ－Ｇ抗体とのプレインキュベーションの有無にかかわらず、ＩＬＴ２－Ｆｃ融合タンパク質（コントロール＝阻害なし）で染色した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体とのプレインキュベーションのために、２５μｌ／ウェルの細胞懸濁液をポリプロピレンの９６ウェルＶ底プレートに移し、４℃で１０分間事前冷却した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は参照抗体（Ｇ２３３、ＭＥＭ－Ｇ／９又は８７Ｇ）を、染色バッファーで２倍の濃度８０μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌ／ウェルの抗体溶液を調製された細胞に加え、１時間５℃でインキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色バッファーで２回洗浄し、３００ｇで３分間遠心分離して、最後に２５μｌ／ウェルの染色バッファーに再懸濁した。

【0486】

ａ）抗ＨＬＡ－Ｇ ｍＡｂと共にプレインキュベートしたＪＥＧ３細胞又はｂ）参照としての未処理のＪＥＧ３細胞に対するヒトＩＬＴ２－Ｆｃキメラタンパク質（ＲＤ ＃２０１７－Ｔ２－０５０）の検出を、以下のようにして決定した。簡潔には、ＩＬＴ２－Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃００９－０００－００３）を染色バッファーで（ＩＬＴ２）の２倍の濃度２０μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌ／ウェルのＩＬＴ２－Ｆｃタンパク質溶液を調製された細胞に加え、２時間５℃でインキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色バッファーで再度２回洗浄し、ヒトＩＬＴ２－Ｆｃタンパク質を、染色バッファーで１０μｇ／ｍｌに希釈した蛍光標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ガンマ特異的抗体（Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的ＦＩＴＣ、Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－０９６－００８）を用いて検出した。細胞ペレットを、５０μｌ／ウェルの検出抗体に再懸濁した。５℃での１時間のインキュベーション後、細胞を染色バッファーで２回洗浄し、７０μｌに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩにおいて測定して、ＪＥＧ ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を決定した。

【0487】

コントロールとして、ＪＥＧ－３プレインキュベート細胞に結合した抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、抗種抗体（Ａｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートした（ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ１１００１）、又はヤギ－抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ１１００６）を濃度１０μｇ／ｍｌで使用することにより検出された。

【0488】

図５のグラフは、異なるＨＬＡ－Ｇ抗体の、ＪＥＧ３腫瘍細胞に天然に発現されるＨＬＡ－Ｇに対する組換えＩＬＴ２の相互作用及び結合を修飾するそれぞれの能力を示す。

【0489】

以下の表は、実験結果をまとめたものである。ＪＥＧ３細胞に対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合は、＋（＝弱い結合）～＋＋＋（＝強い結合）で示されている。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の能力は、ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を、阻害／ブロックする又は増加させる。最後のカラムには、細胞に対する組換えＩＬＴ２の結合又はその阻害／遮断が示され／定量化されている（抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の非存在下でのＩＬＴ２－Ｆｃの染色を、１００％結合、すなわち０％阻害に設定した。負の値は結合がさらに増加していることを示す。染色シグナルの５％未満の相違は有意でないため「効果なし」に分類した。）：

【0490】

実施例７
単球サイトカイン回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）アッセイ（ＨＬＡ－Ｇ媒介性抑制後）
異なるラット抗ヒトＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体の機能的特徴づけのために、単球を用いたＨＬＡ－Ｇ発現細胞の以下の共培養アッセイを使用した。末梢ヒト単球を、健常なドナーの血液から単離した。簡潔には、血液を、抗凝固剤を含むチューブに収集し、ＰＢＳで１：２に希釈した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、３０ｍｌの混合物を、分離培地を事前充填した各Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブに移した。ＰＢＭＣ特異的バンドを１２分間の遠心分離（ブレーキなしで１２００ｘｇ）後に収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。最後に、細胞ペレットを、ＭｉｌｔｅｎｙｉからのＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、製造者の指示に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉのヒトＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（＃１３０－０９１－１５３）による磁気選別を介してヒト単球をＰＢＭＣから単離した（負の選択）。単離された単球を初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＣＳを補充したＰＡＮ ＃Ｐ０４－１７５００、Ｇｉｂｃｏ ＃１０５００；２ｍＭのＬ－グルタミン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ７５１３；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｇｉｂｃｏ ＃１１３６０；ＭＥＭ非必須アミノ酸、Ｇｉｂｃｏ ＃１１１４０；０，１ｍＭの２－メルカプトエタノール、Ｇｉｂｃｏ ＃３１３５０；ＭＥＭビタミン、Ｇｉｂｃｏ ＃１１１２０；ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ ＃１５１４０）に５ｘ１０ｅ５個の細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋細胞の濃縮を、フローサイトメトリーにより監視し、細胞のＩＬＴ２及びＩＬＴ４の発現を分析した。濃縮された単球とＨＬＡ－Ｇ発現細胞との共培養アッセイでは、ＪＥＧ－３細胞を、アッセイの前日に、ＪＥＧ－３培養培地（ＥＢＳＳ及びＬ－グルタミンを含むＭＥＭ Ｅａｇｌｅ、１０％のＦＣＳを補充したＰＡＮ ＃Ｐ０４－００５０９、Ｇｉｂｃｏ ＃１０５００；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｇｉｂｃｏ ＃１１３６０；ＭＥＭ非必須アミノ酸 Ｇｉｂｃｏ ＃１１１４０）において１００μｌ中８ｘ１０ｅ３個の細胞／ウェルで、９６ウェル平底組織培養プレートに播種し、アッセイ当日に培養密度層を形成させた。いくつかの実験では、ＪＥＧ－３ ＨＬＡＧノックアウト細胞株を使用し、上記のようにＪＥＧ－３野生型細胞として播種した。接着性ＪＥＧ－３細胞を、初代細胞培養培地で４倍に段階希釈した抗ＨＬＡ－Ｇ抗体と共にプレインキュベートした。したがって、接着性ＪＥＧ－３細胞由来の上清を除去し、５０μｌ／ウェルの調製済み抗体溶液を添加し、加湿雰囲気下で３７℃及び５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ヒト単球を、５０μｌの初代細胞培養培地中において、２，５ｘ１０ｅ４個のヒト単球／ウェルで、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体と共にプレインキュベートしたＪＥＧ－３細胞に加え、共培養物を、加湿雰囲気中で一晩（およそ１８～２０時間）３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日、５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳによるＬＰＳ刺激を７時間にわたって実施し、その後共培養物の上清を回収した。共培養物上清のＴＮＦアルファの濃度を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃８８－７３４６－８８）のヒトＴＮＦアルファＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（登録商標）を使用して決定した。

【0491】

以下の表は、異なる抗体特性における特定のドナーに対する特定のＨＬＡ－Ｇ抗体の機能特性をまとめたものである。

【0492】

表：機能的抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＨＬＡ－Ｇ特異的抑制免疫応答を回復することができる（すなわち、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞との共培養において単球によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦａ産生を回復する）：
機能的抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＴＮＦ放出（回復）のパーセンテージ％
機能的抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、免疫応答を誘導する（抑制された免疫応答を回復する）ことができ、すなわち、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞との共培養における単球によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦａ産生を回復することができる（抗体がＴＮＦ誘導を示さないか（真にＨＬＡ－Ｇ特異的抗体）、ノックアウト細胞株でＴＮＦ誘導を示すか（ＨＬＡＧ特異的とすることができない）を区別するために、ＨＬＡＧ特異的ＴＮＦ誘導のネガティブコントロールには、ＨＬＡＧノックアウト細胞株を使用した）。

【0493】

抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の％ＴＮＦ誘導の値は、次の条件を使用して計算される：ＪＥＧ３細胞と単球の未処理の共培養＝０％、単球のみの培養（ＨＬＡ－Ｇ誘導抑制なし）＝１００％

【0494】

上の表から、本発明の抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ－３細胞と共培養した単球ではＴＮＦアルファ放出を誘導することができたが、ＨＬＡ－ＧをノックアウトしたＪＥＧ－３細胞と共培養した単球ではＴＮＦアルファ放出を誘導することができなかったことが明らかとなる。

【0495】

表から、参照抗体は、ＨＬＡ－Ｇノックアウト細胞株においても強いＴＮＦアルファ放出を誘導するため、真にＨＬＡ－Ｇ特異的ではないことが明らかとなる。

【0496】

ドナー（以下の異なるドナー）に応じて、％ＴＮＦ放出（回復）のパーセンテージは異なる。

【0497】

実施例８
ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体（抗ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３）の生成
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。

【0498】

遺伝子とオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、伝播／増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。

【0499】

基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子／タンパク質（例えば、抗体重鎖又は抗体軽鎖）の発現のために、以下の機能的要素を含む転写ユニットが使用される：
－ イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ 発現される遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖又はＭＨＣクラスＩ分子）、及び
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0500】

発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。

【0501】

タンパク質定量
精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。

【0502】

組換えモノクローナル二重特異性抗体の発現プラスミドの生成
組換えモノクローナル抗体遺伝子は、それぞれの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードする。

【0503】

モノクローナル抗体分子の一過性発現のための発現プラスミドは、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の発現カセットに加えて、大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。

【0504】

それぞれの抗体の重鎖又は軽鎖の転写ユニットは、以下の機能的要素を含んでいた：
－ イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ Ｎ末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼＡコード化核酸、及び
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0505】

一過性の発現及び分析的特徴づけ
組換え生産は、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で培養されたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）の一過性トランスフェクションによって実施された。モノクローナル抗体の産生のために、細胞は、それぞれの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むプラスミドでコトランスフェクトされた。トランスフェクションのために、「２９３－Ｆｅｃｔｉｎ」トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。トランスフェクションは、製造業者の指示書に記載されている通りに行った。トランスフェクションの３～７日後に細胞培養上清を回収した。上清を低温（例えば－８０℃）で保存した。

【0506】

例えばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられる。

【0507】

組換えＤＮＡ技術、組換えモノクローナル抗体の発現プラスミドの生成、一過性発現及び分析的特徴づけのための上記の方法を使用して、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する以下の二重特異性抗体が生産され、分析された。

【0508】

【0509】

ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体（抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体）：このような抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に含まれる二重特異性抗体鎖の配列番号（ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部位及びヒトＣＤ３に結合する抗原結合部位のそれぞれの可変領域ＶＨ／ＶＬに基づく）：

【0510】

Ｐ１ＡＡ１１８５（ＨＬＡ－Ｇ－００３１及びＣＨ２５２７に基づく）：
配列番号６４ 軽鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５
配列番号６５ 軽鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５
配列番号６６ 重鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５
配列番号６７ 重鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５

【0511】

Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４（ＨＬＡ－Ｇ－００３１－０１０４及びＣＨ２５２７に基づく）
配列番号６８ 軽鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
配列番号６９ 軽鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
配列番号７０ 重鎖１ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４
配列番号７１ 重鎖２ Ｐ１ＡＡ１１８５－１０４

【0512】

Ｐ１ＡＤ９９２４（ＨＬＡ－Ｇ－００９０及びＣＨ２５２７に基づく）
配列番号７２ 軽鎖１ Ｐ１ＡＤ９９２
配列番号７３ 軽鎖２ Ｐ１ＡＤ９９２
配列番号７４ 重鎖１ Ｐ１ＡＤ９９２
配列番号７５ 重鎖２ Ｐ１ＡＤ９９２

【0513】

実施例９
細胞上に発現した天然又は組換えＨＬＡ－Ｇに対する二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の結合（ＦＡＣＳ分析により評価）
異なる細胞及び細胞株で発現されたＨＬＡ－Ｇに対する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ ｍＡｂの結合能力をＦＡＣＳ分析によって評価した。天然にＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３腫瘍細胞又はＳｋｏｖ３若しくはＰＡ－ＴＵ－８９０２トランスフェクタント及びそれぞれの親の、トランスフェクトされていない細胞に対するいずれかの結合が記載されている。

【0514】

フローサイトメトリー分析のために、細胞を、４℃においてＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ ｍＡｂで染色した。簡潔には、２５μｌ／ウェルの各細胞懸濁液（５ｘ１０４細胞／ウェル）を、ポリプロピレンの９６ウェルＶ底プレートに移し、冷蔵庫内において５℃で１０分間事前冷却した。抗ＨＬＡ－Ｇ試料を染色バッファーで２倍の開始濃度８０μｇ／ｍｌに希釈した。抗体の４倍の段階希釈を実施し、２５μｌ／ウェルの抗体溶液を調製された細胞に加え、１時間にわたり５℃でインキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色バッファーで２回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを２５μｌの染色バッファーに再懸濁した。検出のために、蛍光標識抗種抗体（ＰＥにコンジュゲートしたロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃７０９－１１６－１４９）を染色バッファーで１：１００に希釈し、２５μｌ／ウェルの検出抗体を細胞懸濁液に添加した。５℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を再び染色バッファーで２回洗浄し、７０μｌの染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで測定した。Ｐ１ＡＡ１１８５の結合の結果を図７に示す。

【0515】

実施例１０
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体を介したＴ細胞活性化
ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を活性化する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡＧ（ＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ）でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞で試験した。Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞上の細胞表面活性化マーカーＣＤ２５及び初期活性化マーカーＣＤ６９のＦＡＣＳ分析によって評価した。簡潔には、ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地チューブ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用した密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離した。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ細胞を、９６ウェルＵ底プレートに１０：１の比率で播種した。次に、共培養物を、図（図８）に示されるように異なる濃度のＨＬＡＧ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％のＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーによって測定した。

【0516】

フローサイトメトリー分析において、細胞を、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５６５３１０）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃９０１２－０２５７）、及びＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５５５３３）により４℃で染色した。簡潔には、抗体を２倍の濃度に希釈し、２５μｌの抗体希釈液を２５μｌの事前に洗浄した共培養物と共に各ウェルに添加した。細胞を４℃で３０分間染色し、２００μｌ／ウェルの染色バッファーで２回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを２００μｌの染色バッファーに再懸濁し、２μｇ／ｍｌの最終濃度で、生死識別のためにＤＡＰＩで染色した。次に、ＢＤ ＬＳＲフローサイトメーターを使用して試料を測定した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ．１０．１ソフトウェアを使用して行った。平均蛍光強度の幾何平均がエクスポートされ、アイソタイプと抗体の幾何平均の比率が計算された。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＡ１１８５とＰ１ＡＤ９９２４の両方がＴ細胞の活性化を誘導した。

【0517】

実施例１１
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体は、Ｔ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を媒介した
ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を誘導する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡＧ（ＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ）でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞及び内因性ＨＬＡＧを発現するＪＥＧ３細胞で試験した。ＩＦＮガンマ分泌はＬｕｍｉｎｅｘテクノロジーによって検出された。ＴＣＢ処理後のＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を測定するために、ＰＢＭＣとＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ細胞又はＪＥＧ３細胞の共培養物を抗ＨＬＡＧ ＴＣＢとインキュベートした。簡潔には、ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地チューブ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用した密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離した。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ細胞を、９６ウェルＵ底プレートに１０：１の比率で播種した。次に、共培養物を、図（図９）に示されるように異なる濃度のＨＬＡＧ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％のＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、上清を回収し、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキット（Ｌｕｍｉｎｅｘテクノロジー）を製造者の指示に従って使用してＩＦＮガンマ分泌を測定した。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＡ１１８５とＰ１ＡＤ９９２４の両方が、Ｔ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を誘導した。

【0518】

実施例１２
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体によるＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞死滅の誘導
ＨＬＡＧ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡＧ（ＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ）でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞及び内因性ＨＬＡＧを発現するＪＥＧ３細胞で試験した。細胞傷害性は、ＨＬＡＧ ＴＣＢで処理した後の細胞におけるカスパーゼ８の活性化を測定することによって検出された。ＴＣＢ処理後のカスパーゼ８活性化の測定については、ＰＢＭＣとＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ細胞又はＪＥＧ３細胞の共培養物を抗ＨＬＡＧ ＴＣＢと２４時間又は４８時間インキュベートし、カスパーゼ８Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ８２００）を使用してカスパーゼ８の活性化を測定した。簡潔には、ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地チューブ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用した密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離した。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ＨＬＡＧ細胞を１０：１（ウェルあたり１００μｌ）の比率で黒の透明底の９６ウェルプレートに播種した。次に、共培養物を、図（図１０）に示されるように異なる濃度のＨＬＡＧ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％のＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で２４時間又は４８時間インキュベートした。翌日、１００μｌのカスパーゼ８ Ｇｌｏ基質を各ウェルに添加し、室温で１時間シェーカー上に置いた。発光はＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙ２装置で測定された。カスパーゼ８の活性化／細胞傷害性に対応する相対発光単位（ＲＬＵ）がグラフにプロットされている（図１０）。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４は両方とも、ＨＬＡＧを発現するＳＫＯＶ３及びＪＥＧ３細胞において、抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性ＴＣＢ抗体（Ｐ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４）によるＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞死滅を誘導した。

【0519】

実施例１３
ヒトＰＢＭＣを共移植された、組換えＨＬＡＧ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡＧ）でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌における、二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体によるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ＮＳＧ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ）マウス（ｎ＝１０）に、総体積１００μｌの５ｘ１０６個のＳＫＯＶ３ ＨＬＡＧ細胞を皮下注射した。腫瘍が平均体積３００ｍｍ３に達したら、マウス１匹あたり１ｘ１０７個のヒトＰＢＭＣを総体積２００μｌで注射した。ＰＢＭＣ注射の７日後、マウスを無作為化し、週２回ＨＬＡＧ ＴＣＢ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した。コントロールとして、１群のマウスにヒスチジンバッファー（ビヒクル）を隔週で静脈内注射した。試験終了まで、腫瘍体積を週に２回測定した。実験結果を図ｘｘに示す。結果は、異なる試験群において、キャリパーによって測定された１０匹のマウスからの腫瘍体積の中央値及び四分位範囲（ＩＱＲ）を示している。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体のＰ１ＡＡ１１８５及びＰ１ＡＤ９９２４は両方とも強い腫瘍増殖阻害を示し、Ｐ１ＡＤ９９２４は完全寛解を示した。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A-F】

【図11G-N】

【図11O-V】

【図11W-Z】

【図12】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-03-29

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書に記載の一の発明。

【外国語明細書】