特開 2023-87936 細胞外小胞吸着剤およびそれを用いた細胞外小胞の検出および分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023087936

(43)【公開日】2023-06-26

(54)【発明の名称】細胞外小胞吸着剤およびそれを用いた細胞外小胞の検出および分離方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20230619BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230619BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22

C07K14/435 ZNA

C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021202501

(22)【出願日】2021-12-14

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】000173762

【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所

(72)【発明者】

【氏名】穂谷 恵

(72)【発明者】

【氏名】井上 宗宣

(72)【発明者】

【氏名】兜坂 健太

(72)【発明者】

【氏名】松永 太一

(72)【発明者】

【氏名】森本 篤史

(72)【発明者】

【氏名】河合 康俊

(72)【発明者】

【氏名】大竹 則久

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA50

4H045EA65

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

【課題】 細胞外小胞を高感度かつ高精度に検出する方法、および高純度の細胞外小胞を簡便な操作で大量に分離可能な方法を提供すること。
【解決手段】 イクイナトキシンやライセニンなどのスフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子と、当該スフィンゴミエリン認識分子を固定化した不溶性担体とを含む、細胞外小胞吸着剤により、前記課題を解決する。
【選択図】 図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

不溶性担体と、当該担体に固定化した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子と、当該スフィンゴミエリン認識分子を固定化した不溶性担体とを含む、細胞外小胞吸着剤。

【請求項2】

スフィンゴミエリン認識分子が、スフィンゴミエリン結合性タンパク質および不溶性担体との結合能を有した、固定化補助タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の分離剤。

【請求項3】

スフィンゴミエリン結合性タンパク質がイクイナトキシンおよび／またはライセニンである、請求項１または２に記載の吸着剤。

【請求項4】

イクイナトキシンが以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、請求項３に記載の吸着剤。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【請求項5】

ライセニンが以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかから選択されるタンパク質である、請求項３に記載の吸着剤。
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質；
（ｅ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【請求項6】

請求項１から５のいずれかに記載の吸着剤に細胞外小胞を含む溶液を添加して当該細胞外小胞を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞を検出する工程とを含む、細胞外小胞の検出方法。

【請求項7】

請求項１から５のいずれかに記載の吸着剤を充填してなる、細胞外小胞分離カラム。

【請求項8】

請求項７に記載のカラムに細胞外小胞を含む溶液を添加して当該細胞外小胞を前記カラムに充填した吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、細胞外小胞の分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、溶液中に含まれる細胞外小胞を選択的に吸着可能な細胞外小胞吸着剤、および当該細胞外小胞吸着剤を用いた細胞外小胞の検出および分離方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外小胞は内部にマイクロＲＮＡやメッセンジャーＲＮＡなどの核酸やタンパク質などの物質を含み、細胞間の情報伝達を担っていると考えられていることから、がんなどの各種疾患のバイオマーカーとして注目されるだけでなく、新規治療薬やドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）としての応用も期待されている（非特許文献１）。

【0003】

細胞外小胞の単離検出技術として、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０）やテトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）を細胞外小胞のマーカーとして利用する方法が知られている。しかしながら、これらマーカーの発現量は、細胞外小胞を放出する細胞の種類により異なるため、感度および定量性に欠けることが課題である（非特許文献２）。

【0004】

また、細胞外小胞を単離する技術として、超遠心法、限外ろ過法、密度勾配遠心法、ポリマー沈殿法、免疫沈降法などが知られている。しかしながら、これら方法のうち、高純度・高濃度の細胞外小胞が得られること、細胞外小胞が大量かつ安価に得られること、および操作が短時間且つ簡便であること、の３つすべてを満たしている方法はない。

【0005】

細胞外小胞を単離する、さらに他の技術として、リン脂質のホスファチジルセリンに結合性をもつタンパク質であるアネキシンＶやＴｉｍ４タンパク質を利用した方法が知られている（特許文献１および非特許文献２）。しかしながら、前記方法は細胞外小胞の検出率や回収率が十分とはいえない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】ＷＯ２０１６／０８８６８９号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１３巻、１６３７－１６５３頁、２０１３年

【非特許文献2】日本薬理学雑誌 １４９巻、１１９－１２２頁、２０１７年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の課題は、細胞外小胞の産業的利用を発展させるにあたり、細胞外小胞を高感度かつ高精度に検出する方法や、高純度の細胞外小胞を簡便な操作で大量に分離可能な方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、不溶性担体と当該担体に固定化したスフィンゴミエリン認識分子とを含むスフィンゴミエリン認識分子固定化担体が、溶液中に含まれる細胞外小胞を高感度かつ高精度に検出・分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち本発明は、以下の［１］から［８］に記載の態様を包含する。

【0011】

［１］不溶性担体と、当該担体に固定化した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含む、スフィンゴミエリン認識分子とを含む、細胞外小胞吸着剤。

【0012】

［２］スフィンゴミエリン認識分子が、スフィンゴミエリン結合性タンパク質および不溶性担体との結合能を有した、固定化補助タンパク質をさらに含む、［１］に記載の吸着剤。

【0013】

［３］スフィンゴミエリン結合性タンパク質がイクイナトキシンおよび／またはライセニンである、［１］または［２］に記載の吸着剤。

【0014】

［４］イクイナトキシンが以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、［３］に記載の吸着剤。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【0015】

［５］ライセニンが以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかから選択されるタンパク質である、［３］に記載の吸着剤。
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質；
（ｅ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【0016】

［６］［１］から［５］のいずれかに記載の吸着剤に細胞外小胞を含む溶液を添加して当該細胞外小胞を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞を検出する工程とを含む、細胞外小胞の検出方法。

【0017】

［７］［１］から［５］のいずれかに記載の吸着剤を充填してなる、細胞外小胞分離カラム。

【0018】

［８］［７］に記載のカラムに細胞外小胞を含む溶液を添加して当該細胞外小胞を前記カラムに充填した吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、細胞外小胞の分離方法。

【0019】

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

【0020】

リン脂質の一つであるスフィンゴミエリンは、細胞外小胞表面に多く含まれることが知られている（Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、６６巻、３０－４１頁、２０１７年）。本発明は当該知見に着目し検討した結果、成し得た発明である。

【0021】

本明細書において細胞外小胞とは、真核細胞から分泌された脂質二重膜で構成された粒子のことを指し、粒径は２０ｎｍ以上数μｍ以下であり、その大きさや由来により、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）、マイクロベシクル（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、アポトーシス小胞（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）に分類される。中でも、疾患診断や治療に有効性が認められる（例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｓｅｌ）、２０２１年、１０巻、３５９頁）点で、エクソソームおよびマイクロベシクルが挙げられ、これらの小胞に相当する点で、粒径は５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下が好ましい。

【0022】

本発明の細胞外小胞吸着剤を構成する不溶性担体は、水溶液に対して不溶性の担体であれば特に制限されない。一例として、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が挙げられる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましく、具体的には、トヨパール（東ソー製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。中でも、表面積が大きく、スフィンゴミエリン認識分子の固定化量を多くできる点で、粒状物が好ましい。また、その粒径は、細胞外小胞が不溶性担体の隙間を目詰まりすることなく通過でき、かつ入手が容易な点で、直径１μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。

【0023】

本発明の細胞外小胞吸着剤を構成するスフィンゴミエリン認識分子は、少なくともスフィンゴミエリン特異的に結合能を有するタンパク質（以下、「スフィンゴミエリン結合性タンパク質」とも表記）を含んでいればよく、当該タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にスフィンゴミエリン結合能を有さないポリペプチドや分子が付加されていてもよい。前記付加してよい、ポリペプチドや分子の一例として、タンパク質タグであるＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、可溶性の高いタンパク質であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＳｐＡ）のＺドメイン、ＧＳリンカー（グリシン４残基とセリン１残基の繰り返しからなるリンカー）などのリンカー配列、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ認識配列などのプロテアーゼ認識配列、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなどの分離精製用タグ、グルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）などの不溶性担体への固定化用タンパク質が挙げられる。中でも、ＳｐＡのＺドメインが大腸菌による組換えスフィンゴミエリン結合性タンパク質の生産性を向上できる点で、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒがスフィンゴミエリン結合性タンパク質の分子密度や配向性を制御できる点で、それぞれ好ましい。

【0024】

本明細書におけるスフィンゴミエリン結合性タンパク質の一例として、ウメボシイソギンチャク（Ａｃｔｉｎｉａ ｅｑｕｉｎａ）由来のイクイナトキシンＩＩ（Ｅｑｕｉｎａｔｏｘｉｎ ＩＩ、以下「ＥｑｔＩＩ」とも表記）、シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａ）由来のライセニン（Ｌｙｓｅｎｉｎ、以下「Ｌｙｓｎ」とも表記）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）由来のプルロトライシンＡ２（Ｐｌｅｕｒｏｔｏｌｙｓｉｎ Ａ２）やオストレオリシンＡ（Ｏｓｔｒｅｏｌｙｓｉｎ Ａ）が挙げられる。中でも、ＥｑｔＩＩおよびＬｙｓｎは、大腸菌による組換えタンパク質の生産が容易な点で、スフィンゴミエリン結合性タンパク質の好ましい態様といえる。

【0025】

天然型（変異未導入の）ＥｑｔＩＩのアミノ酸配列を配列番号１に、天然型（変異未導入の）ＬｙｓｎのうちＣ末端ドメインのアミノ酸配列を配列番号３に、それぞれ示す。なお、配列番号１はＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ６１９１４の３６番目から２１４番目までのアミノ酸配列に相当し、配列番号３はＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｏ１８４２３の１６０番目から２９７番目までのアミノ酸配列に相当する。また配列番号３に記載の配列からなるタンパク質は、膜孔形成毒素（Ｐｏｒｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎ）である天然型Ｌｙｓｎを無毒化し、安全性を高めたタンパク質である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０巻、２４０７２－２４０８４頁、２００５年）。

【0026】

本発明においてスフィンゴミエリン結合性タンパク質とは、天然に存在するスフィンゴミエリン結合性タンパク質（その部分領域も含む、以下同様）に限らず、スフィンゴミエリン結合能を有する限り、前記タンパク質においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上有してもよい（以下、「スフィンゴミエリン結合性タンパク質変異体」とも表記する）。なお前記アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加は、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行なうことができる。

【0027】

スフィンゴミエリン結合性タンパク質変異体の具体例として、以下の（ｉ）または（ｉｉ）に示す、スフィンゴミエリン結合能を有したタンパク質があげられる。
（ｉ）配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したタンパク質；
（ｉｉ）配列番号１または３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質。

【0028】

前記（ｉ）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上３個以下のいずれかを意味する。また前記（ｉ）に記載の「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。

【0029】

（ｉ）に記載の「置換」の例として、配列番号１の８番目のバリンおよび６９番目のリジンのシステインへの置換があげられる（配列番号２）。なお当該置換は、膜孔形成毒素（Ｐｏｒｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎ）である天然型のＥｑｔＩＩ（配列番号１）を無毒化し、安全性を高める置換である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻、４６５０９－４６５１７頁、２００４年）。

【0030】

（ｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本発明において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。アミノ酸配列間の同一性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の類似性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。

【0031】

スフィンゴミエリン認識分子１分子当たりに含まれるスフィンゴミエリン結合性タンパク質の数に制限はないが、スフィンゴミエリンへの親和性が高く、かつ大腸菌での組換えタンパク質を用いた作製も容易な点で、３個以上９個以下が好ましい。認識分子１分子当たりに含まれるスフィンゴミエリン結合性タンパク質の種類も制限はなく、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＥｑｔＩＩ、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる無毒化ＥｑｔＩＩ（以下、「ＮＴ－ＥｑｔＩＩ」とも表記）および配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＬｙｓｎのＣ末端側ドメイン（無毒化Ｌｙｓｎ、以下「ＮＴ－Ｌｙｓｎ」とも表記）から選択される、いずれか２つ以上をスフィンゴミエリン認識分子１分子あたりに含んでもよい。また、１つのスフィンゴミエリン認識分子固定化担体中に使用されるスフィンゴミエリン認識分子の種類に制限はなく、２種類以上のスフィンゴミエリン認識分子が固定化されていてもよい。

【0032】

本発明のスフィンゴミエリン結合性タンパク質の具体例として、配列番号４および５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。なお配列番号４のうち、５番目から１８３番目までがＮＴ－ＥｑｔＩＩ（配列番号２）のアミノ酸配列であり、１８９番目から２０２番目までがＧＳリンカーの配列であり、２０７番目から３２２番目はタンパク質タグＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢ［１１６残基］）のアミノ酸配列である。また配列番号５のうち、５番目から１４１番目までがＮＴ－Ｌｙｓｎ（配列番号３）の２番目から１３８番目までのアミノ酸配列であり、１４７番目から１６０番目までがＧＳリンカーの配列であり、１６５番目から２８０番目までがタンパク質タグＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのアミノ酸配列である。

【0033】

また本発明の細胞外小胞吸着剤において、不溶性担体上には、スフィンゴミエリン結合性タンパク質が細胞外小胞に対する特異的な結合能を有している限り、スフィンゴミエリンを認識しない物質（以下、「スフィンゴミエリン非結合性物質」とも表記）を結合（固定化）させてもよい。スフィンゴミエリン非結合性物質として、固定化補助タンパク質、ウシ血清アルブミンなど不溶性担体表面の非特異的な吸着を防ぐタンパク質、デキストランなどの担体表面の親水性を向上させる非タンパク質成分、を例示できる。このうち固定化補助タンパク質は、スフィンゴミエリン結合性タンパク質との結合能を有し、かつスフィンゴミエリン結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際に当該タンパク質の密度や配向を制御する機能を有したタンパク質である。１つのスフィンゴミエリン認識分子固定化担体におけるスフィンゴミエリン非結合性物質の結合数や種類に制限はなく、２種類以上のスフィンゴミエリン非結合性物質が固定化（結合）されていてもよい。

【0034】

不溶性担体に固定化するスフィンゴミエリン非結合性物質としては、スフィンゴミエリン結合性タンパク質の密度や配向を制御しスフィンゴミエリン結合性タンパク質の細胞外小胞への結合性を最適化する点で、固定化補助タンパク質が好ましく、３量体構造または９量体構造を有した固定化補助タンパク質が、スフィンゴミエリン結合性タンパク質の多価効果による親和性向上が得られ、かつ作製も容易な点から、さらに好ましい。

【0035】

Ｃ末端側に前述したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを付加したスフィンゴミエリン結合性タンパク質と、アビジンやストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を固定化した不溶性担体とを用いた場合における、固定化補助タンパク質の具体例として、配列番号６から８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。

【0036】

なお配列番号６のうち、５番目が前記不溶性担体へ固定化させる際のビオチン標識に用いるシステイン残基であり、１５番目から７２番目までがＳｐＡのＺドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目まで）のアミノ酸配列であり、７８番目から９２番目までがＧＳリンカーの配列であり、９５番目から１０８番目までがαヘリックスリンカー配列であり、１１６番目から１２８番目までが前述したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの結合性を有するタンパク質タグＳｐｙＴａｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ Ｃ［１３残基］）のアミノ酸配列である。

【0037】

また配列番号７のうち、５番目が前述したビオチン標識に用いるシステイン残基であり、１５番目から７２番目までがＳｐＡのＺドメイン、７８番目から９２番目まで、１１２番目から１２６番目まで、および１６２番目から１７６番目までがＧＳリンカー配列であり、１２９番目から１４２番目まで、および１７９番目から１９２番目までがαヘリックスリンカー配列であり、９５番目から１０７番目まで、１４５番目から１５７番目まで、および２００番目から２１２番目までがタンパク質タグＳｐｙＴａｇのアミノ酸配列である。

【0038】

また配列番号８のうち、５番目から１０番目までがポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までがＢＣ２ＬＣＮレクチンアミノ酸置換体の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列からなり、ただし当該アミノ酸配列において４０番目のグルタミンがロイシンに、８２番目のグルタミン酸がシステイン（前述したビオチン標識部位に相当）に、それぞれ置換した配列；特開２０２０－０２５５３５号公報）、１７６番目から１９０番目まで、２１０番目から２２４番目まで、および２６０番目から２７４番目までがＧＳリンカー配列であり、１９３番目から２０５番目まで、２４３番目から２５５番目まで、および２９８番目から３１０番目までがタンパク質タグＳｐｙＴａｇのアミノ酸配列であり、２２７番目から２４０番目まで、および２７７番目から２９０番目までがαヘリックスリンカー配列である。

【0039】

前述したスフィンゴミエリン結合性タンパク質および固定化補助タンパク質の製造法に特に制限はなく、例えば、特開２０１８－００００３８号公報で開示している、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。具体的には、スフィンゴミエリン結合性タンパク質または固定化補助タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドで宿主を形質転換し得られた形質転換体を培養して培養物（培養された形質転換体自体や分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる）を得る工程、
得られた培養物を遠心分離して得られる形質転換体を適切な緩衝液で懸濁し、界面活性剤などの薬剤による破砕や超音波による物理的破砕によって細胞を破砕後、遠心分離による破砕残渣の除去によりスフィンゴミエリン結合性タンパク質または固定化補助タンパク質を含む可溶性タンパク質抽出液を得る工程、
得られた可溶性タンパク質抽出液をアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、などの液体クロマトグラフィーにより精製する工程、
により、目的とするスフィンゴミエリン結合性タンパク質または固定化補助タンパク質を製造すればよい。

【0040】

組み換えスフィンゴミエリン結合性タンパク質および／または固定化補助タンパク質を生産可能な形質転換体を得るには、当業者が通常用いる方法でよく、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して当該タンパク質の発現ベクターを作製後、当該ベクターを用いて宿主を形質転換し、得ればよい。前記宿主は特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。好ましい大腸菌の一例として、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株があげられる。また、前記発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。

【0041】

スフィンゴミエリン認識分子を不溶性担体に固定化するための工程も、当業者が通常用いる一般的なものであれば特に制限はない。例えば、不溶性担体にマレイミド基やカルボキシ基等の反応性官能基を導入後、当該官能基にスフィンゴミエリン認識分子を直接固定化してもよいし、スフィンゴミエリン結合性タンパク質と固定化補助タンパク質とをＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのアミノ酸配列を含む多量体形成タンパク質を介して結合させスフィンゴミエリン認識分子を調製後、アビジン、ストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を導入した不溶性担体に、前記認識分子が有するビオチンを介して固定化してもよいし、反応性官能基を介して固定化補助タンパク質などのスフィンゴミエリン非結合性物質を不溶性担体に固定化後、スフィンゴミエリン結合性タンパク質をスフィンゴミエリン非結合性物質に結合させることで、前記不溶性担体に固定化してもよいし、不溶性担体にスフィンゴミエリン認識分子を接触させ、当該認識分子を物理的吸着によって不溶性担体に固定化してもよい。中でもスフィンゴミエリン結合性タンパク質において固定化補助タンパク質を介して不溶性担体に固定化させることで、スフィンゴミエリン認識分子を不溶性担体に固定化させると、固定化工程時の反応が穏やかになりスフィンゴミエリン結合性タンパク質の変性が少なくなる点、およびスフィンゴミエリン結合性タンパク質の担体上での配向や密度を制御できる点で、好ましい。

【0042】

本発明の細胞外小胞吸着剤に細胞外小胞を吸着させる工程については、当業者が通常用いる一般的な方法であれば特に制限はない。細胞外小胞を含む溶液は特に制限はなく、生体組織、培養した細胞などの生体に由来するものや、培地や緩衝液等の溶液に細胞外小胞を懸濁させたものであってもよい。前記細胞外小胞を含む溶液を調製するための溶媒は、細胞外小胞を安定な状態で保持可能であり、かつ本発明の吸着剤への細胞外小胞の吸着を阻害しなければ特に制限はないが、スフィンゴミエリン認識分子や溶液中に含まれる細胞外小胞の変性を防ぐ点で、ｐＨ６．０以上８．０以下に調製した緩衝液が好ましく、具体的にはＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ［４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）が例示できる。さらに前記溶媒は、スフィンゴミエリン認識分子と溶液中成分との非特異的吸着を防ぐために界面活性剤をさらに含んでもよく、具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下の非イオン性界面活性剤をさらに含んでもよい。非イオン性界面活性剤の好ましい例として、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）があげられる。

【0043】

本発明の細胞外小胞吸着剤と細胞外小胞を含む溶液とを接触させる温度は、細胞外小胞やスフィンゴミエリン認識分子の変性を防ぐ点で２℃以上４０℃以下が好ましい。また本発明の細胞外小胞吸着剤と細胞外小胞を含む溶液との接触時間は、スフィンゴミエリン認識分子と細胞外小胞が接触する時間を確保し、かつ細胞外小胞の変性を防ぐ点で、３０分以上２４時間以下が好ましく、１時間以上１２時間以下がより好ましい。

【0044】

本発明の細胞外小胞吸着剤に非特異的に吸着した夾雑物を除去する洗浄工程は、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。洗浄用の緩衝液やｐＨは、例えば、前記の細胞外小胞を含む溶液を調製するための溶媒と同様のものを用いればよい。温度についても、本発明の細胞外小胞吸着剤に細胞外小胞を吸着させる工程と同様に実施すればよい。

【0045】

本発明の細胞外小胞吸着剤に吸着した細胞外小胞を検出する工程も特に制限はなく、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。具体的には、細胞外小胞に特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法やＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法により細胞外小胞を検出する方法が例示できる。

【0046】

ウェスタンブロッティング法で検出する場合は、例えば、適当な緩衝液を用いて本発明の吸着剤から細胞外小胞を溶出させ、電気泳動に供した後、細胞外小胞マーカーに対する抗体を用いて検出すればよい。本発明の細胞外小胞吸着剤から細胞外小胞を溶出するには、数百ｍＭのアルギニンを含む、前記の細胞外小胞を含む溶液を調製するための溶媒等を用いる方法の他、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）などの変性剤によりスフィンゴミエリン認識分子を変性させ、細胞外小胞を溶出させる方法が例示できる。細胞外小胞の検出は、例えば、細胞外小胞を含む溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分離し、タンパク質をメンブランに転写した後、細胞外小胞マーカーに対する抗体を用いて検出すればよい。

【0047】

ＥＬＩＳＡ法で行なう場合は、細胞外小胞が吸着した本発明の細胞外小胞吸着剤を固相とし、前記細胞外小胞を含む溶液を調製するための緩衝液等により適宜希釈した抗体を添加し、複合体上の細胞外小胞を抗体により検出すればよい。抗体の検出方法としては、比色法や蛍光法など当業者が通常用いる方法で行なえばよい。抗体の反応温度および反応時間も当業者が通常用いる方法で行なえばよく、抗体やＥＬＩＳＡ法における複合体の安定性が高い点で、反応温度は４℃以上４０℃以下が、反応時間は３０分以上１２時間以下が好ましい。

【発明の効果】

【0048】

本発明の吸着剤は、スフィンゴミエリンが表面に存在する細胞外小胞に結合性を有するスフィンゴミエリン結合性タンパク質を含む、スフィンゴミエリン認識分子を不溶性担体に固定化したものであり、当該担体を用いることにより、細胞外小胞を含む溶液から細胞外小胞を選択的に、かつ高感度・高精度に検出・分離できる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】実施例１から１２および比較例１から３で作製した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質、固定化補助タンパク質、スフィンゴミエリン認識分子およびスフィンゴミエリン認識分子固定化担体の模式図。

【図2】実施例１０および比較例３の固定化担体を用いて、溶液中に含まれる細胞外小胞を検出した結果を示す図。

【図3】実施例１１および１２ならびに比較例１および２の固定化担体を用いて、溶液中に含まれる細胞外小胞を検出した結果を示す図。

【図4】実施例９および比較例２の固定化担体を用いて、培養上清中から分離した細胞外小胞を検出した結果を示す図。

【実施例0050】

以下、作製例、実験例、実施例および比較例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0051】

作製例１ スフィンゴミエリン結合性タンパク質の作製
スフィンゴミエリン結合性タンパク質として、以下の＜実施例１＞および＜実施例２＞に示すタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組換え技術を用いて発現させた。
＜実施例１＞無毒化イクイナトキシン（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ、配列番号２）とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢ［１１６残基］、ＳｐｙＣ）との融合タンパク質（（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ、配列番号４）
＜実施例２＞無毒化ライセニン（ＮＴ－Ｌｙｓｎ、配列番号３）とＳｐｙＣとの融合タンパク質（（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ、配列番号５）
以下、各分子の作製方法を詳細に説明する。

【0052】

＜実施例１＞（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号４）の作製
＜１＞Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＺドメイン（ＳｐＡ－Ｚ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）と（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号４）との融合タンパク質（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号９）を大腸菌で発現可能なベクターｐＥＴ＿（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣを作製した。

【0053】

＜２＞＜１＞で作製した発現ベクターｐＥＴ＿（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組換え大腸菌（形質転換体）を得た。

【0054】

＜３＞得られた形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（１０ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。

【0055】

＜４＞＜３＞の前培養液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）培地（２４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．１ｍＭ添加した後、一晩培養することで（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣを発現させた。

【0056】

＜５＞ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣの精製を、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行ない、限外ろ過フィルターを用いて保存用緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に置換した。

【0057】

＜６＞（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣからヒスチジンタグおよびＳｐＡ－Ｚを除去するため、ヒスチジンタグペプチドを融合したＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（メルク製）を用いてメーカープロトコルに従い（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣを消化した。

【0058】

＜７＞消化液に５ｍＭのイミダゾールを添加後、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することで、（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号４）溶液を得た。

【0059】

＜実施例２＞（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ、配列番号５）
＜１＞ＳｐＡ－Ｚと（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ（配列番号５）との融合タンパク質（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ（配列番号１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ（配列番号１１）を大腸菌で発現可能なベクターｐＥＴ＿（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣを作製した。

【0060】

＜２＞＜実施例１＞＜２＞に記載と同様な方法で（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ（配列番号１１）を発現可能な組換え大腸菌（形質転換体）を取得し、＜実施例１＞＜３＞から＜７＞に記載と同様な方法で（ＮＴ－Ｌｙｓｎ）－ＳｐｙＣ（配列番号５）溶液を得た。

【0061】

作製例２ 固定化補助タンパク質の作製
スフィンゴミエリン非結合性物質として、以下の＜Ａ＞から＜Ｃ＞に示す固定化補助タンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組換え技術を用いて発現させた。
＜Ａ＞Ｎ末端側にビオチン標識用システイン残基（Ｃｙｓ）を付加したＳｐＡ－ＺとＳｐｙＴａｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ Ｂ［１３残基］、ＳｐｙＴ）との融合タンパク質（Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ、配列番号６）
＜Ｂ＞Ｎ末端側にビオチン標識用システイン残基（Ｃｙｓ）を付加したＳｐＡ－Ｚと３コピーのＳｐｙＴとの融合タンパク質（Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ、配列番号７）
＜Ｃ＞ＢＣ２ＬＣＮレクチンアミノ酸置換体（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、ただし当該アミノ酸残基において４０番目のグルタミンがロイシンに、８２番目のグルタミン酸がシステイン（ビオチン標識用）に、それぞれ置換したポリペプチド）（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）と３コピーのＳｐｙＴとの融合タンパク質（（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ、配列番号８）
以下、各固定化補助タンパク質の作製方法を詳細に説明する。

【0062】

＜Ａ＞Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ（配列番号６）
＜Ａ－１＞Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ（配列番号６）をコードするポリヌクレオチドを、ｐＢＲ３２２系プラスミドのｐＧＥＸ（Ｃｙｔｉｖａ製）のマルチクローニングサイトに挿入した。なおｐＧＥＸは、マルチクローニングサイトの上流側にＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＱＬＶ９５７７８の１番目から２１８番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドおよびプロテアーゼ認識部位を有しており、前記挿入により、ＧＳＴとＣｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ（配列番号６）との融合タンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ（配列番号１３）を大腸菌で発現可能なベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴが得られる。ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に示す。

【0063】

＜Ａ－２＞＜Ａ－１＞で作製した発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴで大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、組換え大腸菌（形質転換体）を得た。

【0064】

＜Ａ－３＞得られた形質転換体を６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。

【0065】

＜Ａ－４＞＜Ａ－３＞の前培養液を６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加した後、５時間培養することで、ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴを発現させた。

【0066】

＜Ａ－５＞ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からのＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴの精製は、グルタチオン固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行なった。

【0067】

＜Ａ－６＞前記固定化担体に結合したＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴを、ＧＳＴ融合ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（メルク製）を用いてメーカープロトコルに従い消化し、上清を回収することで、Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ（配列番号６）溶液を得た。

【0068】

＜Ｂ＞Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号７）
＜Ｂ－１＞Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号７）をコードするポリヌクレオチドを、ｐＧＥＸ（Ｃｙｔｉｖａ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、ＧＳＴとＣｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号７）との融合タンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴ（配列番号１５）を大腸菌で発現可能なベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴを作製した。ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６に示す。

【0069】

＜Ｂ－２＞＜Ａ－２＞に記載と同様な方法でＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを発現可能な組換え大腸菌（形質転換体）を取得し、＜Ａ－３＞から＜Ａ－６＞に記載と同様な方法でＣｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号７）溶液を得た。

【0070】

＜Ｃ＞（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号８）
＜Ｃ－１＞（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号８）を大腸菌で発現可能なベクターｐＥＴ＿（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴを作製した。なお（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴは、ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２のＣ末端側に３コピーのＳｐｙＴａｇを付加した構造であり、ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２が３量体構造を形成することから、発現する組換えタンパク質１分子あたり９か所のＳｐｙＴａｇ配列を有する。

【0071】

＜Ｃ－２＞＜実施例１＞＜２＞に記載と同様な方法で（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号８）を発現可能な組換え大腸菌（形質転換体）を取得し、＜実施例１＞＜３＞および＜４＞に記載と同様な方法で（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴを発現させた。

【0072】

＜Ｃ－３＞ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴの精製を、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行なった。限外ろ過フィルターを用いて保存用緩衝液Ｄ－ＰＢＳ（＋）（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４）に置換することで、（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号８）溶液を得た。

【0073】

作製例３ スフィンゴミエリン認識分子固定化担体の作製
作製例１で作製したスフィンゴミエリン結合性タンパク質を、作製例２で作製した非スフィンゴミエリン非結合性物質（固定化補助タンパク質）を介して、不溶性担体に固定化することで、スフィンゴミエリン認識分子固定化担体を作製した。

【0074】

＜１＞スフィンゴミエリン認識分子の作製
作製例１で作製したスフィンゴミエリン結合性タンパク質と、作製例２で作製した非スフィンゴミエリン結合性タンパク質（固定化補助タンパク質）とを、以下に示す方法で結合させることで、不溶性担体に固定化させる、スフィンゴミエリン認識分子を作製した。なおスフィンゴミエリン認識分子の作製に用いた、スフィンゴミエリン結合性タンパク質と固定化補助タンパク質との組み合わせを表１にまとめる。

【0075】

【表1】

【0076】

＜１－１＞作製例２で作製した固定化補助タンパク質を、限外ろ過フィルターを用いてＤ－ＰＢＳ（＋）緩衝液に置換後、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、メーカープロトコルに従って、前記固定化補助タンパク質中に存在するシステイン残基のスルフヒドリル基にビオチンを標識した。

【0077】

＜１－２＞表１に記載の組み合わせに基づき、＜１－１＞で作製したビオチン標識固定化補助タンパク質と作製例１で作製したスフィンゴミエリン結合性タンパク質とを結合させた。具体的には、ビオチン標識固定化補助タンパク質およびスフィンゴミエリン結合性タンパク質を、それぞれ濃度０．３ｍｇ／ｍＬ以上となるよう、Ｄ－ＰＢＳ（＋）またはｐＨ７．０以上８．０以下のＴＢＳ－Ｔ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２））に懸濁し、両懸濁液を混合後、４℃で一昼夜以上放置することでタンパク質タグＳｐｙＴとＳｐｙＣの結合反応によりスフィンゴミエリン認識分子を作製した。なお混合時のモル比は、ビオチン標識固定化補助タンパク質１に対し、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を３（実施例３および６）または９（実施例４、５および７）とした。

【0078】

＜２＞スフィンゴミエリン認識分子の不溶性担体への固定化
＜２－１＞不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用い、当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））１００μＬを採取し、上清を除去した。

【0079】

＜２－２＞上清を除去した磁性粒子を、固定用緩衝液（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で洗浄した。

【0080】

＜２－３＞あらかじめ限外ろ過膜などを用いて固定用緩衝液に置換した＜１＞で作製したスフィンゴミエリン認識分子の溶液を、固定化補助タンパク質の濃度に換算して０．１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に調整後、＜２－２＞で洗浄した磁性粒子に、固定化補助タンパク質量に換算して４．５μｇ添加し、室温で１０分間混和した。

【0081】

＜２－４＞混和後上清を除去し、固定用緩衝液で３回洗浄後、エクソソーム結合用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］、ｐＨ７．３）で１回洗浄し、スフィンゴミエリン認識分子固定化担体を作製した。

【0082】

＜２－５＞コントロールとして、スフィンゴミエリン結合性タンパク質と結合していないビオチン標識固定化補助タンパク質を＜２－２＞で洗浄した磁性粒子に、＜２－３＞および＜２－４＞に記載と同様な方法で固定化し、前記固定化補助タンパク質固定化担体を作製した。

【0083】

なお固定化担体の作製に用いた、スフィンゴミエリン認識分子（実施例８から１２）またはビオチン標識固定化補助タンパク質（コントロール、比較例１から３）を表２に示す。

【0084】

【表2】

【0085】

実験例１ 細胞外小胞を含む溶液からの細胞外小胞の分離
＜１＞細胞外小胞溶液の調製
＜１－１＞前立腺がん細胞（ＰＣ３細胞）を５％ＣＯ_２環境下、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。

【0086】

＜１－２＞培養したＰＣ３細胞を２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地で懸濁後、６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで播種、懸濁し、さらに３日間培養した。

【0087】

＜１－３＞培養後、培養上清を全量（約２ｍＬ）回収し、３００×Ｇで１０分間、室温で遠心分離して浮遊細胞を除去後、上清１．５ｍＬを回収した（培養上清、以下「ＣＭ」とも表記）。

【0088】

＜１－４＞ＣＭをさらに３０００×Ｇで１０分間、４℃で遠心分離して細胞デブリを除去後、上清１．２ｍＬを回収した。回収した上清をさらに１６０００×Ｇで６０分間、４℃で遠心分離し、上清１ｍＬを別のチューブに移した。

【0089】

＜１－５＞別のチューブに移した上清１ｍＬとＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）１ｍＬとを混合し、２５９０００×Ｇで７０分間、４℃で超遠心分離し、上清１．８ｍＬを除去した。残った沈殿物をＰＢＳ１．８ｍＬで懸濁し、２５９０００×Ｇ、７０分間、４℃で超遠心分離して洗浄後、上清１．８ｍＬを除去し、残った沈殿物を含む０．２ｍＬを細胞外小胞溶液とした。

【0090】

＜２＞細胞外小胞の分離
＜２－１＞作製例３＜２＞で作製した固定化担体（表２）のうち、実施例１０から１２、ならびに比較例１から３のいずれかの固定化担体を入れた容器に、＜１＞で調製した細胞外小胞溶液２０μＬを添加後、当該容器を１０℃で３時間、振とうした。振とう後に７．５μＬの上清を採取し、これを「上清液」とした。

【0091】

＜２－２＞残りの上清も除去した後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で２回洗浄した。７．５μＬの２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）水溶液を添加し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌後、１５分間静置した。再度ボルテックスミキサーで撹拌し、７．５μＬの２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＴＴ非含有）（アトー製）を添加後、全量を回収し、これを「溶出液」とした。

【0092】

＜２－３＞上清液および溶出液を熱処理後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供した後、ＰＶＤＦ膜に転写を行い、３％のスキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔ緩衝液によりブロッキングを行った。なおＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施する際、細胞外小胞標品として＜１＞で調製した細胞外小胞溶液を同時に供した。

【0093】

＜２－４＞抗ＣＤ９マウス抗体を１次抗体とし、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗マウス抗体を２次抗体とした、ウェスタンブロットにより細胞外小胞を検出した。

【0094】

実施例１０および比較例３の固定化担体による細胞外小胞分離の結果を図２に、実施例１１および１２ならびに比較例１および２の固定化担体による細胞外小胞分離の結果を図３に、それぞれ示す。スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含む、スフィンゴミエリン認識分子を固定化した、実施例１０から１２の固定化担体で細胞外小胞分離を行なったときの溶出液（実施例１０：図２のレーン５、実施例１１：図３のレーン５、実施例１２：図３のレーン９）において、細胞外小胞標品（図２および図３のレーン１）に相当する明瞭なバンドを確認できた。一方、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含まない、固定化補助タンパク質のみを固定化した、比較例１から３の固定化担体で細胞外小胞分離を行なったときは、溶出液（比較例１：図３のレーン３、比較例２：図３のレーン７、比較例３：図１のレーン３）中に、細胞外小胞標品（図２および図３のレーン１）に相当するバンドは、略または全く確認できなかった。

【0095】

以上の結果より、不溶性担体と、当該担体に固定化した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質である、イクイナトキシン（ＥｑｔＩＩ）またはライセニン（Ｌｙｓｎ）を含む、スフィンゴミエリン認識分子とを含む、スフィンゴミエリン認識分子固定化担体が、細胞外小胞を選択的に捕捉できることがわかる。またスフィンゴミエリン認識分子固定化担体が細胞外小胞を選択的に捕捉できることから、当該固定化担体が溶液中に含まれる細胞外小胞を選択的に分離・検出できることが示唆される。

【0096】

実験例２ 細胞培養上清からの細胞外小胞の分離
＜１＞細胞培養上清の調製
＜１－１＞前立腺がん細胞（ＰＣ３細胞）を５％ＣＯ_２環境下、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。

【0097】

＜１－２＞培養したＰＣ３細胞を、１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（あらかじめ限外濾過膜処理によりエクソソームを除去済）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地に懸濁し、２日間培養後、培養上清を回収した。

【0098】

＜１－３＞回収した培養上清を３００×Ｇで５分間、４℃で遠心分離して浮遊細胞を除去後、上清を回収した。さらに１２００×Ｇで２０分間、４℃で遠心分離して細胞デブリを除去後、上清を回収した。

【0099】

＜１－４＞回収した上清をさらに１００００×Ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、粒径の大きい細胞外小胞を除去後、上清を回収し、これを「細胞培養上清」とした。

【0100】

＜２＞細胞外小胞の分離
＜２－１＞作製例３＜２＞で作製した固定化担体（表２）のうち、実施例９または比較例２の固定化担体をスラリーとして１００μＬ入れた容器に、＜１＞で調製した細胞培養上清７５０μＬを添加後、当該容器を１０℃で３時間、振とうした。

【0101】

＜２－２＞前記固定化担体に吸着しなかった上清を除去後、実験例１＜２－２＞と同様な方法で溶出液を取得した。

【0102】

＜２－３＞細胞培養上清および溶出液を熱処理後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に転写を行い、３％のスキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔ緩衝液によりブロッキングを行った。なおＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施する際、細胞外小胞標品として＜１＞で調製した細胞外小胞溶液を同時に供した。

【0103】

＜２－４＞実験１＜２－４＞に記載の抗体を用いた、ウェスタンブロットにより細胞外小胞を検出した。

【0104】

細胞外小胞分離の結果を図４に示す。スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含む、スフィンゴミエリン認識分子を固定化した、実施例９の固定化担体で細胞外小胞分離を行なったときの溶出液（レーン４）において、細胞外小胞標品（図４のレーン１）に相当する明瞭なバンドを確認できた。一方、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含まない、固定化補助タンパク質のみを固定化した、比較例２の固定化担体で細胞外小胞分離を行なったときは、溶出液（レーン３）に相当するバンドは確認できなかった。以上の結果より、スフィンゴミエリン認識分子固定化担体が、細胞培養上清中に含まれる細胞外小胞を選択的に分離できることが示唆される。

【0105】

また実施例９の固定化担体により分離した細胞外小胞のバンド（レーン４）は当該担体と接触する前の培養上清のバンド（レーン２）に比べ顕著にシグナル強度が強いことから、細胞培養上清中に含まれる細胞外小胞を前記固定化担体上に選択的に濃縮できることが示唆される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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