特開 2023-8900 酵母の産業適格性予測システム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023008900

(43)【公開日】2023-01-19

(54)【発明の名称】酵母の産業適格性予測システム及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230111BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 1/16 20060101ALI20230111BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230111BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 Z

C12M1/34 A

C12N1/00 Z

C12N1/16 Z

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022103985

(22)【出願日】2022-06-28

(31)【優先権主張番号】P 2021107905

(32)【優先日】2021-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(71)【出願人】

【識別番号】519127797

【氏名又は名称】三菱商事ライフサイエンス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100160978

【弁理士】

【氏名又は名称】榎本 政彦

(72)【発明者】

【氏名】大矢 禎一

(72)【発明者】

【氏名】大貫 慎輔

(72)【発明者】

【氏名】呉 俊元

(72)【発明者】

【氏名】増尾 直久

(72)【発明者】

【氏名】岩切 亮

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA27

4B029BB07

4B029CC01

4B029FA15

4B029GA08

4B029GB06

4B029GB10

4B063QA20

4B063QQ07

4B063QR66

4B063QR76

4B063QS07

4B063QS32

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA79X

4B065AC14

4B065BA30

4B065CA46

(57)【要約】      （修正有）

【課題】長時間培養による評価を行わず細胞の形質を評価することで、産業用途酵母の産業適格性を迅速に予測するシステム及び方法を提供する。
【解決手段】目的とする産業適格性が予め評価された酵母菌株の形態情報を取得し、教師ありの機械学習手法で産業適格性の有無判別モデルを作成することで、産業適格性不明の菌株の形態情報から該菌株の産業適格性を予測できる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第一装置により酵母細胞の画像及び、第二装置に第一装置からの教師データが与えられ、画像に基づく教師データを用いた学習により、酵母細胞の産業適格性を判定するシステムを具備することを特徴とする、酵母細胞の産業適格性を予測するシステム。

【請求項2】

前記第一装置は、酵母細胞の画像を取得する装置であって、酵母細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格をそれぞれ特異的に検出可能な蛍光試薬を用いて三重染色し、蛍光顕微鏡を用いることによって染色画像を取得する装置、又は明視野画像を取得する装置である、請求項１記載の学習システム。

【請求項3】

前記第二装置は、第一装置により得られた画像と目的の産業適格性のある酵母細胞とを関連付けたデータを教師データとして与えられることを特徴とする、請求項１又は２記載の学習システム。

【請求項4】

酵母細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格をそれぞれ特異的に検出可能な蛍光染色した染色画像、又は明視野画像を画像解析し、酵母細胞の形態学的な特徴に基づいて予め設定された形態パラメータについて、細胞形態定量解析値を求め、コンピュータに該解析値を、既知の生理状態の酵母細胞について予め取得しておいた細胞形態定量値を教師データとして用いた学習により、目的とする酵母の産業適格性を推論するモデルを作成し、産業適格性が未知である酵母の細胞形態定量解析値から、産業使用酵母の産業適格性を推論する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酵母、特に産業用途酵母の産業適格性を迅速に予測するシステム及び方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

細胞の状態を生きたままの状態で長期間にわたって顕微鏡により観察できる方法が実用化されている。こうした方法により、細胞の成長や分裂などの過程をリアルタイムで観察することができる。例えば、該細胞蛍光染色画像定量化方法より、培養中あるいは保存中の細胞形質変化を把握する用途も開発されている(特許文献1、非特許文献2)。

【0003】

また、酵母は、発酵、醸造などを行うことで、酵母エキス、味噌、醤油などの食品、ビールなどの酒類、さらに、グルタチオンなどの医薬品などの製造に用いられている。これらに使用される産業用の酵母の多くは、育種により特定の物質生産性に特化されているため、例えば、増殖が遅くなる、目的物質の生産性が低下するなど、不安定となるものが多い。

【0004】

酵母の産業利用適性の評価は、ジャーファーメンターなどで培養して、スケールアップ適性などを評価する方法が一般的である。しかし、ジャーファーメンターなどで培養での性質安定性確認は、長時間に渡って、培養を行う必要があるため、非常に時間と労力がかかる。さらに、培養結果は実験者や周囲環境(温度、湿度)など左右されやすいため、高精度の評価再現性を求めることが難しい。そこで、長時間培養評価を経由せず、迅速な評価手法が求められる。酵母の形態で、酵母の状態を把握する方法として、酵母細胞の細胞壁、細胞核およびアクチン細胞骨格の蛍光染色画像の定量化方法が開発されている(非特許文献1)。この方法より、酵母の形態に関する501パラメーターの数値を求めることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開2011-30494

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ohya Y. et al. : High-dimensional and large-scale phenotyping of yeast mutants. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005 Dec 27;102(52):19015-20.

【非特許文献2】Ohnuki S. et al. : Dynamic changes in brewing yeast cells in culture revealed by statistical analyses of yeast morphological data. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014 Mar;117(3):278-84.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、スケールアップによる培養適性や性質安定性の確認が長時間培養による評価を行わず、細胞の形質を評価することで、産業用に適した酵母であることを評価する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者たちは、上記課題の解決につき研究の結果、目的とする産業適格性が予め評価された酵母菌株の形態情報を取得し、教師ありの機械学習手法で産業適格性の有無判別モデルを作成することで、産業適格性不明の菌株の形態情報から該菌株の産業適格性の良さを予測できることを見出し、本発明に至った。

【0009】

本発明は、以下のように示す。
（１）第一装置により酵母細胞の蛍光染色画像及び、第二装置に第一装置からの教師データが与えられ、画像に基づく教師データを用いた学習により、酵母細胞の産業適格性を判定するシステムを具備することを特徴とする、酵母細胞の産業適格性を予測するシステム。
（２）前記第一装置は、酵母細胞の蛍光染色画像を取得する装置であって、酵母細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格をそれぞれ特異的に検出可能な蛍光試薬を用いて三重染色し、蛍光顕微鏡を用いることによって染色画像を取得する装置である、前記（１）記載の学習システム。
（３）前記第二装置は、第一装置により得られた染色画像と目的の産業適格性のある酵母細胞とを関連付けたデータを教師データとして与えられることを特徴とする、前記（１）又は（２）記載の学習システム。
（４） 酵母細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格をそれぞれ特異的に検出可能な蛍光染色した染色画像を画像解析し、酵母細胞の形態学的な特徴に基づいて予め設定された形態パラメータについて、細胞形態定量解析値を求め、コンピュータに該解析値を、既知の生理状態の酵母細胞について予め取得しておいた細胞形態定量値を教師データとして用いた学習により、目的とする酵母の産業適格性を推論するモデルを作成し、産業適格性が未知である酵母の細胞形態定量解析値から、産業使用酵母の産業適格性を推論する方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明によると、スケールアップによる培養適性や性質安定性の確認が長時間培養、スケールアップ培養等による評価を行わず、細胞の形質を評価することで、産業用に適した酵母であることを評価することができるため、酵母の産業適格性を迅速に予測することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】501パラメーターデータの主成分分析

【図2】モデルによるクラス分類

【図3】各菌株の安定・不安定判別スコア

【図4】菌株C01が安定になる確率(55%)

【図5】菌株C02が安定になる確率(84.49%)

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

【0013】

本発明に用いる酵母は、産業利用されている酵母であればいずれもであっても良く、例えば、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母、トルラ酵母などを挙げられる。なお、本発明の好ましい状態によれば、好ましくは、目的とする生産物に合わせて、育種された酵母である。育種の方法は、特に制限はないが、紫外線や薬剤などを利用して酵母細胞を変異させ、目的の酵母を選択してくる方法、目的の遺伝子を導入することにより変異体を作る方法、ゲノム編集などにより、特定箇所にランダム変異、目的変異などを生じさせる方法など、公知の育種方法により得られた酵母が特に好ましく適用することができる。

【0014】

本発明での産業適格性のある酵母とは、大量培養、長時間培養など、通常産業上で行われている酵母の培養や酵母を利用した発酵に利用できる酵母である。例えば、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母などの醸造に用いられる酵母であれば。酵母により生成される特定の成分量等が安定した酵母、製菓製パンに用いる酵母であれば、味質、パンのふくらみなどが安定する酵母、酵母エキスなどの調味料製造においては、長時間の培養耐性、抽出される酵母エキスの味質の安定性など各種酵母を用いて製造される産業において求められる酵母の特性を備えた酵母を示す。より具体的に、産業適格性のある酵母を例示すると、酵母菌体中のアミノ酸、核酸などの含量が特定の範囲内で収まること、抽出されるエキスのアミノ酸、核酸などの含量が特定の含量の範囲内に収まることを挙げることができる。また、このように特定成分の含量が特定の範囲内に収まること、長時間の培養においても、一定した増殖を示すことなどを本発明では酵母の安定性を有するとし、産業適格性を有するものとする。

【0015】

本発明の第一装置は、明視野画像を取得する装置又は酵母のカラー画像を取得する装置である。細胞観察において、カラー画像は、三重染色できる方法であれば良く、例えば、蛍光顕微鏡を用いることで得られる染色画像を挙げることができる。明視野画像を取得する装置は、一般的な光源を用いて、酵母細胞を透過又は反射した光について、その波長や強度の差によって画像化する方法である。染色する場合は、公知の方法(非特許文献1)により酵母細胞を、細胞の外輪、核およびアクチン細胞骨格を蛍光試薬で三重染色を行い、蛍光顕微鏡を用いることで細胞の染色画像を取得できる。

【0016】

本発明の第一装置では、得られた染色画像又は明視野画像の画像解析を行う。画像解析の方法は、非特許文献1に記載された形態パラメータから解析する。具体的には、酵母形態特徴に基づいて、予め設定された形態パラメータとは、細胞の大きさ、細胞と芽の大きさの比、核の位置、小さい芽を持つ細胞の割合などを評価できるように、酵母細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格に着目して、形態学的な見地から予め設定された形態501パラメータの数値を求められる（表３）。本発明の予測モデルに用いられるデータは501パラメータの全部またはそれらから選択される一部でも良い。選択するパラメータ数は任意であるが、通常は、過学習を防ぐため、２０から１００パラメータ、又は３０から５０パラメータを選択する。また選択するパラメータは、本願実施例で示した方法で選択するなど、当業者が適用するトルラ酵母の適正に合わせて選択できるパラメータで良い。

【0017】

本発明の第一装置で行われる画像解析は、酵母細胞の形態学的な特徴に基づいて、予め設定された形態パラメータについて、細胞形態定量の解析値を求めることができれば、その方法については、本発明では制限がない。通常は、得られた画像データをコンピュータ上の画像解析ソフトウエアで解析する。画像解析ソフトも任意のものが使用できるが、例えば、ＣａｌＭｏｒｐｈ（http://www.yeast.ib.k.u-tokyo.ac.jp/CalMorph/より入手できる）を使用することができる。使用方法などは、マニュアルに記載の方法で良い。

【0018】

次に第二装置に、第一装置で取得した既知の産業適格性のある酵母細胞の細胞形態定量値を機械学習させる。本発明は、酵母細胞の細胞形態定量値を教師データとする機械学習である。機械学習のアルゴリズムは、任意のものを採用することができる。例えば、ランダムフォレスター、サポートベクターマシン、k近傍法、線形判別法、ロジスティック回帰などを挙げられる。なお、本発明の好ましい状態によれば、線形判別法である。学習させる酵母の形態パラメータは、任意に選択することができる。例えば、長期間培養に耐性のある既知の酵母細胞の形態を取得する場合は、長期間安定の酵母細胞と不安定酵母細胞の形態定量値を線形判別により、分類する。例えば安定酵母細胞がClass I、不安定酵母細胞をClass IIのように分けることができるよう学習させる。

【0019】

本発明において、前述までに学習装置により、評価ターゲットとする酵母の細胞形態データを本発明の学習装置を利用することで、評価ターゲットとする酵母の特定形質から、当該酵母の産業適格性を予測することができる。モデル作成に用いられる目的とする既知の酵母の種類は多ければ多いほどモデルの予測精度を高めることができる。

【0020】

本発明の産業適格性を予測する方法は、スケールアップなどの産業規模で利用する酵母の予測の他に、酵母の育種工程においても利用することができる。例えば、アミノ酸の生産量が増加した酵母をスクリーニングしたあと、本発明を利用して、産業適格性を予測する。これにより、酵母のアミノ酸量と酵母の産業適格性を判別でき、目的とする酵母を容易に選別することができる。このように例示される方法など、産業用酵母育種工程において、本発明は、育種工程の効率改善にも貢献することができる。

【0021】

また、本発明では、産業適格性の精度を高めるために、学習に使用する既知の株、判定する未知の株ともに、合成培地で培養した後に、本発明を適用することが望ましい。合成培地とは、ペプトン、酵母エキスなどの天然素材を含まない化学的に規定された成分のみを含有する合成培地を用いることが好ましい。酵母用に一般に用いられている合成培地であれば特に制限なく使用できる。例えばトルラ酵母の場合、ＹＮＢ培地（イーストニトロジェンベース）、特許第６４２９６２７号に記載の合成培地などを例示することができる、合成培地で培養する時間は、適用する酵母に合わせて当業者が適宜選択できる時間で良く、天然培地成分の影響がなくなる時間であれば制限はない。

【0022】

また、判定の精度を高める方法として、判定する酵母種と異なる酵母種を産業適格性既知の酵母として利用することができる。例えば、トルラ酵母での産業適格性の判定制度を高める方法として、産業適格性既知の酵母として、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）基準として正規化前処理を行っても良い。このように、判定する酵母種と異なる、産業適格性既知の酵母種を使用することで、産業適格性の判定の精度を高めることができる。

【実施例0023】

以下の実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。
本発明はこれらを限定されるものではない。

【0024】

（培養安定性の予測方法）
長期培養安定性の予測モデルを作成するために、下記(表1)培養安定性既知となる酵母の形態データを取得した。

【0025】

（表１）培養安定性予測モデルの作成に用いられる酵母及びその性質

【0026】

形態データの取得マニュアルはhttp://www.yeast.ib.k.utokyo.ac.jp/CalMorph/software.htmlにより、入手できる。また、顕微鏡画像解析ソフト(CalMorph)も同サイトにより取得できる。501個の酵母形態パラメータの詳細内容は非特許文献1に記載されている。

【0027】

過剰学習を防ぐために、データの主成分分析を実施した。主成分累積率(Cumulative contribution ratio of PCA)90%になるまでの主成分(36主成分)を抽出し、機械学習・判別モデルの構築に用いた(図1)。

【0028】

線形判別法(LDA)を用いて、産業適格性既知のサンプルを教師データとして判別モデルを構築した。酵母がモデルにより、Class IとClass IIに分けられた(図2)。縦軸に安定の確率が示されている。Class I安定酵母はClass II不安定酵母より安定となる確率が著しく高いことが確認できた。

【0029】

育種段階で新たに取得できた培養安定性不明の二株C01,C02の形態情報を取得し、線形判別モデル(LDA)にて培養安定性を予測した。図３に示しているように、教師データ含め、すべての株の判別傾向を可視化した。横軸は各菌株名、縦軸は判別のスコアを示している。ここでは判別スコアが高ければ高いほど、菌株不安定になる可能性が大きい。赤色で示している安定株(S01、B02、B01、A02)と灰色で示している不安定株(A01、H01、H02、H03)は判別スコアによって、わかれている。また、安定性不明株C01がC02より判別スコアが高く、不安定となる可能性が大きいと考えられる。

【0030】

実際安定性不明の株について、n=5でサンプルデータを取得しているため、各サンプルから安定になる確率も算出できる。C01は図4、C02は図5に示されている。不安定確率は白色で、安定確率は灰色で示している。C01が安定となる確率は55%、C02が安定となる確率は84.49%と算出できた。

ジャーファーメンターにて実際の培養安定性テストも実施した。結果(表2)予測値と実測値が一致していることが確認できた。

【0031】

（表２） C01、C02培養安定性の予測値と実測値

【産業上の利用可能性】

【0032】

以上説明してきたように、本発明によると、機械学習手法で産業適格性の判別モデルを作成することで、長期間の培養評価を行わず、産業適格性が不明の菌株の形態情報から該菌株の産業適格性を迅速かつ正確に予測することが可能となる。

【0033】

（表３）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】