特開 2024-101170 抗菌ペプチドの製造方法、抗菌ペプチド組成物、飼料組成物及びその製造方法、抗菌ペプチド組成物の製造装置並びに飼料組成物の製造装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024101170

(43)【公開日】2024-07-29

(54)【発明の名称】抗菌ペプチドの製造方法、抗菌ペプチド組成物、飼料組成物及びその製造方法、抗菌ペプチド組成物の製造装置並びに飼料組成物の製造装置

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/435 20060101AFI20240722BHJP

   A23K 20/147 20160101ALI20240722BHJP

   A23K 10/20 20160101ALI20240722BHJP

【ＦＩ】

C07K14/435

A23K20/147 ZNA

A23K10/20

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023004955

(22)【出願日】2023-01-17

(71)【出願人】

【識別番号】000000206

【氏名又は名称】ＵＢＥ株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504132881

【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100145012

【弁理士】

【氏名又は名称】石坂 泰紀

(74)【代理人】

【識別番号】100211100

【弁理士】

【氏名又は名称】福島 直樹

(72)【発明者】

【氏名】中川 敦允

(72)【発明者】

【氏名】天竺桂 弘子

(72)【発明者】

【氏名】坂本 卓磨

【テーマコード（参考）】

2B150

4H045

【Ｆターム（参考）】

2B150AA03

2B150AA05

2B150AA06

2B150AA07

2B150AA08

2B150AB02

2B150AB03

2B150CD34

2B150DC23

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA51

4H045DA83

4H045EA06

4H045EA07

4H045FA71

(57)【要約】

【課題】抗菌ペプチドの新規な製造方法及び当該製造方法により得られる抗菌ペプチド組成物を提供すること。
【解決手段】本開示は、昆虫に熱傷を与える工程を含む、抗菌ペプチドの製造方法に関する。本開示はまた、セクロピンとディフェンシンとを含有する昆虫体液を含み、前記セクロピン含有量が、前記昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、１．９～２．５質量％であり、前記ディフェンシン含有量が、前記昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、０．５～２．０質量％である、抗菌ペプチド組成物に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

昆虫に熱傷を与える工程を含む、抗菌ペプチドの製造方法。

【請求項2】

前記昆虫がアメリカミズアブである、請求項１に記載の抗菌ペプチドの製造方法。

【請求項3】

前記熱傷を与える工程が、６０～８００℃に加熱した物体を、前記昆虫に５秒以下接触させることにより行われる、請求項１又は２に記載の抗菌ペプチドの製造方法。

【請求項4】

セクロピンとディフェンシンとを含有する昆虫体液を含み、
前記セクロピン含有量が、前記昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、１．９～２．５質量％であり、
前記ディフェンシン含有量が、前記昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、０．５～２．０質量％である、抗菌ペプチド組成物。

【請求項5】

アタシン及びディプテリシンからなる群より選択される少なくとも１種を更に含む、請求項４に記載の抗菌ペプチド組成物。

【請求項6】

昆虫に熱傷を与えることによって得られる、請求項４又は５に記載の抗菌ペプチド組成物。

【請求項7】

請求項４又は５に記載の抗菌ペプチド組成物を含む、飼料組成物。

【請求項8】

飼料又は飼料原料と、請求項１又は２に記載の抗菌ペプチドの製造方法によって得られる抗菌ペプチドと、を混合する工程を含む、飼料組成物の製造方法。

【請求項9】

昆虫に熱傷を与える加熱部を含む、抗菌ペプチド組成物の製造装置。

【請求項10】

熱傷を与えた昆虫又はその処理物と、飼料又は飼料原料とを混合する混合部を含む、飼料組成物の製造装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗菌ペプチドの製造方法に関する。本開示はまた、抗菌ペプチド組成物、飼料組成物及びその製造方法、抗菌ペプチド組成物の製造装置並びに飼料組成物の製造装置に関する。

【背景技術】

【0002】

畜産業、水産業等において用いられる飼料には、飼料変換効率（ＦＣＲ）向上等の観点から、抗生物質を添加することがある。しかし、抗生物質は、耐性菌発生の原因になり得るため、抗生物質に代わる代替手段として、抗菌活性を有するタンパク質又は抗菌活性を有するペプチドを飼料に配合する技術手段が提案されている。

【0003】

抗菌活性を有するペプチドを得る方法として、例えば、昆虫から取得する方法が挙げられる（特許文献１及び非特許文献１～２等）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００９／１３９３４６号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５２ （２０１５） ９８－１０６

【非特許文献2】Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７ （２０１７） １１５－１２４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

昆虫を用いて抗菌ペプチドを効率よく製造する方法については十分な検討がなされているとはいえない。

【0007】

本開示は、抗菌ペプチドの新規な製造方法、当該製造方法により得られる抗菌ペプチド組成物及び当該抗菌ペプチド組成物を含む飼料組成物を提供することを目的とする。本開示はまた、上記抗菌ペプチドを含む飼料組成物の製造方法を提供することも目的とする。本開示はまた、上記抗菌ペプチドを含む抗菌ペプチド組成物の製造装置及び上記飼料組成物の製造装置を提供することも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、以下の［１］～［１０］を提供する。
［１］
昆虫に熱傷を与える工程を含む、抗菌ペプチドの製造方法。
［２］
前記昆虫がアメリカミズアブである、［１］に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
［３］
前記熱傷を与える工程が、６０～８００℃に加熱した物体を、前記昆虫に５秒以下接触させることにより行われる、［１］又は［２］に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
［４］
セクロピンとディフェンシンとを含有する昆虫体液を含み、前記セクロピン含有量が、前記昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、１．９～２．５質量％であり、前記ディフェンシン含有量が、前記昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、０．５～２．０質量％である、抗菌ペプチド組成物。
［５］
アタシン及びディプテリシンからなる群より選択される少なくとも１種を更に含む、［４］に記載の抗菌ペプチド組成物。
［６］
昆虫に熱傷を与えることによって得られる、［４］又は［５］に記載の抗菌ペプチド組成物。
［７］
［４］～［６］のいずれかに記載の抗菌ペプチド組成物を含む、飼料組成物。
［８］
飼料又は飼料原料と、［１］～［３］のいずれかの抗菌ペプチドの製造方法によって得られる抗菌ペプチドと、を混合する工程を含む、飼料組成物の製造方法。
［９］
昆虫に熱傷を与える加熱部を含む、抗菌ペプチド組成物の製造装置。
［１０］
熱傷を与えた昆虫又はその処理物と、飼料又は飼料原料とを混合する混合部を含む、飼料組成物の製造装置。

【発明の効果】

【0009】

本開示によれば、抗菌ペプチドの新規な製造方法、当該製造方法により得られる抗菌ペプチド組成物及び当該抗菌ペプチド組成物を含む飼料組成物を提供することができる。本開示によれば、上記抗菌ペプチドを含む飼料組成物の製造方法を提供することができる。本開示によれば、上記抗菌ペプチドを含む抗菌ペプチド組成物の製造装置及び上記飼料組成物の製造装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】キイロショウジョウバエのディフェンシン（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７８９４８．３）と、ＮＭ＿０７８９４８．３に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブ（Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ）のディフェンシンと推定される転写物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列を示す図である。

【図2】キイロショウジョウバエのセクロピンＡ１（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９８４９．４）と、ＮＭ＿０７９８４９．４に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのセクロピンＡ１と推定される転写物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列を示す図である。

【図3】キイロショウジョウバエのセクロピンＡ２（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９８５０．４）と、ＮＭ＿０７９８５０．４に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのセクロピンＡ２と推定される転写物の、オープンリーディング領域に該当するアミノ酸配列を示す図である。

【図4】キイロショウジョウバエのセクロピンＣ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９８５２．３）と、ＮＭ＿０７９８５２．３に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのセクロピンＣと推定される転写物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列を示す図である。

【図5】キイロショウジョウバエのアタシンＡ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９０２１．５）と、ＮＭ＿０７９０２１．５に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのアタシンＡと推定される転写物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列を示す図である。

【図6】キイロショウジョウバエのディプテリシンＢ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９０６３．４）と、ＮＭ＿０７９０６３．４に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのディプテリシンＢと推定される転写物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列を示す図である。

【図7】ＤＬＰ１、ＤＬＰ２、ＤＬＰ３及びＤＬＰ４の配列及びｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマー作製位置を示す図である。

【図8】ＣＬＰ１、ＣＬＰ２、及びＣＬＰ３の配列及びｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマー作製位置を示す図である。

【図9】ＤＬＰ４のｍＲＮＡの相対発現量結果を示すグラフであり、（Ａ）は熱傷により刺激を与えた場合の結果、（Ｂ）は針刺しにより刺激を与えた場合の結果、（Ｃ）は菌注射により刺激を与えた場合の結果を示す。

【図10】ＣＬＰのｍＲＮＡの相対発現量結果を示すグラフであり、（Ａ）は熱傷により刺激を与えた場合の結果、（Ｂ）は針刺しにより刺激を与えた場合の結果、（Ｃ）は菌注射により刺激を与えた場合の結果を示す。

【図11】刺激ごとの体液抗菌活性の比較結果を示すグラフであり、（Ａ）は熱傷により刺激を与えた場合の結果、（Ｂ）は針刺しにより刺激を与えた場合の結果、（Ｃ）は菌注射により刺激を与えた場合の結果を示す。

【図12】（Ａ）は刺激後のアメリカミズアブ幼虫における体液中のペプチドの電気泳動画像を示す写真であり、（Ｂ）は図１２（Ａ）中の矢印で示される目的物の画像解析結果を示す図であり、（Ｃ）は（Ｂ）の拡大図を示す。

【図13】刺激後のアメリカミズアブ幼虫体液に含まれていたＤＬＰ４ペプチド断片の分析結果を示す図である。

【図14】刺激後のアメリカミズアブ幼虫体液に含まれていたＣＬＰペプチド断片の分析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本開示の一実施形態について説明する。ただし、以下の実施形態は、本開示を説明するための例示であり、本開示を以下の内容に限定する趣旨ではない。

【0012】

本明細書中、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書中に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。本明細書中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。個別に記載した上限値及び下限値は任意に組み合わせ可能である。数値範囲「Ａ～Ｂ」という表記においては、両端の数値Ａ及びＢがそれぞれ下限値及び上限値として数値範囲に含まれる。

【0013】

＜抗菌ペプチドの製造方法＞
本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、昆虫に熱傷を与える工程（熱傷工程）を含む。熱傷工程を含むことによって、昆虫の免疫機構を介した抗菌ペプチド生合成を促進することができる。

【0014】

本明細書において、「抗菌」とは、細菌の増殖を抑制することを意味する。抗菌活性は、例えば、シグモイド関数によるフィッティングを行い、増殖速度が最大になる時間（菌の増殖が最も活発な時間）を記録することによって評価することができる。Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ等の細菌は増殖する際、誘導期から対数増殖期を経て増殖停止する。対数増殖期に向かう際に、波長６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が立ち上がる。この際、増殖曲線が対数期に達するまでの時間を、式（１）に示す、時間tに対するシグモイド関数Ｓ（ｔ）の一次微分から求めることによって、抗菌活性を評価することができる。なお、シグモイド関数によるフィッティングは、Ｙｕｒｙ Ｖ． Ｂｕｋｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｒｅｓ． （２０１５） ８：１０２２－１０３０に記載の方法を参考にして変更を加えて適用することもできる。
Ｓ（ｔ）＝Ａｔａｎｈ｛α（ｔ－β）｝＋Ｂ ・・・（１）
式（１）中、Ａ，Ｂ，α，及びβは定数を示す。
Ｂ－Ａ：誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）におけるＯＤ値
Ｂ＋Ａ：静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）におけるＯＤ値
ａ：対数期（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）における傾きに影響する項
ｂ：対数期（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）に達するまでの時間に影響する項
ＯＤ値とは、波長６００ｎｍにおける吸光度である。

【0015】

本明細書において、「抗菌ペプチド」とは、抗菌活性を有するペプチドを意味する。昆虫は、病原微生物に対する免疫機構（液性免疫応答）を備えており、この防御系を活性化することで病原微生物から身を守っている。このような昆虫の液性免疫応答機構の二次反応における産物の一つとして、抗菌ペプチドが知られている。抗菌ペプチドは、アミノ酸がペプチド結合したものであり、細菌の侵入に対して脂肪体及び／又は血球で発現誘導されて体液中に分泌される。多くの抗菌ペプチドは、耐熱性で、幅広い抗菌スペクトルを持つことを特徴とする。

【0016】

抗菌ペプチドによる抗菌作用として、例えば、細胞質膜を標的にした次のような作用機序が提唱されている。グラム陰性菌ではリポ多糖を含む外膜、グラム陽性菌ではタイコ酸を含むペプチドグリカン層が、それぞれ負電荷を有するため、カチオン性である抗菌ペプチドはそこで集まる。次に、細菌の細胞膜であるリン脂質二重層表面の負電荷と静電相互作用し、結合する。抗菌ペプチドが細胞膜を貫通し、孔を空けて内容物であるイオンが流出する。膜電位が消失して恒常性を維持できずに細菌は死に至る。抗菌ペプチドは、構造的特徴を元に、いくつかのグループに分類できることが知られている。

【0017】

抗菌ペプチドは、例えば、セクロピンタイプ、高システイン含有タイプ、高グリシン含有タイプ、及び高プロリン含有タイプからなる群より選択される少なくとも１種の抗菌ペプチドであってよい。ここで、抗菌活性を熱傷により向上させる観点から、セクロピンタイプの抗菌ペプチド、高システイン含有タイプの抗菌ペプチド、又は高グリシンタイプの抗菌ペプチドであってよい。

【0018】

セクロピンタイプの抗菌ペプチドは、２個のαヘリックス構造を有する。セクロピンタイプの抗菌ペプチドのＮ末端側は、両親媒性であり、かつ、強塩基性である。セクロピンタイプの抗菌ペプチドのＣ末端側は疎水性に富んでいる。双翅目セクロピンの場合、ＱＳＥＡのアミノ酸配列がシグナルペプチドの末端配列となり、ここで切断されてｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅとなる。ｍａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅとなったセクロピンタイプの抗菌ペプチドの分子量は、３．０～５．８ｋＤａである。当該分子量は、セクロピンタイプの抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基の分子量の合計値である。セクロピンタイプの抗菌ペプチドは、Ｃ末端グリシン残基を有していてよく、当該Ｃ末端グリシン残基は、翻訳語修飾（例えば、酵素によるアミド化）を受けていてよい。Ｃ末端グリシン残基のアミド化は、ペプチダーゼによる分解の抑制、及び、αヘリックスとの水素結合の促進に寄与し得る。セクロピンタイプの抗菌ペプチドとしては、例えば、セクロピン、エンボシン、ザルコトキシンＩ、及びアンドロピンが挙げられる。セクロピンタイプの抗菌ペプチドは、セクロピンを含むことが好ましい。セクロピンは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５つのサブタイプに分けられる。

【0019】

高システイン含有タイプの抗菌ペプチドは、システイン残基を少なくとも６個持つ。ｍａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅとなった高システインタイプの抗菌ペプチドの分子量は、１．９～７．６ｋＤａである。当該分子量は、高システイン含有タイプの抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基の分子量の合計値である。高システインタイプの抗菌ペプチドとしては、例えば、ディフェンシン、ザーペシン、ロイヤリシン、ヘリオミシン、ドロソマイシン、サナチン、及びスカラベシンが挙げられる。高システインタイプの抗菌ペプチドは、次のようなシステイン安定化αβモチーフと呼ばれる構造モチーフを持つ。即ち、Ｎ末端から順にループ、αヘリックス及び２つのβシート構造をとる。加えて、２つのジスルフィド結合がＣ末端のβシートとαヘリックスとを接続し、３番目のジスルフィド結合がＮ末端のループを２番目のシートに接続する。これがプロテアーゼ及び熱に対する安定性を高めていると考えられる。高システインタイプの抗菌ペプチドはディフェンシンを含むことが好ましい。

【0020】

高グリシン含有タイプの抗菌ペプチドは、グリシン残基の含有率が高いこと、及び、システイン残基を含まないことを特徴とする。ｍａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅとなった高グリシン含有タイプの抗菌ペプチドの分子量は、６．４～４０．０ｋＤａである。当該分子量は、高グリシン含有タイプの抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基の分子量の合計値である。高グリシン含有タイプの抗菌ペプチドは、アタシンと、アタシン以外とに分類される。アタシンとしては、アタシン、酸性アタシン、塩基性アタシン、及びザルコトキシンＩＩ、ＩＩＩが挙げられる。アタシン以外の高グリシン含有タイプの抗菌ペプチドとしては、ディプテリシン、コレオプテリシン、及び、ヒメノプタエシンが挙げられる。アタシンは、グリシンに富むドメインであるＧ１、Ｇ２と呼ばれる少なくとも２つのＣ末端Ｇドメインを有する。一方、ディプテリシンのＣ末端部分は、グリシンに富むＧ２ドメインで構成されている。ディプテリシンのＮ末端には、短いプロリンに富むドメインであるＰドメインがある。高グリシン含有タイプの抗菌ペプチドは、アタシン及びディプテリシンからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。

【0021】

高プロリン含有タイプの抗菌ペプチドの多くは、プロリン残基の含有率が高く、システイン残基を含まないことを特徴とする。ｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅとなった高プロリン含有タイプの抗菌ペプチドの分子量は、１．３～５．０ｋＤａである。当該分子量は、高プロリン含有タイプの抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基の分子量の合計値である。高プロリン含有タイプの抗菌ペプチドとしては、アピダエシン、アバエシン、ドロソシン、メチニコウィン、レボシン、及び、メタルニコウィンが挙げられる。

【0022】

上記以外の抗菌ペプチドとしては、セラトトキシン、及びモリシンが挙げられる。

【0023】

昆虫は、昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）に属する生物である。熱傷を与える昆虫は、幼虫、前蛹、蛹、又は若虫であってよい。幼虫とは、昆虫が完全変態する過程における、孵化後、かつ、前蛹になる前のものをいう。前蛹とは、昆虫が完全変態する過程において、成虫に移る途中で、摂食停止から脱皮までのものをいう。蛹とは、昆虫が完全変態する過程において、成虫に移る途中で、摂食の停止及び脱皮後に静止しているものをいう。若虫とは、不完全変態昆虫の孵化後、かつ成虫になる前のものをいう。昆虫の性別は特に制限されず、雌であってもよく、雄であってもよい。

【0024】

昆虫の体重は、昆虫の種類等に応じて、適宜設定することができる。例えば、昆虫の体重は、１匹あたり、１００ｍｇ以上、１５０ｍｇ以上、２００ｍｇ以上、２５０ｍｇ以上、又は３００ｍｇ以上であってよく、４００ｍｇ以下であってもよい。

【0025】

昆虫は、双翅目（ハエ目）（Ｄｉｐｔｅｒａ）、蜻蛉目（Ｏｄｏｎａｔａ）、網翅目（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、半翅目（カメムシ目）（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、脈翅目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、膜翅目（ハチ目）（Ｄｉｐｔｅｒａ）、鞘翅目（コウチュウ目）（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、又は鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に属する昆虫であってよい。

【0026】

双翅目は、ハエカ科（Ａｎｉｓｏｐｏｄｉｄａｅ）、ハルカ科（Ｃｒａｍｐｔｏｎｏｍｙｉｉｄａｅ）、エゾカ科（Ｐａｃｈｙｎｅｕｒｉｄａｅ）、クチキカ科（Ａｘｙｍｙｉｉｄａｅ）、モリカ科（Ｈｙｐｅｒｏｓｃｅｌｉｄａｅ）、タケカ科（Ｍｙｃｅｔｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ホソタケカ科（Ｂｏｌｉｔｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ヒゲブトタケカ科（Ｃｅｒｏｐｌａｔｉｄａｅ）、オオタケカ科（Ｓｃｉｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ヒゲナガタケカ科（Ｍａｃｒｏｃｅｒｉｄａｅ）、タマカ科（Ｃｅｃｉｄｏｍｙｉｉｄａｅ）、クロカ科（Ｓｃｉａｒｉｄａｅ）、フルカ科（Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ）、ヒゲナガフルカ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｎｉｄａｅ）、ゴミカ科（Ｓｃａｔｏｐｓｉｄａｅ）、チョウカ科（Ｐｓｙｃｏｄｉｄａｅ）、ニセヒメカガンボ科（Ｔａｎｙｄｅｒｉｄａｅ）、コシボソカガンボ科（Ｐｔｙｃｈｏｐｔｅｒｉｄａｅ）、カガンボダマシ科（Ｔｒｉｃｏｃｈｅｒｉｄａｅ）、シリブトカガンボ科（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｏｍａｔｉｄａｅ）、カガンボ科（Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ）、ヒメカガンボ科（Ｌｉｍｎｏｂｉｉｄａｅ）、カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）、ホソカ科（Ｄｉｘｉｄａｅ）、ケヨソイカ科（Ｃｈａｏｂｏｒｉｄａｅ）、ユスリカ科（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ）、ユスリハエカ科（Ｔｈａｕｍａｌｅｉｄａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）、アミカ科（Ｂｌｅｐｈａｒｏｃｅｒｉｄａｅ）、ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｉｄａｅ）、クサアブ科（Ｃｏｅｎｏｍｙｉｉｄａｅ）、ナガレシギアブ科（Ａｔｈｅｒｉｃｉｄａｅ）、シギアブ科（Ｒｈａｇｉｏｎｉｄａｅ）、ツルギアブ科（Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ）、マドアブ科（Ｓｃｅｎｏｐｉｎｉｄａｅ）、ムシヒキアブ科（Ａｓｉｌｉｄａｅ）、キアブ科（Ｘｙｌｏｐｈａｇｉｄａｅ）、キアブモドキ科（Ｓｏｌｖｉｄａｅ）、アブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）、ツリアブ科（Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ）、コガシラアブ科（Ａｃｒｏｃｅｒｉｄａｅ）、ツリアブモドキ科（Ｎｅｍｅｓｔｒｉｎｉｄａｅ）、オドリバエ科（Ｅｍｐｉｄｉｄａｅ）、アシナガバエ科（Ｄｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ）、ヤリバエ科（Ｌｏｎｃｈｏｐｔｅｒｉｄａｅ）、ヒラタアシバエ科（Ｐｌａｔｙｐｅｚｉｄａｅ）、ノミバエ科（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、アタマバエ科（Ｐｉｐｕｎｃｕｌｉｄａｅ）、アブバエ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、ナガズヤセバエ科（Ｎｅｒｉｉｄａｅ）、マルズヤセバエ科（Ｍｉｃｒｏｐｅｚｉｄａｅ）、フトモモホソバエ科（Ｍｅｇａｍｅｒｉｎｉｄａｅ）、メバエ科（Ｃｏｎｏｐｉｄａｅ）、デガシラバエ科（Ｐｙｒｇｏｔｉｄａｅ）、ハネオレバエ科（Ｐｓｉｌｉｄａｅ）、ヤチバエ科（Ｓｃｉｏｍｙｚｉｄａｅ）、ハマベバエ科（Ｃｏｅｌｏｐｉｄａｅ）、ヒロクチバエ科（Ｐｌａｔｙｓｔｏｍａｔｉｄａｅ）、ベッコウバエ科（Ｄｒｏｍｙｚｉｄａｅ）、ツヤホソバエ科（Ｓｅｐｓｉｄａｅ）、ミバエ科（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、アブラコバエ科（Ｃｈａｍａｅｍｙｉｉｄａｅ）、シマバエ科（Ｌａｕｘａｎｉｉｄａｅ）、クロツヤバエ科（Ｌｏｎｃｈａｅｉｄａｅ）、チーズバエ科（Ｐｉｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ハモグリバエ科（Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ）、トゲハネバエ科（Ｈｅｌｅｏｍｙｚｉｄａｅ）、ヒゲブトコバエ科（Ｃｒｙｐｔｏｃｈａｅｔｉｄａｅ）、ショウジョウバエ科（ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ミギワバエ科（Ｅｐｈｙｄｒｉｄａｅ）、ホソショウジョウバエ科（Ｄｉａｓｔａｔｉｄａｅ）、ヒメコバエ科（Ｏｐｏｍｙｚｉｄａｅ）、キモグリバエ科（Ｃｈｌｏｒｏｐｉｄａｅ）、クチキバエ科（Ｃｌｕｓｉｉｄａｅ）、フンバエ科（Ｓｃａｔｏｐｈａｇｉｄａｅ）、ハナバエ科（Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、ヤドリバエ科（Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ）、ヒラタヤドリバエ科（Ｐｈａｓｉｉｄａｅ）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、ニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ）、シラミバエ科（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ）、コウモリバエ科（Ｓｔｒｅｂｌｉｄａｅ）、クモバエ科（Ｎｙｃｔｅｒｉｂｉｉｄａｅ）等に分類される。

【0027】

双翅目に属する昆虫は、短角亜目（ハエ亜目）（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）に属する昆虫であってよい。双翅目に属する昆虫は、ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）、ニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）に属する昆虫であってよい。ハエ目に属する昆虫としては、例えば、ミズアブ科に属するアメリカミズアブ、ニクバエ科に属するセンチニクバエ、イエバエ科に属するイエバエが挙げられる。

【0028】

蜻蛉目は、カワトンボ科（Ｃａｌｏｐｔｅｒｙｇｉｄａｅ）、ミナミカワトンボ科（Ｅｕｐｈａｅｉｄａｅ）、イトトンボ科（Ｃｏｅｎａｇｒｉｏｎｉｄａｅ）、ヤマイトトンボ科（Ｍｅｇａｐｏｄａｇｒｉｏｎｉｄａｅ）、アオイトトンボ科（Ｌｅｓｔｉｄａｅ）、モノサシトンボ科（Ｐｌａｔｙｃｎｅｍｉｄｉｄａｅ）、サナエトンボ科（Ｇｏｍｐｈｉｄａｅ）、ムカシトンボ科（Ｅｐｉｏｐｈｌｅｂｉｉｄａｅ）、ムカシヤンマ科（Ｐｅｔａｌｕｒｉｄａｅ）、オニヤンマ科（Ｃｏｒｄｕｌｅｇａｓｔｅｒｉｄａｅ）、ヤンマ科（Ａｅｓｃｈｎｉｄａｅ）、エゾトンボ科（Ｃｏｒｄｕｌｉｉｄａｅ）、ヤマトンボ科（Ｍａｃｒｏｍｉｉｄａｅ）、トンボ科（Ｌｉｂｅｌｌｕｌｉｄａｅ）等に分類される。

【0029】

網翅目は、網翅目カマキリ亜目（Ｍａｎｔｏｄｅａ）、網翅目ゴキブリ亜目（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）等に分類される。網翅目カマキリ亜目は、カマキリ科（Ｍａｎｔｉｄａｅ）、ヒメカマキリ科（Ａｃｒｏｍａｎｔｉｄａｅ）等に分類される。網翅目ゴキブリ亜目は、ゴキブリ科（Ｂｌａｔｔｉｄａｅ）、マダラゴキブリ科（Ｅｐｉｌａｍｐｒｉｄａｅ）、オガサワラゴキブリ科（Ｐｙｃｎｏｓｃｅｌｉｄａｅ）、チャバネゴキブリ科（Ｂｌａｔｔｅｌｌｉｄａｅ）、オオゴキブリ科（Ｐａｎｅｓｔｈｉｉｄａｅ）等に分類される。

【0030】

直翅目は、カマドウマ科（Ｒｈａｐｈｉｄｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、コロギス科（Ｇｒｙｌｌａｃｒｉｄａｅ）、キリギリス科）（Ｔｅｔｔｉｇｏｎｉｉｄａｅ）、コオロギ科（Ｇｒｙｌｌｉｄａｅ）、アリツカコオロギ科（Ｍｙｒｍｅｃｈｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ノミバッタ科（Ｔｒｉｄａｃｔｙｌｉｄａｅ）、ケラ科（Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐｉｄａｅ）、ヒシバッタ科（Ｔｅｔｒｉｇｉｄａｅ）、バッタ科（Ｌｏｃｕｓｔｉｄａｅ）等に分類される。

【0031】

半翅目は、半翅目カメムシ亜目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）、半翅目同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）等に分類される。

【0032】

半翅目カメムシ亜目は、ツチカメムシ科（Ｃｙｄｎｉｄａｅ）、マルカメムシ科（Ｐｌａｔａｓｐｉｄａｅ）、カメムシ科（Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ）、ツノカメムシ科（Ａｃａｎｔｈｏｓｏｍｉｄａｅ）、クヌギカメムシ科（Ｕｒｏｓｔｙｌｉｄａｅ）、ヘリカメムシ科（Ｃｏｒｅｉｄａｅ）、ナガカメムシ科（Ｌｙｇａｅｉｄａｅ）、オオホシカメムシ科（Ｌａｒｇｉｄａｅ）、ホシカメムシ科（Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ）、イトカメムシ科（Ｂｅｒｙｔｉｄａｅ）、ヒラタカメムシ科（Ａｒａｄｉｄａｅ）、マキバサシガメ科（Ｎａｂｉｄａｅ）、サシガメ科（Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ）、コバンムシ科（Ｎａｕｃｏｒｉｄａｅ）、タガメ科（Ｂｅｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ）、タイコウチ科（Ｎｅｐｉｄａｅ）、クビナガカメムシ科（Ｅｎｉｃｏｃｅｐｈａｌｉｄａｅ）、グンバイムシ科（Ｔｉｎｇｉｄａｅ）、ハナカメムシ科（Ａｎｔｈｏｃｏｒｉｄａｅ）、トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）、メクラカメムシ科（Ｍｉｒｉｄａｅ）、アメンボ科（Ｇｅｒｒｉｄａｅ）、イトアメンボ科（Ｈｙｄｒｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、カタビロアメンボ科（Ｖｅｌｉｉｄａｅ）、ケシミズカメムシ科（Ｈｅｂｒｉｄａｅ）、ミズカメムシ科（Ｍｅｓｏｖｅｌｉｉｄａｅ）、ムクゲカメムシ科（Ｄｉｐｓｏｃｏｒｉｄａｅ）、ミズギワカメムシ科（Ｓａｌｄｉｄａｅ）、メミズムシ科（Ｏｃｔｈｅｒｉｄａｅ）、ナベブタムシ科（Ａｐｈｅｌｏｃｈｅｉｒｉｄａｅ）、マツモムシ科（Ｎｏｔｏｎｅｃｔｉｄａｅ）、マルミズムシ科（Ｐｌｅｉｄａｅ）、タマミズムシ科（Ｈｅｌｏｔｒｅｐｈｉｄａｅ）、ミズムシ科（Ｃｏｒｉｘｉｄａｅ）等に分類される。

【0033】

半翅目同翅亜目は、セミ科（Ｃｉｃａｄｉｄａｅ）、ツノゼミ科（Ｍｅｍｂｒａｃｉｄａｅ）、アワフキムシ科（Ｃｅｒｃｏｐｉｄａｅ）、コガシラアワフキ科（Ｔｏｍａｓｐｉｄｉｄａｅ）、トゲアワフキ科（Ｍａｃｈａｅｒｏｔｉｄａｅ）、ミミズク科（Ｌｅｄｒｉｄａｅ）、オオヨコバイ科（Ｔｅｔｔｉｇｅｌｌｉｄａｅ）、カンムリヨコバイ科（Ｅｖａｃａｎｔｈｉｄａｅ）、ホソサジヨコバイ科（Ｎｉｒｖａｎｉｄａｅ／Ｐａｒａｂｏｌｏｐｏｎｉｄａｅ）、クロヒラタヨコバイ科（Ｐｅｎｔｈｉｍｉｉｄａｅ）、アオズキンヨコバイ科（Ｊａｓｓｉｄａｅ）、ヒロズヨコバイ科（Ｍａｃｒｏｐｓｉｄａｅ）、シダヨコバイ科（Ａｇａｌｌｉｉｄａｅ）、ブチミャクヨコバイ科（Ｄｒａｂｅｓｃｉｄａｅ）、ズキンヨコバイ科（Ｉｄｉｏｃｅｒｉｄａｅ）、ホシヨコバイ科（Ｘｅｓｔｏｃｅｐｈａｌｉｄａｅ）、ヒメヨコバイ科（Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ）、ヒラタヨコバイ科（Ａｐｈｒｏｄｉｄａｅ）、フクロクヨコバイ科（Ｈｅｃａｌｉｄａｅ）、フトヨコバイ科（Ｅｒｒｈｏｍｅｎｅｌｌｉｄａｅ）、ヨコバイ科（Ｄｅｌｔｏｃｅｐｈａｌｉｄａｅ）、アリヅカウンカ科（Ｔｅｔｔｉｇｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、シマウンカ科（Ｍｅｅｎｏｐｌｉｄａｅ）、ビワハゴロモ科（Ｆｕｌｇｏｌｉｄａｅ）、ハネナガウンカ科（Ｄｅｒｂｉｄａｅ）、コガシラウンカ科（Ａｃｈｉｌｉｄａｅ）、ウンカ科（Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ）、テングスケバ科（Ｄｉｃｔｙｏｐｈａｒｉｄａｅ）、ヒシウンカ科（Ｃｉｓｉｉｄａｅ）、グンバイウンカ科（Ｔｒｏｐｉｄｕｃｈｉｄａｅ）、アオバハゴロモ科（Ｆｌａｔｉｄａｅ）、マルウンカ科（Ｉｓｓｉｄａｅ）、ハゴロモ科（Ｒｉｃａｎｉｉｄａｅ）、キジラミ科（Ｐｓｙｌｌｉｄａｅ） 、コナジラミ科（Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ）、アブラムシ科（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ）、ワタフキカイガラムシ科（Ｍａｒｇａｒｏｄｉｄａｅ）、フクロカイガラムシ科（Ｅｒｉｏｃｏｃｃｉｄａｅ）、カタカイガラムシ科（Ｃｏｃｃｉｄａｅ）、カブラカイガラムシ科（Ｂｅｅｓｏｎｉｉｄａｅ）、マルカイガラムシ科（ Ｄｉａｓｐｉｄｉｄａｅ）等に分類される。

【0034】

脈翅目は、ラクダムシ科（Ｉｎｏｃｅｌｌｉｄａｅ）、センブリ科（Ｓｉａｌｉｄａｅ）、ヘビトンボ科（Ｃｏｒｙｄａｌｉｄａｅ）、カマキリモドキ科（Ｍａｎｔｉｓｐｉｄａｅ）、ツノトンボ科（Ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｅ）、ヒロバカゲロウ科（Ｏｓｍｙｌｉｄａｅ）、クサカゲロウ科（Ｃｈｒｙｓｏｐｉｄａｅ）、アミメカゲロウ科（Ｈｅｍｅｒｏｂｉｉｄａｅ）、ウスバカゲロウ科（Ｍｙｒｍｅｌｅｏｎｔｉｄａｅ）等に分類される。

【0035】

膜翅目は、ナギナタハバチ科（Ｘｙｅｌｉｄａｅ）、ヤドリキバチ科（Ｏｒｕｓｓｉｄａｅ）、ヨフシハバチ科（Ｂｌａｓｔｉｃｏｔｏｍｉｄａｅ）、キバチ科（Ｓｉｒｉｃｉｄａｅ）、クビナガキバチ科（Ｃｅｐｈｉｄａｅ）、ヒラタハバチ科（Ｐａｍｐｈ ｉｌｉｉｄａｅ）、ハバチ科（Ｔｅｎｔｈｒｅｄｉｎｉｄａｅ）、マツハバチ科（Ｄｉｐｒｉｏｎｉｄａｅ）、ミフシハバチ科（Ａｒｇｉｄａｅ）、コンボウハバチ科（Ｃｉｍｂｉｃｉｄａｅ）、コマユバチ科（Ｂｌａｃｏｎｉｄａｅ）、アブラバチ科（Ａｐｈｉｄｉｉｄａｅ）、ヒメバチ科（Ｉｃｈｎｅｕｍｏｎｉｄａｅ）、イチジクコバチ科（Ａｇａｏｎｉｄａｅ）、アシブトコバチ科（Ｃｈａｌｃｉｄｉｄａｅ）、シリアゲコバチ科（Ｌｅｕｃｏｓｐｉｄａｅ）、アリヤドリコバチ科（Ｅｕｃｈａｒｉｔｉｄａｅ）、オナガコバチ科（Ｔｏｒｙｍｉｄａｅ）、カタビロコバチ科（Ｅｕｒｙｔｏｍｉｄａｅ）、コガネコバチ科（Ｐｔｅｒｏｍａｌｉｄａｅ）、トビコバチ科（Ｅｎｃｙｒｔｉｄａｅ）、ホソナガコバチ科（Ｅｌａｓｍｉｄａｅ）、ヒメコバチ科（Ｅｕｌｏｐｈｉｄａｅ）、タマゴヤドリコバチ科（Ｔｒｉｃｈｏｇｒａｍｍａｔｉｄａｅ）、ホソバネヤドリコバチ科（Ｍｙｍａｒｉｄａｅ）、シリボソクロバチ科（Ｐｒｏｃｔｏｔｒｕｐｉｄａｅ）、ヒゲナガクロバチ科（Ｃｅｒａｐｈｒｏｎｉｄａｅ）、ハラビロヤドリバチ科（Ｐｌａｔｙｇａｓｔｅｒｉｄａｅ）、クロタマゴバチ科（Ｓｃｅｌｉｏｎｉｄａｅ）、アリ科（Ｆｏｒｍｉｃｉｄａｅ）、タマバチ科（Ｃｙｎｉｐｉｄａｅ）、カギバラバチ科（Ｔｒｉｇｏｎａｌｉｄａｅ）、カマバチ科（Ｄｒｙｉｎｉｄａｅ）、コツチバチ科（Ｔｉｐｈｉｉｄａｅ）、コンボウヤセイバチ科（Ｇａｓｔｅｒｕｐｔｉｏｎｉｄａｅ）、アリバチ科（Ｍｕｔｉｌｌｉｄａｅ）、アリガタバチ科（Ｂｅｔｈｙｌｉｄａｅ）、セイボウ科（Ｃｈｒｙｃｉｄｉｄａｅ）、セイボウモドキ科（Ｃｌｅｐｔｉｄａｅ）、ベッコウバチ科（Ｐｏｍｐｉｌｉｄａｅ）、ツチバチ科（Ｓｃｏｌｉｄａｅ）、スズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄａｅ）、ジガバチ科（Ｓｐｈｅｃｉｄａｅ）、ヒメハナバチ科（Ａｎｄｒｅｎｉｄａｅ）、ミツバチモドキ科（Ｃｏｌｌｅｔｉｄａｅ）、ケアシハナバチ科（Ｍｅｌｉｔｔｉｄａｅ）、ハキリバチ科（Ｍｅｇａｃｈｉｌｉｄａｅ）、コハナバチ科（Ｈａｌｉｃｔｉｄａｅ）、コシブトハナバチ科（Ａｎｔｈｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）等に分類される。

【0036】

鞘翅目は、ナガヒラタムシ科（Ｃｕｐｅｄｉｄａｅ）、セスジムシ科（Ｒｈｙｓｏｄｉｄａｅ）、ヒゲブトオサムシ科（Ｐａｕｓｓｉｄａｅ）、ハンミョウ科（Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ）、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、ヒョウタンゴミムシ科（Ｓｃａｒｉｔｉｄａｅ）、ゴミムシ科（Ｈａｒｐａｌｉｄａｅ）、ホソクビボミムシ科（Ｂｒａｃｈｉｎｉｄａｅ）、コガシラミズムシ科（Ｈａｌｉｐｌｉｄａｅ）、コツブゲンゴロウ科（Ｎｏｔｅｒｉｄａｅ）、ゲンゴロウ科（Ｄｙｔｉｓｃｉｄａｅ）、ミズスマシ科（Ｃｙｒｉｎｉｄａｅ）、ガムシ科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、エンマムシモドキ科（Ｓｙｎｔｅｌｉｉｄａｅ）、エンマムシ科（Ｈｉｓｔｅｒｉｄａｅ）、チビシデムシ科（Ｃａｔｏｐｉｄａｅ）、シデムシ科（Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ）、デオキノコムシ科（Ｓｃａｐｈｉｄｉｉｄａｅ）、ハネカクシ科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ）、クワガタムシ科（Ｌｕｃａｎｉｄａｅ）、クロツヤムシ科（Ｐａｓｓａｌｉｄａｅ）、コブスジコガネ科（Ｔｒｏｇｉｄａｅ）、センチコガネ科（Ｇｅｏｔｒｕｐｉｄａｅ）、コガネムシ科（ Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）、マルハナノミ科（Ｈｅｌｏｄｉｄａｅ）、マルトゲムシ科（Ｂｙｒｒｈｉｄａｅ）、ヒラタドロムシ科（Ｐｓｅｐｈｅｎｉｄａｅ）、ナガハナノミ科（Ｐｔｉｌｏｄａｃｔｙｌｉｄａｅ）、ドロムシ科（Ｄｒｙｏｐｉｄａｅ）、ヒメドロムシ科（Ｅｌｍｉｄａｅ）、クシヒゲムシ科（Ｒｈｉｐｉｃｅｒｉｄａｅ）、タマムシ科（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）、コメツキムシ科（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ） 、コメツキダマシ科（Ｅｕｃｎｅｍｉｄａｅ）、ホタルモドキ科（Ｄｒｉｌｉｄａｅ）、ホタル科（Ｌａｐｙｒｉｄａｅ） 、ジョウカイボン科（Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ）、ベニボタル科（Ｌｙｃｉｄａｅ）、ヒメトゲムシ科（Ｎｏｓｏｄｅｎｄｒｉｄａｅ）、カツオブシムシ科（Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ）、シバンムシ科（Ａｎｏｂｉｉｄａｅ）、ヒョウホンムシ科（Ｐｔｉｎｉｄａｅ）、ナガシンクイムシ科（Ｂｏｓｔｒｙｃｈｉｄａｅ）、ヒラタキクイムシ科（Ｌｙｃｔｉｄａｅ）、コクヌスト科（Ｔｒｏｇｏｓｉｔｉｄａｅ）、カッコウムシ科（Ｃｌｅｒｉｄａｅ）、ジョウカイモドキ科（Ｍｅｌｙｒｉｄａｅ）、ツツシンクイムシ科（Ｌｙｍｅｘｙｌｉｄａｅ）、ケシキスイ科（Ｎｉｔｉｄｕｌｉｄａｅ）、ネスイムシ科（Ｒｈｉｚｏｐｈａｇｉｄａｅ）、ヒラタムシ科（Ｃｕｃｕｊｉｄａｅ）、ホソヒラタムシ科（Ｓｉｌｖａｎｉｄａｅ）、オオキスイ科（Ｈｅｌｏｔｉｄａｅ）、キスイムシ科（Ｃｒｙｐｔｏｐｈａｇｉｄａｅ）、キスイモドキ科（Ｂｙｔｕｒｉｄａｅ）、コメツキモドキ科（Ｌａｎｇｕｒｉｉｄａｅ）、オオキノコムシ科（Ｅｒｏｔｙｌｉｄａｅ）、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）、テントウダマシ科（Ｅｎｄｏｍｙｃｈｉｄａｅ）、コキノコムシ科（Ｍｙｃｅｔｏｐｈａｇｉｄａｅ）、ホソカタムシ科（Ｃｏｌｙｄｉｉｄａｅ）、ゴミムシダマシ科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ）、ハムシダマシ科（Ｌａｇｒｉｉｄａｅ）、クチキムシ科（Ａｌｌｅｃｕｌｉｄａｅ）、コフゴミムシダマシ科（Ｚｏｐｈｅｒｉｄａｅ）、ツヤキカワムシ科（Ｂｏｒｉｄａｅ）、クチキムシダマシ科（Ｅｌａｃａｔｉｄａｅ）、キカワムシ科（Ｐｙｔｈｉｄａｅ）、アカハネムシ科（Ｐｙｒｏｃｈｒｏｉｄａｅ）、キノコムシダマシ科（Ｔｅｔｒａｔｏｍｉｄａｅ）、ナガクチキムシ科（Ｍｅｌａｎｄｒｙｉｄａｅ）、ハナノミ科（Ｍｏｒｄｅｌｌｉｄａｅ）、オオハナノミ科（Ｒｈｉｐｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、クビナガムシ科（Ｃｅｐｈａｌｏｉｄａｅ）、ツチハンミョウ科（Ｃｅｐｈａｌｏｉｄａｅ）、カミキリモドキ科（Ｏｅｄｅｍｅｒｉｄａｅ）、イッカクチュウ科（Ａｎｔｈｉｃｉｄａｅ）、カミキリムシ科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）、マメゾウムシ科（Ｂｒｕｃｈｉｄａｅ）、ハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）、ヒゲナガゾウムシ科（Ａｎｔｈｒｉｂｉｄａｅ）、オトシブミ科（Ａｔｔｅｌａｂｉｄａｅ）、ミツギリゾウムシ科（Ｂｒｅｎｔｈｉｄａｅ）、ホソクチゾウムシ科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ）、キクイムシ科（Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ）、ナガキクイムシ科（Ｐｌａｔｙｐｏｄｉｄａｅ）等に分類される。

【0037】

鞘翅目に属する昆虫は、ゴミムシダマシ科に属する甲虫であってよい。ゴミムシダマシ科に属する昆虫としてはチャイロコメノゴミムシダマシが挙げられる。鞘翅目に属する昆虫は、ゴミムシダマシ科に属する甲虫の幼虫であるミールワームであってよい。

【0038】

鱗翅目は、コバネガ科（Ｍｉｃｒｏｐｔｅｒｙｇｉｄａｅ）、スイコバネ科（Ｅｒｉｏｃｒａｎｉｉｄａｅ）、コウモリガ科（Ｈｅｐｉａｌｉｄａｅ）、マガリガ科（Ｉｎｃｕｒｖａｒｉｉｄａｅ）、ヒゲナガガ科（Ａｄｅｌｉｄａｅ）、ムグリチビガ科（Ｓｔｉｇｍｅｌｌｉｄａｅ）、ツヤコガ科（Ｈｅｌｉｏｚｅｌｉｄａｅ）、ムモンムグリガ科（Ｔｉｓｃｈｅｒｉｉｄａｅ）、ヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａｅ）、ミノガ科（Ｐｓｙｃｈｉｄａｅ）、ツマオレガ科（Ｌｙｏｎｅｔｉｉｄａｅ）、クチブサガ科（Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）、スガ科（Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔｉｄａｅ）、キヌバコガ科（Ｓｅｙｔｈｉｒｉｄａｅ）、ササベリガ科（Ｅｐｅｒｍｅｎｉｉｄａｅ）、クサムグリガ科（Ｅｌａｃｈｉｓｔｉｄａｅ）、ホソガ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉｉｄａｅ）、ツツミノガ科（Ｃｏｌｅｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、ハマキモドキガ科（Ｇｌｙｐｈｉｐｔｅｒｙｇｉｄａｅ）、マイコガ科（Ｈｅｌｉｏｄｉｎｉｄａｅ）、スカシバガ科（Ａｅｇｅｒｉｉｄａｅ）、トガリホソガ科（Ｃｏｓｍｏｐｔｅｒｙｇｉｄａｅ）、キバガ科（Ｇｅｌｅｃｈｉｉｄａｅ）、ヒロバキバガ科（Ｘｙｌｏｒｙｅｔｉｄａｅ）、ネマルハガ科（Ｂｌａｓｔｏｂａｓｉｄａｅ）、マルハキバガ科（Ｏｅｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、ボクトウガ科（Ｃｏｓｓｉｄａｅ）、シンクイガ科（Ｃａｒｐｏｓｉｎｉｄａｅ）、ノコメハマキガ科（Ｅｕｃｏｓｍｉｄａｅ）、ハマキガ科（Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ）、ホソハマキガ科（Ｐｈａｌｏｎｉｉｄａｅ）、マドガ科（Ｔｈｙｒｉｄｉｄａｅ）、メイガ科（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ）、トリバガ科（Ｐｔｅｒｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、ニジュウシトリバガ科（Ａｌｕｃｉｔｉｄａｅ）、マダラガ科（Ｚｙｇａｅｎｉｄａｅ）、セミヤドリガ科（Ｅｐｉｐｙｒｏｐｉｄａｅ）、イラガ科（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｄａｅ）、ツバメガ科（Ｕｒａｎｉｉｄａｅ）、フタオガ科（Ｅｐｉｐｌｅｍｉｄａｅ）、アゲハモドキガ科（Ｅｐｉｃｏｐｅｉｄａｅ）、シャクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、カギバガ科（Ｄｒｅｐａｎｉｄａｅ）、トガリバガ科（Ｔｈｙａｔｉｒｉｄａｅ）、イカリモンガ科（Ｃａｌｌｉｄｕｌｉｄａｅ）、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）、オビガ科（Ｅｕｐｔｅｒｏｔｉｄａｅ）、カレハガ科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、ドクガ科（Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ）、シャチホコガ科（Ｎｏｔｏｄｏｎｔｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、トラガ科（Ａｇａｒｉｓｔｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｔｉｉｄａｅ）、ヒトリモドキガ科（Ａｇａｎａｉｄａｅ）、コブガ科（Ｎｏｌｉｄａｅ）、カノコガ科（Ａｍａｔｉｄａｅ）、イボタガ科（Ｂｒａｈｍａｅｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、スズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）、セセリチョウ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ）、ジャノメチョウ科（Ｓａｔｙｒｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、マダラチョウ科（Ｄａｎａｉｄａｅ）、テングチョウ科（Ｌｉｂｙｔｈｅｉｄａｅ）、シジミチョウ科（Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ）、シロチョウ科（Ｐｉｅｒｉｄａｅ）、アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ） 等に分類される。

【0039】

昆虫は、抗菌活性、入手が容易であること、工業的に好適な方法で製造しやすいこと、熱傷が与えやすいこと、家畜のタンパク質源としても利用し得ること等から、アメリカミズアブ、センチニクバエ、イエバエ、及びチャイロコメノゴミムシダマシ（例えば、チャイロコメノゴミムシダマシの幼虫であるミールワーム）からなる群より選択される少なくとも１種であってよく、工業的な養殖が比較的容易であることから、アメリカミズアブ、イエバエ、及びミールワームからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、アメリカミズアブであることがより好ましい。アメリカミズアブは、ミールワーム等と比べて発達サイクルが短く、工業的な量産に有利である。また、アメリカミズアブは、イエバエ等と比べて大きく成長しやすいことから、熱傷を与えやすいという利点を有する。

【0040】

昆虫に熱傷を与える方法は、昆虫の外皮表面近傍が損傷する条件で行われる。熱傷を与える条件は、熱傷を与えた時点又は熱傷を与えた直後に昆虫が死亡しない条件であることが好ましい。

【0041】

昆虫に熱傷を与える方法としては、例えば、昆虫の体表面に、熱源を接触させる方法が挙げられる。熱源は、例えば、加熱した物体であってよく、加熱した針、加熱した網状の金属又は加熱したローラー等であってよい。

【0042】

本実施形態に係る方法において、抗菌ペプチドは、熱傷を与えることによって昆虫の表皮組織が損傷し、損傷した自己組織から放出されたダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）が、ペプチドグリカン認識タンパク質に認識され、Ｔｏｌｌ経路及び／又はＩｍｄ経路を介して生成されると考えられる。但し、本実施形態に係る方法によって抗菌ペプチドが生成するメカニズムはこれに限定されない。

【0043】

昆虫の体表面に接触させる熱源の温度は、加熱した物体の温度は、表皮組織が熱傷により損傷を受ける温度であればよく、６０℃以上であってよい。

【0044】

熱傷工程は、６０～８００℃に加熱した物体を昆虫に接触させることにより行われることが好ましい。

【0045】

昆虫と加熱した物体とが接触する時間は、当該物体の温度等に応じて適宜設定することができる。昆虫と加熱した物体とが接触する時間は、例えば、５秒以下、１秒以下又は０．５秒以下であってよい。

【0046】

熱傷工程は、６０～８００℃に加熱した物体を、昆虫に５秒以下接触させることにより行われることが好ましい。例えば、３００℃以上（例えば、３００～８００℃）に加熱した物体を昆虫に接触させる場合、昆虫と加熱した物体とが接触する時間は、１秒以下であることが好ましい。

【0047】

加熱して昆虫と接触させる物体の材質は特に制限されないが、金属、セラミック、又はガラス等であってよい。加熱して昆虫と接触させる物体の熱伝導率は、１Ｗ（ｍ・Ｋ）以上であってよい。

【0048】

熱傷は、昆虫の体表面の一部に与えられてよい。例えば、加熱した物体を昆虫の体表面の一部に接触させることによって、昆虫の体表面の一部に熱傷を与えることができる。熱傷は、昆虫の体表面の１箇所に与えてもよく、複数箇所（例えば、２箇所以上）に与えてもよい。熱傷を１箇所又は複数箇所に与える方法としては、例えば、加熱した針を昆虫の体表面と接触させる方法、加熱した網状の金属を昆虫の体表面に接触させる方法が挙げられる。

【0049】

熱傷を与える方法は、例えば、加熱した針を昆虫の体表面の一部に接触させる方法であってよい。具体的には、針の先端を熱して赤熱させ、赤熱後針の先端を火から離した後に、針を昆虫の体表面と接触させてよい。加熱した針と昆虫とを接触させる時間は、１秒内であってよい。昆虫と、加熱した針とを接触させる部分は１～５ｍｍ程度であってよい。

【0050】

熱傷を与える方法は、例えば、昆虫を輸送過程で、加熱した物体（例えば、加熱したローラー）が配置された加熱ゾーンを昆虫に通過させ、昆虫を輸送しながら、加熱ゾーン内で昆虫と加熱した物体とを接触させる方法であってもよい。

【0051】

本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、熱傷を与えた昆虫を保管する工程（保管工程）を含んでいてよい。保管工程は、抗菌ペプチドを誘導するために行われる。

【0052】

熱傷を与えた昆虫を保管する時間は、特に制限されないが、１時間以上、３時間以上、５時間以上、８時間以上、１０時間以上、又は１２時間以上であってよい。熱傷を与えた昆虫を保管する時間は、例えば、１２～２４時間であってよい。

【0053】

熱傷を与えた昆虫を保管する温度は、昆虫が生存可能な温度であってよく、昆虫の動きが活発になる温度であることが好ましい。熱傷を与えた昆虫の保管温度を昆虫の動きが活発になる温度とすることによって、昆虫体内での抗菌ペプチドの生合成をより効率的に誘導することができる。熱傷を与えた昆虫を保管する温度の下限は、１０℃以上であってよく、昆虫の活動がより活発になることから、２０℃以上、又は２５℃以上であってよい。熱傷を与えた昆虫を保管する温度の上限は、昆虫体内のタンパク質の働きへの悪影響が抑制しやすくなることから、４０℃以下であってよい。熱傷を与えた昆虫を保管する温度は、２５～３５℃であることが好ましい。熱傷を与えた昆虫は飼料とともに保管してよい。

【0054】

本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、熱傷工程の後に、熱傷を与えた昆虫体内の酵素を失活させる工程（酵素失活工程）を更に含んでいてもよい。酵素失活工程では、例えば、ペプチダーゼ等の酵素を失活させる。酵素を失活させる方法としては、例えば、熱傷を与えた昆虫を加熱する方法が挙げられる。加熱温度は、例えば、５０～６０℃であってよい。

【0055】

本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を粉砕して、粉砕物を得る工程（粉砕工程）、熱傷を与えた昆虫又はその処理物から抗菌ペプチドを分離する工程（分離工程）、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を凍結させて、凍結物を得る工程（凍結工程）、熱傷を与えた昆虫又はその処理物（例えば、粉砕物）を乾燥させて、乾燥物を得る工程（乾燥工程）を更に含んでいてもよい。熱傷を与えた昆虫の処理物は、熱傷を与えた昆虫に対して、処理が施されたものをいう。ここでいう処理は、例えば、上述した粉砕工程、凍結工程、乾燥工程で行われる処理であってよく、後述する脱脂工程で行われる処理であってよい。本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、乾燥工程の前に昆虫と残渣とを分離する工程（篩分け工程）を更に含んでいてよく、乾燥工程の前に昆虫を洗浄する工程（洗浄工程）を更に含んでいてよく、乾燥工程の前に昆虫を殺処理する（殺処理）等を更に含んでいてもよい。篩分け工程における残渣は、例えば、昆虫用の飼料であってよい。殺処理する方法として、湯通しする方法等が挙げられる。

【0056】

本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、熱傷を与えた昆虫又はその処理物（粉砕物、又は乾燥物）から脂質を分離する工程（脱脂工程）を更に含んでいてもよい。本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法が脱脂工程を含む場合、脂質の酸化に起因する給餌効率の低下が抑制しやすくなる。

【0057】

本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法は、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を成形する工程（成形工程）を更に含んでいてもよい。成形工程では、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を例えばペレット状に成型してよい。

【0058】

熱傷を与えた昆虫そのもの及び熱傷を与えた昆虫の処理物は、抗菌ペプチド組成物として用いることができる。

【0059】

熱傷工程を含む方法によって得られる抗菌ペプチドを含む抗菌ペプチド組成物は、高い抗菌活性を有している。

【0060】

菌注射によって昆虫に刺激を与え、昆虫による抗菌ペプチド生成を促進する方法では、菌を注射した昆虫を家畜に対して経口投与しにくく、産業利用が難しかった。また、昆虫に対して針を刺すことによって昆虫による抗菌ペプチド生成を促進する方法では、工業的に実用化するのが困難であった。本実施形態に係る製造方法は、昆虫に熱傷を与える工程を含む方法によって昆虫による抗菌ペプチド生成を促進するため、菌注射及び針刺し等の方法によって昆虫に刺激を与える工程を含む方法と比べて、産業化がより容易であり、工業的な抗菌ペプチドの製造方法としてより好適である。

【0061】

本実施形態に係る抗菌ペプチド又は抗菌ペプチド組成物は、飼料組成物、肥料、スキンケア製品、飲食品等の用途に用いることができる。

【0062】

＜抗菌ペプチド組成物＞
本実施形態に係る抗菌ペプチド組成物は、セクロピンとディフェンシンとを含む昆虫体液を含む。抗菌ペプチド組成物は、昆虫から液状成分として回収した昆虫体液を含む組成物であってよく、昆虫体液を含む昆虫自体であってもよい。昆虫体液は、昆虫の幼虫の体液であることが好ましい。

【0063】

昆虫から昆虫体液を回収する方法は、特に制限されない。昆虫から昆虫体液を回収する場合には、体液回収用溶液が用いられてよい。昆虫から昆虫体液を回収する方法の一例は、例えば、昆虫に体液回収用溶液を注入する工程と、昆虫から体液及び体液回収用溶液を含む混合物を回収する工程と、混合物から液状成分以外の成分（例えば、血球及び体組織）を除去する工程とを含む方法であってよい。

【0064】

抗菌ペプチド組成物が昆虫自体である場合、当該昆虫は、死んでいる昆虫であってもよく、生存している昆虫であってもよい。

【0065】

抗菌ペプチド組成物において、セクロピン含有量は、昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、１．９～２．５質量％である。セクロピン含有量の下限は、昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、１．９質量％以上であり、２．０質量％以上であってよい。セクロピン含有量の上限は、昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、２．５質量％以下であり、２．４質量％以下、２．３質量％以下、２．２質量％以下、２．１質量％以下、又は２．０質量％以下であってよい。

【0066】

抗菌ペプチド組成物において、ディフェンシン含有量は、昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、０．５～２．０質量％である。ディフェンシン含有量の下限は、昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、０．５質量％であり、０．６質量％以上、０．７質量％以上、０．８質量％以上、０．９質量％以上、１．０質量％以上又は１．１質量％以上であってよい。ディフェンシン含有量の上限は、昆虫体液中のタンパク質の総質量を基準として、２．０質量％以下であり、１．９質量％以下、１．８質量％以下、１．７質量％以下、１．６質量％以下、１．５質量％以下、１．４質量％以下、１．３質量％以下、１．２質量％以下、又は１．１質量％以下であってよい。

【0067】

セクロピン含有量及びディフェンシン含有量はゲル電気泳動により昆虫体液中のタンパク質を分離すること、分離したタンパク質を染色すること、及び染色されたタンパク質の画像データを解析することを含む方法によって算出することができる。

【0068】

セクロピン含有量及びディフェンシン含有量について、昆虫体液の電気泳度分析結果の一例である図１２（Ａ）を用いてより具体的に説明する。図１２（Ａ）の矢印で示されるバンド中の成分（以下「対象成分」）は、昆虫に刺激を与えることで増加し、かつ、分子量の異なる２つの成分から構成されている。昆虫に刺激を与えることで昆虫体液中のセクロピン及びディフェンシンそれぞれのｍＲＮＡの相対発現量が増加することが少なくともＲＴ－ｑＰＣＲにより確認できることから、測定対象の昆虫に刺激を与えることで増加する対象成分は、主としてセクロピン及びディフェンシンを含むものである。そして、非特許文献１によるとＤＬＰ４の分子量が４．３ｋＤａで、非特許文献２によるとＣＬＰ１（～ＣＬＰ２，～ＣＬＰ３）の分子量が４．８ｋＤａであることから、分子量の大きい方（４．８ｋＤａに対応する成分）がセクロピンを主に含むタンパク質であり、分子量の小さい方（４．３ｋＤａに対応する成分）がディフェンシンを主に含むタンパク質であるということができる。本明細書においては、図１２（Ａ）において矢印で示されるバンド中の２つの成分のうち、４．３ｋＤａに対応する成分の電気泳動画像の解析により算出される量を「ディフェンシン含有量」とし、４．８ｋＤａに対応する成分（分子量の大きい方の成分）の電気泳動画像の解析により算出される量を「セクロピン含有量」とする。セクロピン含有量及びディフェンシン含有量の測定方法の詳細は後述する実施例のとおりである。

【0069】

抗菌ペプチド組成物は、アタシン及びディプテリシンからなる群より選択される少なくとも１種の抗菌ペプチドを更に含んでいてよい。抗菌ペプチド組成物が、当該抗菌ペプチドを含んでいることは、例えば、後述する実施例において示される網羅的遺伝子発現解析によって確認することができる。

【0070】

上述した抗菌ペプチド組成物は、例えば、上述した本実施形態に係る抗菌ペプチドの製造方法によって製造することができる。

【0071】

上述した抗菌ペプチド組成物は、飼料組成物等の用途に好適に使用することができる。

【0072】

＜飼料組成物＞
本実施形態に係る飼料組成物は、上記抗菌ペプチドの製造方法によって得られる抗菌ペプチド、又は、上記抗菌ペプチド組成物を含有する。当該飼料組成物は、上記抗菌ペプチドの製造方法によって得られる抗菌ペプチド、又は、上記抗菌ペプチド組成物を含有することの他は、公知の飼料に含まれる成分を含んでいてよい。

【0073】

飼料は「粗飼料」と「濃厚飼料」とに分類することができる。「粗飼料」は、繊維質を多く含むものである。粗飼料又は粗飼料原料としては、例えば、稲わら又は乾草（干し草）、サイレージ、稲ＷＣＳ（Ｗｈｏｌｅ Ｃｒｏｐ Ｓｉｌａｇｅ、稲発酵粗飼料。）が挙げられる。サイレージは、牧草や青刈りトウモロコシ等の水分含量の多い飼料原料を、サイロ等に詰め込んで発酵させ、貯蔵した得られる飼料である。稲ＷＣＳは、稲の穂と茎葉（けいよう）を丸ごと乳酸発酵させた飼料である。粗飼料は、反芻動物の牛や羊、ヤギ等の草類を主食とする家畜には欠かせない飼料である。

【0074】

「濃厚飼料」は、粗飼料に比べ繊維質が少なく、タンパク質、炭水化物等の栄養素を多く含むものである。濃厚飼料又は濃厚飼料原料としては、穀類、ぬか類、粕類、魚を乾燥させて粉末にした魚粉等を含む飼料が挙げられる。穀類としては、トウモロコシ、コウリャン（アフリカ原産のイネ科の穀物。ソルガムやもろこし等とも呼ばれる。）、大麦、コメ等が挙げられる。ぬか類としては、米ぬか、ふすま（小麦をひいて粉にした後に残る表皮のくず）等が挙げられる。粕類としては、大豆油粕やビール粕、ビートパルプ（ビート（テンサイともいう。砂糖の原料になるアカザ科の植物である。国内では北海道で生産される。）から砂糖を抽出した後の絞り粕）等が挙げられる。飼料は、投与対象の家畜の種類等に応じて、いくつもの濃厚飼料を混合した飼料である配合飼料であってもよい。一般的に、豚及び鶏は濃厚飼料だけで育てられる。

【0075】

本実施形態の飼料組成物の投与時期、投与形態及び投与対象等は、飼料用途に応じて、適宜設定することができる。

【0076】

飼料組成物の投与対象としては、例えば、ブロイラー、豚、採卵鶏等の畜産動物、魚、エビ等の水産動物、愛玩動物（例えば、哺乳類、爬虫類及び両生類）等が挙げられる。

【0077】

本実施形態に係る飼料組成物は、飼料又はその飼料原料と、本実施形態に係る抗菌ペプチド又は抗菌ペプチド組成物とを混合する工程（混合工程）を含む方法によって製造することができる。飼料原料は、飼料に通常用いられる原料である。飼料原料は、投与対象の種類等に応じて、適宜選択することができる。

【0078】

飼料組成物中の抗菌ペプチドの量は、飼料に対して、１０質量ｐｐｍ～１００００質量ｐｐｍであってよい。

【0079】

＜抗菌ペプチド組成物の製造装置＞
本実施形態に係る抗菌ペプチド組成物の製造装置は、昆虫に熱傷を与える加熱部を含む。加熱部の構成は、昆虫に熱傷を与える方法に応じて適宜設計することができる。

【0080】

抗菌ペプチド組成物の製造装置は、昆虫、熱傷を与えた昆虫又は熱傷を与えた昆虫の処理物を輸送する輸送部、熱傷を与えた昆虫を保管する保管部、熱傷を与えた昆虫中の酵素を失活させる酵素失活部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を粉砕する粉砕部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物から抗菌ペプチドを分離する分離部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を凍結させる凍結部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を乾燥させる乾燥部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物から脂質を分離する脱脂処理部、及び、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を成形する成形部等からなる群より選択される少なくとも一種を更に含んでいてよい。保管部、酵素失活部、粉砕部、分離部、凍結部、乾燥部、脱脂処理部及び成形部における具体的態様は上述した態様を際限なく適用することができる。

【0081】

＜飼料組成物の製造装置＞
本実施形態に係る飼料組成物の製造装置は、熱傷を与えた昆虫又はその処理物と、飼料又は飼料原料とを混合する混合部を含む。飼料原料は、飼料に通常用いられる原料である。飼料又は飼料原料は、投与対象の種類等に応じて、適宜選択することができる。熱傷を与えた昆虫の処理物は、上述したとおりであってよい。

【0082】

飼料組成物の製造装置は、昆虫に熱傷を与える加熱部、昆虫、熱傷を与えた昆虫又は熱傷を与えた昆虫の処理物を輸送する輸送部、熱傷を与えた昆虫を保管する保管部、熱傷を与えた昆虫中の酵素を失活させる酵素失活部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を粉砕する粉砕部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物から抗菌ペプチドを分離する分離部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を凍結させる凍結部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を乾燥させる乾燥部、熱傷を与えた昆虫又はその処理物から脂質を分離する脱脂処理部、及び、熱傷を与えた昆虫又はその処理物を成形する成形部等からなる群より選択される少なくとも一種を更に含んでいてよい。保管部、酵素失活部、粉砕部、分離部、凍結部、乾燥部、脱脂処理部及び成形部における具体的態様は上述した態様を際限なく適用することができる。

【実施例0083】

以下、本発明を実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

【0084】

［幼虫］
種：アメリカミズアブ（学名：Ｈｅｒｍｅｔｉａ ｉｌｌｕｃｅｎｓ）
野外にて産卵直前の雌個体を捕獲し、屋内で産卵させて卵を回収した。回収した卵を孵化させ、人工飼料を投与して２７℃にて飼育した。

【0085】

［刺激］
刺激前に、アメリカミズアブの幼虫を水洗し、水分を除去した。ステンレス製の針の先端を火で加熱した。加熱した針の先端を幼虫の体表面に接触させ、熱傷を与えた。熱傷を与えた後、幼虫に人工飼料を給餌し、任意時間２７℃にて保管した。

【0086】

アメリカミズアブの幼虫と、熱した針との接触時間は０．１～１秒程度であった。

【0087】

［脂肪体の回収及びＴＲＩｚｏｌ処理（トータルＲＮＡを分離するための処理）］
抗菌ペプチド関連遺伝子の発現評価は、脂肪体を対象に実施した。次の手順で解剖し、脂肪体を回収した。回収した脂肪体を、ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて処理することによってサンプルを調製した。

【0088】

ペトリディッシュ上に幼虫を移して解剖した。取り出した脂肪体を氷上の１．５ｍｌチューブに集め、０．５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを１．５ｍｌチューブに入れた。１．５ｍｌチューブを取り出し、ホモジナイザーで内容物が均一になるまで撹拌した。当該チューブ内を室温に移し、更にＴＲＩｚｏｌを０．５ｍｌ入れてピペッティングで撹拌した。その後、当該チューブを５分間、室温でインキュベートした。インキュベート後のチューブを、遠心機で１２，０００ｇ×５分間×４℃の条件で遠心した。遠心後、上澄みを別のチューブに移した。その後、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコールに従って、トータルＲＮＡの分離を実施した。

【0089】

［網羅的遺伝子発現解析］
トータルＲＮＡに対してライブラリを作成し、シーケンスデータ取得を実施した。得られた配列データに対し、ＨＩＳＡＴ２（ｈｔｔｐ：//ｄａｅｈｗａｎｋｉｍｌａｂ.ｇｉｔｈｕｂ.ｉｏ/ｈｉｓａｔ２/）を用いて、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/）に登録されている、Ｈ．ｉｌｌｕｃｅｎｓのリファンレンスゲノムに対するゲノムマッピングを行った。マッピング結果に対してＳｔｒｉｎｇＴｉｅ（ｈｔｔｐｓ://ｃｃｂ.ｊｈｕ.ｅｄｕ/ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ/）を用いて、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/）に登録されているＨ．ｉｌｌｕｃｅｎｓのゲノム中の遺伝子領域の場所が記述されたファイルを参照することで、ＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）正規化された転写産物の発現量を取得した。また、取得した転写産物の発現量に対して、ＴＣＣ－ＧＵＩを利用して発現変動遺伝子群（ＤＥＧ）を検出した。この際、ＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅは５％とした。得られた各発現変動遺伝子群（ＤＥＧ）に対してＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ）を用い、e－ｖａｌｕｅが１e^－１０未満となる配列を対象として、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の既知の遺伝子配列に対応づけた。

【0090】

図１は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のディフェンシン（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７８９４８．３）と、ＮＭ＿０７８９４８．３に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブ（Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ）のディフェンシンと推定される転写産物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列である。この内、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６５８５８．１は、ＮＣＢＩデータベースに登録されているＤＬＰ４（ＩＤ：ＫＦ８０５３５０．１）と一致する。

【0091】

図２は、キイロショウジョウバエのセクロピンＡ１（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９８４９．４）と、ＮＭ＿０７９８４９．４に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのセクロピンＡ１と推定される転写産物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列である。

【0092】

図３は、キイロショウジョウバエのセクロピンＡ２（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９８５０．４）と、ＮＭ＿０７９８５０．４に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのセクロピンＡ２と推定される転写産物の、オープンリーディング領域に該当するアミノ酸配列である。この内、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０５９．１は、ＮＣＢＩデータベースに登録されているＣＬＰ２（ＩＤ：ＫＦ８０５３４５．１）と一致する。

【0093】

図４は、キイロショウジョウバエのセクロピンＣ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９８５２．３）と、ＮＭ＿０７９８５２．３に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのセクロピンＣと推定される転写産物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列である。この内、ＭＳＴＲＧ．９０６９．３＿１、ＭＳＴＲＧ.９０７０．１、ＭＳＴＲＧ.９０７０．３、ＭＳＴＲＧ.９０７０．４、ＭＳＴＲＧ.９０７０．５、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０５８．１、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０６２．１、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０６７．１、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０７０．１、ｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０７２．１、及びｒｎａ－ＸＭ＿０３８０６３０７５．１は、ＮＣＢＩデータベースに登録されているＣＬＰ３（ＩＤ：ＫＦ８０５３４６．１）と一致する。

【0094】

図５は、キイロショウジョウバエのアタシンＡ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９０２１．５）と、ＮＭ＿０７９０２１．５に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのアタシンＡと推定される転写産物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列である。

【0095】

図６は、キイロショウジョウバエのディプテリシンＢ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０７９０６３．４）と、ＮＭ＿０７９０６３．４に相同な、熱傷により誘導されたアメリカミズアブのディプテリシンＢと推定される転写産物の、オープンリーディングフレーム領域に該当するアミノ酸配列である。

【0096】

表１～４は、キイロショウジョウバエの各配列に相同な、アメリカミズアブの抗菌ペプチドのＴＰＭ正規化された転写産物の発現量である。図１～６及び表１～４に示す通り、熱傷により、ディフェンシン、セクロピンＡ１、セクロピンＡ２、セクロピンＣ、アタシンＡ及びディプテリシンＢそれぞれに該当する抗菌ペプチドが誘導されていることがわかる。

【0097】

【表1】

【0098】

【表2】

【0099】

【表3】

【0100】

【表4】

【0101】

［ＲＮＡサンプルのＤＮａｓｅ処理］
ＤＮａｓｅ Ｉ， Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のプロトコールに従って、ＤＮａｓｅ処理を実施した。

【0102】

［ｃＤＮＡ合成］
Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに従い、ｃＤＮＡ合成を実施した。

【0103】

［物質誘導］
定量ＰＣＲ（ＲＴ－qＰＣＲ）
合成したｃＤＮＡに対して、ＲＴ－qＰＣＲにより、目的遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量の評価を実施した。ＲＴ－qＰＣＲは、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲＫｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により行った。

【0104】

ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されているＤＬＰ４、ＣＬＰ１，ＣＬＰ２，ＣＬＰ３の遺伝子配列は、図７及び図８に記載のとおりである。図７の、ＫＦから開始されるＩＤはＮＣＢＩデータベースより抽出したＤＬＰ４の配列を示し、ＤＬＰ４＿Ｃｌｏｎｉｎｇは、塩基配列を決定したＤＬＰ４の配列を示し、矢印はＲＴ－ｑＰＣＲ用プライマーの配列部位を示す。図８の、ＪＸまたはＫＦから開始されるＩＤはＮＣＢＩデータベースより抽出したＣＬＰ１の配列を示し、ＣＬＰ１＿Ｃｌｏｎｉｎｇは、塩基配列を決定したＣＬＰ１の配列を示す。矢印はＲＴ－ｑＰＣＲ用プライマーの配列部位を示す。図７及び図８に記載の配列は、遺伝子情報処理ソフトウェア“ＧＥＮＥＴＹＸ”およびＭｅｇａにより整理したものである。

【0105】

内在性コントロールはリボソーマルＲＮＡ（ｒｓ１８）を用い、その遺伝子配列とプライマー配列は次のとおりである。
内在性コントロールの遺伝子配列：
ＣＴＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡＣＧＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＡＧＴＴＴＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＴＣＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＡＧＧＧＧＴＡＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
プライマー配列：
フォワード＞ＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣ、
リバース＞ＡＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＡＴＴＧ

【0106】

図９は、ＤＬＰ４発現量の評価結果を示す。図９のとおり、ＲＴ－ｑＰＣＲにより昆虫に熱傷を与えることによりＤＬＰ４が誘導されることが確認された。

【0107】

セクロピンについては、ＲＴ－ｑＰＣＲにおいて、ＣＬＰ１、ＣＬＰ２及びＣＬＰ３それぞれに由来する単一のＴｍ値を得ることができず、従って、図１０はＣＬＰ１，２，３の混合物発現量の評価結果であると推察される。図１０のとおり昆虫に熱傷を与えることによりセクロピンが誘導されることが確認された。

【0108】

［体液回収用溶液の準備］
体液を回収する際、酸素と接触することによる酸化反応を抑制するために、体液回収用溶液（バッファー）を準備した。
体液回収用溶液は、下記を混合することによって調製した。
・１×ｉｎｓｅｃｔ ＰＢＳ：１００ｍｌ
・グルタチオン：４ｍｍｏｌ／ｌ

【0109】

なお、ＰＢＳとは”Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ”の略であり、リン酸緩衝食塩水のことである。１×ｉｎｓｅｃｔ ＰＢＳは、次のものを混合して調製した（調合量は一つの例）。
・ＫＨ_２ＰＯ_４：１０ｍｍｏｌ／ｌ
・ＮａＨＰＯ_４：１０ｍｍｏｌ／ｌ
・ＮａＣｌ：１３７ｍｍｏｌ／ｌ
・ＫＣｌ：２．７ｍｍｏｌ／ｌ
・Ｈ_２Ｏ：５００ｍｌ

【0110】

［体液回収］
幼虫に注射針と１ｍｌテルモシリンジを使い、０．１ｍｌの体液回収用溶液を注入し、体液回収が容易になる処理を施した。幼虫にハサミを入れ、体液と回収溶液の混合物を、１頭あたり２滴、１．５ｍｌチューブに回収した。回収する際は、酸化反応、メラニン化、タンパク質分解反応等の副反応を避けるため、１．５ｍｌチューブは氷上に設置した。その後、１４，０００ｇ－１０分、４℃で遠心分離して、血球及び体組織と、液体成分とを分離した。上清を別の１．５ｍｌチューブに移し、その後、６０℃－３０分で非働化処理を実施した。固体として浮遊した失活したタンパク質成分を、１４，０００ｇ－１０分、４℃で遠心分離して、上清を回収することで分離した。試験まで、－３０℃で保管した。

【0111】

非働化処理は、血清の補体成分を失活させるために、つまり、今後取り扱う中で抗菌ペプチドを失活させるような副反応を起こさせなくするための処理である。

【0112】

［抗菌活性の評価］
実験条件
記録対象：シグモイド関数によるフィッティングを行い、増殖曲線が対数期に達するまでの時間。当該時間は、具体的には、増殖速度が最大となる点をフィッティング関数の一次微分から求めた。
培地：Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ，１００μｍ／ｗｅｌｌ
菌種：Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ［４６９８］，培地に対して１％添加
非動化：６０℃－３０分
試料：総タンパク質濃度＝１ｍｇ／ｍｌ、クリーンベンチ（ＣＢ）内で０．２μｍフィルタ滅菌，１０μｌ／ｗｅｌｌ
プレート：９６ｗｅｌｌ、丸底（ＦＡＬＣＯＮ）
測定条件：３７℃振盪培養、３０分ごとにＯＤ６００測定

【0113】

抗菌活性試験の対象として、グラム陽性菌であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）４６９８ＴＭ）（以下、単に「Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ」という。）を試験に用いた。Ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地（Ｓｏｙｂｅａｎ－Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ）に、予め－８０℃にて保存しておいた、Ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地：グリセロール＝８０ｖｏｌ％：２０ｖｏｌ％にＭ．ｌｕｔｅｕｓを分散させた溶液（ＯＤ６００＝０．２６）を１ｖｏｌ％添加し、良く撹拌した。撹拌後、９６穴培養プレートに１００μｌずつ添加した。そこに、サンプル溶液を１０μｌずつ添加した。その後、マイクロプレートリーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ社）にて３７℃にて振とう培養しながら、３０分ごとに濁度（６００ｎｍ）を測定し、抗菌活性を評価した。

【0114】

表５及び図１１は、増殖曲線が対数期に達するまでの時間の評価結果を示す。「熱傷」による刺激の試験結果は、Ｎ＝５で実施した際の平均値である。「針刺し」による刺激の試験結果は、Ｎ＝４で実施した際の平均値である。「Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ注射」による刺激の試験結果は、刺激後経過時間９，１５，２１及び２４時間ではＮ＝２で実施した際の平均値であり、刺激後経過時間１８時間ではＮ＝４で実施した際の平均値である。「刺激なし」による刺激の試験結果は、Ｎ＝１３で実施した際の平均値である。

【0115】

表５及び図１１のとおり、熱傷は、「針刺し」の刺激と比べて、増殖曲線が対数期に達するまでの時間が長かった。すなわち、熱傷による刺激を与えた場合、「針刺し」の刺激を与えた場合と比べて体液の抗菌活性がより高まることが示された。刺激後経過時間が９時間及び１５時間である場合には、熱傷による刺激を与えた場合、「Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ注射」による刺激を与えた場合と比べて体液の抗菌活性がより高かった。「Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ注射」では、刺激後経過時間が１８時間以上であると「熱傷」と比べて高い活性を示すが、幼虫体内にＭ．ｌｕｔｅｕｓが存在するため、動物に直接経口投与することはできない。表５中「－」は増殖曲線が対数期に達するまでの時間が４２時間以上であったことを示す。

【0116】

【表5】

【0117】

［試験用のサンプル調製］
抗菌活性試験の際に回収した体液に対し、総タンパク質量が３０μｇ/９μｌとなるように、超純水で希釈して、希釈液を調製した。希釈液は、２００μｌのＰＣＲチューブ中に調製した。還元剤としてメルカプトエタノールを含む１０×サンプルバッファーを希釈液に１μｌ加え、１００℃で、３分間熱処理を実施して、試験用サンプルとした。

【0118】

［電気泳動］
次に示す条件で電気泳動を実施した。図１２に電気泳動の結果の一例を示す。
ゲル：Ｎｏｖｅｘ^ＴＭ １０－２０％ ＴｒｉｃｉｎｅＧｅｌ (１．０ｍｍ×１０ｗｅｌｌ)（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
バッファー：Ｔｒｉｃｉｎ ×１０ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
マーカー：Ｍａｒｋ１２^ＴＭ ＵｎｓｔａｉｎｅｄＳｔａｎｄａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
装置：Ｚｏｏｍ Ｄｕａｌ Ｐｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
泳動条件：１００Ｖ―１３０分
泳動量：サンプル１０μｌ、マーカー１８μｌ
染色：ＡＴＴＯ ＣＢＢ染色液にて一晩染色後、超純水にて３時間以上脱水

【0119】

目的物（図１２（Ａ）中の矢印で示すバンドに含まれる物質）は４～５ｋＤａ程度の分子量を示し、少なくとも２つの異なる分子量を持つ物質の混合物から構成される。これを別々に切り取り、リニアイオントラップ／電場型ＦＴ－ＭＳ／ＭＳにて同定分析を実施した。分析結果を表６に示す。表６より、低分子量の目的物はディフェンシンを含み、高分子量の目的物はセクロピンを含む。

【0120】

【表6】

【0121】

データベース登録のアミノ酸配列と、測定したアミノ酸配列断片を図１３及び図１４に示す。図１３及び図１４中の枠内は、分泌の過程でも切り離されず残っている配列（ｍａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。

【0122】

［カーブフィッティング］
電気泳動後のゲルを透明フィルムに封入後、Ｃａｎｏｎ ９０００Ｆ Ｍａｒｋ ＩＩを用いて、解像度６００にて６００ｄｐｉスキャンして画像データを取得した。画像データを、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて二次元グラフ化し、ＷｅｂＰｌｏｔＤｉｇｉｔｉｚｅｒ（ｈｔｔｐｓ://ａｕｔｏｍｅｒｉｓ.ｉｏ/ＷｅｂＰｌｏｔＤｉｇｉｔｉｚｅｒ/）を用いて座標を付与した。画像処理した後、ガウス関数でカーブフィッティングを実施した。

【0123】

フィッティングした関数から面積を求め、全体の面積に対する割合を算出し、目的物の含有率とした。「熱傷」及び「針刺し」は、表５及び図１１に示す結果の内、増殖曲線が対数期に達するまでの時間が最も大きい刺激後経過時間である、１５時間を選択した。

【0124】

「Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ注射」は、Ｎ＝４の試験全てにおいて増殖曲線が対数期に達するまでの時間が４２時間を超えた最小の刺激後経過時間である２１時間を選択した。なお、「Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ注射」による刺激について、刺激後経過時間が１８時間の場合、Ｎ＝４の試験のうち、３回は増殖曲線が対数期に達するまでの時間が４２時間を超えたが、１回は増殖曲線が対数期に達するまでの時間が３２時間であった。

【0125】

結果を表７に示す。表７中のディフェンシン含有量及びセクロピン含有量は、体液全量を１００％としたときの含有量（単位：質量％）である。電気泳動に用いるサンプル１０μｌ中に、３０μｇのタンパク質が含まれている。この３０μｇのタンパク質は体液由来のものである。なお、体液中のタンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＮａｎｏＤｒｏｐ^ＴＭ Ｏｎｅ／ＯｎｅＣ超微量紫外可視分光光度計（製品番号（カタログ番号）：ＮＤ－ＯＮＥ－Ｗ）にて測定した。

【0126】

【表7】

【産業上の利用可能性】

【0127】

本開示によれば、抗菌ペプチドの新規な製造方法を提供することができる。当該製造方法によって得られる抗菌ペプチドを含む抗菌ペプチド組成物はより高い抗菌活性を有している。当該製造方法によって得られる抗菌ペプチドを含む抗菌ペプチド組成物は飼料組成物等の原料として利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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