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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024010173
(43)【公開日】2024-01-23
(54)【発明の名称】尿路上皮がんを検査する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240116BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240116BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240116BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
【審査請求】有
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023189715
(22)【出願日】2023-11-07
(62)【分割の表示】P 2020550548の分割
【原出願日】2019-10-03
(31)【優先権主張番号】P 2018188733
(32)【優先日】2018-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤田 和利
(72)【発明者】
【氏名】野々村 祝夫
(72)【発明者】
【氏名】松崎 恭介
(72)【発明者】
【氏名】朝長 毅
(57)【要約】 （修正有）
【課題】尿路上皮がんのバイオマーカー及びその利用方法を提供する。
【解決手段】Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、などからなる群より選択される少なくとも1種の尿路上皮がんバイオマーカーを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、などからなる群より選択される少なくとも1種の尿路上皮がんバイオマーカーを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
尿路上皮がんを検査する方法であって、
（1）被検体から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法。
（1）被検体から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法。
【請求項2】
さらに、（2）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんに罹患していると判定する工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項3】
前記バイオマーカーが、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Solute carrier family 12 member 7、Gamma-enolase、Protein diaphanous homolog 1、及びSerine/threonine-protein kinase LMTK2からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項4】
前記バイオマーカーが、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、及びIntercellular adhesion molecule 1からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項5】
前記バイオマーカーが、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、MARCKS-related protein、及びCalreticulinからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項6】
さらに、（3）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんの中でも浸潤がんに罹患していると判定する工程を含む、請求項５に記載の検査方法。
【請求項7】
前記バイオマーカーが2種以上である、請求項１～６のいずれかに記載の検査方法。
【請求項8】
前記尿試料が尿の細胞外小胞である、請求項１～７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項9】
前記尿路上皮がんが膀胱がんである、請求項１～８のいずれかに記載の検査方法。
【請求項10】
前記被検体がヒトである、請求項１～９のいずれかに記載の検査方法。
【請求項11】
Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、尿路上皮がんの検査薬。
【請求項12】
Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、尿路上皮がんの検査キット。
【請求項13】
Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、尿路上皮がんの予防又は治療剤。
【請求項14】
被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【請求項15】
被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの誘発性又は増悪性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、尿路上皮がんを検査する方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
進行性の勝脱がん、腎孟尿管がんなどの尿路上皮がんの予後は悪く、完治は望むことができない。ただ、早期に発見された場合であれば、手術による根治が見込まれるため、早期発見早期治療が重要となる。尿路上皮がんの検査方法としては尿細胞診及び膀胱鏡が施行されている。しかし、尿細胞診の感度は40～50％と低く、さらに勝統鏡は侵襲が高い。
【0003】
近年、正常上皮細胞またはがん細胞が自らのタンパクや核酸などをエクソソームと呼ばれる小胞（30・120nmの膜の構造体）に内包して細胞外へ輸送し、離れた部位の細胞に到達し転移の促進や免疫抑制など腫蕩罵囲の微小環境に影響を及ぼすことが明らかになってきた。エクソソームは血液や尿中に安定して存在していることが明らかになり、診断や治療への応用が期待されている。
【0004】
尿中エクソソームを診断に利用し得ることが報告された例として、非特許文献１には、尿中エクソソーム内のmiR-21-5pは尿路上皮癌のバイオマーカーとなり得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Matsuzaki K et al. Oncotarget. 2017 Apr 11;8(15):24668-24678
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、尿路上皮がんのバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、被検体から採取された尿試料における特定の膜タンパク質群が、尿路上皮がんのバイオマーカーとして有用であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【0008】
項１． 尿路上皮がんを検査する方法であって、
（1）被検体から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法。
（1）被検体から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法。
【0009】
項２． さらに、（2）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんに罹患していると判定する工程を含む、項１に記載の検査方法。
【0010】
項３． 前記バイオマーカーが、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Solute carrier family 12 member 7、Gamma-enolase、Protein diaphanous homolog 1、及びSerine/threonine-protein kinase LMTK2からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである、項１又は２に記載の検査方法。
【0011】
項４． 前記バイオマーカーが、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、及びIntercellular adhesion molecule 1からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである、項１又は２に記載の検査方法。
【0012】
項５． 前記バイオマーカーが、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、MARCKS-related protein、及びCalreticulinからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである、項１又は２に記載の検査方法。
【0013】
項６． さらに、（3）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんの中でも浸潤がんに罹患していると判定する工程を含む、項５に記載の検査方法。
【0014】
項７． 前記バイオマーカーが2種以上である、項１～６のいずれかに記載の検査方法。
【0015】
項８． 前記尿試料が尿の細胞外小胞である、項１～７のいずれかに記載の検査方法。
【0016】
項９． 前記尿路上皮がんが膀胱がんである、項１～８のいずれかに記載の検査方法。
【0017】
項１０． 前記被検体がヒトである、項１～９のいずれかに記載の検査方法。
【0018】
項１１． Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、尿路上皮がんの検査薬。
【0019】
項１２． Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、尿路上皮がんの検査キット。
【0020】
項１３． Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、尿路上皮がんの予防又は治療剤。
【0021】
項１４． 被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【0022】
項１５． 被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの誘発性又は増悪性の評価方法。
【発明の効果】
【0023】
本発明によれば、尿路上皮がんのバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、尿路上皮がんの検査等を、より簡便、且つより効率的に行うことができる。さらに、該バイオマーカーを利用することにより、尿路上皮がんの予防又は治療、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング等を図ることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、及びEpidermal growth factor receptorについての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。ショットガン解析結果のグラフ中、横軸は、左から、健常者、膀胱炎、膀胱がん（表在がん）、膀胱がん（浸潤がん）を示す。SRM解析結果の定量結果の2群間比較結果のグラフ中の横軸は、左から、健常者、膀胱がんを示し、3群間比較結果のグラフ中の横軸は、左から、健常者、膀胱がん（表在がん）、膀胱がん（浸潤がん）を示す。定量結果のグラフ中、縦軸は、定量値を示す。ROC曲線のグラフ中、縦軸は感度（陽性率）を示し、横軸は1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）を示す。
【図2】Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、及びChloride intracellular channel protein 1についての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図１と同じである。
【図3】Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、及びMyristoylated alanine-rich C-kinase substrateについての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図１と同じである。
【図4】Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、及びMARCKS-related proteinについての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図１と同じである。
【図5】Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、及びCalreticulinについての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図１と同じである。
【図6】Gamma-enolase、及びCalpain-2 catalytic subunitについての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図１と同じである。
【図7】Protein diaphanous homolog 1、及びSerine/threonine-protein kinase LMTK2についての、試験例2の定量結果（ショットガン解析結果）、並びに試験例4の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図１と同じである。
【図8】Protein S100-P及びComplement decay-accelerating factor（DAF-1）についての、試験例6の定量結果（TMT解析結果）、並びに試験例6の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。TMT解析結果のグラフ中、横軸は、左から、健常者、膀胱炎、膀胱がん（表在がん）、膀胱がん（浸潤がん）を示す。SRM解析結果の欄中、左から、2群間比較結果のグラフ（縦軸は、定量値を示す。横軸中、左から健常者、膀胱がんを示す）、ROC曲線のグラフ（縦軸は感度（陽性率）を示し、横軸は1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）を示す）、2群間比較結果のグラフ（縦軸は、定量値を示す。横軸中、左から血尿患者、膀胱がんを示す）を示す。
【図9】Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）についての、試験例6の定量結果（TMT解析結果）、並びに試験例6の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図８と同じである。
【図10】Calreticulin（CALR3）及びSyndecan-1（SDC1）についての、試験例6の定量結果（TMT解析結果）、並びに試験例6の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図８と同じである。
【図11】Ephrin type-A receptor 2（EPHA2）及びHeat shock protein HSP 90-betaについての、試験例6の定量結果（TMT解析結果）、並びに試験例6の定量結果（SRM解析結果）及びROC曲線を示す。各グラフの説明は、図８と同じである。
【図12】Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Syndecan-1（SDC1）、Ephrin type-A receptor 2（EPHA2）、Epidermal growth factor receptor（EGFR2）、及びCalreticulin（CALR3）を組み合わせ、ロジスティック回帰解析にて膀胱がんの有無を判定した結果のROC曲線を示す。縦軸は感度（陽性率）を示し、横軸は1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【0026】
1．尿路上皮がんの検査方法
本発明は、その一態様において、尿路上皮がんを検査する方法であって、（1）被検体から採取された尿試料における、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、尿路上皮がんを検査する方法であって、（1）被検体から採取された尿試料における、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【0027】
1-1．工程（1）
検査対象である「尿路上皮がん」は、尿路（腎盂、尿管、膀胱、尿道）に発生するがんである限り特に制限されない。尿路上皮がんとしては、例えば膀胱がん、腎盂・尿管がん等が挙げられる。これらの中でも、検査対象としては、膀胱がんが好ましい。また、尿路上皮がんには、各ステージのがんがふくまれ、表在がん、浸潤がん等が含まれる。
検査対象である「尿路上皮がん」は、尿路（腎盂、尿管、膀胱、尿道）に発生するがんである限り特に制限されない。尿路上皮がんとしては、例えば膀胱がん、腎盂・尿管がん等が挙げられる。これらの中でも、検査対象としては、膀胱がんが好ましい。また、尿路上皮がんには、各ステージのがんがふくまれ、表在がん、浸潤がん等が含まれる。
【0028】
被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
【0029】
被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば尿路上皮がんに罹患しているかどうか不明な検体、尿路上皮がんに罹患していると既に別の方法により判定されている検体、尿路上皮がんに罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、尿路上皮がんの治療中の検体等が挙げられる。
【0030】
尿試料は、尿及びそれに由来する試料（尿由来試料）である限り特に制限されない。尿由来試料は、尿に何らからの操作（分離、精製、薬剤添加等）をして得られる試料である。尿試料としては、尿由来試料が好ましい。尿由来試料としては、尿の細胞外小胞が好ましい。尿試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【0031】
細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。これらの中でもエクソソームが好ましい。
【0032】
細胞外小胞は、尿から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えば超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【0033】
工程（1）の検出対象は、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（本明細書において、これらをまとめて「対象バイオマーカー」と示すこともある。）である。
【0034】
この特定の膜タンパク質群は、尿路上皮がん特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることにより尿路上皮がんを鑑別可能である。
【0035】
この特定の膜タンパク質群は、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなるタンパク質群である。これらは、尿路上皮がん検体における量が健常検体における量よりも高いタンパク質群である。
【0036】
上記膜タンパク質群の中でも、尿路上皮炎での発現が比較的低い（がんと炎症との鑑別により適している）という観点等から、好ましくはHeat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Solute carrier family 12 member 7、Gamma-enolase、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2等が挙げられ、より好ましくはEpithelial cell adhesion molecule、Solute carrier family 12 member 7、Gamma-enolase、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2等が挙げられる。
【0037】
上記膜タンパク質群の中でも、血尿被検体での発現が比較的低い（がんと血尿との鑑別により適している）という観点等から、好ましくはHeat shock protein HSP 90-beta、Syndecan-1、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）等が挙げられる。
【0038】
上記膜タンパク質群の中でも、AUC（感度、特異度）の観点等から、好ましくはClaudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1等が挙げられ、より好ましくはClaudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain等が挙げられ、さらに好ましくはClaudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule等が挙げられ、特に好ましくはClaudin-4が挙げられる。
【0039】
上記膜タンパク質群の中でも、浸潤がんの鑑別により適しているという観点等から、好ましくはClaudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、MARCKS-related protein、Calreticulin等が挙げられ、より好ましくはClaudin-4、Epithelial cell adhesion molecule、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、MARCKS-related protein、Calreticulin等が挙げられ、さらに好ましくはClaudin-4、Epithelial cell adhesion molecule、Calreticulin等が挙げられる。
【0040】
上記膜タンパク質群のタンパク質は、その名称で特定することができる、或いは該名称で示されるヒトタンパク質のオーソログとして特定することができる。
【0041】
工程（1）における対象バイオマーカーの数は、1種のみでもよいが、2種以上の組み合わせであってもよい。より多く（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、7種以上、10種以上、15種以上、19種）の検出対象を組み合わせることにより、尿路上皮がんの検査等を、より正確に行うことが可能になる。
【0042】
検出は、通常は、対象バイオマーカーの量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
【0043】
対象バイオマーカーを検出する方法としては、対象バイオマーカーの一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、対象バイオマーカーを構成するペプチドを検出する質量分析法、対象バイオマーカーを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法等を挙げることができる。なお、対象バイオマーカーのアミノ酸配列情報は、UniProtKBアクセッション番号を基に、EBI（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
【0044】
免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ELISA法、サンドイッチELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。尿試料として細胞外小胞を採用する場合であれば、例えば、細胞外小胞マーカー（CD9等）に対する抗体と対象バイオマーカーに対する抗体とを使用したサンドイッチELISA法を採用することができる。
【0045】
質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、EI法、CI法、FD法、FAB法、MALDI法、ESI法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、2以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（MS／MS）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（LC）やHPLCにより、対象バイオマーカーを構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて対象バイオマーカーを構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する対象バイオマーカーを構成するペプチドにおけるアミノ酸の1個以上が、15N，13C，18O，及び2Hのいずれか1以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてF-moc法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、iTRAQ（登録商標）試薬、ICAT（登録商標）試薬、ICPL（登録商標）試薬、NBS（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
【0046】
ウェスタンブロット法は、一次抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などの標識物質に由来するシグナルを放射線測定器、蛍光検出器などで検出し、測定する方法が例示される。
【0047】
工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、尿路上皮がんの検出指標である対象バイオマーカーの量及び／又は濃度を提供することができ、これにより尿路上皮がんの検出などを補助することができる。
【0048】
工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、治療効果判定、尿路上皮がんの病態解明、尿路上皮がんの予後予測、患者層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）、尿路上皮がんにおける難治化や、リモデリングの評価、尿路上皮がんの組織型や表現型等の鑑別等に利用し得る。
【0049】
1-2．工程（2）
本発明の検査方法は、一態様として、（2）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんに罹患していると判定する工程を含むことが好ましい。該工程2を含む本発明の検査方法によれば、尿路上皮がんを判定することが可能となる。
本発明の検査方法は、一態様として、（2）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんに罹患していると判定する工程を含むことが好ましい。該工程2を含む本発明の検査方法によれば、尿路上皮がんを判定することが可能となる。
【0050】
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、尿路上皮がんに罹患していない被検体から採取された尿試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、尿路上皮がんに罹患していない被検体から採取された尿試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば1（又は1を超える値）～3倍の値とすることができる。
【0051】
また、工程（2）においては、判別式を用いた方法で判定することもできる。判別式は、尿路上皮がんと健常とを区別的に判別する判別式を作成することができる任意の判別分析法、例えばフィッシャーの判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、ニューラルネットワーク、Support Vector Machine（SVM）などを用いて作成できるが、これらの具体例に限定されない。
【0052】
さらに、工程（2）において、例えばニューラルネットワーク、k-近傍法、決定木、ロジスティック回帰分析などの手法を利用して判定することもできる。
【0053】
工程（2）の好ましい一態様においては、被検体が尿路上皮がんの治療中の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、尿路上皮がんの治療効果を判定することができる。
【0054】
1-3．工程（3）
本発明の検査方法は、一態様として、バイオマーカーが、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、MARCKS-related protein、及びCalreticulinからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合に、（3）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんの中でも浸潤がんに罹患していると判定する工程を含むことが好ましい。該工程3は、バイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が尿路上皮がんの中でも表在がんに罹患していると判定する工程も含み得る。該工程3を含む本発明の検査方法によれば、尿路上皮がんが表在がんであるか、或いは浸潤がんであるかを鑑別することができる。
本発明の検査方法は、一態様として、バイオマーカーが、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、MARCKS-related protein、及びCalreticulinからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合に、（3）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんの中でも浸潤がんに罹患していると判定する工程を含むことが好ましい。該工程3は、バイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が尿路上皮がんの中でも表在がんに罹患していると判定する工程も含み得る。該工程3を含む本発明の検査方法によれば、尿路上皮がんが表在がんであるか、或いは浸潤がんであるかを鑑別することができる。
【0055】
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していない被検体から採取された尿試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していない被検体から採取された尿試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば1（又は1を超える値）～3倍の値とすることができる。
【0056】
工程（3）の好ましい一態様においては、被検体が尿路上皮がん（浸潤がん）の治療中の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、尿路上皮がん（浸潤がん）の治療効果を判定することができる。
【0057】
2．尿路上皮がんのより高い精度での診断
工程（2）及び／又は工程（3）を含む本発明の検査方法により、被検体が尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに尿路上皮がんの医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で尿路上皮がんを診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に尿路上皮がんを検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「尿路上皮がんに罹患している」と診断できる。
工程（2）及び／又は工程（3）を含む本発明の検査方法により、被検体が尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに尿路上皮がんの医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で尿路上皮がんを診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に尿路上皮がんを検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「尿路上皮がんに罹患している」と診断できる。
【0058】
3．尿路上皮がんの治療
工程（2）及び／又は工程（3）を含む本発明の検査方法により被検体が尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．尿路上皮がんのより高い精度での診断」に記載の様に尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）尿路上皮がんに罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に尿路上皮がんを検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、尿路上皮がんに罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
工程（2）及び／又は工程（3）を含む本発明の検査方法により被検体が尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．尿路上皮がんのより高い精度での診断」に記載の様に尿路上皮がん（表在がん及び／又は浸潤がん）に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）尿路上皮がんに罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に尿路上皮がんを検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、尿路上皮がんに罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
【0059】
尿路上皮がんの治療方法は、特に制限されず、公知の治療方法を各種採用することができる。治療方法としては、例えば化学療法、外科治療法、放射線治療法、免疫療法などが挙げられる。これらは公知の方法に従って実施することができる。
【0060】
化学療法に用いられる治療薬としては、特に制限されず、各種抗がん剤を用いることができる。抗がん剤としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤、生物製剤などが挙げられる。アルキル化剤としては、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチンなどが挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリンなどが挙げられる。微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチンなどのアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセルなどのタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗生物質抗がん剤としては、例えば、マイトマイシンC、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマーなどが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としてはトポイソメラーゼI阻害作用を有するCPT-11、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼII阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンが挙げられる。白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどが挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタンなどが挙げられる。生物製剤としては、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン2、ウベニメクス、乾燥BCGなどが挙げられる。分子標的薬としては、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、ベバシズマブ、VEGF trap、スニチニブ、ソラフェニブ、トシツズマブ、ボルテゾミブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タミバロテン、トレチノインなどが挙げられる。ここに特定する分子標的薬以外にも、ヒト上皮性増殖因子受容体2阻害剤、上皮性増殖因子受容体阻害剤、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤、mTOR阻害剤、血管内皮増殖因子受容体2阻害剤（α-VEGFR-2抗体）などの血管新生を標的にした阻害剤、MAPキナーゼ阻害剤などの各種チロシンキナーゼ阻害剤、サイトカインを標的とした阻害剤、プロテアソーム阻害剤、抗体－抗がん剤配合体などの分子標的薬なども含めることができる。これら阻害剤には抗体も含む。治療薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
【0061】
4．尿路上皮がんの検査薬、検査キット
本発明は、その一態様において、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、尿路上皮がんの検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、尿路上皮がんの検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【0062】
特定の膜タンパク質群、尿路上皮がん等については、上記「1．尿路上皮がんの検査方法」における定義と同様である。
【0063】
検出剤は、対象バイオマーカーを特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象バイオマーカーに対する抗体等が挙げられる。
【0064】
検出剤は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の付加が挙げられる。
【0065】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。
【0066】
検出剤は、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、検出剤を固定化した基板（例えば抗体を固定化したELISAプレート等）の形態として提供することができる。
【0067】
固定化に使用される固相は、抗体等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。
【0068】
抗体は、対象バイオマーカーを選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法やELISA法において、対象バイオマーカーが特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が対象バイオマーカーに由来するものであると判断できるものであればよい。
【0069】
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。対象バイオマーカーのアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【0070】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象バイオマーカーを用いて、あるいは常法に従って当該対象バイオマーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象バイオマーカー、あるいは対象バイオマーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。
【0071】
抗体の作製に免疫抗原として使用される対象バイオマーカーは、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【0072】
具体的には、対象バイオマーカーをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また対象バイオマーカーの部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【0073】
また本発明の抗体は、対象バイオマーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、対象バイオマーカーと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ対象バイオマーカーのアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【0074】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【0075】
本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【0076】
本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の尿試料における対象バイオマーカーの検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば二次抗体、緩衝液等）、器具（例えば細胞外小胞の精製、分離、濃縮用器具（例えばカラム等））等が挙げられる。
【0077】
5．尿路上皮がんの予防又は治療剤
本発明は、その一態様において、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、尿路上皮がんの予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、尿路上皮がんの予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【0078】
特定の膜タンパク質群等については、上記「1．尿路上皮がんの検査方法」における定義と同様である。
【0079】
抑制剤としては、例えば対象バイオマーカーに対する抗体が挙げられる。該抗体については、上記「4．尿路上皮がんの検査薬、検査キット」で説明した抗体と同様のものを使用することができる。
【0080】
抑制剤の別の例としては、対象バイオマーカーの発現抑制剤が挙げられる。
【0081】
対象バイオマーカーの発現抑制剤としては、対象バイオマーカー、そのmRNA、その前駆体などの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば対象バイオマーカーの遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）、対象バイオマーカーの遺伝子特異的microRNA（miRNA）、対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター； 対象バイオマーカーの遺伝子特異的リボザイム； CRISPR/Casシステムによる対象バイオマーカーの遺伝子遺伝子編集剤などが挙げられる。
【0082】
なお、発現抑制とは、対象バイオマーカー、そのmRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
【0083】
対象バイオマーカーの遺伝子siRNAは、対象バイオマーカーをコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
【0084】
siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45～60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となる対象バイオマーカーをコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。
【0085】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2～4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0086】
siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
【0087】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19－21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19－21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【0088】
siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）
Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）
RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）
Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）
RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
【0089】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【0090】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNAは、対象バイオマーカーをコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このような対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
【0091】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸とは、対象バイオマーカーをコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、対象バイオマーカー合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、対象バイオマーカーの遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、対象バイオマーカーの遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
【0092】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として対象バイオマーカーへの翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象バイオマーカーをコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、対象バイオマーカーの遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
【0093】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象バイオマーカーの遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
【0094】
上記した対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、及び対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。
【0095】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、及び対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸などは、対象バイオマーカーの遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
【0096】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、又は対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸の発現ベクターについては、対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、又は対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及び対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、又は対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター； マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
【0097】
対象バイオマーカーの遺伝子発現抑制剤の別の例としては、対象バイオマーカーの遺伝子特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。対象バイオマーカーの遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【0098】
本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
【0099】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【0100】
形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
【0101】
形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
【0102】
形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
【0103】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【0104】
本発明の剤の対象バイオマーカーの抑制剤の含有量は、抑制剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
【0105】
本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1～1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【0106】
6．尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【0107】
体液、尿試料、特定の膜タンパク質群、尿路上皮がん、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定等については、上記「1．尿路上皮がんの検査方法」における定義と同様である。
【0108】
動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
【0109】
被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
【0110】
本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された尿試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分（或いは、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
【0111】
対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じタンパク質を意味する。
【0112】
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
【0113】
7．尿路上皮がんの誘発性又は増悪性の評価方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【0114】
体液、尿試料、特定の膜タンパク質群、尿路上皮がん、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．尿路上皮がんの検査方法」及び「6．尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
【0115】
本発明の毒性評価方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、特定の膜タンパク質群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された尿試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を尿路上皮がんの誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
【0116】
対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じタンパク質を意味する。
【0117】
「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
【実施例0118】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0119】
試験例1．エクソソーム画分の調製1
被検体として、膀胱がん（表在がん、及び浸潤がん）であると診断されたヒト被検体7名、及び健常ヒト被検体4名を採用した。被検体の背景は以下の通りである。
被検体として、膀胱がん（表在がん、及び浸潤がん）であると診断されたヒト被検体7名、及び健常ヒト被検体4名を採用した。被検体の背景は以下の通りである。
【0120】
【表1】
【0121】
被検体から自然尿を採取し、尿からエクソソーム画分の調製をした。エクソソーム画分の調製は段階的超遠心法により行った。具体的には次のようにして行った。尿をPBSで希釈して、遠心 (2000g、10℃、30分)した。その後、上清を遠心 (17000g,10℃、30分)した。その上清を0.22μmのフィルターに通し、超遠心 (130000g, 10℃、90分)した。ペレットをPBSで1mlに懸濁し、30%スクロース溶液の上層に留置し、スクロースクッション超遠心を施行（130000g, 4℃、70分）した。スクロース層を回収し、さらに超遠心を施行 (130000g, 4℃、70分)した。ペレットをさらに同条件で超遠心した。最終的に得られたペレットをPBSで懸濁して、尿中エクソソーム画分を得た。
【0122】
続いて、得られたエクソソーム画分について、エクソソームマーカー（CD9）を金標識した電子顕微鏡観察、及びウェスタンブロットによるエクソソームマーカー（CD63及びCD9）の検出を行った。その結果、エクソソームが得られていることを確認できた。
【0123】
さらに、得られたエクソソーム画分について、エクソソームの粒子数及び粒子径を測定した。具体的には、ナノサイト（日本カンタム・デザイン株式会社、Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025）を使用して測定した。これは、粒子径ごとのブラウン運動速度の違いをもとに解析するものであり、画面に映る散乱光１つ１つの動きを追尾（トラッキング）し、各々の移動速度（拡散係数）から液中における粒子径（流体力学径）を算出することができる。その結果、粒子径は概ね200nm以下であることを確認した。
【0124】
試験例2．プロテオミクス解析（TMTラベル、LC-MS/MS）
既報の文献（Journal of Proteome Research., 2017, 16 (2), pp 1077-1086.）に従って、TMTラベル-LC-MS/MSプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。試験例1で得られたエクソソーム画分中のタンパク質をトリプシン消化して得られたペプチドサンプルを、TMT 10-plex試薬でラベルした。ラベル化サンプルをSCXカラムで分画し、質量分析計（LTQ-Orbitrap XL、Thermo Fisher Scientific社製）を用いてLC-MS/MS解析した。得られた生データを、解析プログラム（UniProt/SwissProtに対するMascot v2.3.1（Matrix Science社製）を備える、Proteome Discoverer ver.1.3（Thermo Fisher Scientific社製））を用いて解析し、各種タンパク質の定量データを得た。
既報の文献（Journal of Proteome Research., 2017, 16 (2), pp 1077-1086.）に従って、TMTラベル-LC-MS/MSプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。試験例1で得られたエクソソーム画分中のタンパク質をトリプシン消化して得られたペプチドサンプルを、TMT 10-plex試薬でラベルした。ラベル化サンプルをSCXカラムで分画し、質量分析計（LTQ-Orbitrap XL、Thermo Fisher Scientific社製）を用いてLC-MS/MS解析した。得られた生データを、解析プログラム（UniProt/SwissProtに対するMascot v2.3.1（Matrix Science社製）を備える、Proteome Discoverer ver.1.3（Thermo Fisher Scientific社製））を用いて解析し、各種タンパク質の定量データを得た。
【0125】
膀胱がん被検体の尿中エクソソームで高発現（健常被検体に対するFold change > 1.5（p < 0.1））している110タンパク質を同定した。尿中エクソソームで高発現している110タンパク質の中から、（1）がん患者尿中で特に強く発現しているタンパク（Fold change >2,p<0.05）20個、（2）がん患者尿中でやや強く発現しているタンパク（Fold change >2, p<0.1）又は（FC>1.5, p<0.05）37個、及び（3）Exocartaで膀胱がん細胞株由来という報告があるタンパク又はTCGA dataで膀胱がんの予後と関連（p<0.1）していたタンパク33個の、計90個のタンパク質をさらなる解析対象として選定した。
【0126】
試験例3．エクソソーム画分の調製2
被検体として、膀胱がん（表在がん、及び浸潤がん）であると診断されたヒト被検体40名、及び健常ヒト被検体30名を採用した。被検体の背景は以下の通りである。
被検体として、膀胱がん（表在がん、及び浸潤がん）であると診断されたヒト被検体40名、及び健常ヒト被検体30名を採用した。被検体の背景は以下の通りである。
【0127】
【表2】
【0128】
被検体から自然尿を採取し、試験例1と同様の方法により尿中エクソソーム画分の調製した。
【0129】
試験例4．プロテオミクス解析2（SRM/MRM）
試験例2で選定した71個のタンパク質について、既報の文献（Molecular & Cellular Proteomics 13: 10.1074/mcp.M113.037093, 1471-1484, 2014.）に従って、SRMプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。タンパク質のアミノ酸配列情報を基に、SRM法で特異的に検出されるペプチド（トリプシン消化断片）を1又は2種類ずつ選択し、それぞれに対するペプチドと同じアミノ酸配列からなる安定同位体標識ペプチド（SIペプチド）を、内部標準ペプチドとして用いた。試験例3で得られた尿中エクソソーム画分のタンパク質をトリプシン消化して、内部標準ペプチドと混合し、質量分析計（TSQ Vantage、Thermo Fisher Scientific社製）を用いたSRM法により相対定量解析した。得られた定量データに基づいて、膀胱がんで高発現している膜タンパク質19個（Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、及びSerine/threonine-protein kinase LMTK2）をバイオマーカーとして選定した。
試験例2で選定した71個のタンパク質について、既報の文献（Molecular & Cellular Proteomics 13: 10.1074/mcp.M113.037093, 1471-1484, 2014.）に従って、SRMプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。タンパク質のアミノ酸配列情報を基に、SRM法で特異的に検出されるペプチド（トリプシン消化断片）を1又は2種類ずつ選択し、それぞれに対するペプチドと同じアミノ酸配列からなる安定同位体標識ペプチド（SIペプチド）を、内部標準ペプチドとして用いた。試験例3で得られた尿中エクソソーム画分のタンパク質をトリプシン消化して、内部標準ペプチドと混合し、質量分析計（TSQ Vantage、Thermo Fisher Scientific社製）を用いたSRM法により相対定量解析した。得られた定量データに基づいて、膀胱がんで高発現している膜タンパク質19個（Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Ephrin type-A receptor 2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、及びSerine/threonine-protein kinase LMTK2）をバイオマーカーとして選定した。
【0130】
さらに、定量結果に基づき、縦軸を感度（陽性率）とし、横軸を1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）とするROC曲線を統計ソフトJMPを用いて作成した。
【0131】
【0132】
また、試験例2の定量結果より膀胱炎での発現の高低を評価した結果、及びAUC値をまとめた結果を表３に示す。
【0133】
【表3】
【0134】
試験例5．エクソソーム画分の調製3
被検体として、膀胱がん（表在がん、及び浸潤がん）であると診断されたヒト被検体49名、及び非がん被検体48名を採用した。被検体の背景は以下の通りである。
被検体として、膀胱がん（表在がん、及び浸潤がん）であると診断されたヒト被検体49名、及び非がん被検体48名を採用した。被検体の背景は以下の通りである。
【0135】
【表4】
【0136】
被検体から自然尿を採取し、試験例1と同様の方法により尿中エクソソーム画分の調製した。
【0137】
試験例6．プロテオミクス解析3（TMT解析、SRM/MRM）
試験例5で得られた尿中エクソソーム画分のタンパク質を用いて、試験例2及び4と同様にして、TMT解析及びSRM/MRM解析を行った。得られた定量データに基づいて、膀胱がんで高発現している膜タンパク質として、追加で、3つのタンパク質（Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1））をバイオマーカーとして選定した。
試験例5で得られた尿中エクソソーム画分のタンパク質を用いて、試験例2及び4と同様にして、TMT解析及びSRM/MRM解析を行った。得られた定量データに基づいて、膀胱がんで高発現している膜タンパク質として、追加で、3つのタンパク質（Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1））をバイオマーカーとして選定した。
【0138】
さらに、定量結果に基づき、縦軸を感度（陽性率）とし、横軸を1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）とするROC曲線を統計ソフトJMPを用いて作成した。定量結果の例を図８～１１に示す。図８～１１には、合わせてTMT解析結果も示す。
【0139】
試験例7．膀胱がん判定
Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Syndecan-1（SDC1）、Ephrin type-A receptor 2（EPHA2）、Epidermal growth factor receptor（EGFR2）、及びCalreticulin（CALR3）を組み合わせ、ロジスティック回帰解析にて膀胱がんの有無の判定式を作成した。
Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Syndecan-1（SDC1）、Ephrin type-A receptor 2（EPHA2）、Epidermal growth factor receptor（EGFR2）、及びCalreticulin（CALR3）を組み合わせ、ロジスティック回帰解析にて膀胱がんの有無の判定式を作成した。
【0140】
結果を図１２に示す。LMTK2、SDC、EPHA2、EGFR2、及びCALR3を組み合わせることにより診断精度が上昇することが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
尿路上皮がんの検査を補助する方法であって、
（1）被検体から採取された尿試料における、Ephrin type-A receptor 2を検出する工程、を含む、方法。
（1）被検体から採取された尿試料における、Ephrin type-A receptor 2を検出する工程、を含む、方法。
【請求項2】
さらに、（2）前記工程（1）で検出されたEphrin type-A receptor 2の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が尿路上皮がんに罹患している可能性が高いと評価する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記工程（1）において、さらに、Claudin-4、Heat shock protein HSP 90-beta、Epidermal growth factor receptor、Epithelial cell adhesion molecule、HLA class I histocompatibility antigen, B-35 alpha chain、Chloride intracellular channel protein 1、Syndecan-1、Intercellular adhesion molecule 1、Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate、Niban-like protein 1、Solute carrier family 12 member 7、MARCKS-related protein、Tight junction protein ZO-2、Calreticulin、Gamma-enolase、Calpain-2 catalytic subunit、Protein diaphanous homolog 1、Serine/threonine-protein kinase LMTK2、Protein S100-P、Complement decay-accelerating factor（DAF-1）、及びReceptor-type tyrosine-protein phosphatase F（PTPRF-1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記バイオマーカーが2種以上である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記尿試料が尿の細胞外小胞である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記尿路上皮がんが膀胱がんである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記被検体がヒトである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
Ephrin type-A receptor 2の検出剤を含む、尿路上皮がんの検査薬。
【請求項9】
Ephrin type-A receptor 2の検出剤を含む、尿路上皮がんの検査キット。
【請求項10】
被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、Ephrin type-A receptor 2の量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【請求項11】
被検物質で処理された動物から採取された尿試料における、Ephrin type-A receptor 2の量又は濃度を指標とする、尿路上皮がんの誘発性又は増悪性の評価方法。