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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024102232
(43)【公開日】2024-07-30
(54)【発明の名称】幹細胞の凍結保存
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240723BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20240723BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240723BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N1/04
C12N5/071
【審査請求】有
【請求項の数】22
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024074946
(22)【出願日】2024-05-02
(62)【分割の表示】P 2021547274の分割
【原出願日】2020-02-11
(31)【優先権主張番号】19382099.0
(32)【優先日】2019-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】エレウテリオ、ロンバルド、デ、ラ、カマラ
(72)【発明者】
【氏名】マイタネ、オルティス、ビルムブラレス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）などの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む幹細胞集団の凍結保存の方法を提供する。
【解決手段】以下の工程：ａ．幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；およびｂ．幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ることを含んでなる、幹細胞の凍結保存の方法である。
【選択図】なし
【解決手段】以下の工程：ａ．幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；およびｂ．幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ることを含んでなる、幹細胞の凍結保存の方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること
を含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項2】
前記方法が、以下の工程：
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法が、以下の工程：
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること、および前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；ならびに
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の方法。
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること、および前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；ならびに
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記処理工程が、
前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団をＮＡＣで少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４もしくは４８時間インキュベートすること；および／または
ＮＡＣを前記幹細胞の集団に加えて、およそ０．５～１０ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなり、場合によりここで、前記処理工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団をＮＡＣで少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４もしくは４８時間インキュベートすること；および／または
ＮＡＣを前記幹細胞の集団に加えて、およそ０．５～１０ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなり、場合によりここで、前記処理工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記方法が、以下の工程：
ｄ．前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
ｄ．前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、以下の工程：
ｄ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなり、場合によりここで：
前記培養工程は、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなり、さらに場合によりここで、前記培養工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなり；かつ／または
前記方法は、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなる、
請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
ｄ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなり、場合によりここで：
前記培養工程は、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなり、さらに場合によりここで、前記培養工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなり；かつ／または
前記方法は、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなる、
請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記方法が、前記幹細胞の解凍集団または前記幹細胞の拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなる、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記方法が、以下の工程：
ｅ．前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること；ならびに場合により
ｆ．前記幹細胞の凍結拡大集団または前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること；ならびに場合により
ｇ．前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させること
をさらに含んでなる、請求項６～７のいずれか一項に記載の方法。
ｅ．前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること；ならびに場合により
ｆ．前記幹細胞の凍結拡大集団または前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること；ならびに場合により
ｇ．前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させること
をさらに含んでなる、請求項６～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなり、場合によりここで、前記培養工程は、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの初濃度とすることを含んでなり、さらに場合によりここで、前記培養工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、
方法。
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなり、場合によりここで、前記培養工程は、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの初濃度とすることを含んでなり、さらに場合によりここで、前記培養工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、
方法。
【請求項10】
前記幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、かつ／または前記幹細胞が脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により得られる、幹細胞の集団。
【請求項12】
解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して増加し；
解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約５倍増加し；
解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、もしくは少なくとも約２倍増加し；
解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％増加し；
解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少し；かつ／または
解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍減少し、
ここで、前記幹細胞の対照集団は、ＮＡＣで処理された幹細胞の集団と同じ幹細胞の集団に由来し、かつＮＡＣで処理されていないが、その他の点では同一の条件に供されている、
請求項１１に記載の幹細胞の集団。
解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約５倍増加し；
解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、もしくは少なくとも約２倍増加し；
解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％増加し；
解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少し；かつ／または
解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍減少し、
ここで、前記幹細胞の対照集団は、ＮＡＣで処理された幹細胞の集団と同じ幹細胞の集団に由来し、かつＮＡＣで処理されていないが、その他の点では同一の条件に供されている、
請求項１１に記載の幹細胞の集団。
【請求項13】
解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して増加し；
解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約５倍増加し；
解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、もしくは少なくとも約２倍増加し；
解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％増加し；
解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少し；かつ／または
解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍減少する、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約５倍増加し；
解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、もしくは少なくとも約２倍増加し；
解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％増加し；
解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少し；かつ／または
解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍減少する、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
請求項１１または請求項１２に記載の幹細胞の集団と凍結保存培地とを含んでなる凍結保存組成物であって、場合により、前記組成物は凍結され、かつ／または場合により、前記組成物はＮＡＣを含有する、組成物。
【請求項15】
幹細胞の凍結保存のための、ＮＡＣの使用。
【請求項16】
クライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる、凍結保存キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）などの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む幹細胞集団の凍結保存の方法に関する。より詳しくは、本発明は、凍結保存方法におけるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
世界的な修復再生医学の市場は、治療用細胞の生存率および機能が維持され、その結果、製造場所から患者への細胞の輸送、安全性試験および品質管理試験の完了、ならびに細胞バンクの設立が可能になることを必要としている。細胞は、利用前または利用中に、正常温度に戻される前に凍結保存されるか、または低温維持される。これらの療法の成功は、細胞の単に構造だけでなく機能も保存する能力に少なくとも部分的に依存する。
世界的な修復再生医学の市場は、治療用細胞の生存率および機能が維持され、その結果、製造場所から患者への細胞の輸送、安全性試験および品質管理試験の完了、ならびに細胞バンクの設立が可能になることを必要としている。細胞は、利用前または利用中に、正常温度に戻される前に凍結保存されるか、または低温維持される。これらの療法の成功は、細胞の単に構造だけでなく機能も保存する能力に少なくとも部分的に依存する。
【0003】
細胞保存の目的は、種類を問わず、生物学的時間を特定の期間停止し、次いで、細胞の生存率、構造、および機能を要求に応じて復帰させることである。理想的には、凍結保存される細胞／組織は、解凍後に同じ特性を有するはずである。この目的の達成は、多くの場合において実現には程遠いものである。保存成績は、保存直後に測定される高度の細胞生存率の維持に次いで、細胞の応答性、機能、および生殖能力の減少を伴う２４～４８時間にわたるその後の減少をしばしば特徴とする。低温保存に関しては、保存間隔は、ほとんどの細胞系で一般に１～３日に限定される。
【0004】
多くの試験が、細胞特性（例えば、細胞の活動、生存、増殖能）は凍結および解凍プロセスにより影響を受けることを観察している。保存プロセスは、代謝プロセスおよび生化学的プロセスの温度依存的脱共役の結果として、多数のストレスを細胞に与える。これらには、とりわけ、脂質過酸化の下流効果に起因する細胞に対して有害である酸化的呼吸の混乱によるフリーラジカルの生成、ＤＮＡおよびＲＮＡ損傷、細胞骨格構造成分の変化が含まれる。細胞の膜構造、流動性、および構成の変化はまた、膜受容体を活性化し、ストレス応答経路およびアポトーシスの刺激を含む細胞内事象のカスケードを惹起し得る。膜結合Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプおよびＣａ２＋イオンチャネルの遮断を介した細胞のイオンバランスの調節不全は、細胞内ストアからのカルシウムの放出、浸透圧流入、および細胞腫脹を含むストレス応答機序を活性化する。さらなるストレス応答機序の宿主はまた、低温保存を介して活性化されて、細胞に害を及ぼし得る。
【0005】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールまたは動物由来血清などの凍結防止剤が、これらの負の効果を最小限にするために凍結保存培地に一般に加えられる。しかしながら、幹細胞の凍結保存の方法を改善する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）などの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む幹細胞の凍結保存に関する方法および組成物、ならびに前記組成物の使用を提供するものとして要約される。特に、幹細胞の研究試験および臨床適用を促進するために、本発明者らは、治療的使用に必要とされるような、細胞の構造特性および／または機能特性を維持しながら、解凍後の生細胞数の増加、成長率の増加、ミトコンドリア活性の増加および／または回収率の改善をもたらす、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で細胞を処理することが関与する新規な凍結保存アプローチを開発した。
【0007】
本発明は、幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ることを含んでなる方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ａ）前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ることを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ａ）前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること、および前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；ならびに（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ることを含んでなる。前記方法のいずれかにおいて、前記処理工程は、前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団をＮＡＣで少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４または４８時間インキュベートすることを含んでなってもよい。前記処理工程は、ＮＡＣを前記幹細胞の集団に加えて、およそ０．５～１０ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなってもよい。前記処理工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ｄ）前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ｄ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなる。前記培養工程は、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなってもよい。前記培養工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記幹細胞の解凍集団または前記幹細胞の拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ｅ）前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ることをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ｅ）前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること；ならびに（ｆ）前記幹細胞の凍結拡大集団または前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ることをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程：（ｇ）前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させることをさらに含んでなる。
【0008】
本発明はまた、幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなる方法を提供する。前記培養工程は、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの初濃度とすることを含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、前記培養工程は、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる。
【0009】
本発明の方法のいずれかにおいて、前記凍結工程は、約－０．５～約－１０℃／分の速度で温度を－７０℃～－１３０℃に下げることを含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、前記凍結工程は、１０～６０分で温度を＋４℃から－１００～－１８０℃に下げることを含んでなる。
【0010】
本発明の方法のいずれかにおいて、前記幹細胞の集団は、３７℃で解凍され得る。前記幹細胞の凍結集団の細胞密度は、およそ１００万～およそ５，０００万個／ｍＬの範囲、好ましくは、およそ２，５００万個／ｍＬであり得る。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記幹細胞の集団は、実質的に純粋である。いくつかの実施形態において、前記幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記幹細胞は脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記幹細胞はヒト細胞である。好ましい複数の実施形態において、前記幹細胞はヒトＡＳＣである。
【0012】
本発明の方法のいずれかにおいて、前記方法は、前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなってもよい。前記方法は、前記幹細胞の集団を複数のクライオバイアル中で凍結させることを含んでなってもよい。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記方法は、幹細胞の複数の集団に対して本発明の方法のいずれか１つの工程を反復することを含んでなる。前記方法は、前記幹細胞の複数の集団を複数のクライオバイアル中で凍結させることを含んでなってもよい。前記方法は、前記複数の凍結保存バイアルを液体窒素保存容器中で少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、または少なくとも１年間保存することをさらに含んでなってもよい。
【0014】
本発明は、本発明の方法に従って得られる複数の凍結保存バイアルを含有する液体窒素保存容器をさらに提供する。
【0015】
本発明は、本発明の方法により得られる幹細胞の集団を提供する。
【0016】
本発明の方法または本発明の幹細胞の集団のいずれかにおいて、解凍後ならびに場合により約１日間および／または約４日間の培養後の生細胞の数は、幹細胞の対照集団と比較して増加し得る。本発明の方法または本発明の幹細胞の集団のいずれかにおいて、解凍後の生細胞の数は、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約５倍増加し得る。本発明の方法または本発明の幹細胞の集団のいずれかにおいて、解凍後の成長率は、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、または少なくとも約２倍増加し得る。本発明の方法または本発明の幹細胞の集団のいずれかにおいて、解凍後ならびに場合により約１日間および／または約４日間の培養後のミトコンドリア活性は、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％増加し得る。本発明の方法または本発明の幹細胞の集団のいずれかにおいて、解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間は、幹細胞の対照集団と比較して減少し得る。本発明の方法または本発明の幹細胞の集団のいずれかにおいて、解凍後に細胞を回収するのに要する時間は、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍減少し得る。
【0017】
本発明は、本発明の幹細胞の集団と凍結保存培地とを含んでなる凍結保存組成物を提供する。前記組成物は凍結され得る。いくつかの実施形態において、前記組成物はＮＡＣを含有する。
【0018】
本発明はまた、本発明の幹細胞の集団と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。前記組成物は、およそ１００万個の細胞～およそ１億５，０００万個の細胞、好ましくは、およそ３，０００万個の細胞またはおよそ１億２，０００万個の細胞を含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞密度は、およそ１～２，０００万個／ｍＬである。
【0019】
本発明は、例えば、本発明の方法における、幹細胞の凍結保存のためのＮＡＣの使用を提供する。
【0020】
本発明はまた、療法における使用のための、本発明の幹細胞の集団、本発明の医薬組成物または本発明の凍結保存組成物を提供する。
【0021】
本発明は、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための、本発明の幹細胞の集団、本発明の医薬組成物または本発明の凍結保存組成物をさらに提供する。
【0022】
本発明は、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に本発明の幹細胞の集団、本発明の医薬組成物または本発明の凍結保存組成物を投与すること含んでなる方法を提供する。
【0023】
本発明はまた、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための幹細胞の集団を提供し、ここで、前記方法は、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｄ）場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｅ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる。
【0024】
本発明は、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｄ）場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｅ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる方法をさらに提供する。
【0025】
本発明は、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための幹細胞の集団を提供し、ここで、前記方法は、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｄ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる。
【0026】
本発明はまた、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｄ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる方法を提供する。
【0027】
いくつかの実施形態において、本発明に係る使用のための幹細胞の集団または本発明に係る治療の方法は、前記患者に前記幹細胞の集団を投与する前に、本明細書に記載の幹細胞の凍結保存の方法の工程のいずれか１つをさらに含んでなる。
【0028】
本発明に係る使用のための幹細胞の集団、医薬組成物もしくは凍結保存組成物または本発明の治療の方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、およそ１００万～１億５，０００万個の細胞、好ましくは、およそ３，０００万個の幹細胞またはおよそ１億２，０００万個の幹細胞を投与することを含んでなる。前記方法は、およそ１００万～およそ１，０００万個／ｋｇの細胞を投与することを含んでなってもよい。前記方法は、本発明の幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物を注射することを含んでなってもよい。前記幹細胞は、本明細書に定義された通りであり得る。いくつかの実施形態において、前記幹細胞は、同種異系または自己である。好ましい複数の実施形態において、前記幹細胞は、ヒト同種異系ＡＳＣである。
【0029】
本発明は、クライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる凍結保存キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】例示されたアッセイを説明するフローチャート。
【図2】無処理（ＮＴ）細胞と比較した、凍結前に種々の化合物（ＮＡＣ；ＬＹ２９４，００２、ｓｃ－７９またはエキセンディン－４）で処理されているＡＳＣの解凍後播種後２４時間におけるＭＴＳアッセイ。ＭＴＳに関して６回の技術的反復での単一実験を代表するデータ。
【図3】無処理（ＮＴ）細胞と比較した、凍結前に６ｍＭ ＮＡＣ（ＮＡＣ）で処理されているＡＳＣの解凍後播種後２４時間における細胞数。技術的三重反復での単一実験を代表するデータ。
【図4】無処理（ＮＴ）細胞と比較した、凍結前に６ｍＭ ＮＡＣ（ＮＡＣ）で処理されているＡＳＣの解凍後播種後１、４、および７日（Ａ）における細胞密度ならびに２４時間（Ｂ）および９６時間（Ｃ）におけるＭＴＳアッセイ。ＭＴＳの結果は、無処理細胞と比較した、４９０ｎｍの吸光度のパーセンテージとして示す。細胞数に関して三重反復で、ＭＴＳに関して６回の技術的反復での単一実験を代表するデータ。図４Ａにおける０日時点は、他の時点で示される接着生細胞の数ではなく、細胞播種密度を示す。
【図5】解凍後播種後１、４および７日における２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来のＡＳＣの細胞密度を示すグラフ。ＡＳＣを６ｍＭ ＮＡＣで前処理し、無処理細胞と比較した。技術的三重反復での１つの実験を代表するデータ。
【図6】平板培地に加えられた２、６または１２ｍＭ ＮＡＣで解凍後処理された解凍ＡＳＣの播種後７、１１および１４日における細胞密度を示すグラフ。技術的三重反復での２つの実験を代表するデータ。
【図7】フローサイトメトリーによるＡＳＣ同一性アッセイ。ＡＳＣ（ドナーＡ由来であり、凍結前に６ｍＭ ＮＡＣで処理された）を解凍後２週において分析し、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して無処理細胞と比較した。陽性細胞のパーセンテージを図に示す。実験は技術的三重反復で行った。
【図8】無処理細胞と比較した、６ｍＭ ＮＡＣで前処理されたドナーＡ由来の解凍ＡＳＣを使用したリンパ球増殖アッセイ。分析は、ＡＳＣ：ＰＢＭＣに関する比１：７５を使用して、９６時間において行った。（Ａ）活性化ＰＢＭＣの最大増殖とＡＳＣの存在下でのＰＢＭＣとの重ね合わせ。（Ｂ）リンパ球増殖に関する解凍後のＮＡＣ処理ＡＳＣと無処理ＡＳＣとの比較。結果は、右下のパネルにおいて定量化されている。
【図9】ＡＳＣおよび単球の共培養の計画およびタイミングを示す図、ならびにマクロファージおよびｍＤＣの分化および機能に対するＡＳＣの効果を評価するために行った分析。
【図10】成熟ＤＣ培養物単独、またはＮＡＣで前処理されたもしくは無処理の２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来の解凍ＡＳＣの存在下での成熟ＤＣ培養物の２倍顕微鏡像。
【図11】成熟ＤＣ培養物単独、またはＮＡＣで前処理されたもしくは無処理の２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来の解凍ＡＳＣの存在下での成熟ＤＣ培養物の２０倍顕微鏡像。
【図12】フローサイトメトリーにより測定された、ＮＡＣ前処理ありまたはなしでの２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来のＡＳＣの非存在下または存在下でのｍＤＣによる黄色ブドウ球菌粒子の食作用を示すヒストグラム。
【図13】フローサイトメトリーにより測定された、ＮＡＣ前処理ありまたはなしでの２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来のＡＳＣの非存在下または存在下でのｍＤＣによる食作用受容体ＣＤ２０６（マンノース受容体）の表面発現。ＡＳＣは、ｍＤＣにおけるＣＤ１４、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３の発現を誘導する。ＡＳＣのＮＡＣ前処理は、これらの効果を変化させなかった。
【図14】フローサイトメトリーにより測定された、ＮＡＣ前処理ありまたはなしでの２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来のＡＳＣの非存在下または存在下でのｍＤＣによる食作用受容体ＣＤ１６３（スカベンジャー受容体）の表面発現。ＡＳＣは、ｍＤＣにおけるＣＤ１４、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３の発現を誘導する。ＡＳＣのＮＡＣ前処理は、これらの効果を変化させなかった。
【図15】フローサイトメトリーにより測定された、ＮＡＣ前処理ありまたはなしでの２例の異なるドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））由来のＡＳＣの非存在下または存在下でのｍＤＣによるＣＤ１４およびＣＤ１ａ（抗原提示分子）の表面発現を示すドットプロット。ｍＤＣはＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋であるが、ＡＳＣの存在は、新たな調節性ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ－ ＤＣ集団を産生する。ＡＳＣのＮＡＣ前処理は、この効果を修飾しなかった。
【発明を実施するための形態】
【0031】
詳細な説明
本発明は、幹細胞の凍結保存のための方法および組成物に関し、ここで、幹細胞の集団は、凍結前（「ＮＡＣ前処理」）および／または幹細胞が解凍された後（「解凍後処理」）にＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理される。
本発明は、幹細胞の凍結保存のための方法および組成物に関し、ここで、幹細胞の集団は、凍結前（「ＮＡＣ前処理」）および／または幹細胞が解凍された後（「解凍後処理」）にＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理される。
【0032】
本発明者らは、凍結解凍プロセスに対する細胞の抵抗性を改善する目的で、細胞におけるアポトーシス傷害（例えば、低酸素、血清枯渇、酸化ストレス（例えば、過酸化水素処理により引き起こされた）、Ｆａｓリガンド誘導死など）を調節することで知られる多数の化合物を試験した。ＮＡＣは、無処理対照細胞と比較して、生細胞数を増加させる、成長率を増加させる、ミトコンドリア活性を増加させる、かつ／または回収率を改善させるという点で、解凍後の幹細胞に対して利点を与えることが見出された。解凍時に直ちに利用可能な生細胞の数を増加させることは、例えば、急性治療にとって有用である。これらの利点は、例えば、解凍後の培養下の凍結保存細胞を回収および／または拡大するのに必要な時間を低減することにより、幹細胞ストックおよび細胞株の保存、輸送および取扱い、ならびに細胞ベースの療法の調製および輸送を促進する助けとなるであろう。
【0033】
Ｎ－アセチルシステイン
Ｎ－アセチル－Ｌ－システインとしても知られるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、天然に存在するアミノ酸であるＬ－システインのＮ－アセチル誘導体に対する一般名である。これは、分子量１６３．２ｇｍｏｌ－１および以下の化学構造を有する抗酸化剤である：
Ｎ－アセチル－Ｌ－システインとしても知られるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、天然に存在するアミノ酸であるＬ－システインのＮ－アセチル誘導体に対する一般名である。これは、分子量１６３．２ｇｍｏｌ－１および以下の化学構造を有する抗酸化剤である：
【化1】
【0034】
ＮＡＣは、アセタドート（登録商標）、ムコミスト（登録商標）、パルボレックス（登録商標）、フルイムシル（登録商標）などの商品名で市販されている。これは、パラセタモール（アセトアミノフェン）過剰投与の治療を含むいくつかの適応症に対して（注射剤および経口剤として）、ならびに嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患を有する個人における厚い粘液を緩めるための粘液溶解剤として（静脈内投与、経口投与またはミストとして吸入）承認されている。ＮＡＣはまた、肝不全、種々の癌、メタクリロニトリル中毒、造影剤誘発性腎症の低減、および心臓バイパス手術中の再灌流傷害の低減を含む他の適応症を治療するためにも使用または検討されている。
【0035】
ＮＡＣによる前処理
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、凍結前にＮＡＣによる幹細胞の集団の処理、すなわち、幹細胞の集団の「前処理」を含んでなる方法が、本明細書に開示される。このため、「ＮＡＣ前処理細胞」は、ＮＡＣで処理され、次いで凍結されている細胞を指す。
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、凍結前にＮＡＣによる幹細胞の集団の処理、すなわち、幹細胞の集団の「前処理」を含んでなる方法が、本明細書に開示される。このため、「ＮＡＣ前処理細胞」は、ＮＡＣで処理され、次いで凍結されている細胞を指す。
【0036】
前記幹細胞の凍結保存の方法は、以下の工程：（ａ）幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団をＮ－アセチルシステインで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ることを含んでなってもよい。
【0037】
幹細胞の集団をＮＡＣで処理すること（「処理」または「処理工程」）は、一般に、ＮＡＣを幹細胞の集団にとって好適な細胞培養培地に加えることにより、行われる。ＮＡＣのストック溶液は、例えば、水中で調製することができ、次いで、ＮＡＣを培養培地中で必要な濃度に希釈することができる。
【0038】
当業者は、特定の細胞型の成長を支持するための好適な細胞培養培地を認識しているであろう。細胞培養培地は、液体形態、またはゼラチン培地、例えば、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質を含む固体形態であり得る。培地は、既知組成（通常、精製された）成分から構成され、かつ酵母抽出物およびビーフブロスなどの特性が明らかでない生物学的抽出物を含有しない「限定培地」であり得る。培地は、いかなる特殊な栄養補充物も必要としない多くの種類の微生物の成長を促進する「基本培地」であり得る。ほとんどの基本培地は、一般に、４つの基本的な化学群：アミノ酸、炭水化物、無機塩類、およびビタミンを含んでなる。基本培地は、一般に、血清、緩衝液、成長因子、脂質などの補充物が加えられるより複雑な培地の基礎としての役割を果たす。基本培地の例としては、限定されるものではないが、イーグル基本培地、最小必須培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、培地１９９、栄養混合物ハムＦ－１０およびハムＦ－１２、マッコイ５Ａ、ダルベッコＭＥＭ／Ｆ－１２、アルファ改変最小必須培地（アルファＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）、およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられる。一般に、０～２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）または１～２０％ウマ血清が、ＭＳＣの成長を支援するために上記の培地に加えられる。しかしながら、ＭＳＣに対するＦＢＳ中の必要な成長因子、サイトカイン、およびホルモンが同定され、増殖培地中にて適当な濃度で提供される場合、限定培地が使用され得る。培養培地に含まれ得る抗生物質としては、限定されるものではないが、ペニシリンおよびストレプトマイシンが挙げられる。既知組成培養培地中のペニシリンの濃度は、約１０～約２００単位／ｍｌである。既知組成培養培地中のストレプトマイシンの濃度は、約１０～約２００μｇ／ｍｌである。例えば、ＡＳＣに対する好適な細胞培養培地は、完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地 － ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ、Ｇｉｂｃｏ社、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを補充）である。
【0039】
前記処理工程は、ＮＡＣを前記幹細胞の集団に加えて、およそ０．５～１０ｍＭ ＮＡＣ、例えば、およそ２～８ｍＭまたはおよそ４～６ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなってもよい。０．５～２０ｍＭ ＮＡＣ、例えば、およそ３～１５ｍＭ ＮＡＣ、０．５～１２ｍＭまたは４～１２ｍＭ ＮＡＣの初濃度を使用してもよい。特に好ましい実施形態において、ＮＡＣの初濃度は、およそ６ｍＭである。「初濃度」は、幹細胞の集団に添加した際のＮＡＣの濃度を指す。しかしながら、細胞への添加後、例えば、ＮＡＣが分解または代謝されることにより、ＮＡＣの初濃度は減少する可能性が高いと理解されるであろう。このため、前記処理工程は、例えば、幹細胞の集団が曝露するＮＡＣの濃度を維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなってもよい。このため、前記「処理工程」は、幹細胞の集団をＮＡＣの初濃度で処理すること、場合により、前記処理工程中のＮＡＣのレベルをモニタリングすること、およびＮＡＣの濃度を初濃度または事前選択されたレベル（例えば、上記のＮＡＣの濃度）に維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を行うことを含んでなってもよい。
【0040】
前記処理工程は、前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団をＮＡＣで少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４または４８時間インキュベートすることを含んでなってもよい。例えば、ＮＡＣでの幹細胞の集団のインキュベーションは、前記幹細胞の集団を凍結させる前に、約１～約４８時間、約２～２４時間、または約６～２４時間行ってもよい。インキュベーションは、任意の好適な条件下（例えば、幹細胞の集団が安定している）で行ってもよい。好ましい複数の実施形態において、インキュベーションは、特定の細胞型に対する培養条件下で行われる。例えば、ＡＳＣは、完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地 － ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ、Ｇｉｂｃｏ社、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを補充）中にてＮＡＣでインキュベートされ得、５％ＣＯ２にて３７℃でインキュベートされ得る。一つの実施形態において、前記幹細胞の集団は、全培養期間ＮＡＣでインキュベートされない。培養期間は、細胞培養容器への前記幹細胞の集団の播種と前記幹細胞の集団の凍結との間の期間である。一つの実施形態において、前記幹細胞の集団は、第１の期間にＮＡＣ添加なしで培養培地中にてインキュベートされ、次いで、第２の期間にＮＡＣ添加ありで培養培地中にてインキュベートされる。
【0041】
本明細書に開示されるＮＡＣ「処理工程」に供されている幹細胞の集団は、「幹細胞の処理集団」という。
【0042】
前記処理工程の後、前記幹細胞の処理集団は凍結される。本明細書に開示される凍結（「凍結工程」）に供されている幹細胞の集団は、「幹細胞の凍結集団」という。本明細書に開示される解凍（「解凍工程」）に供されている幹細胞の集団は、「幹細胞の解凍集団」という。このため、前記方法は、以下の工程：（ａ）前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ることを含んでなってもよい。
【0043】
前記幹細胞の処理集団を凍結させる前に、ＮＡＣを除去してもよい（すなわち、細胞がもはや細胞外ＮＡＣに曝露しないように）。一般に、これは、前記幹細胞の集団を、例えば、（１）ＮＡＣを含有しない細胞培養培地（例えば、前記処理工程において使用されるような）；（２）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；および／または（３）凍結培地で洗浄することにより行うことができる。本明細書に開示される洗浄（「洗浄工程」）に供されている幹細胞の集団は、「幹細胞の洗浄集団」という。洗浄は、細胞を凍結培地などの異なる培地中で凍結させることができるように、培地交換工程として使用することもできる。このため、前記方法は、以下の工程：（ａ）前記幹細胞の集団をＮ－アセチルシステインで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を洗浄して、Ｎ－アセチルシステインを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること、および前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；ならびに（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ることを含んでなってもよい。
【0044】
前記幹細胞の処理集団の洗浄は、任意の好適な方法により行うことができる。接着細胞に関して、ＮＡＣ含有溶液（例えば、培地）は、簡単なピペット操作により、異なるもの（例えば、ＮＡＣを含まない、かつ／または凍結培地であるもの）と交換することができる。浮遊状態の細胞（トリプシン処理接着細胞を含む）に関して、細胞は、例えば、遠心分離機を使用してペレット化し、上清を除去し、場合により洗浄し（例えば、培養培地またはＰＢＳで）、次いで、必要な培地（例えば、培養培地または凍結培地）に再懸濁させることができる。細胞を洗浄するために、濾過、限外濾過または透析を使用することもできる。接着細胞をトリプシン処理する方法は、当技術分野で公知であり、好適な方法は、実施例において例示される。
【0045】
凍結解凍後、細胞は、例えば、細胞を回収できるようにするため、かつ／または細胞数を増加させるために培養することができる（「培養」または「培養工程」）。得られた細胞は、「幹細胞の拡大集団」という。本明細書で使用する場合の用語「拡大」は、細胞を言及する際、当技術分野におけるその通常の意味を有するものとし、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖している細胞を意味するものとする。「増殖」は、細胞数の増加を指す。「増殖している」および「増殖」は、有糸分裂を受けている細胞を指す。このため、前記方法は、以下の工程：（ｄ）前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなってもよい。
【0046】
本明細書で使用する場合の「培養」は、当技術分野で認識される用語、すなわち、好適な培地中で細胞成長を達成する任意の方法を指す。細胞は、幹細胞の培養のための当技術分野で公知の任意の技術により培養してもよい。培養工程は、小規模、中規模または大規模であり得る。総培養量が約１００ｍＬ未満の場合、培養は小規模とみなされ得る。総培養量が約１００ｍＬ～約５Ｌである場合、培養は中規模とみなされ得る。総培養量（例えば、バイオリアクター中での）が約５Ｌ超である場合、培養は大規模とみなされ得、総培養量は、１０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌまたは１，０００Ｌ超であってもよい。
【0047】
「細胞培養」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。このような培養において、細胞は増殖するが、それ自体は組織に組織化しない。「組織培養」は、その構造および機能を保存するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織、例えば、器官原基または成体器官の外植片の維持または成長を指す。「単層培養」は、細胞が主に互いにおよび基質に接着しながら、好適な培地中で増殖する培養を指す。さらに、「懸濁培養」は、細胞が好適な培地中で懸濁されながら増殖する培養を指す。同様に、「連続流動培養」は、細胞成長、例えば、生存率を維持するための新鮮培地の連続流下での細胞または外植片の培養を指す。「コンフルエント培養」は、総ての細胞が接触し、それにより培養容器の全表面が覆われている細胞培養であり、細胞がまたそれらの最大密度に達していることを意味するが、コンフルエンスは、必ずしも分裂が停止することまたは集団のサイズが増加しないことを意味するわけではない。
【0048】
種々の培養技術、ならびにそれらのスケールアップの考察は、Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 第7版, Wiley-Blackwell January 2016において見出され得る。培養工程は、任意の種類の容器で行うことができる（異なる種類の容器の考察を含む、ＭＳＣの製造のレビューについては、Mizukami et al. “Mesenchymal Stromal Cells: From Discovery to Manufacturing and Commercialization” Stem Cells International (2018) 論文ID 4083921, 1-13 https://doi.org/10.1155/2018/4083921参照）。本明細書に開示される方法において使用され得る容器の例としては、Ｎｕｎｃ Ｃｅｌｌ ＦａｃｔｏｒｙおよびＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋなどの単一コンパートメントまたは多層容器セルファクトリーからなる単層培養フラスコまたは二口平底フラスコ(flat two-dimensional flask)が挙げられる。フラスコの代替として、回転瓶を使用することができ、すなわち、細胞が瓶の内部表面の周囲に単層を形成することができる回転装置内に配置された円柱状の瓶を使用することができる。ＭＳＣ（ＡＳＣなど）を含む細胞の大規模拡大に好適なバイオリアクターは市販されており、２Ｄ（すなわち、実質的に平面の）拡大バイオリアクターおよび３Ｄ拡大バイオリアクターの両方が含まれ得る。本明細書に開示される方法において使用され得るこのようなバイオリアクターの例としては、限定されるものではないが、栓流バイオリアクター、灌流バイオリアクター、連続撹拌槽型バイオリアクター、または固定床バイオリアクター(stationary-bed bioreactor)が挙げられる。バイオリアクターは、バッチモード、フェドバッチモードまたは灌流モードで操作され得る。ＭＳＣの足場依存的な性質のために、バイオリアクター中での培養は、一般に、浮遊状態で容易に維持され、細胞が接着および成長するための表面を提供する小さなビーズ（直径１００～２００μｍ）であるマイクロキャリアの使用を必要とする。マイクロキャリアの例としては、Ｃｙｔｏｄｅｘ－３マイクロキャリア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）が挙げられる。細胞は、一般に、加湿環境下にて３１℃～３７℃の温度で成長する。このため、いくつかの実施形態において、幹細胞の拡大集団を得るための幹細胞（例えば、ＡＳＣなどのＭＳＣ）の解凍集団の培養は、マイクロキャリアを使用した大規模バイオリアクター中で行われる。
【0049】
幹細胞の解凍集団の培養は、例えば、回収率を改善させる、かつ／または細胞数を増加させるために、ＮＡＣの存在下で行ってもよい。言い換えれば、ＮＡＣによる前処理に加えて、解凍後ＮＡＣ処理を使用することができる。このため、前記方法は、以下の工程：（ｄ）前記幹細胞の解凍集団をＮ－アセチルシステインの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなってもよい。前記幹細胞の解凍集団の培養は、細胞型にとって好適な細胞培養条件下で、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭ ＮＡＣ、例えば、およそ０．５～４ｍＭまたはおよそ１～２ｍＭの範囲、好ましくは、およそ２ｍＭの初濃度とすることを含んでなってもよい。ＮＡＣのさらなる添加は、（例えば、ＮＡＣが分解または代謝されることによる）細胞培養培地中のＮＡＣの濃度を維持するために必要とされ得る。このため、前記培養工程は、培養培地中の初濃度のＮＡＣを加えること、次いで、ＮＡＣの初濃度を維持するための、またはＮＡＣの濃度を事前選択されたレベル（例えば、上記のＮＡＣの濃度）に維持するためのＮＡＣのさらなる添加を含んでなってもよい。さらなる添加は、ＮＡＣ単独または他の栄養素と組み合わせて（例えば、流加培養において）、ボーラスとして行うことができる。前記「培養工程」は、ＮＡＣのレベルをモニタリングすること、および初濃度または事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を行うことをさらに含んでなってもよい。あるいは、ＮＡＣは、例えば、灌流培養中に新鮮培地に連続的に補充することができる。
【0050】
ＮＡＣは、必要に応じて、幹細胞の集団の任意の下流での使用の前に除去することができる。このため、前記方法は、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなってもよい。前記洗浄工程は、例えば、薬学上許容可能な担体、ＮＡＣを含有しない溶液／培地、または凍結培地への培地交換を可能とし得る。洗浄は、遠心分離、濾過、限外濾過または透析を含む任意の好適な方法により行うことができる。接着細胞に関して、ＮＡＣ含有溶液（例えば、培地）は、簡単なピペット操作により、異なるものと交換することができる。浮遊状態の細胞（トリプシン処理接着細胞を含む）に関して、細胞は、（例えば、遠心分離機を使用して）ペレット化し、上清を除去し、場合により洗浄し（例えば、培養培地またはＰＢＳで）、次いで、必要な溶液（例えば、培養培地、凍結培地または薬学上許容可能な担体）に再懸濁させることができる。このため、前記方法は、（例えば、工程（ｃ）もしくは（ｄ）の）前記幹細胞の解凍もしくは拡大集団を洗浄する、または前記細胞（例えば、浮遊細胞もしくはトリプシン処理接着細胞）を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなってもよい。
【0051】
幹細胞の拡大集団は、例えば、細胞ストックとしての保存および／または輸送のために凍結してもよい。前記方法は、以下の工程：（ｅ）（例えば、工程（ｄ）からの）幹細胞の拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団を得ることをさらに含んでなってもよい。前記方法は、以下の工程：（ｅ）前記幹細胞の拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団を得ること；および（ｆ）前記幹細胞の凍結拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ることをさらに含んでなってもよい。前記方法は、以下の工程：（ｅ）前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ることを含んでなってもよい。前記方法は、以下の工程：（ｅ）前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること；および（ｆ）前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ることをさらに含んでなってもよい。上記で考察したように、工程（ｄ）の「培養工程」はＮＡＣの存在下で行うことができるため、これらの例において、幹細胞の拡大集団は、凍結前にＮＡＣで「前処理された」とみなされ得る。ＮＡＣは、凍結前に、必要に応じて洗浄により除去することができ、かつ／または洗浄は、例えば、凍結培地への培地交換のために使用することができる。場合により、前記方法は、以下の工程：（ｇ）前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞（例えば、浮遊細胞またはトリプシン処理接着細胞）を薬学上許容可能な担体に再懸濁させることをさらに含んでなってもよい。
【0052】
上記で考察した方法から得られる幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の凍結集団は、マスター細胞ストックを形成する。例えば、幹細胞の集団は、複数のクライオバイアル、例えば、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約５０個、約１００個、約１，０００個、約２，０００個、約５，０００個以上のクライオバイアルに分注し、極低温で（例えば、液体窒素保存容器中で）保存することができる。次いで、個々のクライオバイアルは、下流での使用のために別々に解凍することができる。上記で考察した方法から得られる幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の解凍または拡大集団は、治療用幹細胞集団であり得る。例えば、幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の解凍または拡大集団は、それを必要とする患者に投与するための好適な処方物（例えば、薬学上許容可能な担体を含有する医薬組成物）中に含まれ得る。
【0053】
前記方法は、前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなってもよい。
【0054】
解凍後ＮＡＣ処理
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなる方法が、本明細書に開示される。ＮＡＣの存在下での前記幹細胞の解凍集団の培養（すなわち、解凍後ＮＡＣ処理）は、回収率を改善させ得る、かつまたは生細胞数を増加させ得る。
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなる方法が、本明細書に開示される。ＮＡＣの存在下での前記幹細胞の解凍集団の培養（すなわち、解凍後ＮＡＣ処理）は、回収率を改善させ得る、かつまたは生細胞数を増加させ得る。
【0055】
前記幹細胞の解凍集団の培養は、細胞型にとって好適な細胞培養条件下で、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭ ＮＡＣ、例えば、およそ０．５～４ｍＭまたはおよそ１～２ｍＭの範囲、好ましくは、およそ２ｍＭの初濃度とすることを含んでなってもよい。ＮＡＣのさらなる添加は、（例えば、ＮＡＣが分解または代謝されることによる）細胞培養培地中のＮＡＣの濃度を維持するために必要とされ得る。このため、前記培養工程は、培養培地中の初濃度のＮＡＣを加えること、次いで、ＮＡＣの初濃度を維持するための、またはＮＡＣの濃度を事前選択されたレベル（例えば、上記の解凍後処理のためのＮＡＣの濃度）に維持するためのＮＡＣのさらなる添加を含んでなってもよい。さらなる添加は、場合により他の栄養素と組み合わせて（例えば、流加培養において）、ボーラスとして行うことができる。前記「培養工程」は、ＮＡＣのレベルをモニタリングすること、および初濃度または事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を行うことをさらに含んでなってもよい。あるいは、ＮＡＣは、例えば、灌流培養中に提供された新鮮培地に連続的に補充することができる。
【0056】
前記方法は、前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなってもよい。
【0057】
凍結保存
本明細書において、用語「凍結保存」は、低温環境下、すなわち、－７０℃～－１９６℃での細胞の保存を説明するために使用される。これらの温度は、長期保存（数ヵ月～数年）に好適である。本明細書で考察される幹細胞の文脈における用語「凍結させること」、「凍結させる」および「凍結した」の使用は、このような低温に細胞を曝露させる行為、およびそれに供されている細胞を指す。
本明細書において、用語「凍結保存」は、低温環境下、すなわち、－７０℃～－１９６℃での細胞の保存を説明するために使用される。これらの温度は、長期保存（数ヵ月～数年）に好適である。本明細書で考察される幹細胞の文脈における用語「凍結させること」、「凍結させる」および「凍結した」の使用は、このような低温に細胞を曝露させる行為、およびそれに供されている細胞を指す。
【0058】
一般に、冷却時、外部培地は凍結するため、水を失うことにより細胞が平衡化し、それにより、細胞内溶質濃度が増加する。約－１０～－１５℃未満で、細胞内凍結が生じる。細胞内凍結および溶液効果の両方が、細胞傷害の原因となる。細胞外氷による物理的損傷は、大部分が、細胞の浸透脱水に起因する形質膜傷害の結果である。
【0059】
システムが凍結されたら、総ての生物学的プロセスが停止するわけではない。凍結中、細胞は、凍結氷マトリックスに包まれながら、生化学的に活性の非凍結状態を維持する。温度が凍結防止剤／細胞溶液混合物のガラス転移点（Ｔg）（一般に－１００℃未満）に下がってから、細胞は、生化学的活性および生体分子活性が停止するガラス状態に入る。
【0060】
凍結およびその後の解凍中、温度がＴgを上回る場合、重要な一組の分子事象および生化学的事象が各細胞内で生じ、その解凍後の生存率および機能に激しく影響を及ぼす。この温度範囲（およそ＋１５℃～－９９．９℃）において、凍結保存と低温保存との間で細胞応答機序に多数の類似性が認められ得る。このような事象としては、フリーラジカルの形成、生化学的経路の脱共役、細胞内廃棄物の蓄積、イオン勾配の破壊、タンパク質の変性および分解、ならびに酵素の切断および活性化が挙げられる。これらのおよび他の事象は、アポトーシス細胞死経路および／または壊死性細胞死経路を活性化し得、その結果、遅延性細胞死の現象が生じ得る。これは、保存直後の生存率の尺度と２４～４８時間後の真の生存との間の乖離として観察され得る。
【0061】
凍結保存培地
幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団は、凍結保存培地（「凍結培地」）中で凍結してもよい。前記培地は、凍結解凍後の細胞の特性（例えば、生存率）のうち１つ以上を（特定の程度まで）保存し得、かつ／または回収を助長し得る。前記凍結保存培地は、例えば、約０．５～１０ｍＭの濃度のＮＡＣを含有し得る。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有しない。凍結保存培地は、一般に、１以上の凍結保存剤、例えば、ＤＭＳＯ、ＰＶＰ、セリシン、またはメチルセルロースを含有し、かつ／または市販の凍結保存溶液を含有し得る。前記１以上の凍結保存剤または凍結保存溶液は、凍結保存培地を作製するために、ＤＭＥＭなどの幹細胞培養培地に加えてもよい。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、いかなる添加された成長因子も含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、いかなる添加されたＥＧＦおよびｂＦＧＦも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、添加された亜セレン酸ナトリウムを含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加された成長因子も含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加されたＥＧＦおよびｂＦＧＦも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加された亜セレン酸ナトリウムも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加された成長因子も含有せず、かついかなる添加された亜セレン酸ナトリウムも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かつＥＧＦおよびｂＦＧＦを含有せず、かついかなる添加された亜セレン酸ナトリウムも含有しない。
幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団は、凍結保存培地（「凍結培地」）中で凍結してもよい。前記培地は、凍結解凍後の細胞の特性（例えば、生存率）のうち１つ以上を（特定の程度まで）保存し得、かつ／または回収を助長し得る。前記凍結保存培地は、例えば、約０．５～１０ｍＭの濃度のＮＡＣを含有し得る。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有しない。凍結保存培地は、一般に、１以上の凍結保存剤、例えば、ＤＭＳＯ、ＰＶＰ、セリシン、またはメチルセルロースを含有し、かつ／または市販の凍結保存溶液を含有し得る。前記１以上の凍結保存剤または凍結保存溶液は、凍結保存培地を作製するために、ＤＭＥＭなどの幹細胞培養培地に加えてもよい。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、いかなる添加された成長因子も含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、いかなる添加されたＥＧＦおよびｂＦＧＦも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、添加された亜セレン酸ナトリウムを含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加された成長因子も含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加されたＥＧＦおよびｂＦＧＦも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加された亜セレン酸ナトリウムも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かついかなる添加された成長因子も含有せず、かついかなる添加された亜セレン酸ナトリウムも含有しない。一つの実施形態において、前記凍結保存培地は、ＮＡＣを含有せず、かつＥＧＦおよびｂＦＧＦを含有せず、かついかなる添加された亜セレン酸ナトリウムも含有しない。
【0062】
凍結保存剤（または凍結防止剤）は、理想的には無毒であり、凍結中に細胞を保護し、水の代用となり、かつ／または高いガラス転移温度を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、凍結防止剤は、とりわけ、以下の機序：外部浸透圧を平衡させること、選択的排除を介して生体分子を安定化すること、生体分子周囲に保護ガラスを形成すること、および脂質膜における有害な相転移を予防することを介して、凍結から細胞を保護すると仮定される。
【0063】
歴史的に、ＤＭＳＯ、グリセロールおよび動物血清が、凍結防止剤として使用されている。
【0064】
ＤＭＳＯは、一般に、１～２０％（ｖ／ｖ）、例えば、５～１５％の範囲、すなわち、約１％、２％、５％、１０％または２０％で凍結保存培地に加えられる。およそ１０％の終濃度が、特に好ましい。
【0065】
ＤＭＳＯは、血清、すなわち、仔ウシ／ウシ胎仔血清（ＦＣＳ／ＦＢＳ）またはヒト血清と組み合わせて使用してもよい。例えば、前記凍結保存培地は、２０～９５％血清（ヒトまたはＦＣＳ）および５～１５％ＤＭＳＯを含有し得る。本明細書に記載の方法のいずれか１つに使用される特に好ましい凍結保存培地（例えば、ＡＳＣなどのＭＳＣのための）は、およそ１０％ＤＭＳＯおよびおよそ９０％ＦＣＳ（またはＦＢＳ）を含有する。例えば、ヒトＡＳＣなどのＭＳＣの集団のための凍結保存培地は、ＦＢＳ中の５～１５％ＤＭＳＯを含有し得る。ヒト胚性幹細胞の集団のための凍結培地は、１０％ＤＭＳＯ、３０％ＦＢＳおよび６０％条件ＨＥＳ培地を含有し得る。
【0066】
ＤＭＳＯは、ヒト血清アルブミンと組み合わせて使用してもよい。例えば、前記凍結保存培地は、約２～１０％ヒト血清アルブミンおよび約５～１５％ＤＭＳＯを含有し得る。特に好ましい凍結保存培地は、およそ１０％ＤＭＳＯおよびおよそ５％ヒト血清アルブミンを含有する。
【0067】
他の分子、例えば、グリセロール、エチレングリコール、ヒドロキシセルロース、または二糖類のスクロース、マルトース、およびトレハロースが、凍結培地中のＤＭＳＯと組み合わせた場合、細胞生存率を増大させることが示されている。
【0068】
トレハロースは、ほぼ完全な脱水を生き延びることができる多種多様な生物体において高濃度で認められる二糖類であり、凍結中に特定の細胞を安定化することが示されている。トレハロースは、リン脂質頭部基の間隔を保存すること、ならびに脂質相転移および凍結中の分離を阻害することにより、膜の熱力学的安定性を維持すると考えられる。トレハロースは、脂質二重層を容易には貫通しないものであり、エンドサイトーシスまたは細胞膜を一時的に破壊する他の方法を介して、細胞内にロードしなければならない。例えば、前記ＡＳＣのための凍結保存培地は、約５０～２００ｍＭ、例えば、およそ１００ｍＭの濃度のトレハロースを含有し得る。トレハロースは、例えば、上記で考察した濃度のＤＭＳＯと組み合わせて使用する場合、他の凍結防止剤と関連した潜在的な毒性を低減するために使用することができる（例えば、Buchanan et al. Cell Preservation Technology (2005) 3(4): 212-222参照）。
【0069】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、セリシンおよびマルトース、ならびにメチルセルロース（ＭＣ）が、代替の凍結保存剤である。これらの化合物は、ＤＭＳＯまたは動物由来血清の代替として、例えばＡＳＣの凍結保存溶液として試験されている（Miyagi-Shiohira et al. Cell Medicine (2015) 8: 3-7）。
【0070】
高分子ポリマーであるＰＶＰは、凝固点を低下させ、細胞外塩濃度の増加を阻害し、それにより、凍結解凍プロセス中に細胞膜を安定化する。ＰＶＰは、約１％～４０％、例えば、約８～２５％、例えば、約１％、５％、１０％、２０％または４０％のレベルで前記凍結保存培地に加えることができる。前記凍結保存培地はまた、ＰＶＰに加えて、場合により約５～２０％のヒト血清（例えば、１０％ヒト血清）を含有し得る。例えば、前記ＡＳＣのための凍結保存培地は、１０％ＰＶＰおよび１０％ヒト血清を含有し得る。
【0071】
ＭＣは、凍結保存溶液中の動物由来血清の代用となり得る高分子ポリマーであるが、ＤＭＳＯ（または別の凍結保存剤）の存在は、凍結解凍プロセス後の細胞活性を保持するために必須である。凍結保存培地は、上記で考察したような好適な濃度のＤＭＳＯと組み合わせて、約０．５％～２％ｗ／ｖ ＭＣ、例えば、約１％ｗ／ｖを含有し得る。例えば、前記凍結保存培地は、約１％ＭＣおよび約１０％ＤＭＳＯを含有し得る。
【0072】
セリシンは、これもまた凍結保存溶液中の動物由来血清の代用となり得る繭由来タンパク質である。凍結保存培地は、約０．５％～２％ｗ／ｖセリシン、例えば、約１％ｗ／ｖを含有し得る。セリシンは、マルトース（例えば、５０～２００ｍＭマルトース）および／または上記で考察したような好適な濃度のＤＭＳＯと組み合わせて使用してもよい。例えば、前記凍結保存培地は、約１％セリシン、１００ｍＭマルトースおよび１０％ＤＭＳＯを含有し得る。
【0073】
種々の市販の凍結保存溶液が存在し、例えば：ＦＭ－１（極東製薬工業株式会社、東京、日本）、セルバンカー凍結防止剤シリーズ（日本全薬工業株式会社、福島、日本）；ＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）；Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ凍結保存培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ凍結培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられる。
【0074】
セルバンカー凍結防止剤シリーズは、－８０℃での急速な細胞凍結保存を可能にし、その使用は、凍結および解凍後の生存率の改善に関連する。血清含有セルバンカー１および１＋は、ほぼ総ての哺乳動物細胞の凍結保存に使用することができる。さらに、無血清タイプのセルバンカー２は、無血清培養条件下での細胞の凍結保存を可能にする。他方、ＳＴＥＭＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（セルバンカー３）は、既知組成で、ゼノフリーであり（すなわち、非ヒト動物製品を含有しない）、体性幹細胞および人工多能性幹細胞などの幹細胞の保存性能を最適化する細胞凍結保存溶液である。
【0075】
ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）の種類（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）は、種々の濃度のＤＭＳＯ（ＣＳ１０ １０％ＤＭＳＯ；ＣＳ５ ５％ＤＭＳＯ；ＣＳ２ ２％ＤＭＳＯ）を含有する、無血清、動物成分不含の限定凍結保存培地である。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０は、ＭＳＣ（ＡＳＣを含む）、胚性幹細胞（ＥＳ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の凍結保存に使用されている。Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ凍結保存培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を凍結保存するために使用されている。
【0076】
細胞特異的な凍結保存培地も利用可能であり、例えば、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞用のｍＦｒｅＳＲ（商標）およびＦｒｅＳＲ（商標）－Ｓ凍結保存培地、ＭＳＣ用のＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ凍結培地、ならびにＥＳ／ｉＰＳ細胞由来の神経前駆細胞用のＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）神経前駆細胞凍結培地が挙げられる。例えば、ＭＳＣは、ＭＳＣを凍結保存するためのＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ ＰｌｕｓまたはＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中でのＭＳＣ培養後に使用することができる、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ凍結培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で凍結保存することができる。
【0077】
種々の幹細胞型に使用される例示的な凍結保存培地および凍結防止剤を、以下の表に示す：
【0078】
【表1】
【0079】
ＭＳＣの凍結保存に関するさらなる詳細は、例えば、Marquez-Curtis et al. (Cryobiology (2015) 71(2): 181-197)およびFrancois et al. (Cytotherapy (2012) 14(2): 147-152)において提供される。
【0080】
凍結プロトコールおよび保存条件
凍結速度は、細胞の脱水および損傷を引き起こす溶質および電解質の不均衡を回避するのに十分速く、かつ細胞外および細胞内の氷晶形成を防止するのに十分遅くなければならない。凍結防止剤は培地の凝固点を下げるため、細胞および凍結防止剤を含有する凍結保存培地の混合物は、合わさった凝固点は個々の成分より低いことから、共融系である。凍結プロセス中、液体は、非凍結細胞中のより低い溶質濃度から部分的に凍結した培地へと移動し、一方、形質膜は、細胞外氷晶の侵入を防止する。緩慢凍結は、培地が凍結する時間までに細胞と培地との間の浸透圧の平衡をもたらす速度で液体が細胞から移動することを可能にする。速度が遅すぎると、細胞が致命的に脱水されるか、またはそれらの形質膜が不可逆的に損傷を受ける。速度が速すぎると、液体の移動が不十分となり、細胞が凍結保存プロセス中に高いレベルの凍結水分を保持し、致命的な細胞内氷の損傷に至る。
凍結速度は、細胞の脱水および損傷を引き起こす溶質および電解質の不均衡を回避するのに十分速く、かつ細胞外および細胞内の氷晶形成を防止するのに十分遅くなければならない。凍結防止剤は培地の凝固点を下げるため、細胞および凍結防止剤を含有する凍結保存培地の混合物は、合わさった凝固点は個々の成分より低いことから、共融系である。凍結プロセス中、液体は、非凍結細胞中のより低い溶質濃度から部分的に凍結した培地へと移動し、一方、形質膜は、細胞外氷晶の侵入を防止する。緩慢凍結は、培地が凍結する時間までに細胞と培地との間の浸透圧の平衡をもたらす速度で液体が細胞から移動することを可能にする。速度が遅すぎると、細胞が致命的に脱水されるか、またはそれらの形質膜が不可逆的に損傷を受ける。速度が速すぎると、液体の移動が不十分となり、細胞が凍結保存プロセス中に高いレベルの凍結水分を保持し、致命的な細胞内氷の損傷に至る。
【0081】
本明細書に記載の方法において幹細胞の集団を凍結させるために、機械的冷凍庫または制御速度冷凍庫を使用してもよい。制御速度冷凍庫は、特定の速度で細胞をおよそ－８０℃に冷却するようにプログラムすることができる。ほとんどの細胞（ＭＳＣを含む）を－８０℃に凍結保存するための典型的な凍結速度は、－１℃／分である。このような凍結速度は、例えば、独立気泡ポリエチレンフォーム容器（例えば、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）；ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ社）、スタイロフォーム容器またはイソプロパノール（ＩＰＡ）充填容器（例えば、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））を使用して、幹細胞を－８０℃の機械的冷凍庫に入れる前に、幹細胞の集団を絶縁することにより達成され得る。ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）およびＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）の両方とも、規定の凍結速度－１℃／分を有する。しかしながら、凍結プロトコールは、解凍時の最大の生存率および機能の維持を達成するために、特定の細胞型または細胞株に対する最適化を必要とする場合がある。本明細書に記載の方法において、１つまたは複数の凍結工程は、約－０．５～約－１０℃／分、好ましくは、約－３～約－５℃／分の範囲、例えば、およそ－１、－２、－３、－４、－５または－１０℃／分で行ってもよい。最終凍結温度は、約－７０℃～約－１３０℃であり得る。このため、開示された方法において、１つまたは複数の凍結工程は、約－０．５～約－１０℃／分の速度で温度を－７０℃～－１３０℃に下げることを含んでなってもよい。温度は、１０～６０分で＋４℃から－１００～－１８０℃に下げてもよい。
【0082】
幹細胞の集団は、任意の細胞密度で凍結することができる。幹細胞の凍結集団の好ましい細胞密度は、およそ１００万～およそ５，０００万個／ｍＬの範囲、好ましくは、およそ２，５００万個／ｍＬである。
【0083】
凍結後、細胞の凍結集団は、必要となるまで－１９６℃の液体窒素中で保存してもよい。熱依存的代謝プロセスは一般に－１００℃未満では生じないため、幹細胞は液体窒素中で代謝静止の状態にある。低温機械的ストレスがさほど重度ではない－１００℃超の温度では、種々の容器を使用してもよい。しかしながら、液体窒素温度で材料を保存する場合、極低温に耐えるように特異的に設計された容器（すなわち、「クライオバイアル」）を使用しなければならない。極低温での使用のために特異的に設計された種々の容器が市販されており、プラスチッククライオバイアル（例えば、ねじ蓋付き）またはガラスアンプル（フレームシールされていてもよい）が挙げられる。一般に使用されるサイズは、１．２、２．０、４、５、１０および１５ｍＬクライオバイアルである（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）およびＴｒｕＣｏｏｌ（登録商標）バイアルを参照）。一般に、０．５～１．０ｍＬの細胞懸濁液が１．２または２．０ｍＬバイアルに入れられる。様々なサイズおよび種類の液体窒素保存容器が市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｌｏｃａｔｏｒ（商標）ＰｌｕｓシステムおよびＣｒｙｏＥｘｔｒａ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ極低温保存システムを参照）。
【0084】
好ましい実施形態において、細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団は、－８０℃の１以上のクライオバイアル中の凍結保存培地（例えば、ＦＢＳ中１０％ＤＭＳＯ）中で凍結され、次いで、液体窒素保存容器に移される。
【0085】
本明細書に記載の幹細胞の凍結保存の方法は、複数のクライオバイアル中のＡＳＣなどの幹細胞の集団を凍結させることを含んでなってもよい。複数のクライオバイアルの各々における幹細胞の集団は、同一であってもよい、すなわち、本明細書に開示される方法のいずれか１つから得られる幹細胞の単一集団のアリコートであってもよい。いくつかの例において、前記方法は、幹細胞の複数の集団に対して本明細書に記載の幹細胞の凍結保存の方法のいずれか１つの工程を反復することをさらに含んでなってもよい。反復工程は、連続して、すなわち、先の方法の工程に続いて行ってもよい。あるいは、反復工程は、並行して行ってもよい、すなわち、前記方法の工程は、前記幹細胞の複数の集団に対して同時に行われる。各反復は、同じ方法の工程を含んでなってもよいし、または本明細書に記載の異なる方法の工程を含んでなってもよい。前記幹細胞の複数の集団は、（例えば、１つまたは複数の別々の手順において本明細書に記載の同じ方法の工程を使用することにより、または本明細書に記載の１つまたは複数の異なる方法を使用することにより、異なる集団が得られる）同じドナーから得られる幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団を含んでなってもよい。前記幹細胞の複数の集団は、異なるドナーから得られる幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団であってもよい。あるいは、前記幹細胞の複数の集団は、異なる種類のＭＳＣを含んでなってもよい。例えば、前記幹細胞の複数の集団は、以下のＭＳＣ：骨髄、臍帯、歯髄、血液（例えば、末梢血、臍帯血または月経血）、胎盤および脂肪由来ＭＳＣのうち１つ以上、２つ以上、３つ以上を含んでなってもよい。これらの方法はまた、前記幹細胞の複数の集団を複数のクライオバイアル中で凍結させることを含んでなってもよい。前記方法は、前記複数のクライオバイアルを液体窒素保存容器中で少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、または少なくとも１年間保存することをさらに含んでなってもよい。前記クライオバイアルは、－８０℃で凍結し、次いで、液体窒素保存容器に移してもよい。複数のクライオバイアルは、１個超のクライオバイアル、例えば、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約５０個、約１００個、約１，０００個、約２，０００個または約５，０００個以上のクライオバイアルである。
【0086】
本明細書に記載の方法に従って得られる複数の凍結保存バイアルを含有する液体窒素保存容器も、本明細書において提供される。
【0087】
ガラス化は、開口保存容器内で凍結保存培地に浸漬された細胞の非常に急速な（－１，０００℃／秒超）冷却が関与する冷却の別の形態である。急速凍結は、クライオバイアル中のサンプルを液体窒素に浸漬することにより達成され得る。このプロセスは、氷形成を阻害するが、潜在的に細胞毒性の濃度の凍結防止剤を必要とし、開口容器の使用は、汚染のリスクを有する。ガラス化は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を凍結保存することに成功している。ＤＭＳＯおよびエチレングリコールを含有する凍結保存培地中でのヒト胚性幹細胞の毛細管ガラス化(capillary vitrification)は、緩慢凍結法および急速解凍法と比較して、凍結保存細胞の生存を１桁超増大させることが示されている。簡単に述べれば、より低いＤＭＳＯおよびＥＧ溶液中での平衡化後、ｈＥＳｃのコロニー（１００～４００個の細胞）を、２０％ＤＭＳＯ、２０％エチレングリコールおよび０．５Ｍスクロースを含んでなる凍結保存培地に入れる。コロニーをストローにロードし、液体窒素に浸漬する。
【0088】
解凍プロトコール
一般に、細胞は、それらの成長温度、例えば約３７℃で、またはその付近で解凍される。このため、本明細書に開示される方法において、幹細胞の集団は、３７℃で解凍され得る。
一般に、細胞は、それらの成長温度、例えば約３７℃で、またはその付近で解凍される。このため、本明細書に開示される方法において、幹細胞の集団は、３７℃で解凍され得る。
【0089】
細胞は、凍結および解凍中に、氷晶形成のための温度、－１５℃～－６０℃を通過する。３７℃の水浴への浸漬によるおよそ９０～１００℃／分での急速解凍が、氷晶形成を防止するためにしばしば用いられる。しかしながら、より低い温度またはより遅い速度での解凍は、膜が氷晶化により形成されるあらゆる細孔を塞ぐことを可能にしながら、接着媒介シグナル伝達により検出される酸化ストレスなどの特定の種類の損傷を低減し得る。本明細書に記載の方法において、幹細胞の集団は、一般に、３７℃で解凍される。この急速解凍工程は、クライオバイアル中の細胞を３７℃の水浴に浸漬することにより達成され得る。しかしながら、解凍プロトコールは、最大の生存率および／または細胞機能の維持を達成するために、特定の細胞型または細胞株に対する最適化を必要とする場合がある。
【0090】
解凍細胞は、培養前に、凍結保存培地を除去するために洗浄することができる。上記で考察した（例えば、ＮＡＣの除去および／または培地交換に関連した）洗浄方法の例は、この目的に対しても好適である。
【0091】
解凍後評価
幹細胞の集団の解凍後評価（例えば、ＮＡＣ前処理または解凍後処理の影響を調べるための）は、以下の試験：細胞生存率、形態、細胞表面マーカー評価、分化アッセイおよび他の機能特性の分析のうち１つ以上（または総て）を含んでもよい。例示的な評価を実施例において示す。
幹細胞の集団の解凍後評価（例えば、ＮＡＣ前処理または解凍後処理の影響を調べるための）は、以下の試験：細胞生存率、形態、細胞表面マーカー評価、分化アッセイおよび他の機能特性の分析のうち１つ以上（または総て）を含んでもよい。例示的な評価を実施例において示す。
【0092】
生存率
本明細書で使用する場合、用語「生存率」または「生存可能な」は、凍結保存および解凍された後に正常な成長および発達が可能な細胞を指す。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団の生存率の評価は、前記細胞が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理の結果、負の影響（すなわち、生存率の減少）を受けていないことを確認するために使用することができる（しかしながら、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理は、以下でさらに考察するように、生細胞数、成長率および回収率などに対する正の効果を有し得る）。
本明細書で使用する場合、用語「生存率」または「生存可能な」は、凍結保存および解凍された後に正常な成長および発達が可能な細胞を指す。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団の生存率の評価は、前記細胞が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理の結果、負の影響（すなわち、生存率の減少）を受けていないことを確認するために使用することができる（しかしながら、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理は、以下でさらに考察するように、生細胞数、成長率および回収率などに対する正の効果を有し得る）。
【0093】
細胞生存率のレベルを決定するために、開示された方法において使用され得る実験の例としては、実施例において考察するように、トリパンブルー染色およびＭＴＳアッセイが挙げられる。ＭＴＳアッセイは、機能的生存率（すなわち、代謝）の尺度であり、一方、トリパンブルーアッセイは、構造的生存率（すなわち、膜の完全性）の尺度である。アラマーブルーアッセイなどの当業者に公知の他の方法も、細胞生存率測定に使用してもよい。
【0094】
ＭＴＳアッセイは、増殖アッセイまたは細胞毒性アッセイにおいて生細胞の数を決定するための比色法である。例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔは、新規なテトラゾリウム化合物［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム、分子内塩；ＭＴＳ（ａ）］および電子カップリング試薬（フェナジンエトスルファート；ＰＥＳ）を含有する。ＰＥＳは、増強した化学安定性を有し、これにより、ＭＴＳと組み合わさって安定溶液を形成することが可能となっている。この好都合な「Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」形式は、フェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）が電子カップリング試薬として使用され、ＰＭＳ ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＭＴＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎが別々に供給されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ａｓｓａｙの第１バージョンを改善したものである。ＭＴＳテトラゾリウム化合物（オーエン試薬）は、代謝活性細胞により、組織培養培地に可溶性である有色ホルマザン産物に生体内還元される。アッセイは、少量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを培養ウェルに直接加え、１～４時間インキュベートし、次いで、９６ウェルプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を記録することにより、行うことができる。
【0095】
分化能
凍結保存後、種々の治療応用に適用可能な幹細胞に関して、前記細胞は、生存可能なままでなければならず、かつ未分化状態で維持され、それらの分化能を保持しなければならない。いずれの分化も、下流での適用におけるそれらの使用を限定するであろう。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団の分化能の評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
凍結保存後、種々の治療応用に適用可能な幹細胞に関して、前記細胞は、生存可能なままでなければならず、かつ未分化状態で維持され、それらの分化能を保持しなければならない。いずれの分化も、下流での適用におけるそれらの使用を限定するであろう。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団の分化能の評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
【0096】
本明細書において、用語「分化」または「分化する」は、多能性幹細胞または多能性（非特殊化）幹細胞が、より特殊化された細胞型に変化するプロセスを指す。
【0097】
胚性幹細胞または人工多能性幹細胞における分化能または多能性を決定するための１つの方法は、例えば、免疫蛍光顕微鏡法により、ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ－４などの表面マーカーのレベルを測定することである（Xu, C., et al., (2001) Nat Biotechnol. 19: 971-974）。ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ－４は、未分化幹細胞（すなわち、他の系列に分化する潜在能力を有する）のマーカーである。ＯＣＴ４は、発達多能性の制御において役割を果たす胚性遺伝子転写因子であるため、ＯＣＴ４遺伝子活性が多能性幹細胞の分化において抑制されると、分化が生じる。ＳＳＥＡ４発現は、フローサイトメトリーによっても決定することができる。
【0098】
ＭＳＣは、骨、軟骨、腱および脂肪組織などの異なる組織に分化する能力を有する。それらの分化能は、あらゆる成体組織に分化する潜在能力を有する胚性幹細胞または人工多能性幹細胞などの多能性／全能性幹細胞のものよりも制限されることから、ＭＳＣは多能性成体前駆細胞と考えられている（Jiang et al., (2002) Nature 418(6893):41-49）。異なる組織におけるＭＳＣの分化能を試験する方法は、従来技術において公知である（例えば、Guilak et al., J Cell Physiol. (2006) 206(1): 229-237; Zuk et al., Mol Biol Cell. (2002) 13(12): 4279-4295）。
【0099】
細胞の形態および／またはサイズ
幹細胞の集団の表現型は、形態および／またはサイズにより評価してもよい。用語「表現型」は、細胞表面マーカーなどを含む、サイズ、形態、タンパク質発現などの細胞の観察可能な特徴を指す。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団の細胞の形態および／またはサイズの評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
幹細胞の集団の表現型は、形態および／またはサイズにより評価してもよい。用語「表現型」は、細胞表面マーカーなどを含む、サイズ、形態、タンパク質発現などの細胞の観察可能な特徴を指す。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団の細胞の形態および／またはサイズの評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
【0100】
細胞の形態および／またはサイズは、倒立培養顕微鏡を使用して視認および画像化することができる。
【0101】
ヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣは、形態、増殖、表面マーカー、遺伝子発現、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化能および奇形腫形成を含む類似の特徴を共有する（例えば、Thomson et al. Science (1998) 282(5391): 1145-1147; Xu et al. Nat. Biotechnol. (2001) 19(10): 971-974; Takahashi et al. Cell (2007) 131(5): 861-872; Courtot et al. Biores. Open Access (2014) 3(5): 206-216; Kato et al. Scientific Reports (2016) 6: 34009参照）。
【0102】
起源組織に応じて、ＭＳＣは、形態的および免疫表現型的に類似するが、同一ではない（Colter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA (2000) 97(7): 3213-3218; Kern et al., Stem Cells (2006) 24(5): 1294-1301; Huang et al., J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221-8; Harris et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2013) 8(5): 394-9; Li et al., Ann N Y Acad Sci. (2016) 1370(1): 109-118）。
【0103】
細胞表面マーカーのキャラクタリゼーション
幹細胞集団の表現型キャラクタリゼーションは、１以上の細胞表面マーカーを分析することにより、行うことができる。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団上の１以上の細胞表面マーカーの発現の評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
幹細胞集団の表現型キャラクタリゼーションは、１以上の細胞表面マーカーを分析することにより、行うことができる。このため、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した前記幹細胞の集団上の１以上の細胞表面マーカーの発現の評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
【0104】
目的の細胞表面マーカーに結合する抗体の存在または非存在は、限定されるものではないが、免疫蛍光顕微鏡法、Ｘ線撮影法およびフローサイトメトリーを含む異なる方法により決定され得る。抗体による表面マーカーの発現のプロファイルの決定は、標識抗体を使用した直接的であってもよいし、または目的の細胞マーカーに対する一次特異抗体に対する二次標識抗体を使用し、その結果シグナル増幅が達成される、間接的であり得る。フローサイトメトリーでは、標識抗体を使用することにより、蛍光色素のレベルを、前記抗体に特異的に結合した細胞表面マーカーの量と相関させることができる。幹細胞集団における１以上の細胞表面マーカーの差次的発現は、例えば、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）を使用した前記集団の同定および／または単離を可能にする。
【0105】
例えば、国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)によれば、ＭＳＣを定義する最小限の基準は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４およびＣＤ９０の発現、ならびにＣＤ４５、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９アルファまたはＣＤ１９およびＨＬＡクラスＩＩの発現の欠如であり得る（Dominici et al., Cytotherapy. (2006) 8(4): 315-7）。ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５マーカーを評価するために使用することができる抗体の例を、実施例５に示す。他のマーカーを評価するために使用することができる抗体は、例えば、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から市販されており、その例を以下に列挙する。
【0106】
【表2】
【0107】
例えば、ＡＳＣの集団の解凍後評価は、（例えば、実施例５におけるような）ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現を調べることにより、行うことができる。
このような分析は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
このような分析は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。
【0108】
特定の幹細胞型に関連する細胞表面マーカーは公知であり、以下に例示する。
【0109】
他の機能特性
（ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した）前記幹細胞の集団の他の機能特性の評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。例えば、ＡＳＣに関して、評価され得る他の機能特性としては、刺激リンパ球の増殖を阻害するＡＳＣの能力（例えば、実施例６におけるような）；例えば、単球分化に対するＡＳＣの免疫調節能（例えば、実施例７におけるような）；成熟樹状細胞（ｍＤＣ）による、例えば、黄色ブドウ球菌粒子の食作用を調節するＡＳＣの能力；ｍＤＣの細胞表面上のＣＤ２０６およびＣＤ１６３のうちの１つもしくはその両方のＡＳＣ媒介アップレギュレーション（例えば、実施例９におけるような）；ならびに／または、ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ－ ｍＤＣへのＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋ ｍＤＣのＡＳＣ媒介調節（例えば、実施例９におけるような）が挙げられる。
（ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていない幹細胞の類似集団と比較した）前記幹細胞の集団の他の機能特性の評価は、前記細胞の同一性が、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により影響を受けていないことを確認するために使用することができる。例えば、ＡＳＣに関して、評価され得る他の機能特性としては、刺激リンパ球の増殖を阻害するＡＳＣの能力（例えば、実施例６におけるような）；例えば、単球分化に対するＡＳＣの免疫調節能（例えば、実施例７におけるような）；成熟樹状細胞（ｍＤＣ）による、例えば、黄色ブドウ球菌粒子の食作用を調節するＡＳＣの能力；ｍＤＣの細胞表面上のＣＤ２０６およびＣＤ１６３のうちの１つもしくはその両方のＡＳＣ媒介アップレギュレーション（例えば、実施例９におけるような）；ならびに／または、ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ－ ｍＤＣへのＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋ ｍＤＣのＡＳＣ媒介調節（例えば、実施例９におけるような）が挙げられる。
【0110】
このため、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて、ＡＳＣの解凍集団は、以下の特性：（１）細胞生存率；（２）細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現；（３）刺激リンパ球の増殖を阻害する能力；（４）単球分化に対する免疫調節効果；（５）例えば、黄色ブドウ球菌粒子の成熟樹状細胞による食作用を調節する能力；（６）ｍＤＣの細胞表面上のＣＤ２０６およびＣＤ１６３のうちの１つまたはその両方をアップレギュレートする能力；ならびに（７）ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ－ ｍＤＣへのＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋ ｍＤＣの調節のうち１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上または７個総てに対して評価され得る。各特性に関して、評価は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていないＡＳＣの類似集団と比較して行うことができ、その結果、ＮＡＣによる前処理および／または解凍後処理により、前記細胞の同一性が影響を受けていない、かつ／または細胞生存率が負の影響（すなわち、細胞生存率の減少）を受けていないことを確認することが可能となる。同様に、（例えば、上記で考察したように、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていないＡＳＣの類似集団と比較して評価された）これらの特性のうち１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上または７個総てを有する、本明細書に記載の方法のいずれか１つにより得られるＡＳＣの集団も開示される。
【0111】
幹細胞の種類
前記幹細胞の集団は、多能性幹細胞の集団であってもよいし、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば、骨髄由来、臍帯組織由来、血液由来（臍帯血由来を含む）、月経血由来、歯髄由来、胎盤由来または脂肪由来ＭＳＣの集団であってもよい（Huang et al., J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221-8; Harris et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-9; Li et al., Ann. N Y Acad. Sci. (2016) 1370(1): 109-18）。好ましい実施形態において、前記幹細胞はヒト細胞（例えば、ヒトＡＳＣ）である。本発明の好ましい複数の実施形態において、前記幹細胞の集団は脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である。本明細書に記載の凍結保存の方法において使用されるＡＳＣは、ＡＳＣの拡大集団であってもよい。
前記幹細胞の集団は、多能性幹細胞の集団であってもよいし、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば、骨髄由来、臍帯組織由来、血液由来（臍帯血由来を含む）、月経血由来、歯髄由来、胎盤由来または脂肪由来ＭＳＣの集団であってもよい（Huang et al., J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221-8; Harris et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-9; Li et al., Ann. N Y Acad. Sci. (2016) 1370(1): 109-18）。好ましい実施形態において、前記幹細胞はヒト細胞（例えば、ヒトＡＳＣ）である。本発明の好ましい複数の実施形態において、前記幹細胞の集団は脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である。本明細書に記載の凍結保存の方法において使用されるＡＳＣは、ＡＳＣの拡大集団であってもよい。
【0112】
本発明に係る幹細胞の集団を作製および培養する方法は、周知である。
【0113】
前記幹細胞の集団は、実質的に純粋であり得る。幹細胞の集団（例えば、ＡＳＣの集団などのＭＳＣ集団）に関連した用語「実質的に純粋」は、少なくとも約７５％、一般に、少なくとも約８５％、より一般に、少なくとも約９０％、最も一般に、少なくとも約９５％均一である幹細胞集団を指す。均一性は、形態および／または細胞表面マーカープロファイルにより評価することができる。形態および細胞表面マーカープロファイルを評価するための技法は、本明細書に開示されている。
【0114】
多能性幹細胞
多能性幹細胞の源は２つ存在する。第１に、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、着床前胚盤胞の内部細胞塊に由来し、多能性は、コア転写因子であるオクタマー結合転写因子４（ＯＣＴ４）、性決定領域Ｙ－ｂｏｘ２（ＳＯＸ２）、およびＮａｎｏｇホメオボックス（ＮＡＮＯＧ）の内因性調節ネットワークにより制御される。一つの実施形態において、胚性幹細胞株が使用される。胚性幹細胞株は、単一胚から回収された親細胞の群から産生される常に分裂する細胞を含んでなる。本発明において使用される胚性幹細胞株は、ヒト胚の破壊により得られるものではない。胚性幹細胞株は、例えば、ＡＴＣＣから市販されている。胚性幹細胞株の胚性幹細胞は、培養下にある間、それらの多能性を失わない。特に、胚性幹細胞株の胚性幹細胞は、培養下にある間、分化しない。第２に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞における多能性の誘導に必須の４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）、およびＭＹＣ癌原遺伝子（Ｃ－ＭＹＣ）の異所性発現または高度発現により誘導される。
多能性幹細胞の源は２つ存在する。第１に、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、着床前胚盤胞の内部細胞塊に由来し、多能性は、コア転写因子であるオクタマー結合転写因子４（ＯＣＴ４）、性決定領域Ｙ－ｂｏｘ２（ＳＯＸ２）、およびＮａｎｏｇホメオボックス（ＮＡＮＯＧ）の内因性調節ネットワークにより制御される。一つの実施形態において、胚性幹細胞株が使用される。胚性幹細胞株は、単一胚から回収された親細胞の群から産生される常に分裂する細胞を含んでなる。本発明において使用される胚性幹細胞株は、ヒト胚の破壊により得られるものではない。胚性幹細胞株は、例えば、ＡＴＣＣから市販されている。胚性幹細胞株の胚性幹細胞は、培養下にある間、それらの多能性を失わない。特に、胚性幹細胞株の胚性幹細胞は、培養下にある間、分化しない。第２に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞における多能性の誘導に必須の４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）、およびＭＹＣ癌原遺伝子（Ｃ－ＭＹＣ）の異所性発現または高度発現により誘導される。
【0115】
ヒト胚性幹細胞などの胚性幹細胞の安定（未分化）培養物を単離するための技法は、十分確立されている（例えば、US 5,843,780; Thomson et al., Science (1998) 282: 1145-1147; Turksen K. (編) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, 第331巻, Humana PressにおけるTurksen & Troy (2006) Human Embryonic Stem Cells.; Sevilla et al., Stem Cell Research (2017) 25: 217-220; およびTurksen K. (編) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, 第331巻, Humana PressにおけるMitalipova & Palmarini (2006) Isolation and Characterization of Human Embryonic Stem Cells.）。一つの実施形態において、胚性幹細胞を得る方法は、１以上のヒト胚の破壊を含まない。
【0116】
ｉＰＳＣを作製するための技法は、２００７年に山中のグループによりそれらが発見されて以降、十分確立されている（例えば、Takahashi et al., Cell (2007) 131(5): 861-72）。それ以降、非組込みおよびフィーダーフリーの方法ならびに自動ハイスループット誘導を含む、ｉＰＳＣ作製のための新たな改善された方法が開発されている（Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885-892）。
【0117】
ｉＰＳＣは、一連の多能性マーカー：ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１、ＴＲＡ１－６０の発現、および系列特異的マーカーの欠如を特徴とする。ｉＰＳＣの多能性は、免疫組織化学による三胚葉由来分化マーカーＴｕｊ１（外胚葉マーカー）、ＳＭＡ（中胚葉マーカー）およびＳＯＸ１７（内胚葉マーカー）の事後分析を用いた胚様体アッセイにおける三胚葉に分化するそれらの能力により示される（Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885-892）。
【0118】
ＭＳＣ
「間葉系幹細胞」（本明細書において「ＭＳＣ」ともいう）は、多能性間質細胞である。それらは、一般に結合組織に由来し、非造血細胞である。ＭＳＣの集団は（Dominici et al. 2006 (Cytotherapy 8(4): 315-317)によれば）、（１）標準的な培養条件下（例えば、最小必須培地＋２０％ウシ胎仔血清）でプラスチックに接着し得；（２）ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ４４を発現し得（すなわち、ＭＳＣの集団の８０％以上）；（３）ＣＤ４５、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ-ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩ）の発現を欠如し得（例えば、ＭＳＣ集団の５％以下）；（４）骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化する能力を有し得る。
「間葉系幹細胞」（本明細書において「ＭＳＣ」ともいう）は、多能性間質細胞である。それらは、一般に結合組織に由来し、非造血細胞である。ＭＳＣの集団は（Dominici et al. 2006 (Cytotherapy 8(4): 315-317)によれば）、（１）標準的な培養条件下（例えば、最小必須培地＋２０％ウシ胎仔血清）でプラスチックに接着し得；（２）ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ４４を発現し得（すなわち、ＭＳＣの集団の８０％以上）；（３）ＣＤ４５、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ-ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩ）の発現を欠如し得（例えば、ＭＳＣ集団の５％以下）；（４）骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化する能力を有し得る。
【0119】
ＭＳＣは、例えば、骨髄、臍帯組織および血液、月経血、歯髄、臍帯血、胎盤および脂肪組織から、標準的な方法を使用して得ることができる。
【0120】
異なる組織から得られるＭＳＣは類似しているが、それらは表現型的特徴および機能的特徴にいくつかの違いを有する。例えば、細胞表面マーカーＣＤ５４およびＣＤ１０６の発現レベルは、ＭＳＣの源／起源に応じて異なり得る。これらは、フローサイトメトリーにより測定することができる。ＳＯＸ２、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ６およびＩＬ８などのいくつかの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、異なる組織由来のＭＳＣにより差次的に発現し得、常法により測定することができる。ＩＬ６およびＰＧＥ２分泌も、異なる起源のＭＳＣ間で異なり得、このため、細胞は異なる調節能を有し得る（例えば、Yang et al. PLoS ONE (2013) 8(3) e59354参照）。
【0121】
骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭＳＣ）
骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）は、他の組織源からのＭＳＣと類似している。しかしながら、それらは、他の組織起源のＭＳＣ、例えば、臍帯ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、および月経血ＭＳＣと比較して、表現型的特徴および機能的特徴においていくつかの違いを有する。プラスチックに接着するそれらの能力、最小限の表面同一性マーカーならびに骨、軟骨、腱および脂肪組織に分化する能力を含め、それらの最小限のキャラクタリゼーション基準は共通であるが、それらは総て、いくつかのわずかな違いを有する。これらの特性には、ＣＤ１０５などのいくつかの表面マーカーの異なる発現レベル、それらの免疫調節能および再生能に関連付けられる分泌可溶性因子の異なるレベル、ならびに一般に、それぞれの源または起源を特定の治療適応症にさらに好適とし得るわずかに異なる機能特性が含まれる（Miura et al., Int J Hematology (2016) 103(2): 122-128; Wuchter et al., Cytotherapy (2015) 17(2): 128-139; Wright et al., Stem Cells (2011) 29(2): 169-178）。
骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）は、他の組織源からのＭＳＣと類似している。しかしながら、それらは、他の組織起源のＭＳＣ、例えば、臍帯ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、および月経血ＭＳＣと比較して、表現型的特徴および機能的特徴においていくつかの違いを有する。プラスチックに接着するそれらの能力、最小限の表面同一性マーカーならびに骨、軟骨、腱および脂肪組織に分化する能力を含め、それらの最小限のキャラクタリゼーション基準は共通であるが、それらは総て、いくつかのわずかな違いを有する。これらの特性には、ＣＤ１０５などのいくつかの表面マーカーの異なる発現レベル、それらの免疫調節能および再生能に関連付けられる分泌可溶性因子の異なるレベル、ならびに一般に、それぞれの源または起源を特定の治療適応症にさらに好適とし得るわずかに異なる機能特性が含まれる（Miura et al., Int J Hematology (2016) 103(2): 122-128; Wuchter et al., Cytotherapy (2015) 17(2): 128-139; Wright et al., Stem Cells (2011) 29(2): 169-178）。
【0122】
臍帯由来および歯髄由来ＭＳＣ
Huang et al. (J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806)は、歯髄由来ＭＳＣを考察し、それらの特徴を他の源からのＭＳＣと比較している。Carvalho et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2011) 6(3): 221-228)およびHarris et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-399)は、臍帯由来ＭＳＣ、それらのキャラクタリゼーション（表現型およびセクレトームを含む）ならびにそれらの適用を考察している。
Huang et al. (J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806)は、歯髄由来ＭＳＣを考察し、それらの特徴を他の源からのＭＳＣと比較している。Carvalho et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2011) 6(3): 221-228)およびHarris et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-399)は、臍帯由来ＭＳＣ、それらのキャラクタリゼーション（表現型およびセクレトームを含む）ならびにそれらの適用を考察している。
【0123】
ＡＳＣ
脂肪由来ＭＳＣ（ＡＳＣ）は、通常、皮下脂肪組織から単離され、それにより、ＡＳＣを多数獲得することが可能となる。ＡＳＣは、高い細胞活性をもって急速に増殖し、その結果、ＡＳＣがＭＳＣを得るための理想的な源となる。
脂肪由来ＭＳＣ（ＡＳＣ）は、通常、皮下脂肪組織から単離され、それにより、ＡＳＣを多数獲得することが可能となる。ＡＳＣは、高い細胞活性をもって急速に増殖し、その結果、ＡＳＣがＭＳＣを得るための理想的な源となる。
【0124】
「脂肪組織」とは、任意の脂肪組織を意味する。脂肪組織は、皮下組織、大網／内臓組織、乳腺組織、生殖腺組織、または他の脂肪組織部位に由来する褐色または白色の脂肪組織であり得る。一般に、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。このような細胞は、初代細胞培養物または不死化細胞株を含んでなってもよい。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物体由来であってもよい。一般に、脂肪組織は哺乳動物のものであり、最も一般に、脂肪組織はヒトのものである。脂肪組織の好都合な源は、脂肪吸引術からのものであるが、脂肪組織の源または脂肪組織の単離の方法は、本発明にとって重要なものではない。
【0125】
前記幹細胞の集団は、実施例１に記載の方法、または本明細書に記載の方法のいずれか１つを使用して作製されたＡＳＣの集団であってもよい。
【0126】
好ましいＡＳＣは、製品「Ｄａｒｖａｄｓｔｒｏｃｅｌ」（商品名「Ａｌｏｆｉｓｅｌ（登録商標））において認可されているヒト同種異系脂肪由来幹細胞（ヒトｅＡＳＣ）である。これらの拡大ＡＳＣは、細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現する。前記細胞は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－ベータ１（ＴＧＦ－β１）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤－１（ＴＩＭＰ－１）およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および誘導性インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）などの因子を発現することができる。このため、前記ＡＳＣの集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％；少なくとも約７０％；少なくとも約８０％；少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％以上が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０および／またはＣＤ１０５のうち１つ以上を発現することを特徴とし得る。前記ＡＳＣの集団は、前記細胞の集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％；少なくとも約７０％；少なくとも約８０％；少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現することを特徴とし得る。一般に、前記ＡＳＣの集団は、前記細胞の集団の少なくとも約８０％が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現することを特徴とし得る。
【0127】
Bourin et al. (Cytotherapy (2013) 15(6): 641-648)によれば、ＡＳＣの集団は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現に対して陽性であり、かつＣＤ３１およびＣＤ４５の発現に対して陰性であると定義され得る。前記ＡＳＣの集団において、前記細胞の集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％；少なくとも約７０％；少なくとも約８０％；少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し得、前記ＡＳＣの集団の約５％、約４％、約３％または約２％未満が、ＣＤ３１およびＣＤ４５を発現し得る。一般に、前記ＡＳＣの集団において、前記細胞の集団の少なくとも約８０％が、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し得、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、ＣＤ３１およびＣＤ４５を発現し得る。
【0128】
ＡＳＣは、標準的な培養条件下でプラスチックに接着し得る。
【0129】
拡大ＡＳＣ（ｅＡＳＣ）は、培養下で線維芽細胞様の形態を示す。具体的には、これらの細胞は巨大であり、長く薄い細胞突起がほとんどない浅い細胞体という形態的特徴を有する。核は、巨大かつ円形であり、顕著な核小体を有し、これが核を鮮明な外観にしている。ｅＡＳＣのほとんどはこの紡錘形の形態を示すが、前記細胞のいくつかは多角形の形態を獲得することが通常である(Zuk et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211-228)。
【0130】
ＡＳＣは、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して陽性であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、前記ＡＳＣの集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現することを特徴とし得る。一般に、ｅＡＳＣの少なくとも約８０％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する。
【0131】
ＡＳＣは、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して陰性であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現することを特徴とし得る。より一般に、前記ＡＳＣの集団の約４％、３％または２％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。一つの実施形態において、前記ＡＳＣの集団の約１％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。
【0132】
いくつかの例において、ＡＳＣの集団において、前記細胞の集団の少なくとも約８０％が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現し、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。
【0133】
いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、ＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個または７個）を発現し得る。いくつかの実施形態において、ｅＡＳＣは、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個または８個）を発現しなくてもよい。いくつかの実施形態において、ｅＡＳＣは、ＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のうち４個以上を発現し、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０のうち４個以上を発現しない。
【0134】
ＣＤ３４の発現は、陰性または低レベルであり得、例えば、前記ＡＳＣの集団の０～約３０％により発現され得る。このため、いくつかの例において、上記のＡＳＣは、低レベルで、例えば、前記集団の約５～約３０％においてＣＤ３４を発現し得る。あるいは、他の例において、上記のＡＳＣはＣＤ３４を発現せず、例えば、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、ＣＤ３４を発現する。
【0135】
いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団（例えば、前記細胞の集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）は、マーカーＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上（例えば、最大１３個））を発現し得る。例えば、ＡＳＣは、マーカーＣＤ２９、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のうち１個以上（例えば、２個、３個または総て）、例えば、ＣＤ５９および／またはＣＤ９０を発現し得る。
【0136】
いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、マーカー第ＶＩＩＩ因子、アルファ－アクチン、デスミン、Ｓ－１００、ケラチン、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＳＴＲＯ－１およびＣＤ１３３のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上（例えば、最大１５個））を発現しなくてもよく、例えば、ＡＳＣは、マーカーＣＤ４５、ＣＤ３１およびＣＤ１４のうち１個以上（例えば、２個、３個または総て）、例えば、ＣＤ３１および／またはＣＤ４５を発現しない。
【0137】
特定の複数の実施形態において、上記のＡＳＣは、（ｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）に特異的なマーカーを発現せず；（ｉｉ）ＩＤＯを構成的に発現せず；かつ／または（ｉｉｉ）ＭＨＣ ＩＩを構成的に有意に発現しない。一般に、ＩＤＯまたはＭＨＣ ＩＩの発現は、ＩＦＮ－γによる刺激により誘導され得る。
【0138】
特定の複数の実施形態において、上記のＡＳＣは、Ｏｃｔ４を発現しない。
【0139】
ＡＳＣの集団を調製する方法
ｅＡＳＣおよび本発明の幹細胞の集団を提供するためのＡＳＣの単離および培養の方法、ならびに本発明の幹細胞の集団を含んでなる組成物は、当技術分野で公知である。ＡＳＣは、一般に、脂肪組織の間質画分から調製され、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性により選択される。このため、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法は、（ｉ）患者から得られた脂肪組織の間質画分からＡＳＣの集団を単離すること、および（ｉｉ）前記ＡＳＣの集団を培養すること、という初期工程（前記方法のいずれか１つの工程（ａ）の前）を含んでなってもよい。ＡＳＣは、場合により、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性に関する工程（ｉ）において選択することができる。場合により、ＡＳＣの表現型は、培養工程（ｉｉ）の間および／またはその後に評価してもよい。
ｅＡＳＣおよび本発明の幹細胞の集団を提供するためのＡＳＣの単離および培養の方法、ならびに本発明の幹細胞の集団を含んでなる組成物は、当技術分野で公知である。ＡＳＣは、一般に、脂肪組織の間質画分から調製され、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性により選択される。このため、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法は、（ｉ）患者から得られた脂肪組織の間質画分からＡＳＣの集団を単離すること、および（ｉｉ）前記ＡＳＣの集団を培養すること、という初期工程（前記方法のいずれか１つの工程（ａ）の前）を含んでなってもよい。ＡＳＣは、場合により、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性に関する工程（ｉ）において選択することができる。場合により、ＡＳＣの表現型は、培養工程（ｉｉ）の間および／またはその後に評価してもよい。
【0140】
ＡＳＣは、当技術分野において標準的な任意の手段により得ることができる。一般に、前記細胞は、源の組織（例えば、脂肪吸引組織または脂肪組織）から、一般に、前記組織をコラゲナーゼなどの消化酵素で処理することにより、前記細胞を分離することにより得られる。次いで、消化された組織物質は、一般に、約２０ミクロン～１ｍｍのフィルターで濾過される。次いで、細胞を単離し（一般に、遠心分離により）、接着表面（一般に、組織培養プレートまたはフラスコ）で培養する。このような方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６７７７２３１号に開示されている。この方法によれば、脂肪吸引組織は脂肪組織から得られ、細胞はそれに由来する。この方法の最中に、細胞を、好ましくはＰＢＳで洗浄して、汚染デブリおよび赤血球を除去してもよい。細胞を、ＰＢＳ中のコラゲナーゼで消化する（例えば、３７℃で３０分間、０．０７５％コラゲナーゼ；Ｉ型、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。残存する赤血球を除去するために、消化サンプルを洗浄し（例えば、１０％ウシ胎仔血清で）、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌで処理し、最後にＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に懸濁させることができる。細胞は、４０μｍナイロンメッシュで濾過することができる。
【0141】
本発明の特定の複数の実施形態に係る培養ヒトＡＳＣは、DelaRosa et al. (Tissue Eng Part A. (2009) 15(10): 2795-806)、Lopez-Santalla et al. (Stem cells (2015) 33: 3493-3503)において記載されている。一つの実施形態において（Lopez-Santalla et al. 2015に記載の通りに）、健常ドナー由来のヒト脂肪吸引組織を、リン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で消化した。消化サンプルを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで処理して残存する赤血球を除去し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））に懸濁させた。細胞を組織培養フラスコに播種し（２～３×１０４個／ｃｍ２）、３～４日毎に培養培地を交換しながら培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞が９０％コンフルエンスに達した場合、細胞を新しいフラスコに移した（１０３個／ｃｍ２）。細胞を最大１２～１４回重複して拡大し、凍結させた。実験は、１２～１４回集団倍加した２例の男性成人ドナーおよび２例の女性成人ドナー由来の細胞を用いて行った。ＡＳＣを同じクライオバンクから解凍し、各実験の前に播種した。国際細胞治療学会（International Society for Cellular Therapy）の基準に従って、ＡＳＣを、ＨＬＡ－Ｉ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して陽性であり、かつＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４５に対して陰性であると定義した。
【0142】
別の実施形態において（DelaRosa et al. 2009による記載の通りに）、健常成人ドナー由来のヒト脂肪組織から得られた脂肪吸引組織をＰＢＳで２回洗浄し、１８Ｕ／ｍＬのＰＢＳ中Ｉ型コラゲナーゼで３７℃にて３０分間消化した。１単位のコラゲナーゼが、３７℃、ｐＨ７．５にて５時間でコラーゲンから１ｍＭのＬ－ロイシン当量を遊離させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。消化サンプルを１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで処理し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）に懸濁させ、４０ｍｍナイロンメッシュで濾過した。細胞を組織培養フラスコに播種し（２～３×１０４個／ｃｍ２）、７日毎に培養培地を交換しながら、３７℃および５％ＣＯ２で拡大した。培養物が９０％のコンフルエンスに達した場合、細胞を新しい培養フラスコに移した。細胞は、軟骨形成系列、骨形成系列、および脂肪生成系列に分化するそれらの能力により表現型的に特徴付けられた。さらに、ｈＡＳＣを、特異的表面マーカーによる染色により検証した。ｈＡＳＣは、ＨＬＡ－Ｉ、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して陽性であり、ＨＬＡ－ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ３４に対して陰性であった。６例の健常ドナー（男性３例および女性３例、３５～４７歳）からのプールを試験に使用した。細胞は、４～６継代のものを使用した。
【0143】
ＡＳＣを、ＡＳＣの接着に好適な表面、例えば、プラスチックを含んでなる好適な組織培養容器中で培養する。非接着細胞は、例えば、好適な緩衝液中で洗浄することにより除去して、接着間質細胞（例えば、ＡＳＣ）の単離集団を得る。このように単離した細胞は、組織培養フラスコに播種し（好ましくは、２～３×１０４個／ｃｍ２）、３～４日毎に培養培地を交換しながら、３７℃および５％ＣＯ２で拡大することができる。培養物がおよそ９０％のコンフルエンスに達した場合、細胞を好ましくは接着表面から剥がし（例えば、トリプシンにより）、新しい培養フラスコ（１，０００個／ｃｍ２）に移す（「継代する」）。
【0144】
ＡＳＣは、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、または少なくとも約３０日間培養され得る。一般に、培養下での細胞の拡大は、実質的に純粋な集団が得られるように、集団における細胞表現型の均一性を改善する。
【0145】
いくつかの実施形態において、ＡＳＣは、少なくとも３培養継代、培養下で拡大される、または「少なくとも３回継代される」。他の複数の実施形態において、前記細胞は、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回継代される。細胞は、細胞集団における細胞表現型の均一性を改善するために、３回超継代されることが好ましい。実際に、前記細胞は、細胞表現型の均一性が改善され、分化能が維持される限り、無期限に培養下で拡大され得る。
【0146】
いくつかの実施形態において、ＡＳＣは、少なくとも３回集団倍加させるために培養下で増殖され、例えば、前記細胞は、少なくとも４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回または２０回集団倍加させるために、培養下で拡大される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、７回、８回、９回、１０回、１５回または２０回未満集団倍加させるために、培養下で拡大される。特定の複数の実施形態において、前記細胞は、約５～１０回集団倍加させるために、培養下で拡大される。特定の複数の実施形態において、前記細胞は、約１０～１５回集団倍加させるために、培養下で拡大される。特定の複数の実施形態において、前記細胞は、約１５～２０回集団倍加、例えば、約１６回集団倍加させるために、培養下で拡大される。
【0147】
ＡＳＣの単離は、好ましくは、無菌条件下またはＧＭＰ条件下で行われる。
【0148】
幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団は、同種異系であってもよい、すなわち、前記幹細胞の集団が療法として投与される対象から単離されたものでなくてもよい。
【0149】
幹細胞の集団
本明細書に開示される方法に係るＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理またはＮＡＣによる前処理および解凍後処理の両方の組合せは、以下の特性：幹細胞の対照集団と比較した、生細胞数の増加、成長率の増加、ミトコンドリア活性の増加および回収率の改善のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個総てをもたらし得る。幹細胞の対照集団は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていないが、その他の点では同一の条件に供されている同じ幹細胞の集団である。別の実施形態において、前記幹細胞の対照集団は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供された幹細胞の集団と同じ幹細胞の集団に由来するが、前記対照集団は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていないが、その他の点では同一の条件に供されている。
本明細書に開示される方法に係るＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理またはＮＡＣによる前処理および解凍後処理の両方の組合せは、以下の特性：幹細胞の対照集団と比較した、生細胞数の増加、成長率の増加、ミトコンドリア活性の増加および回収率の改善のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個総てをもたらし得る。幹細胞の対照集団は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていないが、その他の点では同一の条件に供されている同じ幹細胞の集団である。別の実施形態において、前記幹細胞の対照集団は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供された幹細胞の集団と同じ幹細胞の集団に由来するが、前記対照集団は、ＮＡＣによる前処理、ＮＡＣによる解凍後処理、またはその両方に供されていないが、その他の点では同一の条件に供されている。
【0150】
これらの特性のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個総てを有する、本明細書に記載の方法のいずれか１つにより得られる幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団も提供される。
【0151】
解凍後、および場合により約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約７日間、または約１０日間以上の培養後の生細胞の数は、細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団で増加し得る。例えば、解凍後ならびに１日間（および／または４日間）の培養後の生細胞の数は、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約５倍以上増加し得る。例えば、図４Ａは、生細胞の数が、培養１日後（約５，０００対約３，０００個／ｃｍ２）および培養４日後（約１２，５００対約９，０００個／ｃｍ２）に、無処理細胞と比較して６ｍＭ ＮＡＣで前処理されたＡＳＣにおいて増加していることを示している。別の例では、図６は、２ｍＭ ＮＡＣによる解凍後処理は、培養７日目（約６，３００対約５，６００個／ｃｍ２）、１１日目（約１８，７００対約１７，５００個／ｃｍ２）および１４日目（約１８，３００対約１５，２００個／ｃｍ２）において、無処理細胞と比較して生細胞の数を増加させていることを示している。生細胞の数を測定する好適な方法は、上記の通りである。
【0152】
前記幹細胞の集団の成長率（すなわち、１日あたりの生細胞数／ｃｍ２の増加）は、幹細胞の対照集団と比較して増加し得る。解凍後の成長率（例えば、解凍後培養の１～４日目）は、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、または少なくとも約２倍以上増加し得る。例えば、図４Ａは、６ｍＭ ＮＡＣで前処理されたＡＳＣに関する培養１～４日目の成長率は、無処理細胞と比較して増加していることを示している。具体的には、ＮＡＣ前処理細胞に関する１～４日目の成長は、無処理細胞のおよそ２，０００個／ｃｍ２／日と比較して、およそ２，５００個／ｃｍ２／日であり、すなわち、およそ１．２５倍改善している。さらなる例では、図６は、２ｍＭ ＮＡＣで解凍後処理されたＡＳＣに関する７～１１日目の成長率は、無処理細胞と比較して増加しており、すなわち、無処理細胞のおよそ３，０００個／ｃｍ２／日と比較しておよそ３，１００個／ｃｍ２／日であることを示している。
【0153】
解凍後、および場合により約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約７日間、または約１０日間以上の培養後の細胞の幹細胞の集団のミトコンドリア活性（例えば、ＭＴＳアッセイにより測定）は、幹細胞の対照集団と比較して増加し得る。解凍後ならびに１日間（および／または４日間）の培養後のミトコンドリア活性は、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％以上増加し得る。例えば、図４Ｂは、解凍後培養の２４時間後の測定において、無処理細胞と比較して、６ｍＭ ＮＡＣによる前処理後のミトコンドリア活性の３５％超の増加を示している（４９０ｎｍでのＭＴＳアッセイ読み取り値は、対照に対して１００％で正規化した）。別の例では、図４Ｃは、解凍後培養の９６時間後の測定において、無処理細胞と比較して、６ｍＭ ＮＡＣによる前処理後のミトコンドリア活性の１５％超の増加を示している。
【0154】
接着細胞（ＡＳＣなど）に関して、解凍後「回収」は、接着細胞の生細胞数が、培養中に初期の播種密度よりも増加する時点と定義され得る。浮遊状態で成長する細胞に関して、解凍後「回収」は、生細胞数が、培養中に初期の播種密度よりも増加する時点と定義され得る。幹細胞の解凍集団の回収率、すなわち、解凍後に細胞を回収するのに要する時間は、幹細胞の対照集団と比較して改善（すなわち、短縮）され得る。例えば、解凍後に回収するのに要する時間は、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍以上減少し得る。例えば、図４Ａは、６ｍＭ ＮＡＣで前処理されたＡＳＣは、解凍後培養の１日後に回収されているが、無処理細胞ではそうではないことを示している。
【0155】
本明細書に開示される好ましい方法または幹細胞の集団において、前記幹細胞の集団は、以下の特性：（ａ）解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍もしくは少なくとも約５倍以上増加する；（ｂ）解凍後の成長率（例えば、解凍後培養の１～４日目）が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、もしくは少なくとも約２倍以上増加する；（ｃ）解凍後ならびに場合により約１日間および／もしくは約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％増加する；（ｄ）解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少する；ならびに／または（ｅ）解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍減少する、のうち１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、または５個総てを有する。
【0156】
本明細書に開示される好ましい方法または幹細胞の集団において、ＡＳＣの集団は、以下の特性：（１）解凍後および約１日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．５倍増加する（例えば、６ｍＭ ＮＡＣによる２４時間の前処理後）；（２）解凍後および約４日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．３倍増加する（例えば、６ｍＭ ＮＡＣによる２４時間の前処理後）；（３）解凍後培養の１～４日目の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．２５倍増加する（例えば、６ｍＭ ＮＡＣによる２４時間の前処理後）；（４）解凍後および約１日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約３５％増加する（例えば、６ｍＭ ＮＡＣによる２４時間の前処理後）；（５）解凍後および約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１５％増加する（例えば、６ｍＭ ＮＡＣによる２４時間の前処理後）；ならびに／または（６）解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少する（例えば、６ｍＭ ＮＡＣによる２４時間の前処理後）、のうち１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または６個総てを有する。
【0157】
本明細書に記載の好ましい方法または幹細胞の集団において、ＡＳＣの集団は、以下の特性：（ａ）ＮＡＣ（例えば、２ｍＭ）による７日間の解凍後処理後の生存可能なＡＳＣの数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍増加する；（ｂ）ＮＡＣ（例えば、２ｍＭ）による１１日間の解凍後処理後の生存可能なＡＳＣの数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍増加する；（ｃ）ＮＡＣ（例えば、２ｍＭ）による１４日間の解凍後処理後の生存可能なＡＳＣの数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．２倍増加する；および／または（ｄ）ＮＡＣ（例えば、２ｍＭ）による解凍後処理後の成長率が、培養の７～１１日目に測定した場合、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０３倍増加する、のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個総てを有する。
【0158】
凍結保存組成物
本明細書に開示される方法のいずれか１つにより作製される幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団と凍結保存培地とを含んでなる凍結保存組成物が開示される。前記凍結保存組成物は凍結され得る。前記凍結保存組成物は、例えば、およそ０．５～１０ｍＭ、例えば、およそ２～８ｍＭまたはおよそ４～６ｍＭの範囲の濃度のＮＡＣを含有し得る。特に好ましい実施形態において、前記凍結保存組成物中のＮＡＣの濃度は、約６ｍＭである。
本明細書に開示される方法のいずれか１つにより作製される幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団と凍結保存培地とを含んでなる凍結保存組成物が開示される。前記凍結保存組成物は凍結され得る。前記凍結保存組成物は、例えば、およそ０．５～１０ｍＭ、例えば、およそ２～８ｍＭまたはおよそ４～６ｍＭの範囲の濃度のＮＡＣを含有し得る。特に好ましい実施形態において、前記凍結保存組成物中のＮＡＣの濃度は、約６ｍＭである。
【0159】
本発明の方法の実践において、凍結保存プロセスは、種々の細胞プロセスに対する効果を有し得ることが想定される。上記で考察したように、凍結プロセスは、遺伝子転写を含む細胞内反応を停止し得る。これらの効果は、凍結保存培地の化学組成（凍結防止剤の代謝効果、イオン濃度など）またはＮＡＣによる細胞の前処理に起因し得るか、またはそれに加わるものであり得る。また、凍結保存において、凍結により誘導されるストレスは、熱ショックタンパク質または膜不安定化タンパク質が関与する細胞輸送プロセスに影響を及ぼす。
【0160】
医薬組成物
本明細書に開示される方法のいずれか１つにより作製される幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物が開示される。
本明細書に開示される方法のいずれか１つにより作製される幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物が開示される。
【0161】
句「薬学上許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症をもたらすことなく、ヒトおよび動物の組織への接触における使用に好適であるそれらの化合物、材料、組成物、および／または投与形を指すように、本明細書において用いられる。
【0162】
薬学上許容可能な担体の例としては、ある器官、または身体の部分から、別の器官、または身体の部分への対象化合物の運搬または輸送に関与する、薬学上許容可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料が挙げられる。各担体は、処方物の他の成分と適合し、かつ患者に対して有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。
【0163】
前記医薬組成物は、無菌であり、望まれないウイルス、細菌および他の病原体の存在がなく、ならびにパイロジェンフリーであり得る。すなわち、ヒトへの投与のために、対象組成物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準により要求される無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。
【0164】
十分な自己幹細胞を得る際の困難さのために、本明細書に開示される幹細胞の集団は、同種異系源から得てもよい。骨髄由来ＭＳＣおよびＡＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同種異系リンパ球の応答を誘発せず、その結果、これらの細胞は、ＭＨＣ不適合に関係なくいずれの患者にも使用できることが、当技術分野で公知である。このため、前記医薬組成物中の幹細胞（例えば、骨髄由来ＭＳＣまたはＡＳＣ）の集団は、意図される移植宿主に関して同種異系であってもよい。
【0165】
前記医薬組成物は、以下でより詳細に記載するように、例えば、医薬品または生体材料としての使用のために、種々の溶液または材料中の幹細胞の集団の懸濁液を含んでなってもよい。前記医薬組成物は、リンゲル液およびＨＳＡ中の幹細胞（例えば、同種異系ＡＳＣ）の懸濁液を含んでなってもよい。前記医薬組成物は、無菌緩衝生理食塩水中の幹細胞（例えば、同種異系ＡＳＣ）の懸濁液を含んでなってもよい。細胞は、保存剤を含有しない使い捨てバイアル中で提供してもよい。細胞は、１億２，０００万個の細胞の用量（例えば、５００万個／ｍＬの濃度）で投与することができる。細胞（例えば、ＡＳＣ）は、およそ１００万～１，０００万個／ｋｇで投与することもできる。
【0166】
特定の複数の実施形態において、前記医薬組成物は、材料、例えば、ポリマー、糊、ゲルなどの中の幹細胞（例えば、同種異系ＡＳＣ）の懸濁液である。このような懸濁液は、例えば、培養培地から幹細胞を沈殿させて取り出し、所望の溶液または材料にそれらを再懸濁させることにより、調製してもよい。細胞は、例えば、遠心分離、濾過、限外濾過などにより、培養培地から沈殿および／または変化させて取り出してもよい。
【0167】
対象脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物中の対象脂肪組織由来間質幹細胞の濃度は、少なくとも約５００万個／ｍＬ、少なくとも約１，０００万個／ｍＬ、少なくとも約２，０００万個／ｍＬ、少なくとも約３，０００万個／ｍＬ、または少なくとも約４，０００万個／ｍＬであり得る。一般に、濃度は、約１００万個／ｍＬ～１，０００万個／ｍＬ、例えば、約５００万個／ｍＬ～１，０００万個／ｍＬである。特定の複数の実施形態において、細胞密度は、医薬組成物中でおよそ５００万個／ｍＬである。
【0168】
特定の複数の実施形態において、前記医薬組成物は、およそ１００万～１億５，０００万個の細胞、好ましくは、およそ３，０００万個の細胞またはおよそ１億２，０００万個の細胞を含んでなる。
【0169】
いくつかの例において、前記医薬組成物は、ＮＡＣを含んでなってもよい。他の例において、前記医薬組成物は、ＮＡＣを含まなくてもよい。
【0170】
薬学上許容可能な担体および希釈剤は、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒および／または分散媒を含む。このような担体および希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。溶液は、一般に、無菌であり、かつ容易な通針性が存在する程度に流動性である。一般に、溶液は、製造および保存の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用を通じて、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。前記医薬組成物は、本明細書に記載の幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団を、薬学上許容可能な担体または希釈剤、および必要に応じて、上記に列挙された他の成分に懸濁させ、次いで濾過滅菌を行うことにより、調製してもよい。
【0171】
薬学上許容可能な担体として役割を果たし得る材料および溶液のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス；（９）油、例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬処方物において一般に用いられる他の無毒の適合物質が挙げられる。
【0172】
特定の複数の実施形態において、前記医薬組成物は、接着剤をさらに含んでなる。前記接着剤は、フィブリン系接着剤、例えば、フィブリンゲルもしくはフィブリン糊もしくはフィブリン系ポリマーもしくは接着剤、または他の組織接着剤もしくは外科用糊、例えば、シアノアクリレート、コラーゲン、トロンビン、およびポリエチレングリコールであり得る。使用され得る他の材料としては、限定されるものではないが、アルギン酸カルシウム、アガロース、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＶ型もしくは他のコラーゲンアイソフォーム、ポリ乳酸／ポリグリコール酸、ヒアルロン酸誘導体または他の材料が挙げられる（Perka et al. J. Biomed. Mater. Res. (2000) 49: 305-311; Sechriest et al. J. Biomed. Mater. Res. (2000) 49: 534-541; Chu et al. J. Biomed. Mater. Res. (1995) 29:1147-1154; Hendrickson et al. Orthop. Res. (1994) 12: 485-497）。他の複数の実施形態において、前記接着剤は液体包帯であり、ここで、幹細胞（例えば、ＡＳＣ）の集団は、液体包帯材料と混合される。「液体包帯」とは、噴霧器またはブラシで創傷に適用され、次いで、蒸発により溶媒を除去して、創傷に保護フィルムをもたらす化合物、例えば、高分子材料を含んでなる溶液である。
【0173】
前記医薬組成物は、支持体、例えば、医療機器を被覆するためにも使用してもよい。例えば、前記支持体は、縫合糸または糸であり得る。前記支持体は、例えば、浸漬、噴霧、塗布、刷込みなど、当業者に公知の任意の様式において細胞で被覆してもよい。一つの実施形態において、前記支持体は、縫合糸、ステープル、吸収性糸、非吸収性糸、天然糸、合成糸、モノフィラメント糸またはマルチフィラメント糸（ブレードともいう）である。脂肪組織由来間質幹細胞で被覆された創傷を閉鎖するために使用される縫合糸および他の支持体を作製する好ましい方法は、２００５年２月１４日に出願された米国特許出願第１１／０５６，２４１号「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ Ｓｕｔｕｒｉｎｇ」において開示されており、この出願は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。本明細書に開示される医薬組成物は、米国特許出願第１１／０５６，２４１号に開示される方法で使用され得る新規な組成物を表す。
【0174】
さらに、開示される医薬組成物のいずれかにおいて、少なくとも１つの治療剤を前記組成物に組み込んでもよい（これは必要ではなく、場合により除外することができるが）。例えば、前記医薬組成物は、鎮痛剤（例えば、炎症もしくは疼痛の治療の助けとなるために）、または前記組成物で治療された部位の感染症を予防するための抗感染剤を含有し得る。
【0175】
より具体的には、本明細書に記載の医薬組成物に含まれ得る有用な治療剤の限定されない例として、以下の治療カテゴリー：鎮痛剤、例えば、非ステロイド性抗炎症薬、アヘンアゴニストおよびサリチル酸塩；抗感染剤、例えば、駆虫剤、抗嫌気性菌剤、抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、抗真菌性抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、種々のβ－ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、抗マイコバクテリア剤、抗結核抗マイコバクテリア剤、抗原虫剤、抗マラリア抗原虫剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗疥癬剤、抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、鎮痒剤／局所麻酔剤、局所抗感染剤、抗真菌局所抗感染剤、抗ウイルス局所抗感染剤；電解質および腎臓作用剤、例えば、酸性化剤、アルカリ化剤、利尿剤、炭酸脱水酵素阻害利尿剤、ループ利尿剤、浸透圧性利尿剤、カリウム保持性利尿剤、チアジド系利尿剤、電解質置換剤、および尿酸排泄剤；酵素、例えば、膵酵素および血栓溶解酵素；消化器系作用剤、例えば、止痢剤、制吐剤、消化管抗炎症剤、サリチル酸系消化管抗炎症剤、制酸抗潰瘍剤、胃酸ポンプ阻害抗潰瘍剤、胃粘膜抗潰瘍剤、Ｈ２ブロッカー抗潰瘍剤、胆石溶解剤、消化剤、催吐剤、緩下剤および便軟化剤、ならびに運動促進剤；一般的な麻酔剤、例えば、吸入麻酔剤、ハロゲン化吸入麻酔剤、静脈麻酔剤、バルビツール酸系静脈麻酔剤、ベンゾジアゼピン系静脈麻酔剤、およびアヘンアゴニスト静脈麻酔剤；ホルモンおよびホルモン調節剤、例えば、堕胎剤、副腎作用剤、コルチコステロイド副腎作用剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、免疫生物学的製剤、例えば、免疫グロブリン、免疫抑制剤、トキソイド、およびワクチン；局所麻酔剤、例えば、アミド系局所麻酔剤およびエステル系局所麻酔剤；筋骨格作用剤、例えば、抗痛風抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸系抗炎症剤、無機質；ならびにビタミン、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンＫが挙げられる。
【0176】
上記のカテゴリーからの有用な治療剤の好ましいクラスとしては、（１）一般的な鎮痛剤、例えば、リドカインまたはその誘導体、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）鎮痛剤、例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、およびナプロキセン；（２）アヘンアゴニスト鎮痛剤、例えば、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、およびモルヒネ；（３）サリチル酸系鎮痛剤、例えば、アスピリン（ＡＳＡ）（腸溶性ＡＳＡ）；（４）Ｈ１ブロッカー抗ヒスタミン剤、例えば、クレマスチンおよびテルフェナジン；（５）抗感染剤、例えば、ムピロシン；（６）抗嫌気性菌抗感染剤、例えば、クロラムフェニコールおよびクリンダマイシン；（７）抗真菌性抗生物質抗感染剤、例えば、アムホテリシンｂ、クロトリマゾール、フルコナゾール、およびケトコナゾール；（８）マクロライド系抗生物質抗感染剤、例えば、アジスロマイシンおよびエリスロマイシン；（９）種々のβ－ラクタム系抗生物質抗感染剤、例えば、アズトレオナムおよびイミペネム；（１０）ペニシリン系抗生物質抗感染剤、例えば、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、およびペニシリンＶ；（１１）キノロン系抗生物質抗感染剤、例えば、シプロフロキサシンおよびノルフロキサシン；（１２）テトラサイクリン系抗生物質抗感染剤、例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリン；（１３）抗結核抗マイコバクテリア抗感染剤、例えば、イソニアジド（ＩＮＨ）、およびリファンピン；（１４）抗原虫抗感染剤、例えば、アトバコンおよびダプソン；（１５）抗マラリア抗原虫抗感染剤、例えば、クロロキンおよびピリメタミン；（１６）抗レトロウイルス抗感染剤、例えば、リトナビルおよびジドブジン；（１７）抗ウイルス抗感染剤、例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、インターフェロンアルファ、およびリマンタジン；（１８）抗真菌局所抗感染剤、例えば、アムホテリシンＢ、クロトリマゾール、ミコナゾール、およびナイスタチン；（１９）抗ウイルス局所抗感染剤、例えば、アシクロビル；（２０）電解質および腎臓作用剤、例えば、ラクツロース；（２１）ループ利尿剤、例えば、フロセミド；（２２）カリウム保持性利尿剤、例えば、トリアムテレン；（２３）チアジド系利尿剤、例えば、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）；（２４）尿酸排泄剤、例えば、プロベネシド；（２５）酵素、例えば、リボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼ；（２６）制吐剤、例えば、プロクロルペラジン；（２７）サリチル酸系消化管抗炎症剤、例えば、スルファサラジン；（２８）胃酸ポンプ阻害抗潰瘍剤、例えば、オメプラゾール；（２９）Ｈ２ブロッカー抗潰瘍剤、例えば、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、およびラニチジン；（３０）消化剤、例えば、パンクレリパーゼ；（３１）運動促進剤、例えば、エリスロマイシン；（３２）エステル系局所麻酔剤、例えば、ベンゾカインおよびプロカイン；（３３）筋骨格コルチコステロイド抗炎症剤、例えば、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、およびプレドニゾン；（３４）筋骨格抗炎症免疫抑制剤、例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびメトトレキサート；（３５）筋骨格非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ケトロラク、およびナプロキセン；（３６）無機質、例えば、鉄、カルシウム、およびマグネシウム；（３７）ビタミンＢ化合物、例えば、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）およびナイアシン（ビタミンＢ３）；（３８）ビタミンＣ化合物、例えば、アスコルビン酸；ならびに（３９）ビタミンＤ化合物、例えば、カルシトリオールが挙げられる。
【0177】
特定の複数の実施形態において、前記治療剤は、成長因子または細胞の分化および／もしくは増殖に影響を及ぼす他の分子であり得る。最終分化状態を誘導する成長因子は、当技術分野で周知であり、最終分化状態を誘導することが示されている任意のこのような因子から選択され得る。特定の複数の実施形態において、本明細書に記載の方法における使用のための成長因子は、機能的バリアントまたは天然に存在する成長因子のフラグメントであり得る。例えば、バリアントは、保存的アミノ酸変化を行い、当技術分野で公知のアッセイを使用して、成長因子の機能に関して得られたバリアントを試験することにより、作製され得る。
【0178】
使用および適用
ＮＡＣの使用
例えば、本明細書に開示される方法のいずれか１つにおける、幹細胞の凍結保存のためのＮＡＣの使用が開示される。
ＮＡＣの使用
例えば、本明細書に開示される方法のいずれか１つにおける、幹細胞の凍結保存のためのＮＡＣの使用が開示される。
【0179】
医学的適用
幹細胞は、増え続けている数の疾患および障害を治療するために使用されている。このため、本明細書に開示される方法のいずれか１つに従って作製される幹細胞の集団、本明細書に開示される医薬組成物または本明細書に開示される凍結保存組成物は、療法において使用され得る。用語「療法」は、患者における疾患、障害または症状の治療および／または予防を網羅することを意図するものである。用語「対象」、「レシピエント」および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、特に断りのない限り、療法を必要とする任意のヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を指す。好ましい複数の実施形態において、患者はヒトである。患者がヒトである場合、幹細胞の集団は、一般にヒトのものである。
幹細胞は、増え続けている数の疾患および障害を治療するために使用されている。このため、本明細書に開示される方法のいずれか１つに従って作製される幹細胞の集団、本明細書に開示される医薬組成物または本明細書に開示される凍結保存組成物は、療法において使用され得る。用語「療法」は、患者における疾患、障害または症状の治療および／または予防を網羅することを意図するものである。用語「対象」、「レシピエント」および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、特に断りのない限り、療法を必要とする任意のヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を指す。好ましい複数の実施形態において、患者はヒトである。患者がヒトである場合、幹細胞の集団は、一般にヒトのものである。
【0180】
それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための、本明細書に記載の幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物が開示される。前記方法において使用される細胞の集団は、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法のいずれ１つにより作製され得る。
【0181】
また、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物の使用も開示される。
【0182】
瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に本明細書に開示される幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物を投与すること含んでなる方法がさらに開示される。
【0183】
本明細書に記載の幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物は、特に、前記幹細胞の集団がＡＳＣである場合、瘻孔を治療するために使用され得る。用語「瘻孔」は、通常、２つの内部器官間、または内部器官から身体の表面に通じている、あらゆる異常な通路または連絡または接続、例えば、通常は接続されない臓器または血管間の接続または通路を指す。例えば、瘻孔が生じる身体の領域に名前が由来する瘻孔の種類としては、肛門直腸瘻または痔瘻または糞瘻（直腸または他の肛門直腸領域と皮膚表面との間）、動静脈瘻またはＡ－Ｖ瘻（動脈と静脈との間）、胆汁瘻（胆管と皮膚表面との間、しばしば胆嚢手術に起因する）、頸瘻（頸部における異常開口）、頭蓋洞瘻（頭蓋内腔と副鼻腔との間）、腸腸瘻（腸の２つの部分間）、腸管皮膚瘻（腸と皮膚表面との間、すなわち、十二指腸または空腸または回腸から）、腸膣瘻（腸と膣との間）、胃瘻（胃と皮膚表面との間）、子宮腹膜瘻（子宮と腹膜腔との間）、外リンパ瘻（中耳と内耳との間の膜の間の裂傷）、肺動静脈瘻（肺の動脈と静脈との間、血液のシャントに至る）、直腸膣瘻（直腸と膣との間）、臍瘻（臍と腸との間）、気管食道瘻（気管と食道との間）ならびに膀胱膣瘻（膀胱と膣との間）が挙げられる。瘻孔の原因としては、外傷、医学的処置による合併症および疾患が挙げられる。クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患が、肛門直腸瘻、腸腸瘻、および腸管皮膚瘻の主因である。特定の複数の実施形態において、瘻孔は、肛門周囲瘻、例えば、クローン病を有する患者における難治性複雑肛門周囲瘻である。幹細胞（例えば、同種異系ＡＳＣ）の集団は、病変内注射のために約１億２，０００万個（例えば、約５００万個／ｍＬ）の用量で投与してもよい。
【0184】
それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための本明細書に開示される幹細胞の集団であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｄ）場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｅ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる幹細胞の集団が開示される。
【0185】
また、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防するための薬剤の製造のための本明細書に開示される幹細胞の集団の使用であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｄ）場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｅ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる使用も開示される。
【0186】
それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｄ）場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｅ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる方法がさらに開示される。
【0187】
特定の複数の実施形態において、前記治療および／または予防の方法は、前記患者に前記幹細胞の集団を投与する前に、本明細書に開示される方法において定義される工程のいずれか１つ（例えば、「前処理」）をさらに含んでなる。
【0188】
それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための本明細書に記載の幹細胞の集団であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｄ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる幹細胞の集団が開示される。
【0189】
また、それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防するための薬剤の製造のための本明細書に記載の幹細胞の集団の使用であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｄ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる使用も開示される。
【0190】
それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、以下の工程：（ａ）幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；（ｂ）前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；（ｃ）前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および（ｄ）前記患者に前記幹細胞の集団を投与することを含んでなる方法がさらに開示される。
【0191】
特定の複数の実施形態において、前記治療および／または予防の方法は、前記患者に前記幹細胞の集団を投与する前に、本明細書に開示される方法において定義される工程のいずれか１つ（例えば、「解凍後処理」）をさらに含んでなる。
【0192】
前記幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物は、およそ１００万～１億５，０００万個の幹細胞（例えば、同種異系ＡＳＣ）の用量で投与してもよい。好ましい複数の実施形態において、幹細胞（例えば、同種異系ＡＳＣ）は、およそ３，０００万またはおよそ１億２，０００万個の用量で投与してもよい。
【0193】
対象、特にヒト対象への本明細書に開示される幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物の投与は、前記対象における標的部位への前記細胞の注射または移植により行ってもよい。例えば、対象への注射または移植による導入を促進する送達デバイスを使用してもよい。このような送達デバイスとしては、レシピエント対象の身体へ注射するためのチューブ、例えば、カテーテルが挙げられる。好ましい実施形態において、前記チューブは、所望の位置で前記対象に前記幹細胞の集団、医薬組成物または凍結保存組成物を導入することができる針、例えば、シリンジをさらに有する。
【0194】
好ましい複数の実施形態において、前記幹細胞の集団（前記医薬組成物および／または凍結保存組成物中のものを含む）は、ＡＳＣである。
【0195】
前記幹細胞は、同種異系または自己であり得る。
【0196】
対象化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順により決定され得る。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。中毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、副作用を低減させるために所望の部位に剤を標的とする送達システムを設計するように注意が必要である。
【0197】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための様々な用量の処方において使用され得る。任意の治療剤あるいはその中の任意の成分の用量は、一般に、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる投与形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の剤に関して、治療上有効な量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフにより測定され得る。
【0198】
キット
クライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる凍結保存キットが開示される。前記キットは、その使用のための説明書を含んでなってもよい。複数のクライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる凍結保存キットが開示される。前記幹細胞の集団は、本明細書に開示される組成物または医薬組成物として、キットの中に提供され得る。
クライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる凍結保存キットが開示される。前記キットは、その使用のための説明書を含んでなってもよい。複数のクライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる凍結保存キットが開示される。前記幹細胞の集団は、本明細書に開示される組成物または医薬組成物として、キットの中に提供され得る。
【0199】
一般的定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者にとって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
特に定義されない限り、本明細書において使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者にとって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0200】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素(an element)」は、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
【0201】
用語「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprising)」は、包括的なオープンセンスで使用され、追加の要素を含んでもよいことを意味する。
【0202】
一般に、多数の工程を「含んでなる」方法は、特定の順序で行う必要がある工程を必要としない。方法が、多数の連続的に番号が付されたまたはアルファベット順の工程（例えば、（１）、（２）、（３）または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）など）を含んでなる場合、これは、工程が特に断りのない限り規定の順序で行わなければならないことを意味する。しかしながら、このような用語は、規定の工程の各々の間に追加の工程が行われる可能性を除外するものではない。
【0203】
用語「含む」は、本明細書において、「限定されるものではないが、～を含む」を意味するために使用される。「含む」および「限定されるものではないが、～を含む」は、互換的に使用される。
【実施例0204】
本発明を概ね説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の特定の側面および実施形態を単に例示する目的で含まれるものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
【0205】
実施例１ － ＡＳＣの単離および培養
ヒトサンプルを、インフォームドコンセント（組織調達部位に関する基準のスペイン倫理委員会により承認；Ｃｌｉｎｉｃａ ｄｅ ｌａ Ｌｕｚ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、マドリード、スペイン）の下で得た。ＡＳＣは、以前に公表された通りに得た（Manchenio-Corvo et al., Frontiers in Immunology (2017), 8, 462; Menta et al., Frontiers in Immunology (2014), 8, 462）。簡単に述べれば、健常ドナー由来のヒト脂肪吸引組織をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）で消化した。消化サンプルを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで処理して残存する赤血球を除去し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））に懸濁させた。細胞を組織培養フラスコに播種し、３～４日毎に培養培地を交換しながら拡大した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞が９０％コンフルエンスに達した場合、細胞を新しいフラスコに移した。細胞を最大１２～１４回重複して拡大し、１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ中で凍結させた（本明細書に記載の総ての実施例を通じて、ＡＳＣを凍結させる際、１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳを凍結培地として使用した）。実験は、１２～１４回集団倍加した３例の男性成人ドナーおよび３例の女性成人ドナー由来の細胞のプールを用いて行った。拡大ＡＣＳ（ｅＡＳＣ）は、国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)の基準に従った定義（Dominici et al., Cytotherapy (2006) 8(4): 315-317）を満たし、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）からのＣＤ７３（ＡＤ２）およびＣＤ９０（５Ｅ１０）ならびにＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）からのＣＤ１０５（４３Ａ３）に対して陽性であり、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社（モンロビア、カリフォルニア州、米国）からのＣＤ１４（ＲＭ０５２）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社からのＣＤ１９（４Ｇ７）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｌ２４３）、およびＣＤ３４（８Ｇ１２）、ならびにＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社（ブレア、カリフォルニア州、米国）からのＣＤ４５（Ｊ３３）に対して陰性であることが確認された。
ヒトサンプルを、インフォームドコンセント（組織調達部位に関する基準のスペイン倫理委員会により承認；Ｃｌｉｎｉｃａ ｄｅ ｌａ Ｌｕｚ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、マドリード、スペイン）の下で得た。ＡＳＣは、以前に公表された通りに得た（Manchenio-Corvo et al., Frontiers in Immunology (2017), 8, 462; Menta et al., Frontiers in Immunology (2014), 8, 462）。簡単に述べれば、健常ドナー由来のヒト脂肪吸引組織をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）で消化した。消化サンプルを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで処理して残存する赤血球を除去し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））に懸濁させた。細胞を組織培養フラスコに播種し、３～４日毎に培養培地を交換しながら拡大した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞が９０％コンフルエンスに達した場合、細胞を新しいフラスコに移した。細胞を最大１２～１４回重複して拡大し、１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ中で凍結させた（本明細書に記載の総ての実施例を通じて、ＡＳＣを凍結させる際、１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳを凍結培地として使用した）。実験は、１２～１４回集団倍加した３例の男性成人ドナーおよび３例の女性成人ドナー由来の細胞のプールを用いて行った。拡大ＡＣＳ（ｅＡＳＣ）は、国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)の基準に従った定義（Dominici et al., Cytotherapy (2006) 8(4): 315-317）を満たし、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）からのＣＤ７３（ＡＤ２）およびＣＤ９０（５Ｅ１０）ならびにＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）からのＣＤ１０５（４３Ａ３）に対して陽性であり、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社（モンロビア、カリフォルニア州、米国）からのＣＤ１４（ＲＭ０５２）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社からのＣＤ１９（４Ｇ７）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｌ２４３）、およびＣＤ３４（８Ｇ１２）、ならびにＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社（ブレア、カリフォルニア州、米国）からのＣＤ４５（Ｊ３３）に対して陰性であることが確認された。
【0206】
実施例２ － 解凍後のＡＳＣ細胞数に対する種々の前処理工程の評価
ＡＳＣ前処理
ドナーＡ由来のＡＳＣを、バイアルを３７℃浴中で加温し、新鮮完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地 － ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ、Ｇｉｂｃｏ社、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを補充）でＤＭＳＯを含有する凍結培地を希釈することにより、解凍した。細胞を室温にて４５０ｇで６分間遠心分離して、残りのＤＭＳＯを除去し、完全ＤＭＥＭ中２０，０００個／ｃｍ２でＴ－１７５フラスコに蒔いた。２４時間の解凍後、細胞を、以下の表に示す好適な濃度の化合物で２４時間処理した：
ＡＳＣ前処理
ドナーＡ由来のＡＳＣを、バイアルを３７℃浴中で加温し、新鮮完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地 － ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ、Ｇｉｂｃｏ社、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを補充）でＤＭＳＯを含有する凍結培地を希釈することにより、解凍した。細胞を室温にて４５０ｇで６分間遠心分離して、残りのＤＭＳＯを除去し、完全ＤＭＥＭ中２０，０００個／ｃｍ２でＴ－１７５フラスコに蒔いた。２４時間の解凍後、細胞を、以下の表に示す好適な濃度の化合物で２４時間処理した：
【0207】
【表3】
【0208】
ＮＡＣ（ＳＩＧＭＡ社）の６００ｍＭストックを、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）中で調製した。このストックを、５ｍＬの培地にウェルあたり５０μＬストック溶液を直接加え、終濃度６ｍＭとすることにより、前処理および後処理に使用した。２ｍＭに関しては、ウェルあたり１６．７μＬのみを加え、１２ｍＭの場合は、１００μＬのストックを加えた。ＤＭＳＯを、ｓｃ７９およびＬＹ２９４に対するビヒクルとして使用した。
【0209】
前処理工程の後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ０．２５％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して３７℃で８分間トリプシン処理した。完全ＤＭＥＭによるトリプシン不活化の後、細胞を回収し、凍結培地（１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ）に再懸濁させる前に遠心分離し、バイアルあたり５０万または１００万個に凍結させ、さらなる使用のために液体窒素中で保存した。具体的には、細胞をＣｏｏｌ Ｃｅｌｌ（登録商標）デバイス（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ社）中で－８０℃にて２４時間凍結させ、次いで、液体窒素保存容器に移した。総ての実験は、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２にて行った。
【0210】
解凍後の細胞数および成長に対する種々の前処理工程の評価
ＡＳＣを９６ウェル平底プレートに播種し（ウェルあたり１，０００または２，０００個のＡＳＣ）、２４時間培養し、次いで、製造業者の説明書に従ってＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、生細胞数を評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙは、生細胞の数を決定するための比色法である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔは、テトラゾリウム化合物［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム、ＭＴＳ］および電子カップリング試薬（フェナジンエトスルファート；ＰＥＳ）を含有する。ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、細胞により（おそらく、代謝活性細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素により産生されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨにより）、組織培養培地に可溶性である有色ホルマザン産物に生体内還元される。
ＡＳＣを９６ウェル平底プレートに播種し（ウェルあたり１，０００または２，０００個のＡＳＣ）、２４時間培養し、次いで、製造業者の説明書に従ってＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、生細胞数を評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙは、生細胞の数を決定するための比色法である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔは、テトラゾリウム化合物［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム、ＭＴＳ］および電子カップリング試薬（フェナジンエトスルファート；ＰＥＳ）を含有する。ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、細胞により（おそらく、代謝活性細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素により産生されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨにより）、組織培養培地に可溶性である有色ホルマザン産物に生体内還元される。
【0211】
簡単に述べれば、４０μＬの試薬を各ウェル中２００μＬの完全ＤＭＥＭに加え、Ｎａｖｉｓｉｏｎシステム（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）を使用して、４９０ｎｍにて２～３時間後に吸光度を測定した。各条件は、６回の技術的反復で測定した。ＭＴＳアッセイの結果は、無処理（ＮＴ）細胞と比較した、４９０ｎｍの吸光度のパーセンテージとして示す。
【0212】
【0213】
ＮＡＣに加えて、エキセンディン－４、ＩＬ６、ｓｃ７９およびＬＹ２９４による前処理を評価した。Ｓｃ７９は、増殖および生存促進シグナルであるＰＩ３Ｋ経路のアクチベーターであり（Jo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences (2012), 109(26): 10581-10586, Chen et al. Oncotarget (2017) 8(19): 31065-31078）、ＬＹ２９４は、Zonca et al., (2012) Tissue Engineering: Part A 18(7-8): 852-859およびGharibi et al., (2014) Stem Cells 32: 2256-2266において使用されたこの同じ経路の阻害剤分子である。ＤＭＳＯを、ｓｃ７９およびＬＹ２９４に対するビヒクルとして使用した。ＮＡＣ以外の化合物による前処理は、細胞数に対する再現性のある効果を示さなかった。
【0214】
実施例３ － 解凍後のＡＳＣ細胞数に対するＮＡＣ前処理工程のさらなる評価
ＡＳＣ増殖アッセイ
ドナーＡまたはドナーＢ最終原薬（ＦＤＳ）からの実施例２に記載の方法に従ってＮＡＣで前処理したＡＳＣを、バイアルを３７℃浴中で加温し、新鮮完全ＤＭＥＭでＤＭＳＯ（１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ）を含有する凍結培地を迅速に希釈することにより、解凍した。細胞を室温にて４５０ｇで６分間遠心分離して、残りのＤＭＳＯを除去し、ウェルあたり５ｍＬの完全ＤＭＥＭ中ウェルあたり３，０００個でＰ６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３０４６）に三重反復で蒔いた。細胞を１倍ＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ０．２５％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して３７℃で８分間トリプシン処理した。完全ＤＭＥＭによるトリプシン不活化の後、細胞を回収し、遠心分離し、新鮮ＤＭＥＭに再懸濁させた；三重反復ウェルを計数目的で単一サンプルとして統合した。細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して播種し、生存率染色としてトリパンブルーを加えた後の２４時間、９６時間および７日において三重反復で計数した（図４Ａ）。細胞密度の計算は、表面単位（ｃｍ２）あたりの生存可能なＡＳＣ（トリパンブルーに対して陰性）の数を使用して行った。
ＡＳＣ増殖アッセイ
ドナーＡまたはドナーＢ最終原薬（ＦＤＳ）からの実施例２に記載の方法に従ってＮＡＣで前処理したＡＳＣを、バイアルを３７℃浴中で加温し、新鮮完全ＤＭＥＭでＤＭＳＯ（１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ）を含有する凍結培地を迅速に希釈することにより、解凍した。細胞を室温にて４５０ｇで６分間遠心分離して、残りのＤＭＳＯを除去し、ウェルあたり５ｍＬの完全ＤＭＥＭ中ウェルあたり３，０００個でＰ６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３０４６）に三重反復で蒔いた。細胞を１倍ＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ０．２５％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して３７℃で８分間トリプシン処理した。完全ＤＭＥＭによるトリプシン不活化の後、細胞を回収し、遠心分離し、新鮮ＤＭＥＭに再懸濁させた；三重反復ウェルを計数目的で単一サンプルとして統合した。細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して播種し、生存率染色としてトリパンブルーを加えた後の２４時間、９６時間および７日において三重反復で計数した（図４Ａ）。細胞密度の計算は、表面単位（ｃｍ２）あたりの生存可能なＡＳＣ（トリパンブルーに対して陰性）の数を使用して行った。
【0215】
ＮＡＣによる前処理は、２４時間および４日において計数した細胞の数を増加させた（図４Ａに示されるように、解凍後４日における無処理対照における９，２００個／ｃｍ２と比較して、１２，５００個）。これらの所見は、ＮＡＣ前処理後にミトコンドリア活性の１５～２０％の増加を示す、並行して行ったＭＴＳデータ（図４ＢおよびＣ）により支持された。ＡＳＣの成長は、７日目前にコンフルエンシーに達し、したがって、４日目と比較して、この時点での有意な成長はみられない。
【0216】
上記で考察したデータを再確認するために、２例の異なるＡＳＣドナー（ドナーＡ（ＤＯＮ Ａ）およびドナーＢ（ＤＯＮ Ｂ））によるＮＡＣ前処理後に、成長アッセイを行った。細胞数を、各ドナーに対して、ＮＡＣ前処理細胞または無処理細胞を解凍した後の１、４および７日目に分析した（図５ＡおよびＢ）。両ドナーからの細胞は、播種後２４時間から細胞数の増加を示し、この増加は、培養下で１週間維持された（図５）。このデータは、ＮＡＣ前処理は凍結解凍回収後の細胞数を増加させることを確認するものである。
【0217】
実施例４ － 解凍後の細胞成長に対する異なる濃度のＮＡＣによる解凍後処理の効果
細胞成長に対する異なる濃度のＮＡＣによる解凍後処理（解凍後ＮＡＣ処理）の効果も検討した。ＡＳＣを凍結させ（ＮＡＣ前処理なし）、上記で考察したように解凍し、次いで、プレーティングする前に完全ＤＭＥＭ中の３つの異なるＮＡＣ濃度（２、６および１２ｍＭ）で処理し、４、１１および１４日目の細胞数を分析した。２ｍＭ ＮＡＣによる解凍後処理は、培養下で最大２週間持続した細胞数の増加をもたらした（図６）。６ｍＭおよび１２ｍＭ ＮＡＣによる解凍後処理後に認められた低い細胞密度に関する１つの考えられる説明は、これらの濃度のＮＡＣは、プレートに対する解凍後（「浮遊」）ＡＳＣの接着に対して影響を及ぼし得るというものである。
細胞成長に対する異なる濃度のＮＡＣによる解凍後処理（解凍後ＮＡＣ処理）の効果も検討した。ＡＳＣを凍結させ（ＮＡＣ前処理なし）、上記で考察したように解凍し、次いで、プレーティングする前に完全ＤＭＥＭ中の３つの異なるＮＡＣ濃度（２、６および１２ｍＭ）で処理し、４、１１および１４日目の細胞数を分析した。２ｍＭ ＮＡＣによる解凍後処理は、培養下で最大２週間持続した細胞数の増加をもたらした（図６）。６ｍＭおよび１２ｍＭ ＮＡＣによる解凍後処理後に認められた低い細胞密度に関する１つの考えられる説明は、これらの濃度のＮＡＣは、プレートに対する解凍後（「浮遊」）ＡＳＣの接着に対して影響を及ぼし得るというものである。
【0218】
実施例５ － ＮＡＣ前処理は、解凍および培養後のＡＳＣの同一性に影響を及ぼさない ４つの表面マーカー（ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５、国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)の基準に一致(Dominici et al., Cytotherapy (2006) 8(4): 315-317)）の発現を使用して、実施例２に記載の方法に従って６ｍＭの濃度でＮＡＣによる前処理を行った後の解凍および拡大ＡＳＣの同一性を確認した。
【0219】
細胞の同一性は、培養下（解凍後）で２週間後に、標準的なプロトコールに従って分析した。回収した細胞を、以下の表に示す好適な濃度の抗体（製造業者の説明書に従って希釈）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（ＢＤ社）を使用して評価した。
【0220】
【表4】
【0221】
データは、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して分析した。図７は、細胞がＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現することを示しており、凍結前の細胞のＮＡＣ前処理は、解凍および培養後のＡＳＣ同一性マーカーの発現を変化させないことを確認するものである。
【0222】
実施例６ － ＮＡＣ前処理は、刺激リンパ球の増殖を阻害する解凍ＡＳＣの能力に有意に影響を及ぼさない
ＮＡＣによるＡＳＣの前処理がｉｎ ｖｉｔｒｏにおける成長の利点をもたらしたことを示した後、ＮＡＣ前処理がＡＣＳの機能特性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために実験を行った。第１に、刺激リンパ球の増殖を阻害する解凍および拡大ＡＳＣ（実施例２における方法に従ってＮＡＣで前処理した）の能力を測定した。
ＮＡＣによるＡＳＣの前処理がｉｎ ｖｉｔｒｏにおける成長の利点をもたらしたことを示した後、ＮＡＣ前処理がＡＣＳの機能特性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために実験を行った。第１に、刺激リンパ球の増殖を阻害する解凍および拡大ＡＳＣ（実施例２における方法に従ってＮＡＣで前処理した）の能力を測定した。
【0223】
免疫抑制アッセイに関して以前に公表された通りに（Manchenio-Corvo et al., Frontiers in Immunology (2017), 8, 462; Menta et al., Frontiers in Immunology (2014), 8, 462）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｕｎｉｄａｄ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｏｆ Ｍａｄｒｉｄにより提供されたバフィーコートから、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、脾細胞をＣ５７／ＢＬ６雄マウスから得た。
カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識化のために、ＰＢＭＣまたは脾細胞を徹底的に洗浄してＦＢＳを除去し、１０μＭ ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）溶液に再懸濁させ（溶液２００μｌあたり１０７個のＰＢＭＣまたは脾細胞）、３７℃で１０分間一定に振り混ぜながらインキュベートした。氷冷培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を加えることにより反応を停止させ、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を一晩培養し、１つのアリコートを使用して、ＣＦＳＥのためのＦＬ－１電圧を設定および制御した。一晩静置した後、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、製造業者の説明書に従ってＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、および抗ＣＤ２８で被覆されたミクロビーズ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、オーバーン、カリフォルニア州、米国）で活性化した。ＣＦＳＥ標識脾細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）およびＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、バーゼル、スイス）で活性化した。ＰＢＭＣまたは脾細胞（１００万個／ウェル）を、全容量２ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で、単独でまたはｅＡＳＣとともに（４×１０４個／ウェル；ｅＡＳＣ：ＰＢＭＣまたはｅＡＳＣ：脾細胞の比１：２５）、２４ウェルプレート中で培養した。ＡＳＣ：ＰＢＭＣ比１：７５は、最適以下の条件下でのサンプル間の差の評価を可能とするものであった。ＰＢＭＣに関しては５日後、脾細胞に関しては３日後に、細胞を回収し、７－ＡＡＤおよび抗ＣＤ３抗体で標識し、ＣＤ３＋／７－ＡＡＤ－集団（生存可能なＣＤ３ Ｔリンパ球）の細胞増殖を、ＣＦＳＥシグナルの損失に従って、フローサイトメトリーにより決定した。データは、ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ４（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、グレンデール、カリフォルニア州、米国）およびＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏ分析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）ソフトウェアを使用して分析した。ＣａｌｉＢＲＩＴＥビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、エーレムボーデゲム－アールスト、ベルギー）を使用して、サイトメーターにおける収集イベントを較正した。
カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識化のために、ＰＢＭＣまたは脾細胞を徹底的に洗浄してＦＢＳを除去し、１０μＭ ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）溶液に再懸濁させ（溶液２００μｌあたり１０７個のＰＢＭＣまたは脾細胞）、３７℃で１０分間一定に振り混ぜながらインキュベートした。氷冷培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を加えることにより反応を停止させ、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を一晩培養し、１つのアリコートを使用して、ＣＦＳＥのためのＦＬ－１電圧を設定および制御した。一晩静置した後、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、製造業者の説明書に従ってＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、および抗ＣＤ２８で被覆されたミクロビーズ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、オーバーン、カリフォルニア州、米国）で活性化した。ＣＦＳＥ標識脾細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）およびＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、バーゼル、スイス）で活性化した。ＰＢＭＣまたは脾細胞（１００万個／ウェル）を、全容量２ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で、単独でまたはｅＡＳＣとともに（４×１０４個／ウェル；ｅＡＳＣ：ＰＢＭＣまたはｅＡＳＣ：脾細胞の比１：２５）、２４ウェルプレート中で培養した。ＡＳＣ：ＰＢＭＣ比１：７５は、最適以下の条件下でのサンプル間の差の評価を可能とするものであった。ＰＢＭＣに関しては５日後、脾細胞に関しては３日後に、細胞を回収し、７－ＡＡＤおよび抗ＣＤ３抗体で標識し、ＣＤ３＋／７－ＡＡＤ－集団（生存可能なＣＤ３ Ｔリンパ球）の細胞増殖を、ＣＦＳＥシグナルの損失に従って、フローサイトメトリーにより決定した。データは、ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ４（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、グレンデール、カリフォルニア州、米国）およびＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏ分析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）ソフトウェアを使用して分析した。ＣａｌｉＢＲＩＴＥビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、エーレムボーデゲム－アールスト、ベルギー）を使用して、サイトメーターにおける収集イベントを較正した。
【0224】
凍結前にＮＡＣで前処理されたＡＳＣの阻害能は、無処理細胞と類似していた（図８）（ＮＡＣ前処理がＡＳＣの阻害能を増強するわずかな傾向も、１つまたは２つの実験で認められた）。
【0225】
実施例７ － マクロファージおよびｍＤＣの分化および機能に対するＡＳＣの効果に対するＮＡＣ前処理の評価
ＡＳＣの免疫調節能におけるＮＡＣの効果を評価するために実施した第２の機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、単球分化の調節であった。図９は、実験のタイミングおよびセットアップを示す。
ＡＳＣの免疫調節能におけるＮＡＣの効果を評価するために実施した第２の機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、単球分化の調節であった。図９は、実験のタイミングおよびセットアップを示す。
【0226】
血液サンプル
バフィーコートをＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｃｏｍｕｎｉｄａｄ ｄｅ Ｍａｄｒｉｄから得た。約５０～６０ｍＬの血液を、室温のＰＢＳで希釈し、１５ｍＬの室温のＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓの上の５０ｍＬチューブ間に分配した。次いで、チューブを、ブレーキまたは加速化をすることなく、１０℃にて２，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。ＰＢＭＣの白色リングを回収し、５０ｍＬの冷ＰＢＳ中で洗浄し、ブレーキまたは加速化をすることなく１０℃にて１，８００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。５０ｍＬの冷ＲＰＭＩ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕおよび１００μｇ／ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩｃ：ＲＰＭＩ）による２回目の洗浄後、チューブを、ブレーキおよび加速化をしながら１０℃にて１，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。最終洗浄を５０ｍＬの冷ＲＰＭＩｃで行い、ブレーキおよび加速化をしながら１０℃にて１，２００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩｃに再懸濁させ、計数した。細胞を冷ＲＰＭＩｃに１億個／ｍＬで再懸濁させ、１０％ＤＭＳＯを補充した同じ容量の冷ＲＰＭＩｃを加え、すなわち、終濃度５％ＤＭＳＯとした。ＰＢＭＣを、５，０００万個のＰＢＭＣのバイアル中の液体窒素中で凍結させた。
バフィーコートをＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｃｏｍｕｎｉｄａｄ ｄｅ Ｍａｄｒｉｄから得た。約５０～６０ｍＬの血液を、室温のＰＢＳで希釈し、１５ｍＬの室温のＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓの上の５０ｍＬチューブ間に分配した。次いで、チューブを、ブレーキまたは加速化をすることなく、１０℃にて２，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。ＰＢＭＣの白色リングを回収し、５０ｍＬの冷ＰＢＳ中で洗浄し、ブレーキまたは加速化をすることなく１０℃にて１，８００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。５０ｍＬの冷ＲＰＭＩ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕおよび１００μｇ／ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩｃ：ＲＰＭＩ）による２回目の洗浄後、チューブを、ブレーキおよび加速化をしながら１０℃にて１，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。最終洗浄を５０ｍＬの冷ＲＰＭＩｃで行い、ブレーキおよび加速化をしながら１０℃にて１，２００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩｃに再懸濁させ、計数した。細胞を冷ＲＰＭＩｃに１億個／ｍＬで再懸濁させ、１０％ＤＭＳＯを補充した同じ容量の冷ＲＰＭＩｃを加え、すなわち、終濃度５％ＤＭＳＯとした。ＰＢＭＣを、５，０００万個のＰＢＭＣのバイアル中の液体窒素中で凍結させた。
【0227】
ＣＤ１４
＋
単球の単離
ＰＢＭＣの凍結バイアルを解凍し、計数し、製造業者の説明書に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓキット（Ｄｙｎａｌ ＃１１３５０Ｄ）を使用してＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球を単離した。
ＰＢＭＣの凍結バイアルを解凍し、計数し、製造業者の説明書に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓキット（Ｄｙｎａｌ ＃１１３５０Ｄ）を使用してＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球を単離した。
【0228】
ヒト単球の培養および分化
単離されたＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球（上記参照）を、酸素正常状態で、６ウェル（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３０４６）あたり１５０万個で５ｍＬのＲＰＭＩｃに蒔いた。非極性化Ｍ０マクロファージへの分化または単培養下でのＭ１、Ｍ２マクロファージおよび成熟樹状細胞（ｍＤＣ）集団へのさらなる極性化のために、以下の因子を加えた（Beyer et al., PLoS One (2012) 7(9): e45466; Erbel et al., J. Vis. Exp. (2013) 76: e50332; Zhou et al, 2014; Tarique et al, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2015;53(5):676-688を含む、いくつかの刊行物に基づく）。
未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）：ＲＰＭＩｃ＋５ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＳＣＦ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４を５日間
ＤＣ（ｍＤＣ）の成熟：５日目に、４０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳを加える（すなわち、４００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳを補充した５００μＬ／ウェルのＲＰＭＩｃを既存の培地に加える）。
ヒト組換えＧＭ－ＣＳＦ（＃１００－２２Ｂ）およびＩＬ－４（＃２００－０４）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社のものであった。ＬＰＳ（＃Ｌ８２７４）は、ＳＩＧＭＡ社のものであった。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ４の添加は、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）への分化を媒介する；５日後、ＬＰＳの添加により、ｍＤＣへのｉＤＣの成熟を誘導し、２日後、これらの成熟ＤＣの表現型および機能をＡＳＣの存在下または非存在下で分析した。
単離されたＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球（上記参照）を、酸素正常状態で、６ウェル（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３０４６）あたり１５０万個で５ｍＬのＲＰＭＩｃに蒔いた。非極性化Ｍ０マクロファージへの分化または単培養下でのＭ１、Ｍ２マクロファージおよび成熟樹状細胞（ｍＤＣ）集団へのさらなる極性化のために、以下の因子を加えた（Beyer et al., PLoS One (2012) 7(9): e45466; Erbel et al., J. Vis. Exp. (2013) 76: e50332; Zhou et al, 2014; Tarique et al, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2015;53(5):676-688を含む、いくつかの刊行物に基づく）。
未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）：ＲＰＭＩｃ＋５ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＳＣＦ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４を５日間
ＤＣ（ｍＤＣ）の成熟：５日目に、４０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳを加える（すなわち、４００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳを補充した５００μＬ／ウェルのＲＰＭＩｃを既存の培地に加える）。
ヒト組換えＧＭ－ＣＳＦ（＃１００－２２Ｂ）およびＩＬ－４（＃２００－０４）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社のものであった。ＬＰＳ（＃Ｌ８２７４）は、ＳＩＧＭＡ社のものであった。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ４の添加は、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）への分化を媒介する；５日後、ＬＰＳの添加により、ｍＤＣへのｉＤＣの成熟を誘導し、２日後、これらの成熟ＤＣの表現型および機能をＡＳＣの存在下または非存在下で分析した。
【0229】
ＡＳＣによる共培養実験
新鮮単離ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球を、ポリカーボネート６ウェルトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３４１２インサートおよびＦａｌｃｏｎ ＃３５３０４６プレート）中で、ドナーＡまたはドナーＢ由来ＡＳＣとともに共培養した。
新鮮単離ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球を、ポリカーボネート６ウェルトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３４１２インサートおよびＦａｌｃｏｎ ＃３５３０４６プレート）中で、ドナーＡまたはドナーＢ由来ＡＳＣとともに共培養した。
【0230】
ＮＡＣ前処理ＡＳＣ（実施例２における方法に従って）、または無処理ＡＳＣを解凍し、１ｍＬのＲＰＭＩｃ培地中での共培養の設定前１６時間または２４時間において、１５０，０００個のＡＳＣをトランズウェルインサートに蒔き、１５０万個の単球を４ｍＬのＲＰＭＩｃ培地中のウェルの底に入れた。単球単独の分化と同じ因子を使用して、分化を行った（上記参照、すなわち、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ４の添加により、ｉＤＣへの分化を誘導し；５日後、ＬＰＳの添加により、ｍＤＣへのｉＤＣの成熟を誘導し、２日後、これらの成熟ＤＣの表現型および機能をＡＳＣの存在下または非存在下で分析した）。ＡＳＣは、分化プロセスの全期間、トランズウェルインサート中で維持した。
【0231】
活性化クラスターは、ＮＡＣ前処理ＡＳＣまたは無処理ＡＳＣとのｍＤＣの共培養後、プレート上に形成せず、ＡＳＣはｍＤＣの活性化を調節し、この効果はＮＡＣ前処理により妨害されないことが示された（倍率２倍（図１０）および倍率２０倍（図１１）の顕微鏡像を参照）。
【0232】
実施例８ － ＮＡＣ前処理は、ｍＤＣによる黄色ブドウ球菌粒子の食作用を調節するＡＳＣの能力を有意に変化させない
黄色ブドウ球菌粒子を貪食するｍＤＣの能力を調節する解凍ＡＣＳの能力に対するＮＡＣ前処理（実施例２における方法に従った）の効果を分析した。
黄色ブドウ球菌粒子を貪食するｍＤＣの能力を調節する解凍ＡＣＳの能力に対するＮＡＣ前処理（実施例２における方法に従った）の効果を分析した。
【0233】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの単培養または共培養における分化の後（使用したサイトカイン、濃度および分化時間を含む分化条件は、実施例７において示している）、マクロファージおよびｍＤＣを、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して３７℃で１０分間回収した。極性化マクロファージまたはｍＤＣの食作用能を、製造業者の説明書に従って、ｐＨＲｏｄｏ Ｒｅｄ結合黄色ブドウ球菌粒子（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ１００１０）を使用して評価した。簡単に述べれば、５０，０００個のｍＤＣを９６ウェルＵ底ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３７９９）に移し、細胞をＲＰＭＩｃ中で６０分間静置した。凍結乾燥ｐＨＲｏｄｏ結合粒子を、使用前にバイアルあたり１ｍＬのＲＰＭＩｃ中で溶解し、粒子を２０％の振幅で５分間超音波処理した。次いで、ウェルあたり５０μＬのｐＨＲｏｄｏ Ｚｙｍｏｓａｎを加え、細胞を３７℃にて酸素正常状態で６０分間インキュベートした。その後、氷上で食作用を停止させ、細胞を洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（ＢＤ社）でのＦＡＣＳ分析の前に、５μＬ ７－アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）で染色した。食作用に関する陰性対照は、ｐＨＲｏｄｏ試薬なしの細胞とした。結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。ＰＥチャネルにおける蛍光の強度は、細胞あたり貪食された細菌粒子の量と比例している。
【0234】
図１２は、非接触条件下（すなわち、ｍＤＣおよびＡＳＣ細胞をトランズウェルプレート中で共培養した）でのＡＳＣの存在は、蛍光チャネルにおいてより強い細胞、すなわち、貪食された蛍光粒子を有する細胞の新たな集団の出現をもたらすことを示している。ＮＡＣによるＡＳＣのＮＡＣ前処理は、ｍＤＣの食作用能を増大するそれらの能力を変化させなかった。
【0235】
実施例９ － 成熟樹状細胞上の表面発現に対するＡＳＣ媒介効果に対するＮＡＣ前処理の効果
細菌を貪食するｍＤＣの能力は、ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０６（マンノース受容体）またはＣＤ１６３（スカベンジャー受容体）などの食作用マーカーの発現と関連している。これらの膜受容体は、真菌、細菌および寄生虫の表面上の特異的なパターンを認識し、単球、マクロファージおよびＤＣによるそれらの食作用を媒介する。ＣＤ１６３受容体は、組織損傷後のアポトーシス細胞からの細胞デブリのクリアランスにさらに介入し、創傷治癒のプロセスに寄与する。
細菌を貪食するｍＤＣの能力は、ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０６（マンノース受容体）またはＣＤ１６３（スカベンジャー受容体）などの食作用マーカーの発現と関連している。これらの膜受容体は、真菌、細菌および寄生虫の表面上の特異的なパターンを認識し、単球、マクロファージおよびＤＣによるそれらの食作用を媒介する。ＣＤ１６３受容体は、組織損傷後のアポトーシス細胞からの細胞デブリのクリアランスにさらに介入し、創傷治癒のプロセスに寄与する。
【0236】
成熟樹状細胞による食作用受容体ＣＤ２０６（マンノース受容体）およびＣＤ１６３（スカベンジャー受容体）の表面発現に対する解凍ＡＳＣ媒介効果に対するＮＡＣ前処理（実施例２に従った）の効果を、フローサイトメトリーにより測定した。
【0237】
表現型キャラクタリゼーション
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの単培養または共培養における分化の後（使用したサイトカイン、濃度および分化時間を含む分化条件は、実施例７において示している）、上清を回収し、今後のサイトカインおよび／またはＨＰＬＣ分析のために凍結させた後、マクロファージおよびｍＤＣを、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して３７℃で１０分間回収した。ｍＤＣを計数した後、それらを染色のための９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ ＃２４９５７０）に分配した。細胞を、１％ヒト血清を含有するＢｌｕｅ ＭＡＣＳ緩衝液中で氷上にて１５分間インキュベートし、Ｆｃγ受容体媒介非特異的抗体結合をブロッキングした。その後、細胞を以下の抗体ミックスで氷上にて２０分間染色した（５０μＬの１：１０抗体希釈液中で染色；ＣＤ６４は例外で、１：２０希釈であった）：
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの単培養または共培養における分化の後（使用したサイトカイン、濃度および分化時間を含む分化条件は、実施例７において示している）、上清を回収し、今後のサイトカインおよび／またはＨＰＬＣ分析のために凍結させた後、マクロファージおよびｍＤＣを、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して３７℃で１０分間回収した。ｍＤＣを計数した後、それらを染色のための９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ ＃２４９５７０）に分配した。細胞を、１％ヒト血清を含有するＢｌｕｅ ＭＡＣＳ緩衝液中で氷上にて１５分間インキュベートし、Ｆｃγ受容体媒介非特異的抗体結合をブロッキングした。その後、細胞を以下の抗体ミックスで氷上にて２０分間染色した（５０μＬの１：１０抗体希釈液中で染色；ＣＤ６４は例外で、１：２０希釈であった）：
【0238】
【表5】
【0239】
使用した抗体の詳細を、以下の表に示す：
【0240】
【表6】
【0241】
ウェルあたり５μＬの７ＡＡＤを加え、氷上で１０分間染色することにより、細胞生存率を評価し、サンプルをＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターにおいて取得した。結果は、ＦＳＣ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアで分析した。
【0242】
細菌を貪食するｍＤＣの能力は、ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０６（マンノース受容体）またはＣＤ１６３（スカベンジャー受容体）などの食作用マーカーの発現と関連している。これらの膜受容体は、真菌、細菌および寄生虫の表面上の特異的なパターンを認識し、単球、マクロファージおよびＤＣによるそれらの食作用を媒介する。ＣＤ１６３受容体は、組織損傷後のアポトーシス細胞からの細胞デブリのクリアランスにさらに介入し、創傷治癒のプロセスに寄与する。成熟樹状細胞による食作用受容体ＣＤ２０６（マンノース受容体）およびＣＤ１６３（スカベンジャー受容体）の表面発現に対する解凍ＡＳＣ媒介効果に対するＮＡＣ前処理（実施例２に従った）の効果を、フローサイトメトリーにより測定した。
【0243】
ＡＳＣは、単球、マクロファージおよびｍＤＣの表面上のＣＤ２０６およびＣＤ１６３マーカーの発現をアップレギュレートし、このアップレギュレーションは、ＡＳＣをＮＡＣで前処理した場合でさえ、インタクトであった（図１３および１４）。
【0244】
成熟樹状細胞上のＣＤ１４およびＣＤ１ａの表面発現に対する解凍ＡＳＣ媒介効果に対するＮＡＣ前処理（実施例２に従った）の効果も、フローサイトメトリーにより測定した。ｍＤＣはＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋である。ＣＤ１ａは、抗原提示分子であり、免疫系の他の細胞へのｍＤＣによる抗原の提示を媒介し、それらの応答を活性化する。ＡＳＣは、これらのｍＤＣの表現型を調節して、それらをＣＤ１４＋ＣＤ１ａ－細胞に変える。この集団は、抗炎症特性および調節特性を有している（Chang et al., Journal of Immunology, 165(7), 3584-3591）。
【0245】
図１５は、ＡＳＣのＮＡＣ前処理は、このｍＤＣ調節集団の形成を誘導する解凍ＡＳＣの能力を変化させないことを示している。
【0246】
番号が付された実施形態
本発明はまた、以下の番号が付された実施形態を提供する：
本発明はまた、以下の番号が付された実施形態を提供する：
【0247】
１．幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること
を含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること
を含んでなる、方法。
【0248】
２．前記方法が、以下の工程：
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、実施形態１に記載の方法。
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、実施形態１に記載の方法。
【0249】
３．前記方法が、以下の工程：
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること、および前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；ならびに
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
ａ．前記幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること、および前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；ならびに
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
【0250】
４．前記処理工程が、前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団をＮＡＣで少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４または４８時間インキュベートすることを含んでなる、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
【0251】
５．前記処理工程が、ＮＡＣを前記幹細胞の集団に加えて、およそ０．５～１０ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなる、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
【0252】
６．前記処理工程が、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、実施形態５に記載の方法。
【0253】
７．前記方法が、以下の工程：
ｄ．前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、実施形態２～６のいずれか一項に記載の方法。
ｄ．前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、実施形態２～６のいずれか一項に記載の方法。
【0254】
８．前記方法が、以下の工程：
ｄ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなる、実施形態２～６のいずれか一項に記載の方法。
ｄ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることをさらに含んでなる、実施形態２～６のいずれか一項に記載の方法。
【0255】
９．前記培養工程が、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなる、実施形態８に記載の方法。
【0256】
１０．前記培養工程が、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、実施形態９に記載の方法。
【0257】
１１．前記方法が、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなる、実施形態８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【0258】
１２．前記方法が、前記幹細胞の解凍集団または前記幹細胞の拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなる、実施形態２～１１のいずれか一項に記載の方法。
【0259】
１３．前記方法が、以下の工程：
ｅ．前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、実施形態７～１２のいずれか一項に記載の方法。
ｅ．前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、実施形態７～１２のいずれか一項に記載の方法。
【0260】
１４．前記方法が、以下の工程：
ｅ．前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること；ならびに
ｆ．前記幹細胞の凍結拡大集団または前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、実施形態７～１３のいずれか一項に記載の方法。
ｅ．前記幹細胞の拡大集団または前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団または幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること；ならびに
ｆ．前記幹細胞の凍結拡大集団または前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、実施形態７～１３のいずれか一項に記載の方法。
【0261】
１５．前記方法が、以下の工程：
ｇ．前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させること
をさらに含んでなる、実施形態１４に記載の方法。
ｇ．前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させること
をさらに含んでなる、実施形態１４に記載の方法。
【0262】
１６．幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ることを含んでなる、方法。
【0263】
１７．前記培養工程が、ＮＡＣを加えて、およそ０．５～５ｍＭの初濃度とすることを含んでなる、実施形態１６に記載の方法。
【0264】
１８．前記培養工程が、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、実施形態１７に記載の方法。
【0265】
１９．前記凍結工程が、約－０．５～約－１０℃／分の速度で温度を－７０℃～－１３０℃に下げることを含んでなる、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【0266】
２０．前記凍結工程が、１０～６０分で温度を＋４℃から－１００～－１８０℃に下げることを含んでなる、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【0267】
２１．前記幹細胞の集団が、３７℃で解凍される、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【0268】
２２．前記幹細胞の凍結集団の細胞密度が、およそ１００万～およそ５，０００万個／ｍＬの範囲、好ましくは、およそ２，５００万個／ｍＬである、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【0269】
２３．前記幹細胞の集団が、実質的に純粋である、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【0270】
２４．前記幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、実施形態１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【0271】
２５．前記幹細胞が脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【0272】
２６．前記幹細胞がヒト細胞である、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【0273】
２７．前記方法が、前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなる、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【0274】
２８．前記方法が、前記幹細胞の集団を複数のクライオバイアル中で凍結させることを含んでなる、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【0275】
２９．前記方法が、幹細胞の複数の集団に対して実施形態１～２８のいずれか一項に記載の工程を反復することを含んでなる、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【0276】
３０．前記方法が、前記幹細胞の複数の集団を複数のクライオバイアル中で凍結させることを含んでなる、実施形態２９に記載の方法。
【0277】
３１．前記方法が、前記複数の凍結保存バイアルを液体窒素保存容器中で少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、または少なくとも１年間保存することを含んでなる、実施形態２８または実施形態３０に記載の方法。
【0278】
３２．実施形態２８または実施形態３０に記載の方法に従って得られる複数の凍結保存バイアルを含有する、液体窒素保存容器。
【0279】
３３．実施形態１～３１のいずれか一項に記載の方法により得られる、幹細胞の集団。
【0280】
３４．解凍後および場合により約１日間または約４日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して増加する、実施形態１～３１のいずれか一項に記載の方法または実施形態３３に記載の幹細胞の集団。
【0281】
３５．解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約５倍増加する、実施形態１～３１および３４のいずれか一項に記載の方法または実施形態３３もしくは３４に記載の幹細胞の集団。
【0282】
３６．解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも約１．０３倍、少なくとも約１．０５倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．１５倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、または少なくとも約２倍増加する、実施形態１～３１、３４もしくは３５のいずれか一項に記載の方法または実施形態３３～３５に記載の幹細胞の集団。
【0283】
３７．解凍後および場合により約１日間または約４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％増加する、実施形態１～３１、３４～３６のいずれか一項に記載の方法または実施形態３３～３６に記載の幹細胞の集団。
【0284】
３８．解凍後にＡＳＣを回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して減少する、実施形態１～３１、３４～３７のいずれか一項に記載の方法または実施形態３３～３７に記載の幹細胞の集団。
【0285】
３９．解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍減少する、実施形態１～３１、３４～３８のいずれか一項に記載の方法または実施形態３３～３８に記載の幹細胞の集団。
【0286】
４０．実施形態３３～３８のいずれか一項に記載の幹細胞の集団と凍結保存培地とを含んでなる、凍結保存組成物。
【0287】
４１．前記組成物が凍結される、実施形態４０に記載の凍結保存組成物。
【0288】
４２．前記組成物がＮＡＣを含有する、実施形態４０または実施形態４１に記載の凍結保存組成物。
【0289】
４３．実施形態３３～３８のいずれか一項に記載の幹細胞の集団と薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【0290】
４４．前記組成物が、およそ１００万個の細胞～およそ１億５，０００万個の細胞、好ましくは、およそ３，０００万個の細胞またはおよそ１億２，０００万個の細胞を含んでなる、実施形態４３に記載の医薬組成物。
【0291】
４５．前記細胞密度が、およそ１００万～２，０００万個／ｍＬである、実施形態４３または実施形態４４に記載の医薬組成物。
【0292】
４６．幹細胞の凍結保存のための、ＮＡＣの使用。
【0293】
４７．実施形態１～３１および３４～３９のいずれか一項に記載の方法における、実施形態４６に記載のＮＡＣの使用。
【0294】
４８．療法における使用のための、実施形態３３～３９のいずれか一項に記載の幹細胞の集団、実施形態４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物または実施形態４０～４２のいずれか一項に記載の凍結保存組成物。
【0295】
４９．それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための、実施形態３３～３９のいずれか一項に記載の幹細胞の集団、実施形態４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物または実施形態４０～４２に記載の凍結保存組成物。
【0296】
５０．瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に実施形態３３～３９のいずれか一項に記載の幹細胞の集団、実施形態４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物または実施形態４０～４２に記載の凍結保存組成物を投与すること含んでなる、方法。
【0297】
５１．それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための幹細胞の集団であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｄ．場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；
および
ｅ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、幹細胞の集団。
ａ．幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｄ．場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；
および
ｅ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、幹細胞の集団。
【0298】
５２．それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｄ．場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；
および
ｅ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団をＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｄ．場合により、前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；
および
ｅ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、方法。
【0299】
５３．前記方法が、前記患者に前記幹細胞の集団を投与する前に、実施形態３～１４、１８～３１または３４～３９に定義される工程のいずれか１つをさらに含んでなる、実施形態５１に記載の使用のための幹細胞の集団または実施形態５２に記載の治療の方法。
【0300】
５４．それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法における使用のための幹細胞の集団であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および
ｄ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、幹細胞の集団。
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および
ｄ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、幹細胞の集団。
【0301】
５５．それを必要とする患者における、瘻孔を治療する、かつ／または炎症性障害、自己免疫疾患、もしくは免疫介在性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ、アレルギー（例えば、ＩＶ型過敏性反応）、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎もしくは臓器拒絶反応を治療および／もしくは予防する方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および
ｄ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること；および
ｄ．前記患者に前記幹細胞の集団を投与すること
を含んでなる、方法。
【0302】
５６．前記方法が、前記患者に前記幹細胞の集団を投与する前に、実施形態１５～３１または３４～３９のいずれか一項に定義される工程のいずれか１つをさらに含んでなる、実施形態５４に記載の使用のための幹細胞の集団または実施形態５５に記載の治療の方法。
【0303】
５７．前記方法が、およそ１００万～１億５，０００万個の細胞、好ましくは、およそ３，０００万個の幹細胞またはおよそ１億２，０００万個の幹細胞を投与することを含んでなる、実施形態４８、４９、５１、５３、５４もしくは５６のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞の集団、医薬組成物もしくは凍結保存組成物、または実施形態５０、５２、５３、５５もしくは５６のいずれか一項に記載の方法。
【0304】
５８．前記方法が、およそ１００万～およそ１，０００万個／ｋｇの細胞を投与することを含んでなる、実施形態４８、４９、５１、５３、５４、５６もしくは５７のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞の集団、医薬組成物もしくは凍結保存組成物、または実施形態５０、５２、５３、５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
【0305】
５９．前記方法が、実施形態４３～４５のいずれか一項に記載の幹細胞の集団もしくは医薬組成物または実施形態４０～４２のいずれか一項に記載の凍結保存組成物を注射することを含んでなる、実施形態４８、４９、５１、５３、５４、５６～５８のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞の集団もしくは医薬組成物もしくは凍結保存組成物、または実施形態５０、５２、５３、５５～５８のいずれか一項に記載の方法。
【0306】
６０．前記幹細胞が、実施形態２３～２６のいずれか一項に定義された通りである、実施形態４８、４９、５１、５３、５４、５６～５９のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞の集団もしくは医薬組成物もしくは凍結保存組成物、または実施形態５０、５２、５３、５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
【0307】
６１．前記幹細胞が、同種異系または自己である、実施形態４８、４９、５１、５３、５４、５６～６０のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞の集団もしくは医薬組成物もしくは凍結保存組成物、または実施形態５０、５２、５３、５５～６０のいずれか一項に記載の方法。
【0308】
６２．クライオバイアルと、ＮＡＣを含有する容器と、幹細胞の集団を含んでなる容器とを含んでなる、凍結保存キット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-31
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること
を含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；および
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項2】
前記方法が、以下の工程：
ａ．前記幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
ａ．前記幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮＡＣで処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．前記幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｄ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、方法。
ａ．前記幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）で処理して、幹細胞の処理集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の処理集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄集団を得ること；
ｃ．前記幹細胞の洗浄集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；および
ｄ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項4】
前記処理工程が、
前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮＡＣで少なくとも１時間インキュベートすることを含んでなる、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記幹細胞の集団を凍結させる前に、前記幹細胞の集団を２～８ｍＭのＮＡＣで少なくとも１時間インキュベートすることを含んでなる、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記処理工程が、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、以下の工程：
ｄ．前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
ｄ．前記幹細胞の解凍集団を培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記方法が、以下の工程：
ｄ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
ｄ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
前記培養工程が、ＮＡＣを加えて、０．５～５ｍＭの範囲の初濃度とすることを含んでなり；かつ／または
前記方法は、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
前記方法は、前記幹細胞の拡大集団を洗浄して、ＮＡＣを除去し、かつ幹細胞の洗浄および拡大集団を得る工程をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記培養工程が、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記方法が、前記幹細胞の解凍集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項11】
前記方法が、前記幹細胞の拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させる工程をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記方法が、以下の工程：
ｅ．前記幹細胞の拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
ｅ．前記幹細胞の拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記方法が、以下の工程：
ｅ．前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
ｅ．前記幹細胞の洗浄および拡大集団を凍結させて、幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記方法が、以下の工程：
ｆ．前記幹細胞の凍結拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
ｆ．前記幹細胞の凍結拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記方法が、以下の工程：
ｆ．前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
ｆ．前記幹細胞の凍結、洗浄および拡大集団を解凍して、幹細胞の解凍拡大集団を得ること
をさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記方法が、以下の工程：
ｇ．前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させること
をさらに含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
ｇ．前記幹細胞の解凍拡大集団を洗浄し、かつ前記細胞を薬学上許容可能な担体に再懸濁させること
をさらに含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
幹細胞の凍結保存の方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
を含んでなる、方法。
ａ．幹細胞の集団を凍結させて、幹細胞の凍結集団を得ること；
ｂ．前記幹細胞の凍結集団を解凍して、幹細胞の解凍集団を得ること；および
ｃ．前記幹細胞の解凍集団をＮＡＣの存在下で培養して、幹細胞の拡大集団を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項18】
前記培養工程が、ＮＡＣを加えて、０．５～５ｍＭの初濃度とすることを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記培養工程が、ＮＡＣを加えて、２ｍＭの初濃度とすることを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記培養工程が、ＮＡＣの濃度を事前選択されたレベルに維持するためのＮＡＣの１回以上のさらなる添加を含んでなる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、かつ／または前記幹細胞が脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
解凍後ならびに１日間および／もしくは４日間の培養後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して増加し；
解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも１．０５倍増加し；
解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも１．０３倍増加し；
解凍後ならびに１日間および／もしくは４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも５％増加し；
かつ／または
解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも１．１倍減少し、
前記幹細胞の対照集団が、ＮＡＣにより処理された幹細胞の集団と同じ幹細胞の集団に由来し、ＮＡＣにより処理されていないが、その他の点では同一の条件に供されている、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
解凍後の生細胞の数が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも１．０５倍増加し；
解凍後の成長率が、幹細胞の対照集団と比較して、前記幹細胞の集団において少なくとも１．０３倍増加し；
解凍後ならびに１日間および／もしくは４日間の培養後のミトコンドリア活性が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも５％増加し；
かつ／または
解凍後に細胞を回収するのに要する時間が、幹細胞の対照集団と比較して少なくとも１．１倍減少し、
前記幹細胞の対照集団が、ＮＡＣにより処理された幹細胞の集団と同じ幹細胞の集団に由来し、ＮＡＣにより処理されていないが、その他の点では同一の条件に供されている、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】