▶ 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構の特許一覧 ▶ 学校法人加計学園の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024103589
(43)【公開日】2024-08-01
(54)【発明の名称】オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240725BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240725BHJP
C07D 209/18 20060101ALN20240725BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12N15/09 Z
C12N15/29
C07D209/18
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024086613
(22)【出願日】2024-05-28
(62)【分割の表示】P 2021532685の分割
【原出願日】2020-04-30
(31)【優先権主張番号】P 2019131464
(32)【優先日】2019-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業「植物のタンパク質分解系を応用した高機能ＲＮＡウイルスベクター遺伝子操作・細胞改変技術の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504202472
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
(71)【出願人】
【識別番号】599035627
【氏名又は名称】学校法人加計学園
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】鐘巻 将人
(72)【発明者】
【氏名】林 謙一郎
(57)【要約】
【課題】厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能なオーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、細胞、及び化合物を提供する
【解決手段】非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える、キット。
【選択図】なし
【解決手段】非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える、キット。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、
オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、
少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、
を備える、キット。
オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、
少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用に関する。具体的には、本発明は、オーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、及び細胞に関する。
本願は、２０１９年７月１６日に、日本に出願された特願２０１９－１３１４６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年７月１６日に、日本に出願された特願２０１９－１３１４６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
本発明者らはこれまでに、オーキシンデグロンシステムと呼ばれるタンパク質の分解制御技術の開発を行ってきた（例えば、特許文献１～３参照）。このシステムでは、オーキシン応答性ユビキチンリガーゼを構成するＴＩＲ１を、酵母や動物細胞等の真核生物由来の細胞に導入し、オーキシンの添加の有無やタイミングを調整することで、分解タグ（植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分タンパク質；デグロンともいう。）を付加した標的タンパク質の分解を制御する。
【0003】
本発明者らが開発した標的タンパク質の分解を制御方法（オーキシンデグロン法ともいう。）は、すでに細胞生物学研究で広く使用されており、酵母、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどのモデル生物への利用も進んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００８－１８７９５８号公報
【特許文献2】国際公開第２０１０／１２５６２０号
【特許文献3】国際公開第２０１３／０７３６５３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従来のオーキシンデグロン法を利用すると、オーキシンの添加により、分解タグ（デグロン）を付加した標的タンパク質を迅速に分解することが可能になる。しかしながら、従来のオーキシンデグロン法では、オーキシン非添加時にも標的タンパク質の弱い分解が起きるため、厳密な発現制御に困難があった。また、分解誘導に１００μＭ以上の比較的高濃度のオーキシンが使用されており、特に多細胞動物においてオーキシン自体の毒性影響が懸念されていた。
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能なオーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、細胞、及び化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の態様を含む。
【0008】
本発明は以下の態様を含む。
［１］非植物由来の真核細胞中の目的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える、キット。
［２］更に、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備える、［１］に記載のキット。
［３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、［１］又は［２］に記載のキット。
［４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１］～［３］のいずれか一つに記載のキット。
［５］前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体である、［１］～［４］のいずれか一つに記載のキット。
［１］非植物由来の真核細胞中の目的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える、キット。
［２］更に、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備える、［１］に記載のキット。
［３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、［１］又は［２］に記載のキット。
［４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１］～［３］のいずれか一つに記載のキット。
［５］前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体である、［１］～［４］のいずれか一つに記載のキット。
【0009】
【化1】
【0010】
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
［６］更に、前記第一の核酸と、前記第二の核酸及び前記第三の核酸との間に、連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備える、［２］～［５］のいずれか一つに記載のキット。
［７］更に、前記第一の核酸、並びに／又は、前記第二の核酸及び前記第三の核酸を含むトランスポゾンベクターを備える、［２］～［６］のいずれか一つに記載のキット。
［８］更に、内在性の目的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含有する、［１］～［７］のいずれか一つに記載のキット。
［９］更に、前記第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞を備える、請求項［１］～［８］のいずれか一つに記載のキット。
［１０］［１］～［９］のいずれか一つに記載のキットを用いる、標的タンパク質の分解方法。
［１１］非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる標的タンパク質分解誘導剤であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体を含有する、標的タンパク質分解誘導剤。
［６］更に、前記第一の核酸と、前記第二の核酸及び前記第三の核酸との間に、連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備える、［２］～［５］のいずれか一つに記載のキット。
［７］更に、前記第一の核酸、並びに／又は、前記第二の核酸及び前記第三の核酸を含むトランスポゾンベクターを備える、［２］～［６］のいずれか一つに記載のキット。
［８］更に、内在性の目的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含有する、［１］～［７］のいずれか一つに記載のキット。
［９］更に、前記第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞を備える、請求項［１］～［８］のいずれか一つに記載のキット。
［１０］［１］～［９］のいずれか一つに記載のキットを用いる、標的タンパク質の分解方法。
［１１］非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる標的タンパク質分解誘導剤であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体を含有する、標的タンパク質分解誘導剤。
【0011】
【化2】
【0012】
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
［１２］標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する、細胞。
［１３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、［１２］に記載の細胞。
［１４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１２］又は［１３］に記載の細胞。
［１５］下記一般式（ＩＩ）で表される化合物。
［１２］標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する、細胞。
［１３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、［１２］に記載の細胞。
［１４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１２］又は［１３］に記載の細胞。
［１５］下記一般式（ＩＩ）で表される化合物。
【0013】
【化3】
【0014】
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ３０は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ３１は、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３０が、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基である場合、Ｒ３１は、炭素数１～６のアルキル基である。）
【発明の効果】
【0015】
本発明のオーキシンデグロンシステムのキットによれば、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】実施例１において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解を調べた結果である。
【図2】実施例２において、複数種類のオーキシンアナログを添加による、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解を調べた結果である。
【図3】実施例３における、コロニー形成試験の結果である。
【図4】（Ａ）５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加した、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞の顕微鏡像である。（Ｂ）５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的なＤＨＣ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した結果である。
【図5】標的タンパク質分解系の概念図である。
【図6】（Ａ）５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的なＣＥＮＰＨの分解をウエスタンブロッティングにより確認した結果である。（Ｂ）５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的なＰＯＬＤ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した結果である。
【図7】（Ａ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞、及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解を調べた結果である。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞、及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解をＦＡＣＳ解析した結果である。
【図8】複数種類のオーキシンアナログ添加による、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解をＦＡＣＳ解析した結果である。
【図9】（Ａ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理したＨＣＴ１１６細胞の細胞周期への影響を調べた結果である。（Ｂ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理したＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成効率への影響を調べた結果である。
【図10】（Ａ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）において、異なる用量のＩＡＡ（オーキシン）と５－Ｐｈ－ＩＡＡをそれぞれ使用してｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーター分解を誘導した結果を示すグラフである。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）において、レポーター分解を経時的に誘導した結果を示すグラフである。
【図11】ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）において、５－Ｐｈ－ＩＡＡ除去後のｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーター発現の回復を調べた結果である。
【図12】（Ａ）実施例５における実験の概要を示す図である。（Ｂ）各酵母株におけるプレート上でのコロニーの形成の程度を示した写真である。
【図13】（Ａ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１を含むレポーターの分解を調べた写真である。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１レポーターの分解を経時的に誘導した結果を示すグラフである。（Ｃ）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１の分解による細胞周期への影響を調べた結果である。（Ｄ）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１の分解による姉妹染色分体の凝集への影響を調べた写真である。
【図14】実施例７における実験の概要を示す図である。
【図15】（Ａ）ゲノム編集を試みたＯｓＴＩＲ１（ＷＴ若しくはＦ７４Ｇ）、又はＡｔＡＦＢ２発現細胞における、コロニー形成の有無を示す写真である。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞における、１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によるＤＨＣ１－ｍＡＣの分解を調べた結果である。（Ｃ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によりＤＨＣ１－ｍＡＣを分解したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞における、Ｍ期の細胞の割合を示したグラフである。（Ｄ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によりＤＨＣ１－ｍＡＣを分解したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞における、分裂期の状態を示す染色像である。
【図16】（Ａ）ｍＡＩＤ及びｍｉｎｉ－ＩＡＡ７（ｍＩＡＡ７）のアミノ酸配列のアライメントである。（Ｂ）ｍｉｎｉ－ＩＡＡ７（ｍＩＡＡ７）を用いて、ゲノム編集を試みたＯｓＴＩＲ１（ＷＴ若しくはＦ７４Ｇ）、又はＡｔＡＦＢ２発現細胞における、コロニー形成の有無を示す写真である。（Ｃ）ＡｔＡＦＢ２又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞で、ｍＩＡＡ７又はｍＡＩＤタグ付きＤＨＣ１の分解を誘導した際のレポーターの分解をＦＡＣＳ解析した結果である。
【図17】ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現しているＨＣＴ１１６における、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によるｍＡＩＤを付加したＳＭＣ２、ＣＴＣＦ、及びＰＯＬＲ２Ａの分解を調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
≪オーキシンデグロンシステムのキット≫
本発明のキットは、非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える。
本発明のキットは、非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える。
【0018】
「オーキシンデグロンシステム」とは、本発明者らが開発したタンパク質の分解制御技術であり、植物ホルモンオーキシンによって導入される植物特異的なタンパク質分解系を、非植物由来の真核細胞に応用したシステムである（例えば、特許文献１～３参照）。
具体的に、このシステムは、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）のサブユニットであるＦ－ｂｏｘタンパク質としての植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドで標識された標的タンパク質とを非植物由来の真核細胞に導入することにより、オーキシン受容体であるＴＩＲ１ファミリータンパク質が、オーキシン依存的に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドを認識し、非植物由来の真核細胞におけるユビキチン／プロテアソーム分解系を利用して、標的タンパク質を分解するシステムである。
具体的に、このシステムは、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）のサブユニットであるＦ－ｂｏｘタンパク質としての植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドで標識された標的タンパク質とを非植物由来の真核細胞に導入することにより、オーキシン受容体であるＴＩＲ１ファミリータンパク質が、オーキシン依存的に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドを認識し、非植物由来の真核細胞におけるユビキチン／プロテアソーム分解系を利用して、標的タンパク質を分解するシステムである。
【0019】
本発明者らは、係るシステムにおいて、オーキシン非依存的に標的タンパク質が分解されるという問題を見出した。係る問題に対して、本発明者らは、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグの組み合わせを見出した。
また、本発明者らは、低濃度のオーキシンアナログで、標的タンパク質を分解誘導できることを見出した。
本発明によれば、オーキシン非添加時には、標的タンパク質の分解はほとんど起こらず、オーキシン添加時には、標的タンパク質の分解効率が非常に高いオーキシンデグロンシステムを提供できる。
また、本発明者らは、低濃度のオーキシンアナログで、標的タンパク質を分解誘導できることを見出した。
本発明によれば、オーキシン非添加時には、標的タンパク質の分解はほとんど起こらず、オーキシン添加時には、標的タンパク質の分解効率が非常に高いオーキシンデグロンシステムを提供できる。
【0020】
＜第一の核酸＞
本発明において、第一の核酸は、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする。
ＴＩＲ１ファミリータンパク質とは、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ－ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、標的タンパク質を分解することが知られている。
本発明において、第一の核酸は、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする。
ＴＩＲ１ファミリータンパク質とは、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ－ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、標的タンパク質を分解することが知られている。
【0021】
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子等が挙げられる。
中でも、イネ由来のＴＩＲ１遺伝子である、ＯｓＴＩＲ１遺伝子が好ましい。係る遺伝子としては、ＮＣＢＩに登録されているアクセッション番号ＮＭ_００１０５９１９４（ＧｅｎｅＩＤ：４３３５６９６）、Ｏｓ０４ｇ０３９５６００又はアクセッション番号ＥＡＹ９３９３３、ＯｓＩ_１５７０７の遺伝子が挙げられ、より具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。更に、ヒト細胞用にコドンを最適化した配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子が好ましい。
中でも、イネ由来のＴＩＲ１遺伝子である、ＯｓＴＩＲ１遺伝子が好ましい。係る遺伝子としては、ＮＣＢＩに登録されているアクセッション番号ＮＭ_００１０５９１９４（ＧｅｎｅＩＤ：４３３５６９６）、Ｏｓ０４ｇ０３９５６００又はアクセッション番号ＥＡＹ９３９３３、ＯｓＩ_１５７０７の遺伝子が挙げられ、より具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。更に、ヒト細胞用にコドンを最適化した配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子が好ましい。
【0022】
本発明において、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、オーキシン結合部位に変異を有するものである。係る変異タンパク質は、後述するオーキシンアナログとの親和性を有するものであれば特に限定されないが、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているものが好ましく、Ｇに変異しているものがより好ましい。
【0023】
具体的には、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質が特に好ましい。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７４位がグリシンであるアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７４位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７４位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７４位がグリシンであるアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７４位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７４位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【0024】
（ｂ）において欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１ ～１２０個が好ましく、１～６０個がより好ましく、１～２０個が更に好ましく、１～１０個が特に好ましく、１～５個が最も好ましい。
（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【0025】
ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ａタンパク質としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられ、ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ａタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号５で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ｇタンパク質としては、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられ、ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ｇタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号７で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ｇタンパク質としては、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられ、ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ｇタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号７で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【0026】
変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、エキソンとイントロンとを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。
【0027】
本明細書において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシンアナログの存在下で、分解タグ（Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質）を認識することを意味する。ＴＩＲ１ファミリータンパク質が分解タグを認識できれば、分解タグで標識化された標的タンパク質を分解できるからである。
【0028】
本発明のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端に、該第一の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。
【0029】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）の転写を指向するものを意味する。
【0030】
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＲＳＶプロモーター等が挙げられる。
【0031】
本発明のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。
【0032】
ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、宿主細胞に応じた発現ベクターを用いることができる。
【0033】
ベクターは、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端又は３’末端に、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【0034】
本発明のキットは、第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞を備えてもよい。係る細胞は、第一の核酸をセーフハーバー座位に有することが好ましい。
「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）をセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。セーフハーバー座位としては、例えば、ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １０遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ遺伝子座、ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子座等が挙げられる。中でも、ヒト由来細胞の場合は外来ＤＮＡをＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することが好ましい。
「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）をセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。セーフハーバー座位としては、例えば、ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １０遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ遺伝子座、ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子座等が挙げられる。中でも、ヒト由来細胞の場合は外来ＤＮＡをＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することが好ましい。
【0035】
細胞としては、非植物由来の真核細胞であれば特に限定されず、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等の魚類や両生類、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓやショウジョウバエ等の無脊椎動物が挙げられる。
また、株化された真核動物由来細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞も挙げられる。真核細胞として具体的には、例えば、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞等が挙げられる。具体的には、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞、ニワトリＤＴ４０細胞等が挙げられる。
また、菌類としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母等が挙げられる。
また、株化された真核動物由来細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞も挙げられる。真核細胞として具体的には、例えば、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞等が挙げられる。具体的には、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞、ニワトリＤＴ４０細胞等が挙げられる。
また、菌類としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母等が挙げられる。
【0036】
＜オーキシンアナログ＞
本発明において、オーキシンアナログは、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するものであれば特に限定されず、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体であることが好ましい。
本発明において、オーキシンアナログは、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するものであれば特に限定されず、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体であることが好ましい。
【0037】
【化4】
【0038】
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
【0039】
［環状の脂肪族炭化水素基］
Ｒ１０における環状の脂肪族炭化水素基としては、単環式基でも多環式基でもよい。
単環式の脂肪族炭化水素としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、ジメチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基が挙げられる。
多環式の脂環式炭化水素基としては、デカヒドロナフチル基、アダマンチル基、２－アルキルアダマンタン－２－イル基、１－（アダマンタン－１－イル）アルカン－１－イル基、ノルボルニル基、メチルノルボルニル基、イソボルニル基等が挙げられる。
Ｒ１０における環状の脂肪族炭化水素基としては、単環式基でも多環式基でもよい。
単環式の脂肪族炭化水素としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、ジメチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基が挙げられる。
多環式の脂環式炭化水素基としては、デカヒドロナフチル基、アダマンチル基、２－アルキルアダマンタン－２－イル基、１－（アダマンタン－１－イル）アルカン－１－イル基、ノルボルニル基、メチルノルボルニル基、イソボルニル基等が挙げられる。
【0040】
環状の脂肪族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ジオキサン、ジオキソラン等が挙げられる。
【0041】
置換基としては、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
【0042】
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
【0043】
アルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、上述した炭素数１～６のアルキル基と同様のものが挙げられる。中でも、炭素数アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
【0044】
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。
【0045】
［芳香族炭化水素基］
Ｒ１０における芳香族炭化水素基としては、上述した炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
芳香族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジン、インドール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、クロメン、イソクロメン等が挙げられる。
Ｒ１０における芳香族炭化水素基としては、上述した炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
芳香族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジン、インドール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、クロメン、イソクロメン等が挙げられる。
【0046】
置換基としては、［環状の脂肪族炭化水素基］で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【0047】
一般式（Ｉ）で表される化合物のエステル体は、一般式（Ｉ）の－ＣＯＯＨにおける水素原子が、炭化水素基に置換されたものであり、アルキル基に置換されたものが好ましい。
係るアルキル基としては、炭素数１～６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
係るアルキル基としては、炭素数１～６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
【0048】
一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ１０が芳香族炭化水素基であるものとして、下記一般式（Ｉ－１）で表される化合物、又はそのエステル体が好ましい。
【0049】
【化5】
【0050】
（一般式（Ｉ－１）中、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。ｎは０～５の整数であり、ｎが２～５の整数である場合、ｎ個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよい。）
【0051】
Ｒ１のハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
【0052】
Ｒ１のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。中でも、炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
【0053】
Ｒ１のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、上述した炭素数１～６のアルキル基と同様のものが挙げられる。中でも、炭素数アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
【0054】
Ｒ１のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。
【0055】
Ｒ１のｎは０～５の整数であり、０～３が好ましい。一般式（Ｉ－１）で表される化合物が複数のＲ１を有する場合、以下の化合物、又はそのエステル体が挙げられる。
【0056】
【化6】
【0057】
（一般式（Ｉ－１－１）～（Ｉ－１－３）中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。）
【0058】
一般式（Ｉ－１－１）～（Ｉ－１－３）における、Ｒ１～Ｒ３は、一般式（Ｉ－１）におけるＲ１と同様である。
【0059】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、以下に示す化合物、又はそのエステル体が好ましい。
下記式（Ｉ－１－４）で示される化合物（５－（３－ＭｅＯＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－６）で示される化合物（５－（３，４－ｄｉＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－７）で示される化合物（５－（３－ＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－４）で示される化合物（５－（３－ＭｅＯＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－６）で示される化合物（５－（３，４－ｄｉＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－７）で示される化合物（５－（３－ＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
下記式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
【0060】
【化7】
【0061】
【化8】
【0062】
また、下記式（Ｉ－１－９）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
【0063】
【化9】
【0064】
また、Ｒ１０が芳香族炭化水素基であるものとして、下記式（Ｉ－２）～（Ｉ－５）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
【0065】
【化10】
【0066】
また、Ｒ１０が環状の脂肪族炭化水素基であるものとして、下記一般式（Ｉ－６）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
【0067】
【化11】
【0068】
（一般式（Ｉ－６）中、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。ｍは０～１１の整数であり、ｍが２～１１の整数である場合、ｍ個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよい。）
【0069】
Ｒ１は、一般式（Ｉ－１）で挙げられてものと同様である。ｍは０～６が好ましく、０～３がより好ましい。
【0070】
また、Ｒ１０が環状の脂肪族炭化水素基であるものとして、下記式（Ｉ－７）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
【化12】
【0071】
＜第二の核酸＞
本発明において、第二の核酸は、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする。
Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類について特別な限定はない。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子、ＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。
本発明において、第二の核酸は、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする。
Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類について特別な限定はない。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子、ＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。
【0072】
本発明のキットは、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の全長又は部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
【0073】
ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）、ＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
これらの中でも、シロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。
これらの中でも、シロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。
【0074】
分解タグは、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体と結合し、標的タンパク質を分解に導くものであれば特に限定されず、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のうち、ｍＡＩＤの全長又は部分タンパク質を含むものが好ましい。
【0075】
「ｍＡＩＤ」とは、「Ｍｉｎｉ－ａｕｘｉｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ」の略称であり、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の一つであるシロイヌナズナＩＡＡ１７の部分配列からなるタンパク質である。この部分配列とは、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は、該配列を２個以上連結してなる配列である。このｍＡＩＤは標的タンパク質を標識する分解タグとなり得る。例えば、ｍＡＩＤのアミノ酸配列は、配列番号８で表される。
【0076】
＜第三の核酸＞
本発明のキットにおいて、標的タンパク質が定まっている場合には、第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備えていてもよい。第二の核酸は、第三の核酸の５’側又は３’側のどちらに隣接されて配置されてもよい。
第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、第一の核酸と同様に、プロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましく、発現ベクターに組み込まれたものであってもよい。
本発明のキットにおいて、標的タンパク質が定まっている場合には、第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備えていてもよい。第二の核酸は、第三の核酸の５’側又は３’側のどちらに隣接されて配置されてもよい。
第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、第一の核酸と同様に、プロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましく、発現ベクターに組み込まれたものであってもよい。
【0077】
＜第四の核酸＞
上記、第一の核酸、及び、第二の核酸、又は第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、それぞれ発現ベクターに組み込まれたものであってもよいが、本発明のキットは、第一の核酸と、第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸との間に連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備えていてもよい。
第四の核酸としては、リードスルーリンカーをコードする核酸、非リードスルーリンカーをコードする核酸が挙げられる。
リードスルーリンカーをコードする核酸としては、内在性酵素による切断配列をコードする核酸が挙げられ、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸が挙げられる。
非リードスルーリンカーをコードする核酸としては、ＩＲＥＳが挙げられる。
上記、第一の核酸、及び、第二の核酸、又は第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、それぞれ発現ベクターに組み込まれたものであってもよいが、本発明のキットは、第一の核酸と、第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸との間に連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備えていてもよい。
第四の核酸としては、リードスルーリンカーをコードする核酸、非リードスルーリンカーをコードする核酸が挙げられる。
リードスルーリンカーをコードする核酸としては、内在性酵素による切断配列をコードする核酸が挙げられ、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸が挙げられる。
非リードスルーリンカーをコードする核酸としては、ＩＲＥＳが挙げられる。
【0078】
＜トランスポゾンベクター＞
本発明のキットは、第一の核酸、並びに／又は、第二の核酸及び前記第三の核酸からなる融合核酸を含むトランスポゾンベクターを備えていてもよい。
具体的には、本発明のキットは、プロモーター配列が作動可能に連結された、第一の核酸、及び／又は、融合核酸の両端にトランスポゾンエレメントを備えたベクターと、トランスポゼースをコードする核酸を備えたベクターを含むことが好ましい。
第一の核酸及び融合核酸は、それぞれ個別のベクターに含まれていてもよいが、一つのベクターに含まれる場合には、係るベクターは、上記第四の核酸を含むことが好ましい。
本発明のキットは、第一の核酸、並びに／又は、第二の核酸及び前記第三の核酸からなる融合核酸を含むトランスポゾンベクターを備えていてもよい。
具体的には、本発明のキットは、プロモーター配列が作動可能に連結された、第一の核酸、及び／又は、融合核酸の両端にトランスポゾンエレメントを備えたベクターと、トランスポゼースをコードする核酸を備えたベクターを含むことが好ましい。
第一の核酸及び融合核酸は、それぞれ個別のベクターに含まれていてもよいが、一つのベクターに含まれる場合には、係るベクターは、上記第四の核酸を含むことが好ましい。
【0079】
トランスポゾンの転移には、トランスポジション反応を触媒する酵素（トランスポゼース）と、このトランスポゼースにより認識されて転移するＤＮＡ（トランスポゾンエレメント）が必要である。本発明のキットは、これらを含むことが好ましい。
本発明のキットにおいて、トランスポゼースをコードするＤＮＡ及びトランスポゾンエレメントが、トランスポゾンＤＮＡとして、連結して一つの発現系に組み込まれている場合には、トランスポゾンＤＮＡは、一度細胞内に導入すると、自らトランスポゼースを発現して転移し得る。
このような自律性トランスポゾンは、転移した位置から別の位置へ転移する可能性がある。そのため、より安定して染色体内に目的遺伝子を導入するためには、本発明のキットは、トランスポゼースをコードするＤＮＡ及びトランスポゾンエレメントが、それぞれ別個の発現系に組み込まれていることが好ましい。
本発明のキットにおいて、トランスポゼースをコードするＤＮＡ及びトランスポゾンエレメントが、トランスポゾンＤＮＡとして、連結して一つの発現系に組み込まれている場合には、トランスポゾンＤＮＡは、一度細胞内に導入すると、自らトランスポゼースを発現して転移し得る。
このような自律性トランスポゾンは、転移した位置から別の位置へ転移する可能性がある。そのため、より安定して染色体内に目的遺伝子を導入するためには、本発明のキットは、トランスポゼースをコードするＤＮＡ及びトランスポゾンエレメントが、それぞれ別個の発現系に組み込まれていることが好ましい。
【0080】
トランスポゾンとしては、特に限定されず、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２等が挙げられる。
【0081】
＜第五の核酸＞
第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、相同組換えにより内在性の第三の核酸と入れ替えられてもよいが、係る融合核酸がトランスポゾン等により、任意の染色体に組み込まれている場合には、本発明のキットは、内在性の標的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含むことが好ましい。標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムとしては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられる。これらのシステムの細胞への導入方法としては、特に限定されず、標的ゲノムＤＮＡ切断酵素自体を細胞に導入してもよく、第五の核酸を含む標的ゲノムＤＮＡ切断酵素発現ベクターを細胞に導入してもよい。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいては、Ｃａｓ９発現ベクターと、切断したい箇所にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクターと、を細胞に導入する方法や、発現精製した組み換えＣａｓ９タンパク質と、ガイドＲＮＡと、を細胞に導入する方法等が挙げられる。ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの２つに分かれていてもよく、１本につながっているｓｇＲＮＡであってもよい。
第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、相同組換えにより内在性の第三の核酸と入れ替えられてもよいが、係る融合核酸がトランスポゾン等により、任意の染色体に組み込まれている場合には、本発明のキットは、内在性の標的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含むことが好ましい。標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムとしては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられる。これらのシステムの細胞への導入方法としては、特に限定されず、標的ゲノムＤＮＡ切断酵素自体を細胞に導入してもよく、第五の核酸を含む標的ゲノムＤＮＡ切断酵素発現ベクターを細胞に導入してもよい。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいては、Ｃａｓ９発現ベクターと、切断したい箇所にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクターと、を細胞に導入する方法や、発現精製した組み換えＣａｓ９タンパク質と、ガイドＲＮＡと、を細胞に導入する方法等が挙げられる。ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの２つに分かれていてもよく、１本につながっているｓｇＲＮＡであってもよい。
【0082】
≪標的タンパク質分解方法≫
本発明の標的タンパク質の分解方法は、上述した本発明のキットを用いる方法である。オーキシンデグロンシステムにおいて、上述のキットを用いることで、厳密かつ自在に標的タンパク質の分解制御が可能である。
本発明の標的タンパク質の分解方法は、上述した本発明のキットを用いる方法である。オーキシンデグロンシステムにおいて、上述のキットを用いることで、厳密かつ自在に標的タンパク質の分解制御が可能である。
【0083】
例えば、上述のキットを用いて標的タンパク質の分解制御を行う方法としては、以下の方法等が挙げられる。
まず、細胞内において、分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現させる。分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質は、定常的に発現していることが好ましい。
まず、細胞内において、分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現させる。分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質は、定常的に発現していることが好ましい。
【0084】
次いで、オーキシンアナログを培地に添加する。培地に含まれるオーキシンアナログの濃度は、限定されず、例えば、１μＭ以上０．１ｍＭ未満であり、１０ｎＭ以上５０μＭ以下であることが好ましい。実施例で後述するように、一般式（Ｉ）で表される化合物とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）の組み合わせでは、５０ｎＭの濃度で、十分に標的タンパク質の分解を誘導できる。所定濃度のオーキシンアナログの添加により、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体が形成され、この複合体が分解タグによって標識された標的タンパク質を認識し、標的タンパク質の分解が誘導される。
【0085】
本発明の分解方法によれば、オーキシンアナログ特異的に標的タンパク質の分解を誘導できる。
【0086】
≪化合物≫
本発明の化合物は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物である。
本発明の化合物は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物である。
【0087】
【化13】
【0088】
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ３０は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ３１は、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３０が、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基である場合、Ｒ３１は、炭素数１～６のアルキル基である。）
【0089】
Ｒ３０のハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
【0090】
Ｒ３０及びＲ３１のアルキル基としては、例えば、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。中でも、炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
【0091】
一般式（ＩＩ）で表される化合物のうち、下記式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－４）で表される化合物が好ましい。
【0092】
【化14】
【0093】
≪細胞≫
本発明の細胞は、標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する。
本発明の細胞は、第一の核酸をセーフハーバー座位に有することが好ましい。
本発明の細胞は、標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する。
本発明の細胞は、第一の核酸をセーフハーバー座位に有することが好ましい。
【0094】
細胞としては、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、
非植物由来の真核細胞であれば特に限定されず、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。
非植物由来の真核細胞であれば特に限定されず、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。
【0095】
ＴＩＲ１ファミリータンパク質としては、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、イネ由来のＴＩＲ１タンパク質である、ＯｓＴＩＲ１タンパク質が好ましい。
【0096】
変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているものが好ましく、Ｇに変異しているものがより好ましい。
【0097】
具体的には、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、上述した（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質が特に好ましい。
【0098】
本発明の細胞は、更に、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸と、を含む染色体を有することが好ましい。
【0099】
第一の核酸、第二の核酸、及び第三の核酸の染色体への導入方法としては、特に限定されず、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたように、ＣＲＩＳＰＲシステム等ゲノム編集技術を用いて導入してもよく、トランスポゾンベクターを用いて導入してもよい。
【実施例0100】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0101】
［実施例１］
１．オーキシンアナログの合成
式（Ｉ－２）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を合成した。
１．オーキシンアナログの合成
式（Ｉ－２）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を合成した。
【0102】
２．細胞の準備
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）－ＮＬＳ（核移行シグナル）遺伝子がＰ２Ａ配列を介してコードされるＤＮＡがトランスポゾンにより染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」又は「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」と称する）を準備した（図１参照。）。
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）－ＮＬＳ（核移行シグナル）遺伝子がＰ２Ａ配列を介してコードされるＤＮＡがトランスポゾンにより染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」又は「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」と称する）を準備した（図１参照。）。
【0103】
３．オーキシンアナログの添加
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンアナログ（培地中の濃度：０、２００μＭ）を添加して、２４時間培養した。また、対照として、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンを添加した細胞も準備した。
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンアナログ（培地中の濃度：０、２００μＭ）を添加して、２４時間培養した。また、対照として、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンを添加した細胞も準備した。
【0104】
３．ＦＡＣＳ解析
オーキシンアナログの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図１に示す。
オーキシンアナログの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図１に示す。
【0105】
図１から、オーキシンアナログを添加したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞では、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞と比較して、分解誘導前の発現が高く均一である。さらに、オーキシンアナログを添加したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞では、オーキシンを添加したＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞と比較して、よりシャープにＧＦＰの分解が観察された。
【0106】
更に同様の実験を、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞に１００μＭオーキシンを添加し、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞に、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加し、４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図７（Ａ）に示す。
同質遺伝的背景で、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を比較したところ、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）においては、オーキシン未添加の状態で、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターレベルが低く、そのシグナルピークが広く、基底分解があることを示していた。ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）に１００μＭオーキシンを添加することにより、シグナルピークが左にシフトし、レポーターが分解したことを示した。
対照的に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞では、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの発現レベルが高く、そのシグナルピークがよりシャープであり、これらの細胞では基底分解が、低いことが示された。更に、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを４時間添加すると、レポーターはＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞で効率的に分解された。
同質遺伝的背景で、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を比較したところ、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）においては、オーキシン未添加の状態で、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターレベルが低く、そのシグナルピークが広く、基底分解があることを示していた。ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）に１００μＭオーキシンを添加することにより、シグナルピークが左にシフトし、レポーターが分解したことを示した。
対照的に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞では、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの発現レベルが高く、そのシグナルピークがよりシャープであり、これらの細胞では基底分解が、低いことが示された。更に、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを４時間添加すると、レポーターはＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞で効率的に分解された。
【0107】
更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞も用い、３つのクローンで同様の実験を行った。結果を図７（Ｂ）に示す。
図７（Ｂ）に示す様に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現する３つの細胞株は、低発現レベルでより広いピークを示し、オーキシン無しでも基底分解があることを示唆した。
一方、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）を発現するクローンは、５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加しない状態で、レポーターのより強い発現レベルを示し、基底分解が抑制されたことを示唆している。
更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するクローンは、５－Ｐｈ－ＩＡＡ処理によりＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）を発現するクローンと比較して、よりシャープなｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解を示した。 すべての場合において、シグナルピークは、５－Ｐｈ－ＩＡＡ処理後に左にシフトし、分解が誘発されたことを示した。
図７（Ｂ）に示す様に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現する３つの細胞株は、低発現レベルでより広いピークを示し、オーキシン無しでも基底分解があることを示唆した。
一方、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）を発現するクローンは、５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加しない状態で、レポーターのより強い発現レベルを示し、基底分解が抑制されたことを示唆している。
更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するクローンは、５－Ｐｈ－ＩＡＡ処理によりＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）を発現するクローンと比較して、よりシャープなｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解を示した。 すべての場合において、シグナルピークは、５－Ｐｈ－ＩＡＡ処理後に左にシフトし、分解が誘発されたことを示した。
【0108】
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）をより詳細に比較するために、異なる用量のＩＡＡ（オーキシン）と５－Ｐｈ－ＩＡＡをそれぞれ使用してｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーター分解を誘導した（図１０（Ａ）参照）。図１０（Ａ）に示す様に、 ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞の分解に必要なリガンド濃度は有意に低かった。 ＤＣ５０値（５０％分解の濃度）は、それぞれＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）で、３００±３０ｎＭ及び０．４５±０．０１ｎＭであり、５－Ｐｈ－ＩＡＡを使用したシステムが、従来のオーキシンデグロンシステムと比較して、約６７０倍の低濃度で機能することが確認された。
【0109】
標的タンパク質除去による、経時的動態を調べるために、時間経過後のサンプルを取り、レポーターの発現レベルを観察した（図１０（Ｂ）参照。）。本発明に係る分解システム（ＡＩＤ２システムともいう。）は、半減期が６２．３±２．０分で、従来のシステムと比べて、遥かにシャープに機能することが確認された。
一方、従来のシステムは、半減期１４７．１±１２．５分で効率が低下していた。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を使用したＡＩＤ２システムは、標的タンパク質の基底分解が少なく、新しい活性化リガンドである５－Ｐｈ－ＩＡＡの濃度が大幅に低くて済み、ターゲットの分解速度が速くなることが確認された。
一方、従来のシステムは、半減期１４７．１±１２．５分で効率が低下していた。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を使用したＡＩＤ２システムは、標的タンパク質の基底分解が少なく、新しい活性化リガンドである５－Ｐｈ－ＩＡＡの濃度が大幅に低くて済み、ターゲットの分解速度が速くなることが確認された。
【0110】
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）と５－Ｐｈ－ＩＡＡのペアを使用したＡＩＤ２システムの可逆性を確認するために、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解を誘発した後に、５－Ｐｈ－ＩＡＡを含まない培地に交換し、レポーターの発現を調べた。結果を図１１に示す。図１１に示す様に、レポーター発現は３時間後に完全に回復し、ＡＩＤ２システムの可逆性が示された。
【0111】
［実施例２］
１．オーキシンアナログの合成
式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－６）で示される化合物（５－（３，４－ｄｉＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－７）で示される化合物（５－（３－ＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。）を合成した。式（Ｉ－１－４）で示される化合物（５－（３－ＭｅＯＰｈ）－ＩＡＡともいう。）は、東京化成工業株式会社から購入した。
以下に、合成した化合物の合成方法を示す。
１．オーキシンアナログの合成
式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－６）で示される化合物（５－（３，４－ｄｉＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－７）で示される化合物（５－（３－ＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。）を合成した。式（Ｉ－１－４）で示される化合物（５－（３－ＭｅＯＰｈ）－ＩＡＡともいう。）は、東京化成工業株式会社から購入した。
以下に、合成した化合物の合成方法を示す。
【0112】
［5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステルの合成］
【0113】
【化15】
【0114】
5-ブロモインドール3-酢酸 (500 mg, 1.97 mmol) のメタノール 溶液（25 mL）を100 mL 丸底フラスコ入れて、撹拌しながら塩化アセチル 1 mL を滴下した。室温で3時間反応させた。反応液を水 100 mL に注ぎ、これを50 mL の酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水 100 mLで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮して茶褐色オイルの5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル（26 mg, 1.96 mmol, 収率99 %) を得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (s, 1H), 7.73 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 7.6, 5.7 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 13.5, 4.8 Hz, 1H), 7.16-7.10 (m, 1H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.71 (s, 3H)，13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.33, 134.80, 129.06, 125.21, 124.42, 121.59, 113.12, 112.730, 108.24, 52.18, 30.98.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (s, 1H), 7.73 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 7.6, 5.7 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 13.5, 4.8 Hz, 1H), 7.16-7.10 (m, 1H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.71 (s, 3H)，13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.33, 134.80, 129.06, 125.21, 124.42, 121.59, 113.12, 112.730, 108.24, 52.18, 30.98.
【0115】
［5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステルの合成］
【0116】
【化16】
【0117】
5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (540 mg, 2.01 mmol) 、フェニルボロン酸 (467 mg, 3.83 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド[PdCl2(PPhe3)2 ：67 mg, 0.095 mmol]を 、ジメチルホルムアミド 5 mL 、エタノール 5 mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 2 mL を入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステルを橙色オイルとして得た(134 mg, 0.50 mmol,収率25.1 %) 。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.69-7.61 (m, 2H), 7.43 (t, J = 7.8 Hz, 3H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.34-7.28 (m, 1H), 7.16 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.17 (qd, J = 7.1, 4.0 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H),13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.19, 142.64, 135.74, 133.37, 128.74, 127.52, 126.44, 123.88, 122.18, 117.53, 111.52, 109.04, 60.95, 31.50.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.69-7.61 (m, 2H), 7.43 (t, J = 7.8 Hz, 3H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.34-7.28 (m, 1H), 7.16 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.17 (qd, J = 7.1, 4.0 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H),13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.19, 142.64, 135.74, 133.37, 128.74, 127.52, 126.44, 123.88, 122.18, 117.53, 111.52, 109.04, 60.95, 31.50.
【0118】
［5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステル（式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。））の合成］
【0119】
【化17】
【0120】
5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステル (124 mg, 0.47 mmol) を10 mL 丸底フラスコにとり、メタノール 1 mL とテトラヒドロフラン1 mLを加えた。これに水酸化リチウム水溶液(23 mg, 0.96 mmolを水1 mL に溶解)を滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌して加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 5 mLと 酢酸エチル 5 mL を加えて酢酸エチル層に生成物を抽出した。さらに酢酸エチル 5 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 10 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-フェニルインドール3-酢酸を淡褐色粉末(98 mg, 0.39 mmol, 収率 83.4 %)として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, acetone-d6) δ10.61 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.68-7.65 (m, 2H), 7.48-7.46 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 3H), 7.34 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.26 (tt, J = 7.3, 1.4 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6) δ 173.20, 143.65, 137.15, 133.06, 129.51, 129.15, 127.86, 126.96, 125.39, 121.85, 118.07, 112.54, 109.65, 31.39
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, acetone-d6) δ10.61 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.68-7.65 (m, 2H), 7.48-7.46 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 3H), 7.34 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.26 (tt, J = 7.3, 1.4 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6) δ 173.20, 143.65, 137.15, 133.06, 129.51, 129.15, 127.86, 126.96, 125.39, 121.85, 118.07, 112.54, 109.65, 31.39
【0121】
［5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステルの合成］
【0122】
【化18】
【0123】
5-ブロモインドール3-酢酸 (508 mg、2.00 mmol) のエタノール溶液（25 mL）を100 mL 丸底フラスコに入れて、これに撹拌しながら塩化アセチル 1 mL を滴下した。この反応液を室温で3時間撹拌した。反応液を水 100 mL に注ぎ、これを50 mL の酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水 100 mLで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、茶褐色オイルの5-ブロモインドール3-酢酸エチルエステル(556 mg, 1.97 mmol, 収率99 %) を得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.23 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.24 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 2H), 1.28 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172.07, 134.82, 129.05, 125.08, 124.49, 121.64, 112.99, 112.77, 108.21, 61.11, 31.31, 14.32.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.23 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.24 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 2H), 1.28 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172.07, 134.82, 129.05, 125.08, 124.49, 121.64, 112.99, 112.77, 108.21, 61.11, 31.31, 14.32.
【0124】
［5-(3-メチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルの合成］
【0125】
【化19】
【0126】
5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (112 mg, 0.40 mmol) 、3-メチルフェニルボロン酸 (107 mg, 0.79 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（PdCl2(PPhe3)2 ：15 mg, 0.02 mmol)を 、ジメチルホルムアミド １ mL、エタノール １mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 0.5 mLを入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-(3-メチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルを黄色オイル(17 mg, 0.058 mmol, 収率14.6 %)として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J=7.8, 1H), 7.19 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.16-7.11 (m, 1H), 4.18 (q, J=7.6, 2H), 3.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.12, 142.59, 138.23, 135.68, 133.51, 128.62, 128.32, 127.84, 127.19, 124.61, 123.74, 122.24, 117.51, 111.39, 109.13, 60.91, 31.49, 21.67, 14.34.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J=7.8, 1H), 7.19 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.16-7.11 (m, 1H), 4.18 (q, J=7.6, 2H), 3.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.12, 142.59, 138.23, 135.68, 133.51, 128.62, 128.32, 127.84, 127.19, 124.61, 123.74, 122.24, 117.51, 111.39, 109.13, 60.91, 31.49, 21.67, 14.34.
【0127】
［5-（3-メチルフェニル）-インドール3-酢酸の合成］
【0128】
【化20】
【0129】
5-(3-メチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステル (４０mg, 0.14 mmol) を5 mLガラスバイアルにとり、メタノール0.25 mL とテトラヒドロフラン0.25 mL を加えた。これに、10 %（W/V）水酸化カリウム水溶液0.25 ｍLを滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌し加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 １ mLと 酢酸エチル 2 mL を加えて抽出した。さらに酢酸エチル 2 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 1 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-（3-メチルフェニル）-インドール3-酢酸を淡褐色粉末(29 mg, 0.11 mmol, 収率 80.2 %)として得た。得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (s, 1H), 7.77 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.48-7.40 (m, 3H), 7.36 (d, J=8.7Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.3Hz,1H), 7.16-7.09 (m, 2H), 3.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.84, 142.51, 138.29, 135.63, 133.70, 128.67, 128.36, 127.69, 127.27, 124.68, 124.04, 122.41, 117.34, 111.53, 108.22, 31.07, 21.68.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (s, 1H), 7.77 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.48-7.40 (m, 3H), 7.36 (d, J=8.7Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.3Hz,1H), 7.16-7.09 (m, 2H), 3.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.84, 142.51, 138.29, 135.63, 133.70, 128.67, 128.36, 127.69, 127.27, 124.68, 124.04, 122.41, 117.34, 111.53, 108.22, 31.07, 21.68.
【0130】
［5-(3,4-ジメチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルの合成］
【0131】
【化21】
【0132】
5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (11３ mg, 0.40 mmol) 、3,4-ジメチルフェニルボロン酸 (120 mg, 0.80 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（PdCl2(PPhe3)2 ：15 mg, 0.02 mmol)を 、ジメチルホルムアミド １ mL、エタノール １mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 0.5 mLを入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-(3,4-ジメチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルを黄色オイル(36 mg, 0.12 mmol, 収率29.2 %)として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.79 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.22-7.14 (m, 2H), 4.17 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.80 (s, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.31 (s,3H), 1.25 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz CDCl3) δC 172.17, 140.24, 136.80, 135.55, 134.75, 133.44, 130.30, 128.80, 127.83, 124.85, 123.70, 122.15, 117.23, 111.37, 109.04, 60.89, 31.49, 20.04, 19.46, 14.35
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.79 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.22-7.14 (m, 2H), 4.17 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.80 (s, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.31 (s,3H), 1.25 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz CDCl3) δC 172.17, 140.24, 136.80, 135.55, 134.75, 133.44, 130.30, 128.80, 127.83, 124.85, 123.70, 122.15, 117.23, 111.37, 109.04, 60.89, 31.49, 20.04, 19.46, 14.35
【0133】
［5-(3,4-ジメチルフェニル）-インドール3-酢酸の合成］
【0134】
【化22】
【0135】
5-(3,4-ジメチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステル (30 mg, 0.098 mmol) を5 mLガラスバイアルにとり、メタノール0.25 mL とテトラヒドロフラン0.25 mL を加えた。これに10 %（W/V）水酸化カリウム水溶液0.25 ｍLを滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌し加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 １ mLと 酢酸エチル 2 mL を加えて抽出した。さらに酢酸エチル 2 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 1 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-（3,4-ジメチルフェニル）-インドール3-酢酸を淡褐色粉末(20 mg, 0.0716 mmol, 収率 73.4 %)として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.46-7.40 (m, 2H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.22-7.14 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.30 (s, 3H),13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.32, 140.13, 136.83, 135.50, 134.83, 133.67, 130.05, 128.83, 127.69, 124.89, 123.91, 122.34, 117.10, 111.45, 108.23, 30.99, 20.03, 19.46.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.46-7.40 (m, 2H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.22-7.14 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.30 (s, 3H),13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.32, 140.13, 136.83, 135.50, 134.83, 133.67, 130.05, 128.83, 127.69, 124.89, 123.91, 122.34, 117.10, 111.45, 108.23, 30.99, 20.03, 19.46.
【0136】
［5-(3-クロロフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルの合成］
【0137】
【化23】
【0138】
5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (11３ mg, 0.40 mmol) 、3-クロロフェニルボロン酸 (128 mg, 0.82 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（PdCl2(PPhe3)2 ：15 mg, 0.02 mmol)を 、ジメチルホルムアミド １ mL、エタノール １mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 0.5 mLを入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-(3-クロロフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルを黄色オイル(25 mg, 0.79 mmol, 収率19.5 %)として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H),7.80 (s, 1H), 7.63 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.53 (dt, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30-7.24 (m, 1H), 7.23 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.81 (s, 2H), 1.27 (t, 7.2 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 171.99, 144.48, 135.96, 134.54, 131.96, 129.90, 127.98, 127.52, 126.38, 125.59, 123.99, 121.98, 117.68, 111.61, 109.29, 60.95, 31.45, 14.34.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H),7.80 (s, 1H), 7.63 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.53 (dt, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30-7.24 (m, 1H), 7.23 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.81 (s, 2H), 1.27 (t, 7.2 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 171.99, 144.48, 135.96, 134.54, 131.96, 129.90, 127.98, 127.52, 126.38, 125.59, 123.99, 121.98, 117.68, 111.61, 109.29, 60.95, 31.45, 14.34.
【0139】
［5-（3-クロロフェニル）-インドール3-酢酸（式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。））の合成]
【0140】
【化24】
【0141】
5-(3-クロロフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステル (38 mg, 0.12 mmol) を5 mLガラスバイアルにとり、メタノール0.25 mL とテトラヒドロフラン0.25 mL を加えた。これに10 %（W/V）水酸化カリウム水溶液0.25 mLを滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌し加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 １ mLと 酢酸エチル 2 mL を加えて抽出した。さらに酢酸エチル 2 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 1 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-（3-クロロフェニル）-インドール3-酢酸を淡褐色粉末(31 mg, 0.11 mmol, 収率 89.6 %)として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.61 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (dt, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.40 (s, 2H), 7.34 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.26-7.28 (m, 1H), 7.20 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.42, 144.36, 135.92, 134.54, 132.15, 129.94, 127.74, 127.54, 126.45, 125.66, 124.26, 122.15, 117.51, 111.73, 108.39, 30.98.
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.61 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (dt, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.40 (s, 2H), 7.34 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.26-7.28 (m, 1H), 7.20 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.42, 144.36, 135.92, 134.54, 132.15, 129.94, 127.74, 127.54, 126.45, 125.66, 124.26, 122.15, 117.51, 111.73, 108.39, 30.98.
【0142】
２．細胞の準備
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）－ＮＬＳ（核移行シグナル）遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」又は「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」と称する）を準備した（図１参照。）。
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）－ＮＬＳ（核移行シグナル）遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」又は「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」と称する）を準備した（図１参照。）。
【0143】
３．オーキシンアナログの添加
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンアナログ（培地中の濃度：０、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）を添加して、２４時間培養した。また、対照として、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンを添加した細胞も準備した。
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンアナログ（培地中の濃度：０、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）を添加して、２４時間培養した。また、対照として、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンを添加した細胞も準備した。
【0144】
４．ＦＡＣＳ解析
各オーキシンアナログの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図２に示す。図２において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、オーキシンアナログ溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した細胞を示す。
各オーキシンアナログの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図２に示す。図２において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、オーキシンアナログ溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した細胞を示す。
【0145】
図２から、オーキシンアナログを添加したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞では、オーキシンを添加したＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞と比較して、低濃度でＧＦＰの分解が観察された。
【0146】
更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞に、低濃度の各オーキシンアナログを処理した。結果を図８に示す。用いたオーキシンアナログの中で、
５－Ｐｈ－ＩＡＡは、１ｎＭおよび１０ｎＭで他の化合物よりより強いｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解誘導の効果を示した。
５－Ｐｈ－ＩＡＡは、１ｎＭおよび１０ｎＭで他の化合物よりより強いｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解誘導の効果を示した。
【0147】
ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理した影響を調べた、図９（Ａ）に示す様に、細胞周期への影響を示さなかった。図９（Ｂ）に示す様に、コロニー形成効率の変化を示さなかった。５－Ｐｈ－ＩＡＡは、効果的なリガンドであり、１μＭでは毒性が無いことが確認された。
【0148】
［実施例３］
１．細胞の準備
ＨＣＴ１１６細胞において、セーフハーバー座位であるＡＡＶＳ１遺伝子座に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子を導入し、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞を構築した。
１．細胞の準備
ＨＣＴ１１６細胞において、セーフハーバー座位であるＡＡＶＳ１遺伝子座に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子を導入し、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞を構築した。
【0149】
２．コロニー形成試験
ｍＡＩＤとＣｌｏｖｅｒとネオマイシン耐性遺伝子を有し、ｍＡＩＤとネオマイシン耐性遺伝子とを挟むように、ＤＨＣ１遺伝子に対して相同な配列を有するプラスミドベクターを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞に導入し、内在性のＤＨＣ１遺伝子と相同組換えを行った。次いで、Ｇ４１８によるセレクションの後、形成されたコロニーを、クリスタルバイオレットを用いて染色した。尚、「ＤＨＣ１」とはｄｙｎｅｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ１の略称であり、ダイニン重鎖１を意味する。結果を図３に示す。
ｍＡＩＤとＣｌｏｖｅｒとネオマイシン耐性遺伝子を有し、ｍＡＩＤとネオマイシン耐性遺伝子とを挟むように、ＤＨＣ１遺伝子に対して相同な配列を有するプラスミドベクターを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞に導入し、内在性のＤＨＣ１遺伝子と相同組換えを行った。次いで、Ｇ４１８によるセレクションの後、形成されたコロニーを、クリスタルバイオレットを用いて染色した。尚、「ＤＨＣ１」とはｄｙｎｅｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ１の略称であり、ダイニン重鎖１を意味する。結果を図３に示す。
【0150】
図３から、ＣＲＩＳＰＲ無しでは、耐性遺伝子が働いていないためコロニーの形成は確認されなかった。ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞では、相同組換えを行った細胞においても、オーキシン非依存的な分解誘導がなされているためか、コロニーの形成は確認されなかった。一方、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞では、相同組換えを行った細胞において、コロニーの形成は確認された。
【0151】
３．分解誘導試験
上記２にて相同組換えを行った、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞（以下、「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する。）を用いて、ＤＨＣ１の分解誘導試験を行った。
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞に、式（Ｉ－２）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を添加し、２４時間後の細胞の様子を観察した（図４（Ａ））。
上記２にて相同組換えを行った、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞（以下、「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する。）を用いて、ＤＨＣ１の分解誘導試験を行った。
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞に、式（Ｉ－２）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を添加し、２４時間後の細胞の様子を観察した（図４（Ａ））。
【0152】
図４（Ａ）に示すように、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加により、ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が分解されることで、分裂期の細胞の蓄積が観察された。
更に、ＤＨＣ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した（図４（Ｂ））。図４（Ｂ）に示すように、相同組換えを行って作製したクローン＃１～３の全てにおいて、５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的に、ＤＨＣ１及びｍＡＩＤの分解が確認された。
更に、ＤＨＣ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した（図４（Ｂ））。図４（Ｂ）に示すように、相同組換えを行って作製したクローン＃１～３の全てにおいて、５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的に、ＤＨＣ１及びｍＡＩＤの分解が確認された。
【0153】
［実施例４］
内在性の標的タンパク質分解系を構築するには、以下３点の難点がある。（１）多くの培養細胞は多倍体化しているため、標的遺伝子のアリルが２コピー以上ある。そのため、様々な培養細胞株でこの分解系を構築することが難しい。（２）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）があらかじめ導入された親株を作成する必要がある。（３）多数の分解系を構築してライブラリー化するには手間がかかる。
内在性の標的タンパク質分解系を構築するには、以下３点の難点がある。（１）多くの培養細胞は多倍体化しているため、標的遺伝子のアリルが２コピー以上ある。そのため、様々な培養細胞株でこの分解系を構築することが難しい。（２）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）があらかじめ導入された親株を作成する必要がある。（３）多数の分解系を構築してライブラリー化するには手間がかかる。
【0154】
係る問題点を解決するために、図５に示す、新たな標的タンパク質分解系を構築した。この分解系では、（１）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－標的遺伝子が、Ｐ２Ａリンカー遺伝子で繋がれたトランスポゾンベクターと、（２）ｇＲＮＡとＣａｓ９遺伝子を含む、内在性の標的遺伝子をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターを含む。
この分解系では、トランスポゾンベクターにより、ゲノム中にＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－標的遺伝子をインテグレートさせる一方で、ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターにより、内在性の標的遺伝子をノックアウトする。
この分解系では、トランスポゾンベクターにより、ゲノム中にＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－標的遺伝子をインテグレートさせる一方で、ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターにより、内在性の標的遺伝子をノックアウトする。
【0155】
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＣＥＮＰＨ又はｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＰＯＬＤ１標的遺伝子が、Ｐ２Ａリンカー遺伝子で繋がれたトランスポゾンベクターを作製し、このベクターを内在性ＣＥＮＰＨ又はＰＯＬＤ１遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターとともにＨｅＬａ細胞へ導入した。係る細胞へ５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加し、標的タンパク質の分解をウエスタンブロッティングにより確認した（図６）。
図６（Ａ）に抗ＣＥＮＰＨ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。内在性のＣＥＮＰＨ遺伝子がノックアウトされていることが確認され、かつ５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的にｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＣＥＮＰＨの分解が確認された。
図６（Ｂ）に抗ＰＯＬＤ１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。クローン＃１～３において、内在性のＰＯＬＤ１遺伝子がノックアウトされていることが確認され、かつ５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的にｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＰＯＬＤ１の分解が確認された。
図６（Ａ）に抗ＣＥＮＰＨ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。内在性のＣＥＮＰＨ遺伝子がノックアウトされていることが確認され、かつ５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的にｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＣＥＮＰＨの分解が確認された。
図６（Ｂ）に抗ＰＯＬＤ１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。クローン＃１～３において、内在性のＰＯＬＤ１遺伝子がノックアウトされていることが確認され、かつ５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的にｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＰＯＬＤ１の分解が確認された。
【0156】
［実施例５］
ＡＩＤ２システムが酵母でも機能することを確認するために、ＧＡＬ１－１０プロモーターの制御下で、ＵＲＡ３遺伝子座に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ、Ｆ７４Ｇ、又はＦ７４Ａ）を導入した（図１２（Ａ）参照。）。その後、必須の複製イニシエーターである、ＭＣＭ１０、ＳＬＤ３、又はＣＤＣ４５をコードする遺伝子にｍＡＩＤタグを付けた。
例えば、図１２（Ｂ）のＯｓＴＩＲ１ ＯＮ、リガンドなし、ｃｄｃ４５－ｍＡＩＤ等に示されるように、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ又はＦ７４Ａ）を発現している酵母株は、遅い増殖を示し、酵母でより高い基底分解があることを示唆した。
更に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ及びＦ７４Ａ）は、５００μＭＩＡＡでこれらｍＡＩＤ導入株の増殖抑制がみられたこのことは、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）がＩＡＡに対する反応性を残していることを示唆している。
すべての場合において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ又はＦ７４Ａ）を発現する株は、５μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを含むプレート上で、強い増殖阻害を示した。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ又はＦ７４Ａ）が発現された場合、ｍｃｍ１０－ｍＡＩＤ株及びｓｌｄ３－ｍＡＩＤ株の増殖が強く阻害されることから、ＡＩＤ２システムがより分解能力が高く、強い表現型を示す変異体を製造できることを示している。
ＡＩＤ２システムが酵母でも機能することを確認するために、ＧＡＬ１－１０プロモーターの制御下で、ＵＲＡ３遺伝子座に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ、Ｆ７４Ｇ、又はＦ７４Ａ）を導入した（図１２（Ａ）参照。）。その後、必須の複製イニシエーターである、ＭＣＭ１０、ＳＬＤ３、又はＣＤＣ４５をコードする遺伝子にｍＡＩＤタグを付けた。
例えば、図１２（Ｂ）のＯｓＴＩＲ１ ＯＮ、リガンドなし、ｃｄｃ４５－ｍＡＩＤ等に示されるように、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ又はＦ７４Ａ）を発現している酵母株は、遅い増殖を示し、酵母でより高い基底分解があることを示唆した。
更に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ及びＦ７４Ａ）は、５００μＭＩＡＡでこれらｍＡＩＤ導入株の増殖抑制がみられたこのことは、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）がＩＡＡに対する反応性を残していることを示唆している。
すべての場合において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ又はＦ７４Ａ）を発現する株は、５μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを含むプレート上で、強い増殖阻害を示した。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ又はＦ７４Ａ）が発現された場合、ｍｃｍ１０－ｍＡＩＤ株及びｓｌｄ３－ｍＡＩＤ株の増殖が強く阻害されることから、ＡＩＤ２システムがより分解能力が高く、強い表現型を示す変異体を製造できることを示している。
【0157】
［実施例６］
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を恒常的に発現するヒトＨＣＴ１１６細胞を材料に、ゲノム編集によりＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞を作製し、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加による効果を確認した。図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、 ＲＡＤ２１－ｍＡＣの発現レベルは、添加前の０分でＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現している細胞よりも、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞の方が高く、従来のＡＩＤシステムのにおける基底分解を示している。
ＲＡＤ２１－ｍＡＣは、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）両方の場合に、リガンドの添加後に急速に消失した。但し、Ｔ１／２は、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）でそれぞれ２６．５分と１１．７分であり、ＲＡＤ２１－ｍＡＣがＡＩＤ２システムによってより速く分解されたことを示している。これらの結果は、ＡＩＤ２システムが、従来のＡＩＤシステムよりもＲＡＤ２１－ｍＡＣをより迅速に制御できることを示している。
ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を恒常的に発現するヒトＨＣＴ１１６細胞を材料に、ゲノム編集によりＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞を作製し、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加による効果を確認した。図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、 ＲＡＤ２１－ｍＡＣの発現レベルは、添加前の０分でＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現している細胞よりも、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞の方が高く、従来のＡＩＤシステムのにおける基底分解を示している。
ＲＡＤ２１－ｍＡＣは、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）両方の場合に、リガンドの添加後に急速に消失した。但し、Ｔ１／２は、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）でそれぞれ２６．５分と１１．７分であり、ＲＡＤ２１－ｍＡＣがＡＩＤ２システムによってより速く分解されたことを示している。これらの結果は、ＡＩＤ２システムが、従来のＡＩＤシステムよりもＲＡＤ２１－ｍＡＣをより迅速に制御できることを示している。
【0158】
ＡＩＤ２システムによる急速なＲＡＤ２１－ｍＡＣ分解の表現型を見るために、細胞周期を調べたところ、ＲＡＤ２１－ｍＡＣ分解細胞の大部分がＧ２／Ｍ期で停止していることが確認された（図１３（Ｃ）参照。）。ＲＡＤ２１－ｍＡＣ分解細胞は、ＲＡＤ２１の本質的な役割と一致して、姉妹染色分体の対合に重大な欠陥を示した（図１３（Ｄ）参照。）。
【0159】
［実施例７］
ＯｓＴＩＲ1（Ｆ７４Ｇ）がより少ない基底分解を示したことに鑑みて、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を恒常的に発現するＨＣＴ１１６細胞で、ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＤＨＣ１－ｍＡＣ）を作製できるかどうか検討した。 ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ又はＦ７４Ｇ）を構成的に発現する親細胞株に、デグロンタグを付加するためのＣＲＩＳＰＲプラスミドと、それぞれネオマイシンまたはハイグロマイシン耐性マーカーを持つ二つのドナーをトランスフェクトした（図１４参照。）。ＯｓＴＩＲ1（Ｆ７４Ｇ）発現細胞において、Ｇ４１８及びハイグロマイシンの存在下で、コロニーは形成され、両アリルでのＤＨＣ１遺伝子にタグが付加された（図１５（Ａ）参照。）。 ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現する細胞では、コロニーは形成されなかった。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するクローンでは、ＤＨＣ１－ｍＡＣは１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡの添加により効率的に分解した（図１５（Ｂ）参照。）。 これらの細胞は有糸分裂で停止し（図１５Ｃ参照。）、有糸分裂紡錘体形成に強い欠陥を示した（図１５（Ｄ）参照。）。これは、ＤＨＣ１が有糸分裂時に形成される紡錘体形成に必須であることと一致している。
ＯｓＴＩＲ1（Ｆ７４Ｇ）がより少ない基底分解を示したことに鑑みて、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を恒常的に発現するＨＣＴ１１６細胞で、ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＤＨＣ１－ｍＡＣ）を作製できるかどうか検討した。 ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ又はＦ７４Ｇ）を構成的に発現する親細胞株に、デグロンタグを付加するためのＣＲＩＳＰＲプラスミドと、それぞれネオマイシンまたはハイグロマイシン耐性マーカーを持つ二つのドナーをトランスフェクトした（図１４参照。）。ＯｓＴＩＲ1（Ｆ７４Ｇ）発現細胞において、Ｇ４１８及びハイグロマイシンの存在下で、コロニーは形成され、両アリルでのＤＨＣ１遺伝子にタグが付加された（図１５（Ａ）参照。）。 ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現する細胞では、コロニーは形成されなかった。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するクローンでは、ＤＨＣ１－ｍＡＣは１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡの添加により効率的に分解した（図１５（Ｂ）参照。）。 これらの細胞は有糸分裂で停止し（図１５Ｃ参照。）、有糸分裂紡錘体形成に強い欠陥を示した（図１５（Ｄ）参照。）。これは、ＤＨＣ１が有糸分裂時に形成される紡錘体形成に必須であることと一致している。
【0160】
更に、シロイヌナズナのＴＩＲ１パラログであるＡｔＡＦＢ２を用いて、ＤＨＣ１－ｍＡＣ変異体が作製できるかどうか検討した。図１５（Ａ）に示されるように、コロニーを得ることができたが、得られたコロニー数は、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）と比較して少なかった。
【0161】
更に、ｍＡＩＤの代わりに、もう1つのデグロンタグであるｍｉｎｉ－ＩＡＡ７（ｍＩＡＡ７）を用いて同様の実験を行った（図１６参照）。図１６（Ｂ）に示す様に、すべての条件において、コロニー形成が確認された。ただし、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞と比較して、コロニー数はＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＡｔＡＦＢ２を発現する細胞の方が少なかった。
ＡｔＡＦＢ２又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞で、ｍＩＡＡ７又はｍＡＩＤタグ付きＤＨＣ１の分解を誘導した（図１６（Ｃ）参照）。図１６（Ｃ）において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）とｍＡＩＤタグの組み合わせが、最も効率的であることが確認された。これは、図１６（Ａ）に示す様に、ｍＩＡＡ７の長さが短いため、及び／又はｍＩＡＡ７のユビキチン化に必要なリジン残基が少ないために、ＩＡＡによる３成分複合体の形成効率が落ちるためと考えられる。
ＡｔＡＦＢ２又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞で、ｍＩＡＡ７又はｍＡＩＤタグ付きＤＨＣ１の分解を誘導した（図１６（Ｃ）参照）。図１６（Ｃ）において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）とｍＡＩＤタグの組み合わせが、最も効率的であることが確認された。これは、図１６（Ａ）に示す様に、ｍＩＡＡ７の長さが短いため、及び／又はｍＩＡＡ７のユビキチン化に必要なリジン残基が少ないために、ＩＡＡによる３成分複合体の形成効率が落ちるためと考えられる。
【0162】
［実施例８］
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を恒常的に発現するＨＣＴ１１６細胞を使用しては、ＡＩＤ細胞株を作製することが困難であった、コンデンシン複合体のサブユニットＳＭＣ２、インシュレータータンパク質ＣＴＣＦ、及びＲＮＡ ポリメラーゼ ２ 最大サブユニット（ＰＯＬＲ２Ａ）について、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現する細胞で、細胞株を作製できるか検討した。図１７に示すように、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現しているＨＣＴ１１６内の内因性ＳＭＣ２、ＣＴＣＦ、及びＰＯＬＲ２Ａの両アリルにタグを付加できることが確認された。これらの細胞株では、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡの添加によりｍＡＩＤ融合ターゲットが急速に分解された。これらの結果により、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現する細胞を使用するＡＩＤ２システムが、元のＡＩＤシステムを使用して細胞株を作製することが不可能な遺伝子に対しても作製できることが確認された。
ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を恒常的に発現するＨＣＴ１１６細胞を使用しては、ＡＩＤ細胞株を作製することが困難であった、コンデンシン複合体のサブユニットＳＭＣ２、インシュレータータンパク質ＣＴＣＦ、及びＲＮＡ ポリメラーゼ ２ 最大サブユニット（ＰＯＬＲ２Ａ）について、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現する細胞で、細胞株を作製できるか検討した。図１７に示すように、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現しているＨＣＴ１１６内の内因性ＳＭＣ２、ＣＴＣＦ、及びＰＯＬＲ２Ａの両アリルにタグを付加できることが確認された。これらの細胞株では、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡの添加によりｍＡＩＤ融合ターゲットが急速に分解された。これらの結果により、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現する細胞を使用するＡＩＤ２システムが、元のＡＩＤシステムを使用して細胞株を作製することが不可能な遺伝子に対しても作製できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0163】
本発明のオーキシンデグロンシステムによれば、オーキシン非依存的な標的タンパク質の分解を阻害することができるため、厳密かつ自在に標的タンパク質の分解制御が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】