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特開2024-10393クリ属植物の渋皮剥皮性を判定する方法、及びクリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024010393
(43)【公開日】2024-01-24
(54)【発明の名称】クリ属植物の渋皮剥皮性を判定する方法、及びクリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20240117BHJP
A01H 6/00 20180101ALI20240117BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
A01H6/00 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022111709
(22)【出願日】2022-07-12
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、農林水産省、「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発委託事業」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100211199
【弁理士】
【氏名又は名称】原田 さやか
(72)【発明者】
【氏名】寺上 伸吾
(72)【発明者】
【氏名】西尾 聡悟
(72)【発明者】
【氏名】高田 教臣
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 寿広
(72)【発明者】
【氏名】竹内 由季恵
(72)【発明者】
【氏名】加藤 秀憲
【テーマコード（参考）】
2B030
4B063
【Ｆターム（参考）】
2B030AA03
2B030AB03
2B030AD20
2B030CA05
2B030CB02
4B063QA08
4B063QQ04
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物の渋皮剥皮性を判定する新規な方法、及び渋皮剥皮性判定に用いる新規プライマーセットを提供すること。
【解決手段】
クリ属植物における渋皮剥皮性を判定する方法であって、クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む、方法。
【選択図】なし
【解決手段】
クリ属植物における渋皮剥皮性を判定する方法であって、クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物における渋皮剥皮性を判定する方法であって、
クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む、方法。
クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む、方法。
【請求項2】
１対の相同染色体の両方において、前記増幅されるＤＮＡ領域の長さが、３６６塩基長～３６８塩基長である場合に、前記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
１対の相同染色体の両方において、前記増幅されるＤＮＡ領域の長さが、３６７塩基長である場合に、前記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
クリ属植物のＤＮＡにおける、前記増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することが、
前記増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するためのプライマーセットを用いて、クリ属植物のＤＮＡを増幅する工程、並びに
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するためのプライマーセットを用いて、クリ属植物のＤＮＡを増幅する工程、並びに
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記プライマーセットが、
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド配列からなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、請求項４に記載の方法。
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド配列からなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して、同一又は違いが１塩基長のみである場合に前記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、請求項４に記載の方法。
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して、同一又は違いが１塩基長のみである場合に前記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して同一である場合に、前記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、請求項４に記載の方法。
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して同一である場合に、前記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法により渋皮剥皮性を判定することを含む、クリ属植物の作出方法。
【請求項9】
請求項４に記載の方法により渋皮剥皮性を判定することを含む、クリ属植物の作出方法。
【請求項10】
配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するための、クリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセット。
【請求項11】
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含む、請求項１０に記載のプライマーセット。
【請求項12】
請求項９に記載の方法により得られるクリ属植物。
【請求項13】
請求項１２に記載のクリ属植物から得られた果実又は種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クリ属植物の渋皮剥皮性を判定する方法、及びクリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセットに関する。
【背景技術】
【0002】
ニホングリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．）は、チュウゴクグリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ）やヨーロッパグリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｓａｔｉｖａ）と比較して果実は大きいものの、渋皮が果肉から剥がれにくいという欠点を有している。そのため、家庭消費や加工利用への障害となっており、近年は天津甘栗などに代表されるチュウゴクグリ加工品の輸入が増加する一方で、ニホングリの消費は大きく減少している。よって、渋皮剥皮性を改良することがニホングリの最大の育種目標とされている。「ぽろたん」に続き「ぽろすけ」が育成されたことにより、渋皮がむけやすいニホングリの収穫期間は拡大されたが、どちらも早生品種であり、中生及び晩生品種の育成が望まれている。このような事情から、易渋皮剥皮性を有するクリ属植物をＤＮＡマーカーにより選抜することで、育種の効率化が求められている。
【0003】
ニホングリの渋皮剥皮性については、遺伝様式が明らかとなっており（非特許文献１）、主働一遺伝子によって制御されていることが分かっており、渋皮剥皮性と連鎖するマーカーについても開発されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Takada et al., “Inheritance of the Easy-peeling Pellicle Trait of Japanese ChestnutCultivar Porotan”, HortScience, (2012) Volume 47(7) :845-847
【非特許文献2】Nishio et al., “Mapping andpedigree analysis of the gene that controls the easy peel pellicle trait inJapanese chestnut (Castanea crenata Sieb. et Zucc.)”, Tree Genetics &Geneomes, (2013) Volume 9: 723-730
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、ニホングリ育種における渋皮剥皮性の評価法では、播種後圃場に定植し、樹を大きく育てて結実させた果実を用いる必要がある。このため、育種圃場には、渋皮が剥けにくい実生を含む多数の実生を維持・管理する必要がある。
【0006】
また、渋皮剥皮性を制御する遺伝子座（ｐｅｅｌｉｎｇ（ｐｅｌｌｉｃｌｅ－ｐｅｅｌｉｎｇ ｌｏｃｕｓやｐ ｌｏｃｕｓと表現される場合もある。））と連鎖する既存のＤＮＡマーカーは、渋皮剥皮性を制御する遺伝子座との距離があるため、易渋皮剥皮性実生を選抜しても、難渋皮剥皮性実生が含まれてしまうことがある。また、連鎖マーカーの遺伝子型が渋皮剥皮性の表現型及び遺伝子型と対応していないことから、交配組合せによっては両親間にマーカーの多型性がなく、そもそもマーカー選抜が行えないという問題があった。
【0007】
このような状況を鑑み、本発明は、クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物の渋皮剥皮性を判定する新規な方法、及び渋皮剥皮性判定に用いる新規プライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、高精度に渋皮剥皮性判定が可能な染色体ＤＮＡマーカーを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物における渋皮剥皮性を判定する方法であって、
クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む、方法。
［２］
１対の相同染色体の両方において、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さが、３６６塩基～３６８塩基である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［１］に記載の方法。
［３］
１対の相同染色体の両方において、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さが３６７塩基長である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［２］に記載の方法。
［４］
クリ属植物のＤＮＡにおける、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することが、
上記増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するためのプライマーセットを用いて、クリ属植物のＤＮＡを増幅する工程、並びに
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記プライマーセットが、
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、［４］に記載の方法。
［６］
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して、同一又は違いが１塩基長分のみである場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
易渋皮剥皮性品種が、ぽろたん、ぽろすけ及び奴からなる群から選択される、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載の方法により渋皮剥皮性を判定することを含む、クリ属植物の作出方法。
［１０］
配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出ための、クリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセット。
［１１］
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含む、［１０］に記載のプライマーセット。
［１２］
［９］に記載の方法により得られるクリ属植物。
［１３］
［１２］に記載のクリ属植物から得られた果実又は種子。
［１］
クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物における渋皮剥皮性を判定する方法であって、
クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む、方法。
［２］
１対の相同染色体の両方において、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さが、３６６塩基～３６８塩基である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［１］に記載の方法。
［３］
１対の相同染色体の両方において、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さが３６７塩基長である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［２］に記載の方法。
［４］
クリ属植物のＤＮＡにおける、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することが、
上記増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するためのプライマーセットを用いて、クリ属植物のＤＮＡを増幅する工程、並びに
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記プライマーセットが、
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、［４］に記載の方法。
［６］
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して、同一又は違いが１塩基長分のみである場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、
１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含む、［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
易渋皮剥皮性品種が、ぽろたん、ぽろすけ及び奴からなる群から選択される、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載の方法により渋皮剥皮性を判定することを含む、クリ属植物の作出方法。
［１０］
配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出ための、クリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセット。
［１１］
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含む、［１０］に記載のプライマーセット。
［１２］
［９］に記載の方法により得られるクリ属植物。
［１３］
［１２］に記載のクリ属植物から得られた果実又は種子。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ニホングリ易渋皮剥皮性アレルを有する実生を、ＤＮＡマーカーにより早期に識別することができる。
【0011】
また、従来の連鎖マーカーよりも原因遺伝子座（Ｐｅｅｌｉｎｇ遺伝子座）の近くに座乗するマーカーであることから、より高精度に選抜が可能である。さらに、増幅産物長と渋皮剥皮性アレルとの間に相関が見られることから、渋皮剥皮性の遺伝子型を推定することが可能となる。
【0012】
本発明により、ニホングリ易渋皮剥皮性アレルを有する実生個体を高精度に幼苗選抜できることから、従来育種や既存の連鎖マーカーと比較して育種選抜に要する時間が大幅に短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】「ぽろたん」、「丹沢」、「国見」、及び「石鎚」の関係、渋皮剥皮性の表現型及び遺伝子型を示す図である。図中、（易）は易渋皮剥皮性、（難）は難渋皮剥皮性を意味する。
【図2】「ぽろたん」×クリ筑波４３号の集団から構築された連鎖地図（ＬＧ．１、第１染色体）におけるｐｅｅｌｉｎｇ遺伝子座、既存マーカー（ＰＲＤ５２、ＰＲＤ５８）及び新規マーカー（ＣｍＳｃａ０６７１６）の位置関係を示す図である。数値はマーカー間の遺伝距離（ｃＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
クリ属植物とは、ブナ科クリ亜科クリ属植物を意味する。クリ属植物には、例えば、ニホングリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．）、チュウゴクグリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ）、アメリカグリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｄｅｎｔａｔａ）、及びヨーロッパグリ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｓａｔｉｖａ）が挙げられる。本実施形態の方法は、渋皮が果実から剥がれにくい傾向のあるニホングリで特に有効であることから、クリ属植物は、ニホングリ又はニホングリ由来であることが好ましい。
【0015】
本明細書において、「植物」は、特段の限定がない限り、植物全体、植物細胞、植物プロトプラスト、植物カルス、又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、配偶子、種子、葉、花、枝、果実、茎、根、葯等を含む。なお、クリ属植物において、イガは総苞といい、他の果実でいう皮に該当する。また、鬼皮は他の果実でいう果肉に該当し、渋皮とそれより内部の子実（果肉）は種子に該当する。本明細書において「クリ果実」は、特段の限定がない限り、鬼皮、渋皮及び果肉を含む部分を意味する。本明細書において「実生」は、交雑等によって得られた種子から発芽した植物を意味する。
【0016】
渋皮剥皮性は、加熱後のクリ果実における渋皮の剥け易さを意味する。渋皮剥皮性は、加熱したクリ果実において渋皮を剥皮できるか否かで判断することができる。加熱前に果実の鬼皮に対してナイフ等の刃物で切れ目（例えば、深さ３．５ｍｍ、長さ２ｃｍ～３／４週）を入れ、加熱したクリ果実においてナイフ等を使用して手で渋皮を剥皮できるものを易渋皮剥皮性、渋皮が剥皮できないものを難渋皮剥皮性とすることができる。加熱は、例えば、沸騰したお湯を用いて２～３分で行ってもよく、オーブントースター（例えば、５００Ｗ～８００Ｗ又は６００Ｗ）を用いて７～１５分で行ってもよい。
【0017】
易渋皮剥皮性の品種としては、特に限定されないが、例えば、ニホングリ品種である、「ぽろたん」（農林認定品種登録番号：くり農林８号、品種登録の番号：１５６５８）、「ぽろすけ」（品種登録の番号：２６８２８）及び「奴」が挙げられる。易渋皮剥皮性は単一遺伝子座における劣性（潜性）の主働遺伝子ｐによって支配されており、これがホモ型（ｐｐ）となった場合に易渋皮剥皮性となる。
【0018】
難渋皮剥皮性品種としては、特に限定されないが、例えば、「丹沢」、「国見」、「筑波」及び「石鎚」が挙げられる。「丹沢」及び「国見」は上記劣性の主働遺伝子をヘテロ型（Ｐｐ）に有する。「筑波」及び「石鎚」は上記劣性の主働遺伝子をもたず、遺伝子型はＰＰである。
【0019】
＜クリ属植物の渋皮剥皮性判定方法＞
本発明は一実施形態として、クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物における渋皮剥皮性を判定する方法を提供する。本実施形態の方法は、クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む。判定する対象であるクリ属植物は、例えば、交配後代クリ属植物であってもよく、ニホングリ又はニホングリに由来するクリ属植物の交配後代クリ属植物であってもよい。
本発明は一実施形態として、クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）植物における渋皮剥皮性を判定する方法を提供する。本実施形態の方法は、クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することを含む。判定する対象であるクリ属植物は、例えば、交配後代クリ属植物であってもよく、ニホングリ又はニホングリに由来するクリ属植物の交配後代クリ属植物であってもよい。
【0020】
本発明は、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さを指標（ぽろたんでは、３６７ｂｐ）として、渋皮剥皮性を判定することができるという発見に基づくものである。上記ＤＮＡ領域には、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ）が含まれる。配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを以下に示す。
フォワードプライマー ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡ（５’→３’、配列番号１）
リバースプライマー ＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧ（５’→３’、配列番号２）
フォワードプライマー ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡ（５’→３’、配列番号１）
リバースプライマー ＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧ（５’→３’、配列番号２）
【0021】
上記「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅」する際のＤＮＡ増幅反応としては、上記プライマー対を用いてＰＣＲで増幅できる限り特に制限されないが、例えば、非等温条件下での増幅反応であるＰＣＲ法や、これを応用したリアルタイムＰＣＲ法等であってよい。例えば、被験クリ属植物からＤＮＡ抽出し、そのＤＮＡを鋳型として上記プライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅することであってよい。ＤＮＡ増幅反応を行う際の反応液組成、温度サイクル条件の温度及び反応時間等は、核酸増幅法の種類、プライマーのＴｍ値、使用する機器の仕様等を考慮して当業者が適宜設定することができる。ＰＣＲ法の場合、例えば、反応液は、鋳型及び上記プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼの他、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン、１以上の塩類、トリスバッファ（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ）、ＥＤＴＡ、グリセロール及びｐＨバッファからなる群から選択される１以上を含んでいてもよい。また、例えば、９０℃～９８℃で３０秒～１８０秒間の初期変性工程後、９０℃～９８℃で５秒～１８０秒間の変性工程、５５℃～６８℃で１０秒～６０秒間のアニーリング工程及び７０℃～７５℃で３０秒～７００秒の伸長工程を１サイクルとして、２０サイクル～５０サイクル行い、６８℃～７２℃で１２０秒～３６０秒の最終伸長工程を行う条件で核酸増幅反応を実施してもよい。また、例えば、９５℃～９８℃で６０秒～１２０秒の初期変性工程後、９５℃～９８℃で２０秒～３０秒間の変性工程、５５℃～６０℃で２０秒～３０秒間のアニーリング工程及び７０℃～７５℃で３０秒～６０秒の伸長工程を１サイクルとして、３８サイクル～４２サイクル行い、６８℃～７２℃で２４０秒～３００秒の最終伸長工程を行う条件で核酸増幅反応を実施してもよい。配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲでＤＮＡ領域が増幅していることは、例えば、アガロースゲル電気泳動、フラグメント解析、ＤＮＡシーケンシングにより確認できる。増幅したＤＮＡ断片の長さは、例えば、分子量マーカーとの比較や、フラグメント解析、ＤＮＡシーケンシングにより確認することができる。例えば、得られた増幅産物は、適切な機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ等のＤＮＡシーケンサー）で分析してもよい。また、遺伝子型を判定する解析は、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて行ってもよい。この方法によれば、アガロースゲル電気泳動により目視で判断できない数塩基の差異も確認することができる。
【0022】
本明細書において、ヌクレオチド塩基の一文字コードは、国際純正・応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の定める塩基表記に従い使用している。プライマーは、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ若しくは類似体、又は縮重塩基（Ｍ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｋ）からなっていてよい。
【0023】
本明細書において、「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのＤＮＡ塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全ＤＮＡ塩基配列に対する同一塩基の割合（％）を意味する。アラインメントの作成及び配列同一性の算出には、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ提供 ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）を用いることができる。
【0024】
渋皮剥皮性の判定は、易渋皮剥皮性品種又は難渋皮剥皮性品種と比較して行ってもよく、所定の基準値に基づき行ってもよい。
【0025】
易渋皮剥皮性は単一遺伝子座における劣性の主働遺伝子ｐによって支配されており、これがホモ型（ｐｐ）となった場合に易渋皮剥皮性となることから、易渋皮剥皮性となるには、上記は１対（２本）の相同染色体のうちの両方において該当しなくてはならない。すなわち、クリ属植物において、２本の相同染色体のうちの１本の「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び、配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さが易渋皮剥皮性品種の当該ＤＮＡ領域と同一であっても、もう１本のＤＮＡ領域が難渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域と同一である場合には、当該クリ属植物は易渋皮剥皮性ではなく、難渋皮剥皮性となる。
【0026】
例えば、１対の相同染色体の両方において、判定するクリ属植物（被験クリ属植物）の「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び、配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さが、易渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域と比較して同一又は違いが１塩基長分のみである場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。また、例えば、１対の相同染色体の両方において、上記ＤＮＡ領域の長さが、易渋皮剥皮性品種と同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。例えば、１対の相同染色体の両方において、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さが、３６６塩基～３６８塩基である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含んでもよく、１対の相同染色体の両方において、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さが３６７塩基長である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。
【0027】
また、例えば、１対の相同染色体の少なくとも一方において、判定するクリ属植物の「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び、配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さが、易渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域と比較して３塩基長以上異なる場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性ではない、又は難渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。３塩基長以上異なる場合とは、例えば、４塩基長以上、５塩基長以上、６塩基長以上異なる場合であってもよく、３塩基長以上短い又は４塩基長以上短い、５塩基長以上短い、又は６塩基長以上短い場合であってもよい。
【0028】
また、例えば、１対の相同染色体の少なくとも一方において、判定するクリ属植物の「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び、配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さが、難渋皮剥皮性品種と比較して同一又は違いが１塩基長分のみである場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性ではない、又は難渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。１対の相同染色体の少なくとも一方において、上記ＤＮＡ領域の長さが、難渋皮剥皮性品種と比較して同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性ではない、又は難渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。ここで、難渋皮剥皮性品種の相同染色体間において、当該ＤＮＡ領域の長さに違いがある場合には、より短い方のＤＮＡ領域の長さと比較する。
【0029】
易渋皮剥皮性品種又は難渋皮剥皮性品種と比較する場合には、例えば、上記ＤＮＡ領域を挟み込むプライマーを設計し、判定するクリ属植物のＤＮＡと、易渋皮剥皮性品種のＤＮＡ及び／又は難渋皮剥皮性品種のＤＮＡをそれぞれ用いてＤＮＡ増幅し、クリ属植物の増幅産物の長さと、易渋皮剥皮性品種の増幅産物の長さ及び／又は難渋皮剥皮性品種の増幅産物の長さを比較してもよい。
【0030】
易渋皮剥皮性品種である「ぽろたん」及び「奴」において、１対の相同染色体の両方における「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さは３６７塩基長である。したがって、易渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域は、例えば、３６６塩基長～３６８塩基長であってよく、３６７塩基長であってもよい。
【0031】
難渋皮剥皮性品種である「丹沢」において、１対の相同染色体の一方における「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さは３６３塩基長であり、もう一方における当該ＤＮＡ領域の長さは３６７塩基長である。そのため、「丹沢」を難渋皮剥皮性品種として用いる場合には、当該ＤＮＡ領域の長さはより短い方である３６３塩基長を基準とする。「国見」において、１対の相同染色体の一方における「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さは３５９塩基長であり、もう一方における当該ＤＮＡ領域の長さは３６７塩基長である。そのため、「国見」を難渋皮剥皮性品種として用いる場合には、当該ＤＮＡ領域の長さはより短い方である３５９塩基長を基準とする。「筑波」において、１対の相同染色体の両方における「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さは３５９塩基長であり、もう一方における当該ＤＮＡ領域の長さは３７９塩基長である。そのため、「筑波」を難渋皮剥皮性品種として用いる場合には、当該ＤＮＡ領域の長さは３５９塩基長を基準とする。「石鎚」において、１対の相同染色体の一方における「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さは３５９塩基長であり、もう一方における当該ＤＮＡ領域の長さは３７９塩基長である。そのため、「石鎚」を難渋皮剥皮性品種として用いる場合には、当該ＤＮＡ領域の長さはより短い方である３５９塩基長を基準とする。したがって、難渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域（相同染色体間において、当該ＤＮＡ領域の長さに違いがある場合には、より短い方）は、例えば、３５８塩基長～３６４塩基長であってよく、３５９塩基長～３６３塩基長であってよく、３５９塩基長または３６３塩基長であってもよい。
【0032】
所定の基準値に基づき渋皮剥皮性の判定をする場合には、例えば、１対の相同染色体の両方において、判定するクリ属植物のＤＮＡ領域の長さが、所定の基準値と比較して同一又は違いが１塩基長のみである場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。また、例えば、１対の相同染色体の両方において、上記ＤＮＡ領域の長さが、所定の基準値と比較して同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。また、例えば、１対の相同染色体の少なくとも一方において、判定するクリ属植物のＤＮＡ領域の長さが、所定の基準値と比較して３塩基長以上異なる場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性ではない、又は難渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。３塩基長以上異なる場合とは、例えば、４塩基長以上、５塩基長以上、６塩基長以上異なる場合であってもよく、３塩基以上短い又は４塩基長以上短い、５塩基長以上短い、又は６塩基長以上短い場合であってもよい。これらの場合の所定の基準値は、易渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域に基づいて設定されたものであってよく、例えば、３６６塩基長～３６８塩基長であってよく、３６７塩基長であってもよい。基準値は複数の易渋皮剥皮性品種の平均値から定めたものであってもよい。
【0033】
また、例えば、１対の相同染色体の少なくとも一方において、判定するクリ属植物のＤＮＡ領域の長さが、所定の基準値と比較して同一又は違いが１塩基長分のみである場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性ではない、又は難渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。１対の相同染色体の少なくとも一方において、上記ＤＮＡ領域の長さが、所定の基準値と比較して同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性ではない、又は難渋皮剥皮性であると判定することを含んでいてもよい。これらの場合の所定の基準値は、難渋皮剥皮性品種における当該ＤＮＡ領域に基づいて設定されたものであってよく、例えば、３５８塩基長～３６４塩基長であってよく、３５９塩基長～３６３塩基長であってよく、３５９塩基長または３６３塩基長であってもよい。基準値は複数の難渋皮剥皮性品種の平均値から定めたものであってもよい。
【0034】
本実施形態の方法においては、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さに基づいて渋皮剥皮性を判定すればよく、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の記載において配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーはあくまでも当該ＤＮＡ領域を特定するために使用されているものであり、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマー以外のプライマーを用いて判定することを除外するものではない。本実施形態の方法は、例えば、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の周辺の領域（例えば、外側の領域）を含めて判定してもよく、例えば、上記ＤＮＡ領域の長さに基づいて渋皮剥皮性を判定することは、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の５’側及び／又は３’側の領域を含めて判定してもよい。したがって、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さを検出するためのプライマーセットは、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」よりも外側の領域を含め、当該領域を挟み込むように設計してもよい。
【0035】
本実施形態の方法において、例えば、クリ属植物のＤＮＡにおける、「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さに基づき、渋皮剥皮性を判定することは、上記増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するためのプライマーセットを用いて、被験クリ属植物のＤＮＡを増幅する工程、並びにＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程を含むものであってもよい。ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程は、例えば、１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して、同一又は違いが１塩基長分のみである場合に上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含むものであってよく、ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程が、１対の相同染色体の両方において、ＤＮＡ増幅産物の増幅長が、易渋皮剥皮性品種と比較して同一である場合に、上記クリ属植物は易渋皮剥皮性であると判定することを含むものであってもよい。
【0036】
各プライマーの長さは、目的のＤＮＡ領域を増幅可能である限り特に制限されないが、例えば、１５塩基～５０塩基、１８塩基～５０塩基、１９塩基～４５塩基、２０塩基～４０塩基、２０塩基～３０塩基等であってよく、各プライマーにおけるクリ属植物のゲノム配列に基づく配列は、１０塩基～３０塩基、１５塩基～２５塩基、１８塩基～２０塩基等であってもよい。
【0037】
「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」の長さを検出するためのプライマーセットは、例えば、配列番号１に示す配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２に示す配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含むものであってよく、配列番号１に示す配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を３’末端側に有するヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２に示す配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を３’末端側に有するヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセットであってもよい。
【0038】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の配列に対する配列同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％であってもよい。また、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列及び／又は配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列は、例えば、１９塩基長～２１塩基長であってよく、２０塩基長であってもよい。また、各プライマーは、特定の配列である塩基配列、又はその３’末端若しくは５’末端に０～５個、１～４個、１～３個、１～２個、若しくは１個のヌクレオチド付加若しくは欠失を含む塩基配列を含むものであってもよい。
【0039】
配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を３’末端側に有するヌクレオチドからなるプライマーは、３’末端側がこの配列になっていればよく、５’側にさらにヌクレオチド配列等を含んでいてよい。配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を３’末端側に有するヌクレオチドからなるプライマーも同様に、３’末端側がこの配列になっていればよく、５‘側にさらにヌクレオチド配列等を含んでいてよい。例えば、フォワードプライマーは、
５’－（さらなるヌクレオチド配列等）ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号１）－３’であってよく、
リバースプライマーは
５’－（さらなるヌクレオチド配列等）ＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号２）－３’
であってもよい。
５’－（さらなるヌクレオチド配列等）ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号１）－３’であってよく、
リバースプライマーは
５’－（さらなるヌクレオチド配列等）ＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号２）－３’
であってもよい。
【0040】
さらなるヌクレオチド配列は、クリ属植物のゲノム配列に基づくものであってもよく、ゲノム配列と無関係の配列であってもよい。さらなるヌクレオチド配列を有するプライマーを用いた場合には、さらなるヌクレオチド配列の分増幅産物の長さが長くなる。例えば、配列番号３に示すフォワードヌクレオチドからなるプライマー及び配列番号４に示すヌクレオチドからなるリバースプライマーを用いた場合、それぞれクリ属ゲノム配列よりもユニバーサル配列の２０ｂｐ及びｐｉｇ－ｔａｉｌ配列の７ｂｐ分長いため、増幅産物の長さもクリ属ゲノム配列より２７ｂｐ分長くなる。
【0041】
本実施形態において、クリ属植物のＤＮＡを増幅する際のＤＮＡ増幅反応としては、特に制限されないが、例えば、非等温条件下での増幅反応であるＰＣＲ法や、これを応答したリアルタイムＰＣＲ法等であってよい。例えば、被験クリ属植物からＤＮＡ抽出し、そのＤＮＡを鋳型としてプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅することであってよい。ＤＮＡはクリ属植物の葉等から常法により抽出することができる。ＤＮＡ増幅反応を行う際の反応液組成、温度サイクル条件の温度及び反応時間等は、核酸増幅法の種類、プライマーのＴｍ値、使用する機器の仕様等を考慮して当業者が適宜設定することができる。ＰＣＲ法の場合、例えば、反応液は、鋳型及び上記プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼの他、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン、１以上の塩類、トリスバッファ（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ）、ＥＤＴＡ、グリセロール及びｐＨバッファからなる群から選択される１以上を含んでいてもよい。また、例えば、９０℃～９８℃で５秒～１８０秒間の変性工程の後、５５℃～６８℃で１０秒～６０秒間のアニーリング工程、７０℃～７５℃で３０秒～７００秒の伸長工程を１サイクルとして、２０サイクル～５０サイクル行う条件で核酸増幅反応を実施してもよい。「配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域」が増幅していることは、例えば、アガロースゲル電気泳動、フラグメント解析、ＤＮＡシーケンシングにより確認できる。増幅したＤＮＡ断片の長さは、例えば、分子量マーカーとの比較や、ＤＮＡシーケンシングにより確認することができる。
【0042】
各プライマーは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、又は化学的手段により検出可能な標識を有するものであってもよい。検出可能な標識としては、例えば、標識アビジン（例えば、蛍光標識ストレプトアビジン）で検出するビオチン、ハプテン、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド及びローダミン）、電子密度試薬、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ）、及び放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ及び１２５Ｉ）が挙げられる。標識は、例えば、プライマーの配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列又は配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列よりも５’末側に標識を有していてもよく、リンカーを介して標識されていてもよい。
【0043】
ＤＮＡ増幅産物の増幅長に基づき、渋皮剥皮性を判定する工程は、上述したように渋皮剥皮性を判定する工程である。判定はヒトが行ってもよいし、ソフトウェアや機器が行うように設定してもよい。本実施形態の方法は、さらに、判定結果を表示する工程を含んでもよい。判定を行うのはソフトウェアや機器である場合には、判定結果はＰＣ又は機器の画面上に表示されてもよい。
【0044】
＜クリ属植物の作出方法＞
本発明は、一実施形態として、上述した判定方法により渋皮剥皮性を判定することを含む、クリ属植物の作出方法も提供する。クリ属植物の作出方法は、さらに、易渋皮剥皮性であると判定されたクリ属植物を選抜することを含んでもよい。上述したように、易渋皮剥皮性は単一遺伝子座における劣性の主働遺伝子ｐによって支配されており、これがホモ型（ｐｐ）となった場合に易渋皮剥皮性となる。ホモ型ｐｐを有するクリ属植物を選抜することで、易渋皮剥皮性のクリ属植物を作出することができる。判定する対象であるクリ属植物は、交配後代クリ属植物であってよく、ニホングリ又はニホングリに由来するクリ属植物の交配後代クリ属植物であってもよい。交配後代クリ属植物は、相同染色体の少なくとも一方にｐを含む（すなわち、ホモ型ｐｐ又はヘテロ型Ｐｐ）クリ属植物を交配することにより得られた雑種第１代（Ｆ１）であってもよく、さらなる交配により得られた雑種第２代（Ｆ２）以降の植物、例えば、Ｆ３、Ｆ４であってもよく、例えば、Ｆ１を易渋皮剥皮性であるクリ属植物と戻し交配をした第１代（ＢＣ１）であってもよく、さらに戻し交配をした第２代（ＢＣ２）以降の植物であってもよい。
本発明は、一実施形態として、上述した判定方法により渋皮剥皮性を判定することを含む、クリ属植物の作出方法も提供する。クリ属植物の作出方法は、さらに、易渋皮剥皮性であると判定されたクリ属植物を選抜することを含んでもよい。上述したように、易渋皮剥皮性は単一遺伝子座における劣性の主働遺伝子ｐによって支配されており、これがホモ型（ｐｐ）となった場合に易渋皮剥皮性となる。ホモ型ｐｐを有するクリ属植物を選抜することで、易渋皮剥皮性のクリ属植物を作出することができる。判定する対象であるクリ属植物は、交配後代クリ属植物であってよく、ニホングリ又はニホングリに由来するクリ属植物の交配後代クリ属植物であってもよい。交配後代クリ属植物は、相同染色体の少なくとも一方にｐを含む（すなわち、ホモ型ｐｐ又はヘテロ型Ｐｐ）クリ属植物を交配することにより得られた雑種第１代（Ｆ１）であってもよく、さらなる交配により得られた雑種第２代（Ｆ２）以降の植物、例えば、Ｆ３、Ｆ４であってもよく、例えば、Ｆ１を易渋皮剥皮性であるクリ属植物と戻し交配をした第１代（ＢＣ１）であってもよく、さらに戻し交配をした第２代（ＢＣ２）以降の植物であってもよい。
【0045】
本作出方法は、例えば、易渋皮剥皮性のクリ属植物と易渋皮剥皮性のクリ属植物を交配することを含んでもよく、易渋皮剥皮性のクリ属植物と難渋皮剥皮性のクリ属植物（ヘテロ型Ｐｐ）を交配することを含んでもよく、難渋皮剥皮性のクリ属植物（ヘテロ型Ｐｐ）と難渋皮剥皮性のクリ属植物（ヘテロ型Ｐｐ）を交配することを含んでもよい。易渋皮剥皮性のクリ属植物及び難渋皮剥皮性のクリ属植物としては、既に渋皮剥皮性は分かっている品種を用いてもよいし、上述した方法により渋皮剥皮性を判定したクリ属植物を用いてもよい。また、選抜した後、さらに交配をしてもよい。例えば、より優れた形質を有する交配後代植物を得るために、例えば、近親交配、戻し交配及び連続戻し交配等を行ってもよい。例えば、選抜した易渋皮剥皮性のクリ属植物植物をさらに易渋皮剥皮性のクリ属植物又は難渋皮剥皮性のクリ属植物（ヘテロ型Ｐｐ）と交配してもよい。
【0046】
本実施形態による方法により、クリ属植物、特に易渋皮剥皮性のクリ属植物を得ることができる。このクリ属植物が実生等である場合には、さらに生長させることで果実又は種子等を得ることもできる。
【0047】
本実施形態に係るに作出方法おける具体的な態様等は、判別方法の説明を含む、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。
【0048】
＜クリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセット＞
本発明は、一実施形態として、クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するための、クリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセットも提供する。そのようなプライマーセットとしては、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。例えば、プライマーセットは、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含むものであってよく、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）を有するプライマーをさらに含むものであってもよい。この場合、フォワードプライマーにおけるゲノム配列に相補的な配列（例えば、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列）又はリバースプライマーにおけるゲノム配列に相補的な配列（例えば、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列）よりも５’末側に、当該検出可能な標識を含んでいてもよい。配列番号１及び配列番号２に対する配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
本発明は、一実施形態として、クリ属植物のＤＮＡにおける、配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲで増幅されるＤＮＡ領域の長さを検出するための、クリ属植物の渋皮剥皮性判定用プライマーセットも提供する。そのようなプライマーセットとしては、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。例えば、プライマーセットは、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含むものであってよく、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）を有するプライマーをさらに含むものであってもよい。この場合、フォワードプライマーにおけるゲノム配列に相補的な配列（例えば、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列）又はリバースプライマーにおけるゲノム配列に相補的な配列（例えば、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列）よりも５’末側に、当該検出可能な標識を含んでいてもよい。配列番号１及び配列番号２に対する配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
【0049】
プライマーセットを使用したＤＮＡ増幅方法、渋皮剥皮性判定方法については、上述したとおりである。その他、本実施形態に係るにおける具体的な態様等も、判別方法の説明を含む、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。
【実施例0050】
［参考例 ニホングリ渋皮剥皮性の既存マーカー］
図１に「ぽろたん」、「丹沢」、「国見」及び「石鎚」の関係、渋皮剥皮性の表現型及び遺伝子型を示す。既存マーカーとしては、ＰＲＤ５２及びＰＲＤ５８（非特許文献２）を用い、以下のように遺伝子型解析を行った。なお、図２に、渋皮剥皮性を制御する遺伝子座であるｐｅｅｌｉｎｇと既存マーカー（ＰＲＤ５２、ＰＲＤ５８）の位置関係を示す。
図１に「ぽろたん」、「丹沢」、「国見」及び「石鎚」の関係、渋皮剥皮性の表現型及び遺伝子型を示す。既存マーカーとしては、ＰＲＤ５２及びＰＲＤ５８（非特許文献２）を用い、以下のように遺伝子型解析を行った。なお、図２に、渋皮剥皮性を制御する遺伝子座であるｐｅｅｌｉｎｇと既存マーカー（ＰＲＤ５２、ＰＲＤ５８）の位置関係を示す。
【0051】
ニホングリの品種「ぽろたん」、「奴」、「丹沢」、「国見」、「筑波」及び「石鎚」の葉からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出は、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。
【0052】
各品種から抽出したＤＮＡを用い、非特許文献２に記載の条件下でＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅を実施した。プライマーセットは、非特許文献２に記載のＰＲＤ５２プライマーセット及びＰＲＤ５８プライマーセットを増幅産物の安定の観点から若干改変したものを用いた。なお、用いた各プライマーセットがターゲットとする反復領域は、非特許文献２に記載のＰＲＤ５２プライマーセット及びＰＲＤ５８プライマーセットと同一である。
【0053】
得られたＤＮＡ増幅産物と渋皮剥皮性の表現型及び遺伝子型との関係を以下の表１に示す。増幅産物長においてスラッシュで区切られ２つの数値が記載されているのは、１対の相同染色体のうちのそれぞれの相同染色体における増幅産物長を意味する。
【0054】
【表1】
【0055】
表１において、例えば、ＰＲＤ５２を用いた場合に、易剥皮性である「ぽろたん」と難剥皮性である「丹沢」の増幅産物長が同じである。また、例えば、ＰＲＤ５８を用いた場合に、「ぽろたん」と「奴」で増幅産物長が異なっている。このように、ＰＲＤ５２及びＰＲＤ５８のいずれのプライマーセットを用いた場合にも、表現型と増幅産物長が対応していないことが分かった。
【0056】
［実施例１ 新規プライマーセット（１）］
新規マーカー（ＣｍＳｃａ０６７１６）、すなわち配列番号１のフォワードプライマー及び配列番号２のリバースプライマーの５’末端に、ユニバーサル配列及びｐｉｇ－ｔａｉｌ配列をそれぞれ付加したプライマーセットを作製し、以下のように遺伝子型解析を行った。なお、図２に、ｐｅｅｌｉｎｇ遺伝子座と新規マーカーの位置関係を示す。既存マーカーと比較して、新規マーカーはｐｅｅｌｉｎｇ遺伝子座に非常に近い位置に存在することが分かる。
新規マーカー（ＣｍＳｃａ０６７１６）、すなわち配列番号１のフォワードプライマー及び配列番号２のリバースプライマーの５’末端に、ユニバーサル配列及びｐｉｇ－ｔａｉｌ配列をそれぞれ付加したプライマーセットを作製し、以下のように遺伝子型解析を行った。なお、図２に、ｐｅｅｌｉｎｇ遺伝子座と新規マーカーの位置関係を示す。既存マーカーと比較して、新規マーカーはｐｅｅｌｉｎｇ遺伝子座に非常に近い位置に存在することが分かる。
【0057】
ニホングリの品種「ぽろたん」、「奴」、「丹沢」、「国見」、「筑波」及び「石鎚」から参考例と同様にＤＮＡを抽出した。
【0058】
ＳＳＲ－ＰＣＲ解析は、Ｓｃｈｕｅｌｋｅ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０００）１８：２３３－２３４の方法を参考にし、ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲにて行った。２．５μＬの２×ＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、配列番号１の配列の５’末端にユニバーサル配列（配列番号５）を付与した０．３μＭのフォワードプライマー（配列番号３）、配列番号２の５’末端にｐｉｇ－ｔａｉｌ配列を付与した０．５μＭのリバースプライマー（配列番号４）、６－ＦＡＭ蛍光でラベルした０．２μＭのユニバーサルプライマー、約２ｎｇのＤＮＡを含む、合計５μＬの反応系で行った。Ｓｃｈｕｅｌｋｅ（２０００）の論文では、Ｍ１３（－２１）配列がユニバーサル配列として用いられているが、改変した２０－ｂｐの配列をユニバーサル配列（５’－ＧＣＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＣ－３’ 配列番号５）として用いた。リバースプライマーの５’末端に付与されたｐｉｇ－ｔａｉｌ配列（Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０：１００４－１０１０， ５’－ＧＴＴＴＣＴＴ－３’）は、ジェノタイピングを安定化させるためのものである。ＰＣＲ システム ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ を用いて、以下のプログラムで、ＰＣＲ反応を行った。
・９５°Ｃ２分（初期変性）。
・９５°Ｃ３０秒（変性）、５５°Ｃ３０秒（アニーリング）、７２°Ｃ４５秒（伸長）の反応を、４０サイクル。
・７２°Ｃ５分（最終伸長）の反応後、４°Ｃで保持する。
・９５°Ｃ２分（初期変性）。
・９５°Ｃ３０秒（変性）、５５°Ｃ３０秒（アニーリング）、７２°Ｃ４５秒（伸長）の反応を、４０サイクル。
・７２°Ｃ５分（最終伸長）の反応後、４°Ｃで保持する。
【0059】
得られた増幅産物は、ＤＮＡシーケンサーで分析した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒのプロトコールに従い、３６ｃｍキャピラリー、ＰＯＰ－７ポリマー、内部標準（４００ ＨＤ ＲＯＸ）、専用のバッファー（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡ）を用いて、泳動した。ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて、遺伝子型を判定した。
【0060】
得られたＤＮＡ増幅産物と渋皮剥皮性の表現型及び遺伝子型との関係を以下の表２に示す。なお、フォーワードプライマーに２０ｂｐのユニバーサル配列、リバースプライマーに７ｂｐのｐｉｇ－ｔａｉｌ配列を付与しているため、増幅産物における実際のゲノム配列の長さは、増幅産物長から２７ｂｐを引いた長さとなる。
【0061】
【表2】
【0062】
上記プライマーセットを用いた３９４ｂｐの増幅産物（実際のゲノム配列の長さは３６７ｂｐ）が渋皮剥皮性の主働遺伝子ｐと対応していることが分かった。
【0063】
同様に他のニホングリの品種についても解析を行った。３９４ｂｐの増幅産物の増幅の有無に基づき、増幅産物長タイプと、遺伝子型及び渋皮剥皮性との関係を以下の表３に示す。増幅産物長タイプは、１対の相同染色体の両方において３９４ｂｐの増幅産物が確認された品種を「３９４ホモ」、１対の相同染色体の片方において３９４ｂｐの増幅産物が確認された品種を「３９４ヘテロ」、１対の相同染色体のいずれにおいても３９４ｂｐの増幅産物が確認されなかった品種を「３９４を増幅しない」と記載している。
【0064】
【表3】
【0065】
このように、この新規マーカーにより、渋皮剥皮性の遺伝子型を推定することが可能となり、易渋皮剥皮性のクリ属植物を高精度に選抜可能となったことが示された。
【0066】
［実施例２ 新規プライマーセット（２）］
新規マーカー（ＣｍＳｃａ０６７１６）のプライマーセットを設計し、遺伝子型解析を行った。ニホングリの各品種のＤＮＡは参考例と同様に抽出した。
２．５μＬの２×ＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、配列番号１の配列の５’末端に蛍光色素を付与した０．４μＭのフォワードプライマー、配列番号２の配列からなる０．４μＭのリバースプライマー、約２ｎｇのＤＮＡを含む、合計５μＬの反応系で行った。ＰＣＲ システム ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ を用いて、以下のプログラムで、ＰＣＲ反応を行った。
・９５°Ｃ２分（初期変性）。
・９５°Ｃ３０秒（変性）、５５°Ｃ３０秒（アニーリング）、７２°Ｃ４５秒（伸長）の反応を、４０サイクル。
・７２°Ｃ５分（最終伸長）の反応後、４°Ｃで保持する。
新規マーカー（ＣｍＳｃａ０６７１６）のプライマーセットを設計し、遺伝子型解析を行った。ニホングリの各品種のＤＮＡは参考例と同様に抽出した。
２．５μＬの２×ＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、配列番号１の配列の５’末端に蛍光色素を付与した０．４μＭのフォワードプライマー、配列番号２の配列からなる０．４μＭのリバースプライマー、約２ｎｇのＤＮＡを含む、合計５μＬの反応系で行った。ＰＣＲ システム ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ を用いて、以下のプログラムで、ＰＣＲ反応を行った。
・９５°Ｃ２分（初期変性）。
・９５°Ｃ３０秒（変性）、５５°Ｃ３０秒（アニーリング）、７２°Ｃ４５秒（伸長）の反応を、４０サイクル。
・７２°Ｃ５分（最終伸長）の反応後、４°Ｃで保持する。
【0067】
得られた増幅産物を、実施例２と同様にＤＮＡシーケンサーで分析し、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて、遺伝子型を判定した。
【0068】
得られたＤＮＡ増幅産物と表現型及び遺伝子型との関係は実施例２の表２及び３と同様であった。なお、本実施例のプライマーセットを用いた場合の増幅産物は、表２及び３に記載の増幅産物長から２７ｂｐを引いた長さとなる。
【0069】
このように、この新規マーカーにより、渋皮剥皮性の遺伝子型を推定することが可能となり、易渋皮剥皮性のクリ属植物を高精度に選抜可能となったことが示された。
【図1】
【図2】
【配列表】