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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024104057
(43)【公開日】2024-08-02
(54)【発明の名称】細胞老化マーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240726BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240726BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240726BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240726BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240726BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240726BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 D
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C07K16/18
C07K14/47
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023008071
(22)【出願日】2023-01-23
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000125370
【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】樋上 賀一
(72)【発明者】
【氏名】小林 正樹
(72)【発明者】
【氏名】野崎 優香
(72)【発明者】
【氏名】出口 祐介
(72)【発明者】
【氏名】平田 琢朗
(72)【発明者】
【氏名】八谷 一貴
【テーマコード（参考）】
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045DA36
2G045FB03
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA71
(57)【要約】
【課題】既存の細胞老化マーカーとは機序が相違する新たな細胞老化マーカーを見出し、細胞老化の診断及び新たな機序のｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇの開発手段を提供すること。
【解決手段】本発明は、ＰＡＲＩＳ蛋白質からなる細胞老化マーカー、及び
ＰＥＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、ＰＡＲＩＳ蛋白質からなる細胞老化マーカー、及び
ＰＥＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＡＲＩＳ蛋白質からなる細胞老化マーカー。
【請求項2】
ＰＥＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤。
【請求項3】
被検者より採取した細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量を測定することを特徴とする、被検者由来の細胞が細胞老化している可能性を試験する方法。
【請求項4】
前記測定値が、細胞老化を起こしていない被検者由来の細胞の測定値に比べて高い場合に、前記被検者由来の細胞が細胞老化を起こしている可能性があると判定する、請求項３記載の方法。
【請求項5】
前記ＰＡＲＩＳタンパク質量の測定手段が、請求項２記載の細胞老化診断剤を用いる免疫学的測定手段である請求項３又は４記載の方法。
【請求項6】
被験物質を添加又は投与して、対象細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定することを特徴とする、細胞老化抑制剤又は細胞老化促進剤のスクリーニング方法。
【請求項7】
前記ＰＡＲＩＳタンパク質量の変化の測定手段が、請求項２載の細胞老化診断剤を用いる免疫学的測定手段である請求項６載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞老化マーカー及び細胞老化診断薬に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、老齢個体の組織内に老化細胞が存在し、ＳＡＳＰ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）因子の分泌により周囲細胞に悪影響を及ぼすこと、老化細胞選択的な細胞死により、様々な老化関連病態が抑制されて、寿命延伸が可能であることが示された。
【0003】
メトフォルミン、ＳＧＬＴ２阻害薬、ＮＡＤ誘導体など健康長寿を志向する化合物が提案されている。また、新たな取り組みとして、近年、ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇの開発が進められている。その創薬標的は老化関連抗アポトーシス経路で、この経路を阻害するｄａｓａｔｉｎｉｂ、ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、ｆｉｓｅｔｉｎ単独又はこれらを組み合わせたｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇによる臨床試験が、米国において一部の老化関連疾患に対して行われている（非特許文献１）。またごく最近、老化細胞の一部はＰＤ－Ｌ１を発現して強い炎症を誘導するとともに、ＣＤ８陽性Ｔ細胞からの免疫監視を逃れていることが示され、抗ＰＤ１抗体がｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇになりうる可能性が示された（非特許文献２）。
【0004】
ＤＮＡ傷害、活性化メタボライト、ミトコンドリア異常など様々なストレスや障害により細胞老化が誘導される。ｐ１６INK4aやｐ２１CIP1/WAF1、ＳＡ－βＧａｌ活性などが細胞老化マーカーとして汎用されている（非特許文献３）。しかし、ｐ１６INK4aやｐ２１CIP1/WAF1、ＳＡＳＰ等のターゲットを標的とする創薬は進んでおらず、多岐にわたる老化関連疾患の発症を予防可能な化合物は未だ報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Chaib S, Tchkonia T, Kirkland JL. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 2022 Aug;28(8):1556-1568. doi: 10.1038/s41591-022-01923-y. Epub 2022 Aug 11.
【非特許文献2】Wang TW, Johmura Y, Suzuki N, Omori S, Migita T, Yamaguchi K, Hatakeyama S, Yamazaki S, Shimizu E, Imoto S, Furukawa Y, Yoshimura A, Nakanishi M. Blocking PD-L1-PD-1 improves senescence surveillance and ageing phenotypes. Nature. 2022 Nov;611(7935):358-364. doi: 10.1038/s41586-022-05388-4. Epub 2022 Nov 2.
【非特許文献3】Tuttle CSL, Luesken SWM, Waaijer MEC, Maier AB. Senescence in tissue samples of humans with age-related diseases: A systematic review. Ageing Res Rev. 2021 Jul;68:101334. doi: 10.1016/j.arr.2021.101334. Epub 2021 Apr 2.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
既存の主なｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇの創薬標的は老化関連抗アポトーシス経路である。ｐ１６ink4aやｐ２１CIP1/WAF1は広く認知されている細胞老化マーカーであるが、まだ有効性が確実な化合物は作られていない。また、ｐ１６ink4aやｐ２１CIP1/WAF1は細胞周期を抑制するので、この長期間の阻害は発癌リスクを生ずると考えられる。
本発明の課題は、既存の細胞老化マーカーとは機序が相違する新たな細胞老化マーカーを見出し、細胞老化の診断及び新たな機序のｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇの開発手段を提供することにある。
本発明の課題は、既存の細胞老化マーカーとは機序が相違する新たな細胞老化マーカーを見出し、細胞老化の診断及び新たな機序のｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇの開発手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
そこで本発明者は、ミトコンドリア生合成を促進するＰＧＣ－１αを負に制御する転写因子であるＰＡＲＩＳに着目し、ＰＡＲＩＳ蛋白質発現の増加及び減少と、脂肪細胞の分化に関連する因子、脂肪細胞のミトコンドリア活性、他の細胞老化マーカーとの関係などを検討した結果、ＰＡＲＩＳ蛋白質の過剰発現、蓄積により、脂肪細胞への分化抑制、ミトコンドリア機能異常が起こり、細胞老化が誘導されていることを見出し、ＰＡＲＩＳが細胞老化のマーカーとして有用であり、組織中のＰＡＲＩＳ量を測定すれば細胞老化の診断が可能であり、ＰＡＲＩＳ量に影響を与える物質を探索すれば、細胞老化抑制剤又は細胞老化促進剤のスクリーニングが可能であることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［７］を提供するものである。
［１］ＰＡＲＩＳ蛋白質からなる細胞老化マーカー。
［２］ＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤。
［３］被検者より採取した細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量を測定することを特徴とする、被検者由来の細胞が細胞老化している可能性を試験する方法。
［４］前記測定値が、細胞老化を起こしていない被検者由来の細胞の測定値に比べて高い場合に、前記被検者由来の細胞が細胞老化を起こしている可能性があると判定する、［３］記載の方法。
［５］前記ＰＡＲＩＳタンパク質量の測定手段が、［２］記載の細胞老化診断剤を用いる免疫学的測定手段である［３］又は［４］記載の方法。
［６］被験物質を添加又は投与して、対象細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定することを特徴とする、細胞老化抑制剤又は細胞老化促進剤のスクリーニング方法。
［７］前記ＰＡＲＩＳタンパク質量の変化の測定手段が、［２］記載の細胞老化診断剤を用いる免疫学的測定手段である［６］記載のスクリーニング方法。
［１］ＰＡＲＩＳ蛋白質からなる細胞老化マーカー。
［２］ＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤。
［３］被検者より採取した細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量を測定することを特徴とする、被検者由来の細胞が細胞老化している可能性を試験する方法。
［４］前記測定値が、細胞老化を起こしていない被検者由来の細胞の測定値に比べて高い場合に、前記被検者由来の細胞が細胞老化を起こしている可能性があると判定する、［３］記載の方法。
［５］前記ＰＡＲＩＳタンパク質量の測定手段が、［２］記載の細胞老化診断剤を用いる免疫学的測定手段である［３］又は［４］記載の方法。
［６］被験物質を添加又は投与して、対象細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定することを特徴とする、細胞老化抑制剤又は細胞老化促進剤のスクリーニング方法。
［７］前記ＰＡＲＩＳタンパク質量の変化の測定手段が、［２］記載の細胞老化診断剤を用いる免疫学的測定手段である［６］記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の細胞老化診断マーカーを測定すれば、被検者の細胞が細胞老化を起こしている可能性があることを判定できる。また、本発明の細胞老化マーカー量に影響を与える物質をスクリーニングすれば、細胞老化抑止剤又は細胞老化促進剤を探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】マウスの各組織（後腹膜周囲ＷＡＴ（ｒＷＡＴ）、精巣周囲ＷＡＴ（ｅＷＡＴ）、皮下ＷＡＴ（ｓＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、大腿四頭筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、間脳（Ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）、脳幹（Ｂｒａｉｎ ｓｔｅｍ）に対するＰＡＲＩＳ蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果を示す。
【図1C】マウスのＷＡＴをコラゲナーゼ処理し、白色脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）と、成熟脂肪細胞が含まれるＡＥＦに分画し、ＰＡＲＩＳ蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った結果を示す。
【図2A】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスのＷＡＴを採取し、ＰＡＲＩＳ蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った結果を示す。
【図2B】通常食摂餌（ＮＤ）したマウスと、高脂肪食摂餌（ＨＦＤ）したマウスからＷＡＴを採取し、ＰＡＲＩＳ蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った結果を示す。
【図2C】自由摂食群（ＡＬ）のマウスと、カロリー制限（ＣＲ）のマウスからＷＡＴを採取し、ＰＡＲＩＳ蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った結果を示す。
【図2D】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスのＷＡＴを採取し、脂肪細胞分化の主要制御因子であるＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、ミトコンドリア生合成の主要制御因子であるＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図2E】通常食摂餌（ＮＤ）したマウスと、高脂肪食摂餌（ＨＦＤ）したマウスからＷＡＴを採取し、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図2F】自由摂食群（ＡＬ）のマウスと、カロリー制限（ＣＲ）のマウスからＷＡＴを採取し、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図2G】３３週齢と１１１週齢のマウスのＷＡＴをコラゲナーゼ処理し、白色脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）を分画し、ＰＡＲＩＳ蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った結果を示す。
【図3A】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図3B】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの肝臓（Ｌｉｖｅｒ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図3C】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図3D】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの心臓（Ｈｅａｒｔ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図3E】８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの大腿四頭筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図4A】マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰＡＲＩＳタンパク質、ＰＧＣ－１ａタンパク質、ＰＰＡＲｇタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図4E】マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を解析した結果を示す。
【図4F】マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰｐａｒγのｍＲＮＡ量を解析した結果を示す。
【図5A】マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３Ｌ１において、ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）細胞を作成し、脂肪滴蓄積量をＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏ染色を用いて解析した結果を示す。
【図5C】５つのＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株において、ＰＡＲＩＳの発現量とＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏを指標とした脂肪蓄積量をプロットした結果を示す。
【図5D】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果を示す。
【図5E】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、ＣｅｂｐαのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果を示す。
【図5F】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、脂肪細胞の初期の分化誘導に関与するＣｅｂｐδのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果を示す。
【図5G】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、脂肪細胞の初期の分化誘導に関与するＣｅｂｐβのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果を示す。
【図5K】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞とコントロール（Ｍｏｃｋ）細胞を分化させ、ＰＡＲＩＳとＰＰＡＲγのタンパク質発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した結果を示す。
【図6A】３Ｔ３Ｌ１細胞において、ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）によるＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を解析した結果を示す。
【図6B】Ｐｇｃ－１ａのプロモーター下でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するプラスミドを、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞に一過性導入し、Ｐｇｃ－１αのプロモーター活性を解析した結果を示す。
【図6C】５つのＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株において、Ｐｇｃ－１α ｍＲＮＡ発現量とＰＡＲＩＳタンパク質発現量をプロットした結果を示す。
【図6D】ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）が、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）発現量に与える影響を示す。
【図6E】ＰＡＲＩＳ ＯＥが、ミトコンドリア酸素消費速度（呼吸速度）（ＯＣＲ）に与える影響を示す。
【図6F】ＰＡＲＩＳ ＯＥが、ミトコンドリア膜のプロトン電位依存的に蓄積するＴＭＲＭに与える影響を示す。
【図6G】ＰＡＲＩＳ ＯＥが、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色したミトコンドリアの数に与える影響を示す。
【図7A】ＰＡＲＩＳ ＯＥが、細胞増殖速度に与える影響を示す。
【図7B】ＰＡＲＩＳ ＯＥが、細胞老化マーカーであるＣｄｋｎ１ａ（ｐ２１CIP/WAF1）、Ｃｄｋｎ２ａ（ｐ１６INK4a）のｍＲＮＡ量に与える影響を示す。
【図7C】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞において、ＰＡＲＩＳ、ｐ１６INK4a、ＤＡＰＩ（核マーカー）の細胞染色を行った結果を示す。
【図7E】ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞とコントロール（Ｍｏｃｋ）細胞それぞれを、核画分と細胞質画分に分画し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明において、細胞老化（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）とは、ＤＮＡ損傷応答などで見られる、増殖していた細胞が増殖促進刺激に対する抵抗性を獲得し、安定的に細胞周期が停止した状態をいい、加齢（ａｇｉｎｇ）とは明確に相違する。老化した細胞は、形態的な変化、代謝の変化、クロマチンの再構成、遺伝子発現の変化などを有し、ＳＡＳＰ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）と呼ばれる炎症促進性の表現型を獲得することも知られている。
細胞老化は、損傷を受けた細胞が悪性形質転換し、がん化するのを防ぐ機構であると考えられている一方で、様々な加齢に関わる病態 (組織の変性、炎症性疾患、がんなど) に老化した細胞が関与するという知見もある。老化した細胞の数は加齢と共に増えるが、細胞老化は発生や創傷治癒時にも重要な役割を果たすともいわれる。
細胞老化は、損傷を受けた細胞が悪性形質転換し、がん化するのを防ぐ機構であると考えられている一方で、様々な加齢に関わる病態 (組織の変性、炎症性疾患、がんなど) に老化した細胞が関与するという知見もある。老化した細胞の数は加齢と共に増えるが、細胞老化は発生や創傷治癒時にも重要な役割を果たすともいわれる。
【0012】
本発明の一態様は、ＰＡＲＩＳ蛋白質からなる細胞老化マーカーである。
ＰＡＲＩＳ蛋白質は、ミトコンドリア生合成を促進するＰＧＣ－１αを負に制御する転写因子であることは知られているが、脂肪老化のマーカーとして有用であることは全く報告されていない。
ＰＡＲＩＳ蛋白質は、ミトコンドリア生合成を促進するＰＧＣ－１αを負に制御する転写因子であることは知られているが、脂肪老化のマーカーとして有用であることは全く報告されていない。
【0013】
後記実施例に示すように、本発明者は、ＰＡＲＩＳタンパク質が脂肪組織の血管間葉系分画のａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓに多く局在し、脂肪組織において加齢や肥満症において増加すること、一方、代謝改善、抗老化、寿命延伸効果のあるカロリー制限（ＣＲ）マウスの脂肪組織では、発現が減少することを見出した。また、この時、ＰＡＲＩＳタンパク質発現量と脂肪細胞の分化に関連するＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα発現や、ミトコンドリ生合成を促進するＰｇｃ－１α発現が負に相関した。加えて、ＰＡＲＩＳタンパク質は老化にともない褐色脂肪組織、肝臓、腎臓においても増加したが、心臓や骨格筋では増加は見られなかった。
脂肪細胞の分化過程において、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現は減少し、それとは逆にＰＰＡＲγタンパク質発現が増加し、Ｐｇｃ－１αタンパク質発現は減少した。
脂肪細胞の分化過程において、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現は減少し、それとは逆にＰＰＡＲγタンパク質発現が増加し、Ｐｇｃ－１αタンパク質発現は減少した。
【0014】
ＰＡＲＩＳタンパク質を過剰発現すると脂肪細胞へのトリグリセリド蓄積が減少し、その蓄積量はＰＡＲＩＳタンパク質発現量と負の相関を示した。また、脂肪分化関連遺伝子のうちＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα遺伝子発現、ＰＰＡＲγタンパク質発現が減少した。すなわち、ＰＡＲＩＳタンパク質の過剰発現は脂肪細胞分化を抑制した。
ＰＡＲＩＳタンパク質を過剰発現するとＰｇｃ－１α発現が減少し、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーター活性も減少した。またＰＡＲＩＳタンパク質発現量はＰｇｃ－１α発現量と負の相関を示した。ＰＡＲＩＳタンパク質の過剰発現によりｍｔＤＮＡの減少、ミトコンドリア酸素消費、特に最大呼吸能力が減少した。また、ミトコンドリア膜電位異常を示さないＴＭＲＭ陽性ミトコンドリアが減少した。すなわち、脂肪分化関連遺伝子のうちＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα遺伝子発現、ＰＰＡＲγタンパク質発現が減少した。すなわち、ＰＡＲＩＳタンパク質の過剰発現は脂肪細胞のミトコンドリア活性を抑制した。
ＰＡＲＩＳタンパク質を過剰発現するとＰｇｃ－１α発現が減少し、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーター活性も減少した。またＰＡＲＩＳタンパク質発現量はＰｇｃ－１α発現量と負の相関を示した。ＰＡＲＩＳタンパク質の過剰発現によりｍｔＤＮＡの減少、ミトコンドリア酸素消費、特に最大呼吸能力が減少した。また、ミトコンドリア膜電位異常を示さないＴＭＲＭ陽性ミトコンドリアが減少した。すなわち、脂肪分化関連遺伝子のうちＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα遺伝子発現、ＰＰＡＲγタンパク質発現が減少した。すなわち、ＰＡＲＩＳタンパク質の過剰発現は脂肪細胞のミトコンドリア活性を抑制した。
【0015】
ＰＡＲＩＳタンパク質を過剰発現すると細胞増殖能力は低下して、細胞老化マーカーであるｐ２１CIP1/WAFや１６INK4a発現が増加した。さらに、核でのＰＡＲＩＳ陽性細胞と１６INK4a陽性細胞の共局在を検討したところ、相関係数０．４５とその相関は強くはなかった。核分画と細胞質分画に分けて、１６INK4a発現を検討したところ、ＰＡＲＩＳ過剰発現により分子量１６ＫＤａ付近のバンドは顕著に増加していた。１００ＫＤａ付近に非特異的なバンドが観察されたことから、核でのＰＡＲＩＳ陽性細胞と１６INK4a陽性細胞の共局在の相関が高くなかったものと考えられた。
【0016】
以上の結果から、ＰＡＲＩＳ蛋白質の過剰発現、蓄積により、脂肪細胞への分化抑制、ミトコンドリア機能異常が起こり、細胞老化が誘導されていることを見出し、ＰＡＲＩＳが細胞老化のマーカーとして有用であることを見出した。また、組織中のＰＡＲＩＳ量を測定すれば細胞老化の診断が可能であり、ＰＡＲＩＳ量に影響を与える物質を探索すれば、細胞老化抑制剤又は細胞老化促進剤のスクリーニングが可能であることを見出した。
【0017】
本発明の他の一態様は、ＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤である。
本発明の細胞老化診断剤は、ＰＡＲＩＳ蛋白質を検出できるものを用いることができる。従って、ＰＡＲＩＳ蛋白質に結合する抗体、抗体断片又はアプタマーが用いられる。
本発明の細胞老化診断剤は、ＰＡＲＩＳ蛋白質を検出できるものを用いることができる。従って、ＰＡＲＩＳ蛋白質に結合する抗体、抗体断片又はアプタマーが用いられる。
【0018】
ＰＡＲＩＳ蛋白質に結合する抗体は、ＰＡＲＩＳ蛋白質又はその断片をマウスなどの動物に免疫することにより作製することができる。また、常法により、モノクローナル抗体を作成してもよいし、ファージライブラリーのスクリーニングにより作成することもできる。
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。
アプタマーとしては、ペプチドアプタマーが挙げられる。ペプチドアプタマーは、例えば、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
これらの抗体、その断片又はアプタマーを用いる検出法としては、採取した細胞又は細胞を含む組織を用いる免疫学的測定、免疫組織化学染色が挙げられる。具体的には、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相蛋白質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等が挙げられる。なお、逆相蛋白質アレイを用いた検出とは、試料を固相にアレイ状に固定し、ＰＡＲＩＳ蛋白質に特異的な抗体等を反応させることにより、試料中のＰＡＲＩＳ蛋白質を検出する解析方法である。
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。
アプタマーとしては、ペプチドアプタマーが挙げられる。ペプチドアプタマーは、例えば、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
これらの抗体、その断片又はアプタマーを用いる検出法としては、採取した細胞又は細胞を含む組織を用いる免疫学的測定、免疫組織化学染色が挙げられる。具体的には、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相蛋白質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等が挙げられる。なお、逆相蛋白質アレイを用いた検出とは、試料を固相にアレイ状に固定し、ＰＡＲＩＳ蛋白質に特異的な抗体等を反応させることにより、試料中のＰＡＲＩＳ蛋白質を検出する解析方法である。
【0019】
本発明の他の一態様は、被検者より採取した細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量を測定することを特徴とする、被検者由来の細胞が細胞老化している可能性を試験する方法である。
本発明方法に用いられる試料は、被検者より採取した細胞又は組織である。被検者としては、細胞老化が疑われるヒトが挙げられるが、健康診断の対象者であってもよい。
採取される細胞又は組織としては、被験者のへ負担を考慮すると、脂肪細胞又は脂肪組織が好ましい。
ＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定にあたっては、前記のＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤を用いるのが好ましい。従って、被検者から採取した細胞又は細胞を含む組織を用いて免疫学的測定又は免疫組織化学染色を行うのが好ましい。
得られたＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定値が、細胞老化を起こしていない被検者由来の細胞の測定値に比べて高い場合に、前記被検者由来の細胞が細胞老化を起こしている可能性があると判定することができる。
本発明方法に用いられる試料は、被検者より採取した細胞又は組織である。被検者としては、細胞老化が疑われるヒトが挙げられるが、健康診断の対象者であってもよい。
採取される細胞又は組織としては、被験者のへ負担を考慮すると、脂肪細胞又は脂肪組織が好ましい。
ＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定にあたっては、前記のＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤を用いるのが好ましい。従って、被検者から採取した細胞又は細胞を含む組織を用いて免疫学的測定又は免疫組織化学染色を行うのが好ましい。
得られたＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定値が、細胞老化を起こしていない被検者由来の細胞の測定値に比べて高い場合に、前記被検者由来の細胞が細胞老化を起こしている可能性があると判定することができる。
【0020】
本発明の他の一態様は、被験物質を添加又は投与して、対象細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定することを特徴とする、細胞老化抑制剤又は細胞老化促進剤のスクリーニング方法である。
本発明のスクリーニング方法は、インビトロ又はインビボのいずれでも行うことができる。インビトロの場合は、哺乳類から採取した細胞又は組織を用い、被験物質を添加して、対象細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定する。一方、インビボの場合は、哺乳類に被験物質を投与して、当該哺乳類の細胞又は組織を採取し、得られた細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定する。
ここで、細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の測定は、前記のＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤を用いるのが好ましい。従って、例えば、採取した細胞又は細胞を含む組織を用いて免疫学的測定又は免疫組織化学染色を行うのが好ましい。
得られたＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定値が、細胞老化を起こしていない対象の細胞の測定値に比べて高い場合に、添加又は投与した被験物質は細胞老化促進剤である可能性があると判定することができる。また、得られたＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定値が、細胞老化を起こしていない対象の細胞の測定値に比べて低い場合に、添加又は投与した被験物質は細胞老化抑制剤である可能性があると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法は、インビトロ又はインビボのいずれでも行うことができる。インビトロの場合は、哺乳類から採取した細胞又は組織を用い、被験物質を添加して、対象細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定する。一方、インビボの場合は、哺乳類に被験物質を投与して、当該哺乳類の細胞又は組織を採取し、得られた細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の変化を測定する。
ここで、細胞又は組織中のＰＡＲＩＳタンパク質量の測定は、前記のＰＡＲＩＳ蛋白質と結合する抗体、抗体断片又はアプタマーを含有する細胞老化診断剤を用いるのが好ましい。従って、例えば、採取した細胞又は細胞を含む組織を用いて免疫学的測定又は免疫組織化学染色を行うのが好ましい。
得られたＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定値が、細胞老化を起こしていない対象の細胞の測定値に比べて高い場合に、添加又は投与した被験物質は細胞老化促進剤である可能性があると判定することができる。また、得られたＰＡＲＩＳ蛋白質量の測定値が、細胞老化を起こしていない対象の細胞の測定値に比べて低い場合に、添加又は投与した被験物質は細胞老化抑制剤である可能性があると判定することができる。
【実施例0021】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【0022】
「材料と方法」
（１）使用マウスの作製と維持
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを、東京理科大学薬学部動物実験施設内ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）環境下、１２時間明期（８：００～２０：００）、室温約２３℃のＳＰＦ条件下で、自由飲水にて飼育した。ＣＲＦ－１（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を十分量与え続け、８週齢、２４週齢、１００週齢まで自由摂食させた。その後安楽死させ、精巣周囲ＷＡＴ（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ＷＡＴ；ｅＷＡＴ）、皮下ＷＡＴ（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ＷＡＴ；ｓＷＡＴ）、後腹膜周囲ＷＡＴ（ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ＷＡＴ；ｒＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ；ＢＡＴ）、大腿四頭筋、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、大脳皮質、小脳、間脳、脳幹を採取した。また、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスをｎｏｒｍａｌ ｄｉｅｔ（ＮＤ）群と８週齢から高脂肪食を与えたｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（ＨＦＤ）群に分け、２１～２２週齢（１４週間ＨＦＤ）で安楽死させ、ｅＷＡＴ及びｓＷＡＴを採取した。臓器は液体窒素により急速凍結後－８０oＣにて保存した。ＮＤ群にはＣＲＦ－１、ＨＦＤ群にはＨｉｇｈ ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２（ＣＲＥＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を与えた。
（１）使用マウスの作製と維持
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを、東京理科大学薬学部動物実験施設内ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）環境下、１２時間明期（８：００～２０：００）、室温約２３℃のＳＰＦ条件下で、自由飲水にて飼育した。ＣＲＦ－１（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を十分量与え続け、８週齢、２４週齢、１００週齢まで自由摂食させた。その後安楽死させ、精巣周囲ＷＡＴ（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ＷＡＴ；ｅＷＡＴ）、皮下ＷＡＴ（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ＷＡＴ；ｓＷＡＴ）、後腹膜周囲ＷＡＴ（ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ＷＡＴ；ｒＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ；ＢＡＴ）、大腿四頭筋、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、大脳皮質、小脳、間脳、脳幹を採取した。また、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスをｎｏｒｍａｌ ｄｉｅｔ（ＮＤ）群と８週齢から高脂肪食を与えたｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（ＨＦＤ）群に分け、２１～２２週齢（１４週間ＨＦＤ）で安楽死させ、ｅＷＡＴ及びｓＷＡＴを採取した。臓器は液体窒素により急速凍結後－８０oＣにて保存した。ＮＤ群にはＣＲＦ－１、ＨＦＤ群にはＨｉｇｈ ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２（ＣＲＥＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を与えた。
【0023】
（２）細胞培養と分化方法
マウス白色前駆脂肪細胞株３Ｔ３－Ｌ１はＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｂｓｄｏｒｆｅｒｇｒｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍＬ Ｐ／Ｓ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＷＡＫＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（以下、通常培地）で培養し、０．２５～２．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度で維持した。
マウス白色前駆脂肪細胞株３Ｔ３－Ｌ１はＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｂｓｄｏｒｆｅｒｇｒｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍＬ Ｐ／Ｓ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＷＡＫＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（以下、通常培地）で培養し、０．２５～２．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度で維持した。
【0024】
（成熟脂肪細胞への分化誘導）
３Ｔ３－Ｌ１分化誘導は１．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、２日後に１００％コンフルエントに達した時点をＤａｙ－２とし、通常培地で培地交換を行った。さらに、２日後をＤａｙ０とし、２日間は５００μＭ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎ（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（ＤＥＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む通常培地で培養することで脂肪細胞への分化誘導を行った。その後は２日置きに１０μｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ（ＷＡＫＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び５０ｎＭ ｔｒｉ－ｉｏｄｅ ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（Ｔ３；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む通常培地で培養することで成熟脂肪細胞へと誘導した。
３Ｔ３－Ｌ１分化誘導は１．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、２日後に１００％コンフルエントに達した時点をＤａｙ－２とし、通常培地で培地交換を行った。さらに、２日後をＤａｙ０とし、２日間は５００μＭ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎ（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（ＤＥＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む通常培地で培養することで脂肪細胞への分化誘導を行った。その後は２日置きに１０μｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ（ＷＡＫＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び５０ｎＭ ｔｒｉ－ｉｏｄｅ ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（Ｔ３；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む通常培地で培養することで成熟脂肪細胞へと誘導した。
【0025】
（３）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
記載していないすべての操作は室温で行った。細胞サンプルはＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８，２％ ＳＤＳ，３Ｍ Ｕｒｅａ，６％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、９５℃で５分間加熱処理した後、超音波破砕した。一方、ＷＡＴ及び他はＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、ソニケーションにより破砕したのち遠心（１２０００ｇ，３０分）、上清を９５℃で５分間加熱処理した。各サンプルはＢＳＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によりタンパク質量を定量し、タンパク質量を０．２～２ｍｇ／ｍＬに調節後、ＢＰＢ／２－Ｍｅ溶液（０．２５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ，５０％ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を１／１０量加えた。その後再び９５℃で５分間加熱処理した後、解析時まで－２０℃に保存した。サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロースメンブレン（ＰＡＬＬ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）に転写した。転写後、メンブレンはｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液中（２．５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ），０．２５％ ＢＳＡ，ＴＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０））にて１時間振盪させた。その後、一次抗体を至適濃度で加えた反応液（Ｉｍｍｕｎｏ ｓｈｏｔ ｒｅａｇｅｎｔ １（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）：ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液＝２：１）中で、４℃にて一晩反応させた。一次抗体反応後、メンブレンをＴＴＢＳにて４回洗浄し、各二次抗体を至適濃度で加えた反応液（Ｉｍｍｕｎｏ ｓｈｏｔ ｒｅａｇｅｎｔ ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）：ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液＝２：１）中で１時間反応させた。二次抗体反応後、メンブレンをＴＴＢＳにて４回洗浄し、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒTM ＬＤ （Ｗａｋｏ）を用いた化学発光をルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ－３０００，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて検出した。
記載していないすべての操作は室温で行った。細胞サンプルはＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８，２％ ＳＤＳ，３Ｍ Ｕｒｅａ，６％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、９５℃で５分間加熱処理した後、超音波破砕した。一方、ＷＡＴ及び他はＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、ソニケーションにより破砕したのち遠心（１２０００ｇ，３０分）、上清を９５℃で５分間加熱処理した。各サンプルはＢＳＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によりタンパク質量を定量し、タンパク質量を０．２～２ｍｇ／ｍＬに調節後、ＢＰＢ／２－Ｍｅ溶液（０．２５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ，５０％ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を１／１０量加えた。その後再び９５℃で５分間加熱処理した後、解析時まで－２０℃に保存した。サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロースメンブレン（ＰＡＬＬ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）に転写した。転写後、メンブレンはｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液中（２．５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ），０．２５％ ＢＳＡ，ＴＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０））にて１時間振盪させた。その後、一次抗体を至適濃度で加えた反応液（Ｉｍｍｕｎｏ ｓｈｏｔ ｒｅａｇｅｎｔ １（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）：ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液＝２：１）中で、４℃にて一晩反応させた。一次抗体反応後、メンブレンをＴＴＢＳにて４回洗浄し、各二次抗体を至適濃度で加えた反応液（Ｉｍｍｕｎｏ ｓｈｏｔ ｒｅａｇｅｎｔ ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）：ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液＝２：１）中で１時間反応させた。二次抗体反応後、メンブレンをＴＴＢＳにて４回洗浄し、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒTM ＬＤ （Ｗａｋｏ）を用いた化学発光をルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ－３０００，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて検出した。
【0026】
（４）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ ＰＣＲ
組織または細胞からＩＳＯＧＥＮ II（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ （Ｔｈｅｒｍｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて濃度を測定した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ ＡｃｅTM ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤTM ＳＹＢＲTM ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲをＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔTM ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて行った。なお、それぞれの各々の反応条件は試薬メーカーの推奨プロトコルに従った。定量は検量線法により行った。
組織または細胞からＩＳＯＧＥＮ II（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ （Ｔｈｅｒｍｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて濃度を測定した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ ＡｃｅTM ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤTM ＳＹＢＲTM ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲをＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔTM ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて行った。なお、それぞれの各々の反応条件は試薬メーカーの推奨プロトコルに従った。定量は検量線法により行った。
【0027】
（５）細胞染色
細胞はカバーガラス（Ｉｗａｋｉ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ， Ｊａｐａｎ）を配置した６－ｗｅｌｌ Ｄｉｓｈで培養した。細胞を１ｍＬ ＰＢＳで洗浄後、１ｍＬ ４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ溶液で１５分間固定し、再び１ｍＬ ＰＢＳで洗浄後、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００で１０分間膜透過処理し、再度ＰＢＳで洗浄した。その後ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（１％ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ），０．２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））中で、シェーカーで静かに揺らしながら３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ反応を行い、洗浄液をＴＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ）に変更し洗浄後、至適濃度で一次抗体を加えたｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液中で４℃にて一晩反応させた。翌日、ＴＰＢＳで洗浄（５分×４回）した後、各二次抗体を至適濃度で加えたｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液で１時間反応させ、再びＴＰＢＳ（５分×４回）で洗浄した。洗浄後、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔTM（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ－ｇｌａｓｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）上に封入したサンプルを蛍光顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。撮影した写真の定量はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いた。
細胞はカバーガラス（Ｉｗａｋｉ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ， Ｊａｐａｎ）を配置した６－ｗｅｌｌ Ｄｉｓｈで培養した。細胞を１ｍＬ ＰＢＳで洗浄後、１ｍＬ ４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ溶液で１５分間固定し、再び１ｍＬ ＰＢＳで洗浄後、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００で１０分間膜透過処理し、再度ＰＢＳで洗浄した。その後ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（１％ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ），０．２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））中で、シェーカーで静かに揺らしながら３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ反応を行い、洗浄液をＴＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ）に変更し洗浄後、至適濃度で一次抗体を加えたｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液中で４℃にて一晩反応させた。翌日、ＴＰＢＳで洗浄（５分×４回）した後、各二次抗体を至適濃度で加えたｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液で１時間反応させ、再びＴＰＢＳ（５分×４回）で洗浄した。洗浄後、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔTM（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ－ｇｌａｓｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）上に封入したサンプルを蛍光顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。撮影した写真の定量はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いた。
【0028】
実施例１
マウスの各組織（後腹膜周囲ＷＡＴ（ｒＷＡＴ）、精巣周囲ＷＡＴ（ｅＷＡＴ）、皮下ＷＡＴ（ｓＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、大腿四頭筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、間脳（Ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）、脳幹（Ｂｒａｉｎ ｓｔｅｍ）を採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。β－ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ、ＣＢＢはｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた。
その結果、図１Ａ及び図１Ｂ（図１Ａの定量結果）に示すように、ＰＡＲＩＳ蛋白質の発現は脂肪組織で特に多かった。
マウスのＷＡＴをコラゲナーゼ処理し、白色脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）と、成熟脂肪細胞が含まれるＡＥＦに分画し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図１Ｃに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は、脂肪前駆細胞で高かった。
マウスの各組織（後腹膜周囲ＷＡＴ（ｒＷＡＴ）、精巣周囲ＷＡＴ（ｅＷＡＴ）、皮下ＷＡＴ（ｓＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、大腿四頭筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、間脳（Ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）、脳幹（Ｂｒａｉｎ ｓｔｅｍ）を採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。β－ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ、ＣＢＢはｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた。
その結果、図１Ａ及び図１Ｂ（図１Ａの定量結果）に示すように、ＰＡＲＩＳ蛋白質の発現は脂肪組織で特に多かった。
マウスのＷＡＴをコラゲナーゼ処理し、白色脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）と、成熟脂肪細胞が含まれるＡＥＦに分画し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図１Ｃに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は、脂肪前駆細胞で高かった。
【0029】
実施例２
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスのＷＡＴを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図２Ａに示すように、ＷＡＴにおけるＰＡＲＩＳの発現は高齢群で増加した。
通常食摂餌（ＮＤ）したマウスと、高脂肪食摂餌（ＨＦＤ）したマウスからＷＡＴを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図２Ｂに示すように、ＷＡＴにおけるＰＡＲＩＳの発現は、高脂肪食摂餌により増加した。
自由摂食群（ＡＬ）のマウスと、カロリー制限（ＣＲ）のマウスからＷＡＴを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図２Ｃに示すように、ＷＡＴにおけるＰＡＲＩＳの発現は、ＣＲにより減少した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスのＷＡＴを採取し、脂肪細胞分化の主要制御因子であるＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、ミトコンドリア生合成の主要制御因子であるＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した。その結果、図２Ｄに示すように、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αの発現は高齢群で有意に減少もしくは減少傾向をしめした。
通常食摂餌（ＮＤ）したマウスと、高脂肪食摂餌（ＨＦＤ）したマウスからＷＡＴを採取し、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した。その結果、図２Ｅに示すように、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αの発現は高脂肪食摂餌により有意に減少した。
自由摂食群（ＡＬ）のマウスと、カロリー制限（ＣＲ）のマウスからＷＡＴを採取し、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した。その結果、図２Ｆに示すように、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αの発現はＣＲにより有意に増加した。
３３週齢と１１１週齢のマウスのＷＡＴをコラゲナーゼ処理し、白色脂肪組織由来間葉系幹細胞 （ＡＤＳＣ）を分画した。その結果、図２Ｇ及び図２Ｆ（図２Ｇの定量結果）に示すように、ＰＡＲＩＳの発現は１１１週齢マウスのＡＤＳＣで増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスのＷＡＴを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図２Ａに示すように、ＷＡＴにおけるＰＡＲＩＳの発現は高齢群で増加した。
通常食摂餌（ＮＤ）したマウスと、高脂肪食摂餌（ＨＦＤ）したマウスからＷＡＴを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図２Ｂに示すように、ＷＡＴにおけるＰＡＲＩＳの発現は、高脂肪食摂餌により増加した。
自由摂食群（ＡＬ）のマウスと、カロリー制限（ＣＲ）のマウスからＷＡＴを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、図２Ｃに示すように、ＷＡＴにおけるＰＡＲＩＳの発現は、ＣＲにより減少した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスのＷＡＴを採取し、脂肪細胞分化の主要制御因子であるＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、ミトコンドリア生合成の主要制御因子であるＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した。その結果、図２Ｄに示すように、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αの発現は高齢群で有意に減少もしくは減少傾向をしめした。
通常食摂餌（ＮＤ）したマウスと、高脂肪食摂餌（ＨＦＤ）したマウスからＷＡＴを採取し、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した。その結果、図２Ｅに示すように、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αの発現は高脂肪食摂餌により有意に減少した。
自由摂食群（ＡＬ）のマウスと、カロリー制限（ＣＲ）のマウスからＷＡＴを採取し、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を測定した。その結果、図２Ｆに示すように、Ｐｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｐｇｃ－１αの発現はＣＲにより有意に増加した。
３３週齢と１１１週齢のマウスのＷＡＴをコラゲナーゼ処理し、白色脂肪組織由来間葉系幹細胞 （ＡＤＳＣ）を分画した。その結果、図２Ｇ及び図２Ｆ（図２Ｇの定量結果）に示すように、ＰＡＲＩＳの発現は１１１週齢マウスのＡＤＳＣで増加した。
【0030】
実施例３
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ａに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は高齢群で有意に増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの肝臓（Ｌｉｖｅｒ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｂに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は高齢群で有意に増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｃに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は高齢群で有意に増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの心臓（Ｈｅａｒｔ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｄに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は若齢群・高齢群間で変化はなかった。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの大腿四頭筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｅに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は若齢群・高齢群間で変化はなかった。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ａに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は高齢群で有意に増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの肝臓（Ｌｉｖｅｒ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｂに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は高齢群で有意に増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｃに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は高齢群で有意に増加した。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの心臓（Ｈｅａｒｔ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｄに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は若齢群・高齢群間で変化はなかった。
８週齢の若齢群と１００週齢の高齢群のマウスの大腿四頭筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）を採取し、ＰＡＲＩＳタンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで解析した。その結果、図３Ｅに示すように、ＰＡＲＩＳの発現は若齢群・高齢群間で変化はなかった。
【0031】
実施例４
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰＡＲＩＳの発現量を解析した。その結果、図４Ａ～図４Ｄに示すように、ＰＡＲＩＳタンパク質量は３Ｔ３Ｌ１の分化に伴い減少した。この時、ＰＡＲＩＳの発現量は、脂肪細胞分化に関わるＰＰＡＲγ、ミトコンドリア生合成に関わるＰＧＣ－１αのタンパク質発現量と負に相関した。
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を解析した。その結果、図４Ｅに示すように、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量は分化に伴い増加し、ＰＡＲＩＳタンパク質発現量と負に相関した。
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰｐａｒγのｍＲＮＡ量を解析した。その結果、図４Ｆに示すように、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量は分化に伴い増加し、ＰＡＲＩＳタンパク質発現量と負に相関した。
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰＡＲＩＳの発現量を解析した。その結果、図４Ａ～図４Ｄに示すように、ＰＡＲＩＳタンパク質量は３Ｔ３Ｌ１の分化に伴い減少した。この時、ＰＡＲＩＳの発現量は、脂肪細胞分化に関わるＰＰＡＲγ、ミトコンドリア生合成に関わるＰＧＣ－１αのタンパク質発現量と負に相関した。
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量を解析した。その結果、図４Ｅに示すように、Ｐｇｃ－１αのｍＲＮＡ量は分化に伴い増加し、ＰＡＲＩＳタンパク質発現量と負に相関した。
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３Ｌ１を成熟脂肪細胞へ分化させ、経時的なＰｐａｒγのｍＲＮＡ量を解析した。その結果、図４Ｆに示すように、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量は分化に伴い増加し、ＰＡＲＩＳタンパク質発現量と負に相関した。
【0032】
実施例５
マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３Ｌ１において、ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）細胞を作成し、脂肪滴蓄積量をＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏ染色を用いて解析した。その結果、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、ＰＡＲＩＳ ＯＥにより脂肪分化が抑制された。
５つのＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株において、ＰＡＲＩＳの発現量とＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏを指標とした脂肪蓄積量をプロットした。その結果、図５Ｃに示すように、ＰＡＲＩＳのタンパク質発現量と脂肪分化抑制の程度は、有意に負に相関した。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量を経時的に解析した。その結果、図５Ｄに示すように、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量はＰＡＲＩＳ ＯＥにより有意に減少した。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、ＣｅｂｐαのｍＲＮＡ量を経時的に解析した。その結果、図５Ｅに示すように、ＣｅｂｐαのｍＲＮＡ量はＰＡＲＩＳ ＯＥにより有意に減少した。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、脂肪細胞の初期の分化誘導に関与するＣｅｂｐδのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果、変化はなかった（図５Ｆ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、脂肪細胞の初期の分化誘導に関与するＣｅｂｐβのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果、変化はなかった（図５Ｇ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞とコントロール（Ｍｏｃｋ）細胞を分化させ、ＰＡＲＩＳとＰＰＡＲγのタンパク質発現量を解析した。その結果、図５Ｋ及び図５Ｌに示すように、ＰＰＡＲγの発現量はＰＡＲＩＳ ＯＥにより減少し、特に、ＰＰＡＲγの発現量のピークである分化誘導後４日の時点において、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株におけるＰＰＡＲγの発現量の減少は顕著であった。
マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３Ｌ１において、ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）細胞を作成し、脂肪滴蓄積量をＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏ染色を用いて解析した。その結果、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、ＰＡＲＩＳ ＯＥにより脂肪分化が抑制された。
５つのＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株において、ＰＡＲＩＳの発現量とＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏを指標とした脂肪蓄積量をプロットした。その結果、図５Ｃに示すように、ＰＡＲＩＳのタンパク質発現量と脂肪分化抑制の程度は、有意に負に相関した。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量を経時的に解析した。その結果、図５Ｄに示すように、ＰｐａｒγのｍＲＮＡ量はＰＡＲＩＳ ＯＥにより有意に減少した。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、ＣｅｂｐαのｍＲＮＡ量を経時的に解析した。その結果、図５Ｅに示すように、ＣｅｂｐαのｍＲＮＡ量はＰＡＲＩＳ ＯＥにより有意に減少した。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、脂肪細胞の初期の分化誘導に関与するＣｅｂｐδのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果、変化はなかった（図５Ｆ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞を分化させ、脂肪細胞の初期の分化誘導に関与するＣｅｂｐβのｍＲＮＡ量を経時的に解析した結果、変化はなかった（図５Ｇ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞とコントロール（Ｍｏｃｋ）細胞を分化させ、ＰＡＲＩＳとＰＰＡＲγのタンパク質発現量を解析した。その結果、図５Ｋ及び図５Ｌに示すように、ＰＰＡＲγの発現量はＰＡＲＩＳ ＯＥにより減少し、特に、ＰＰＡＲγの発現量のピークである分化誘導後４日の時点において、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株におけるＰＰＡＲγの発現量の減少は顕著であった。
【0033】
実施例６
神経細胞において、ＰＡＲＩＳがＰｇｃ－１αのプロモーター領域に結合し、その転写を負に制御するという報告がある（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ ．Ｃｅｌｌ １４４（５）： ６８９－７０２．，２０１１）。３Ｔ３Ｌ１細胞においても、ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）によってＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量が減少した（図６Ａ）。
Ｐｇｃ－１ａのプロモーター下でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するプラスミドを、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞に一過性導入し、Ｐｇｃ－１αのプロモーター活性を解析した。その結果、図６Ｂに示すように、ＰＡＲＩＳ ＯＥによりＰｇｃ－１αのプロモーター活性（転写活性）が減少した。
５つのＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株において、Ｐｇｃ－１α ｍＲＮＡ発現量とＰＡＲＩＳタンパク質発現量をプロットした結果、負に相関した（図６Ｃ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は有意に減少した（図６Ｄ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ミトコンドリア酸素消費速度（呼吸速度）（ＯＣＲ）が減少した（図６Ｅ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ミトコンドリア膜のプロトン電位依存的に蓄積するＴＭＲＭが減少した（図６Ｆ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色したミトコンドリアの数が減少した（図６Ｇ）。
神経細胞において、ＰＡＲＩＳがＰｇｃ－１αのプロモーター領域に結合し、その転写を負に制御するという報告がある（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ ．Ｃｅｌｌ １４４（５）： ６８９－７０２．，２０１１）。３Ｔ３Ｌ１細胞においても、ＰＡＲＩＳを恒常的に発現するＰＡＲＩＳ過剰発現（ＰＡＲＩＳ ＯＥ）によってＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ量が減少した（図６Ａ）。
Ｐｇｃ－１ａのプロモーター下でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するプラスミドを、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞に一過性導入し、Ｐｇｃ－１αのプロモーター活性を解析した。その結果、図６Ｂに示すように、ＰＡＲＩＳ ＯＥによりＰｇｃ－１αのプロモーター活性（転写活性）が減少した。
５つのＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞株において、Ｐｇｃ－１α ｍＲＮＡ発現量とＰＡＲＩＳタンパク質発現量をプロットした結果、負に相関した（図６Ｃ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は有意に減少した（図６Ｄ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ミトコンドリア酸素消費速度（呼吸速度）（ＯＣＲ）が減少した（図６Ｅ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ミトコンドリア膜のプロトン電位依存的に蓄積するＴＭＲＭが減少した（図６Ｆ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色したミトコンドリアの数が減少した（図６Ｇ）。
【0034】
実施例７
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、細胞増殖の速度が減少した（図７Ａ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、細胞老化マーカーであるＣｄｋｎ１ａ（ｐ２１CIP/WAF1）、Ｃｄｋｎ２ａ（ｐ１６INK4a）のｍＲＮＡ量が減少した。一方でＴｒｐ５３は変化がなかった（図７Ｂ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞において、ＰＡＲＩＳ、ｐ１６INK4a、ＤＡＰＩ（核マーカー）の細胞染色を行った。その結果、ＰＡＲＩＳの発現が特に顕著な細胞はｐ１６INK4a陽性であった（図７Ｃ）
図７Ｃと同様の実験系において、１細胞ごとのＰＡＲＩＳとｐ１６INK4aの発現量をプロットした。その結果、ＰＡＲＩＳとｐ１６INK4aの発現量は非常に弱い正の相関を示した（図７Ｄ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞とコントロール（Ｍｏｃｋ）細胞それぞれを、核画分と細胞質画分に分画し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞の核画分でのみｐ１６INK4aの発現量が増加した（図７Ｅ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、細胞増殖の速度が減少した（図７Ａ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥにより、細胞老化マーカーであるＣｄｋｎ１ａ（ｐ２１CIP/WAF1）、Ｃｄｋｎ２ａ（ｐ１６INK4a）のｍＲＮＡ量が減少した。一方でＴｒｐ５３は変化がなかった（図７Ｂ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞において、ＰＡＲＩＳ、ｐ１６INK4a、ＤＡＰＩ（核マーカー）の細胞染色を行った。その結果、ＰＡＲＩＳの発現が特に顕著な細胞はｐ１６INK4a陽性であった（図７Ｃ）
図７Ｃと同様の実験系において、１細胞ごとのＰＡＲＩＳとｐ１６INK4aの発現量をプロットした。その結果、ＰＡＲＩＳとｐ１６INK4aの発現量は非常に弱い正の相関を示した（図７Ｄ）。
ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞とコントロール（Ｍｏｃｋ）細胞それぞれを、核画分と細胞質画分に分画し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果、ＰＡＲＩＳ ＯＥ細胞の核画分でのみｐ１６INK4aの発現量が増加した（図７Ｅ）。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5K】
【図5L】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
