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特開2024-104863シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024104863
(43)【公開日】2024-08-06
(54)【発明の名称】シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240730BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240730BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240730BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240730BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240730BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240730BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240730BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240730BHJP
C12N 5/20 20060101ALI20240730BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240730BHJP
C07K 1/22 20060101ALN20240730BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
C12N15/63 Z
C12M1/34 F
A61P35/00
A61P1/18
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 E
A61K39/395 T
G01N33/574 Z
C07K7/06
C07K14/705
C12N5/20
C12P21/08
C07K1/22
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023009264
(22)【出願日】2023-01-25
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（糖鎖利用による革新的創薬技術開発事業）」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(71)【出願人】
【識別番号】598121341
【氏名又は名称】慶應義塾
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】久野 敦
(72)【発明者】
【氏名】千葉 靖典
(72)【発明者】
【氏名】安形 清彦
(72)【発明者】
【氏名】圷 ゆき枝
(72)【発明者】
【氏名】坂元 亨宇
(72)【発明者】
【氏名】眞杉 洋平
(72)【発明者】
【氏名】山▲崎▼ 剣
(72)【発明者】
【氏名】松田 厚志
【テーマコード（参考）】
4B029
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB15
4B029BB17
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B064AG26
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA05
4B064DA14
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC02
4C085CC23
4C085DD32
4C085DD33
4C085DD34
4C085DD35
4C085DD84
4C085DD88
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045EA51
4H045EA54
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】
シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、ハイブリドーマ、核酸、発現ベクター、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出キット、検出方法、医薬等を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明に係るシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体により、上記目的を達成することができる。
【選択図】なし
シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、ハイブリドーマ、核酸、発現ベクター、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出キット、検出方法、医薬等を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明に係るシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体により、上記目的を達成することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号２若しくは３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項3】
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは
ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは
ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項4】
ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、
ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、若しくは
ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３
を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、若しくは
ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３
を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ。
【請求項6】
受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０として寄託されているハイブリドーマ、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１として寄託されているハイブリドーマ、または受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２として寄託されているハイブリドーマ。
【請求項7】
受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されているハイブリドーマ、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されているハイブリドーマ、若しくは受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２で寄託されているハイブリドーマ若しくはその子孫により産生される抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項8】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項10】
生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出するための、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片を含む検出キット。
【請求項11】
生物学的試料が、がん組織に由来する、請求項１０に記載の検出キット。
【請求項12】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片を使用することを含む、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出方法。
【請求項13】
生物学的試料が、がん組織に由来する、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項14】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片を用いてがん組織に由来する生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定するための方法。
【請求項15】
配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項16】
請求項１５に記載の少なくとも１のペプチドを動物に免疫することを含む、抗体の作製方法。
【請求項17】
請求項１５に記載のペプチドを使用することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を選択するための方法。
【請求項18】
請求項１～４及び７のいずれか１項に記載の抗体、または抗体断片を含む、がんを治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ディスアドヘリン（ＦＸＹＤ５）は、様々な固形がん組織、及び一部の正常細胞においても発現することが知られる膜糖タンパク質である。
ディスアドヘリンはＯ－結合型糖鎖により高度に修飾されることが報告されている（非特許文献３）。
ディスアドヘリンは細胞膜上に発現し、細胞接着を低下させ、がん組織ではがんの浸潤や転移に関与する。特に、Ｏ－結合型糖鎖ディスアドヘリンは細胞間接着をさらに低下させることが報告されている。Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、正常細胞と比較してがん組織において高発現し、Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの阻害によって、細胞接着の低下が阻止されることも報告されている（非特許文献４）。
ディスアドヘリンはＯ－結合型糖鎖により高度に修飾されることが報告されている（非特許文献３）。
ディスアドヘリンは細胞膜上に発現し、細胞接着を低下させ、がん組織ではがんの浸潤や転移に関与する。特に、Ｏ－結合型糖鎖ディスアドヘリンは細胞間接着をさらに低下させることが報告されている。Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、正常細胞と比較してがん組織において高発現し、Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの阻害によって、細胞接着の低下が阻止されることも報告されている（非特許文献４）。
【0003】
これまで、ヒトのディスアドヘリンに対する抗体として、国立がん研究センターにて開発されたＮＣＣ－３Ｇ１０、ＮＣＣ－Ｍ５３や、当該分子上の特定位置のＮ－アセチルガラクトサミン修飾物を認識するｍＡｂ ６Ｃ５が報告されている（非特許文献１～２、５）。
【0004】
しかしながら、これらの既存抗体は、ディスアドヘリンを検出することができるものの、血管など周辺の正常組織に存在するディスアドヘリンも検出するため、がん組織に特異的な、がんの浸潤や転移の促進に作用するディスアドヘリンを特異的に検出するためには十分でなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Dysadherin, a cancer-associated cell membrane glycoprotein, down-regulates E-cadherin and promotes metastasis, Ino Y. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 365-370, 2001.
【非特許文献2】Dysadherin overexpression in pancreatic ductal adenocarcinoma reflects tumor aggressiveness: relationship to e-cadherin expression, Shimamura T. et al., J. Clin. Oncol., 21(4), 659-67, 2003.
【非特許文献3】Aberrant O-glycosylation inhibits stable expression of dysadherin, a carcinoma-associated antigen, and facilitates cell-cell adhesion, Tsuiji H. et al., Glycobiology, vol. 13, no. 7, pp.521-527, 2003.
【非特許文献4】The O-glycosylated ectodomain of FXYD5 impairs adhesion by disrupting cell-cell trans-dimerization of Na, K-ATPase beta 1 subunits, Tokhtaeva E. et al., Journal of Cell Science, 129, 2394-2406, 2016.
【非特許文献5】A strategy for generating cancer-specific monoclonal antibodies to aberrant O-glycoproteins: identification of a novel dysadherin-Tn antibody, Steentoft C. et al., Glycobiology, vol. 29, no. 4, pp. 307-319, 2019.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意研究により、がん組織に発現するディスアドヘリン上のＯ－結合型糖鎖が高度にシアル酸修飾を含むことを見いだし、がん組織に発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体の取得に成功し、本発明の完成に至った。
【0008】
本発明は以下の態様を有する。
［１］ シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片。
［２］ 配列番号２若しくは３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、［１］記載の抗体、またはその抗原結合断片。
［３］ ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは
ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、［１］若しくは［２］に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
［４］ ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、
ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、若しくは
ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３
を含む、［１］若しくは［２］記載の抗体、またはその抗原結合断片。
［５］ ［１］～［４］いずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ。
［６］ 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されているハイブリドーマ、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されているハイブリドーマ、または受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２で寄託されているハイブリドーマ。
［７］ 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されているハイブリドーマ、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されているハイブリドーマ、若しくは受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２で寄託されているハイブリドーマ若しくはその子孫により産生される抗体、またはその抗原結合断片。
［８］ ［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸。
［９］ ［８］に記載の核酸を含有する発現ベクター。
［１０］ 生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出するための、［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、または抗原結合断片を含む検出キット。
［１１］ 生物学的試料が、がん組織に由来する、［１０］に記載の検出キット。
［１２］ ［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片を使用することを含む、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出方法。
［１３］ 生物学的試料が、がん組織に由来する、［１２］に記載の検出方法。
［１５］ ［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片を用いてがん組織に由来する生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定するための方法。
［１５］ 配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
［１６］ ［１５］に記載の少なくとも１のペプチドを動物に免疫することを含む、抗体の作製方法。
［１７］ ［１５］に記載のペプチドを使用することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を選択するための方法。
［１８］ ［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、または抗体断片を含む、がんを治療するための医薬。
［１９］ 配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドの、抗体作製の免疫原としての使用。
［２０］ ［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗体断片の治療上有効量を、それを必要とするがん患者に投与することを含む、がんの治療方法。
［２１］ がんの治療における使用のための［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、または抗体断片。
［２２］ がんの治療用医薬の製造における［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、または抗体断片の使用。
［１］ シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片。
［２］ 配列番号２若しくは３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、［１］記載の抗体、またはその抗原結合断片。
［３］ ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは
ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、［１］若しくは［２］に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
［４］ ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、
ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３、若しくは
ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）２、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）３、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）３
を含む、［１］若しくは［２］記載の抗体、またはその抗原結合断片。
［５］ ［１］～［４］いずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ。
［６］ 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されているハイブリドーマ、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されているハイブリドーマ、または受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２で寄託されているハイブリドーマ。
［７］ 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されているハイブリドーマ、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されているハイブリドーマ、若しくは受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２で寄託されているハイブリドーマ若しくはその子孫により産生される抗体、またはその抗原結合断片。
［８］ ［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸。
［９］ ［８］に記載の核酸を含有する発現ベクター。
［１０］ 生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出するための、［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、または抗原結合断片を含む検出キット。
［１１］ 生物学的試料が、がん組織に由来する、［１０］に記載の検出キット。
［１２］ ［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片を使用することを含む、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出方法。
［１３］ 生物学的試料が、がん組織に由来する、［１２］に記載の検出方法。
［１５］ ［１］～［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片を用いてがん組織に由来する生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定するための方法。
［１５］ 配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
［１６］ ［１５］に記載の少なくとも１のペプチドを動物に免疫することを含む、抗体の作製方法。
［１７］ ［１５］に記載のペプチドを使用することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を選択するための方法。
［１８］ ［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、または抗体断片を含む、がんを治療するための医薬。
［１９］ 配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドの、抗体作製の免疫原としての使用。
［２０］ ［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、またはその抗体断片の治療上有効量を、それを必要とするがん患者に投与することを含む、がんの治療方法。
［２１］ がんの治療における使用のための［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、または抗体断片。
［２２］ がんの治療用医薬の製造における［１］～［４］及び［７］のいずれかに記載の抗体、または抗体断片の使用。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】膵がん患者３症例（ＩＤ：２９６Ｔ、３２３Ｔ、３２５Ｔ）（Ａ～Ｃ）のがん部領域組織におけるディスアドへリンの糖鎖プロファイリングのためのレクチンアレイの結果を示すグラフである。Ｄは膵臓がん細胞株（ＰＳＮ－１）由来ディスアドへリンのレクチンアレイの結果を示す。縦軸は相対シグナル値を示し、横軸にはレクチンアレイチップｖｅｒ１．０に含まれる４５種レクチンのうち特徴的なものを抜粋している。
【図2】マウス免疫抗原用タンパク質発現コンストラクトを示す図である。
【図3】シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体の作製における、マウス免疫のスケジュール及び概要を示す表である。
【図4】３匹のマウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）から得られた抗血清及び既存の抗ＤＡ抗体（３Ｇ１０）を用いたＥＬＩＳＡ測定系による抗体価を示すグラフである。
【図5】３匹のマウスのうちの１匹（マウスＩＤ：ＤＡ＃２）について、細胞融合の条件を示す表である。
【図6】細胞融合からその後の選抜により最終的に３クローンを取得するまでの経過を示す表である。
【図7】ハイブリドーマの培養上清を用い、ＨＣＳにより得られた結果（蛍光顕微鏡画像）の一部である。
【図8】１４種のハイブリドーマの培養上清（ＤＡＰ－１、ＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－４、ＤＡＰ－５、ＤＡＰ－６、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－９、ＤＡＰ－１０、ＤＡＰ－１１、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）及び既存抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ）を用いた、ＢｘＰＣ－３（ディスアドヘリン陽性のヒト膵臓腺がん細胞株（ＢｘＰＣ３））、ＭＣＦ－７（ディスアドヘリン陰性のヒト乳腺がん細胞株、ネガティブコントロール（ＭＣＦ７））、及びｒＤＡ（糖鎖修飾のないリコンビナントヒトディスアドヘリン）に対するウェスタンブロット解析の結果を示す。
【図9】ハイブリドーマの培養上清（ＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）、精製抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍＡｂ）（ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）及び既存抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ）を用いた、ＨＣＳ、ウェスタンブロット解析、モノクローナル抗体のアイソタイプ、抗体グループ、免疫組織化学染色、及びフローサイトメトリーの結果を示す表である。
【図10】ハイブリドーマの培養上清（ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）及び既存抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ）を用いた、シアリダーゼＡ処理あり（ＳＡ（－））または処理なし（ＳＡ（＋））の細胞溶解物（Ａ５４９、ＨＣＣ８２７、ＢｘＰＣ－３（ＢｘＰＣ３）、Ｃａｐａｎ－２（Ｃａｐａｎ２）、ＨＴ２９、ＨＡＫ１Ｂ、ＨＬＦ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３）に対するウェスタンブロット解析の結果を示す。
【図11】ハイブリドーマの培養上清（ＤＡＰ－７）及び既存抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ）を用いた、膵臓がん組織、正常膵臓組織、膵炎組織における免疫組織化学染色の結果を示す。矢尻は血管内皮、矢印は神経、Ｌはランゲルハンス島を示す。
【図12】野生型ヒトディスアドヘリンのアミノ酸配列（配列番号１）及びエピトープマッピングのために設計した変異体８種のアミノ酸配列（配列番号６５～７２）の一部（上段）、及び抗ＤＡ抗体（ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）及び既存抗ＤＡ抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ）のエピトープマッピングの結果（エピトープグループ、エピトープ位置）、及び結合親和性（下段）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の効果を阻害しない範囲で適宜変更を加えて実施することができる。
実施形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
実施形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【0012】
〔抗体〕
本実施形態に係る抗体は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である。
本実施形態に係る抗体は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である。
【0013】
一実施形態において、該抗体は、その製造工程で用いられた細胞、生物体内から単離された、単離抗体である。
【0014】
本明細書において、ディスアドヘリン（ｄｙｓａｄｈｅｒｉｎ）は「ＦＸＹＤ５」、「ＦＸＹＤ５タンパク質」、「ＤＡ」と同義で用いられる。
【0015】
本明細書において、ディスアドヘリンにおけるシアル酸は、いかなるシアル酸も包含し、例えば、その修飾によっても限定されず、アセチル修飾されたシアル酸、グリコリル修飾されたシアル酸、水酸基で置換されたシアル酸等であってもよい。
一実施形態において、本実施形態に係る抗体の特異的結合の観点から、ディスアドヘリンにおけるシアル酸は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）であることが好ましい。
すなわち、一実施形態において、抗体は、ＮｅｕＡｃ修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である。
一実施形態において、本実施形態に係る抗体の特異的結合の観点から、ディスアドヘリンにおけるシアル酸は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）であることが好ましい。
すなわち、一実施形態において、抗体は、ＮｅｕＡｃ修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である。
【0016】
本実施形態に係る抗体は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの少なくとも一部に結合性を有することにより、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する。一方、本実施形態に係る抗体は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有さないディスアドヘリンに対し、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに対する結合性と比較して結合性が低い、または結合しない抗体である。
【0017】
一実施形態において、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、がん組織内のがん細胞において発現するディスアドヘリンである。
よって、一実施形態において、抗体は、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である。
がん細胞では、ディスアドヘリン上のＯ－結合型糖鎖が高度にシアル酸修飾されており、本実施形態に係る抗体によって、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを特異的に検出することができる。
よって、一実施形態において、抗体は、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である。
がん細胞では、ディスアドヘリン上のＯ－結合型糖鎖が高度にシアル酸修飾されており、本実施形態に係る抗体によって、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを特異的に検出することができる。
【0018】
一実施形態において、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖は、ディスアドヘリンにおいて、少なくとも１つ以上のＯ－結合型糖鎖付加位置に付加されている。Ｏ－結合型糖鎖付加位置のアミノ酸は限定されないが、Ｓｅｒ及び／またはＴｈｒであることが好ましい。
【0019】
一実施形態において、抗体が認識するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、抗体が結合する範囲でその由来動物は限定されないが、哺乳動物由来のディスアドヘリンであることが好ましく、ヒト由来のディスアドヘリンであることが好ましい。
【0020】
一実施形態において、抗体は、１つ若しくは複数の任意のＯ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒ及び／またはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するヒトディスアドヘリンに結合する抗体である。
【0021】
本実施形態に係る抗体は、本技術分野で当業者に周知の方法を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【0022】
抗体は、その由来が特に限定されるものではなく、例えば、マウス抗体、ラット抗体、ハムスター抗体、モルモット抗体、ウサギ抗体、アルパカ抗体、ウマ抗体、ヤギ抗体、ヒツジ抗体、サル抗体、イヌ抗体、及び／またはヒト抗体であってもよい。
抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び／またはライブラリー由来であってもよい。例えば、抗体の一部がヒト由来、それ以外がヒト以外に由来するアミノ酸配列を有する抗体であってもよい。
抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び／またはライブラリー由来であってもよい。例えば、抗体の一部がヒト由来、それ以外がヒト以外に由来するアミノ酸配列を有する抗体であってもよい。
【0023】
一実施形態において、抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる観点から、抗体は、野生型ヒトディスアドヘリン（ＵｎｉＰｒｏｔ： Ｑ９６ＤＢ９）（配列番号１）の２４～４６番目のアミノ酸配列（配列番号２）を含むペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する、または野生型ヒトディスアドヘリンの５８～６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）を含むペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する抗体である。
一実施形態において、抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる観点から、抗体は、野生型ヒトディスアドヘリン（配列番号１）の４９～５６番目のアミノ酸配列（配列番号７３）を含むペプチドに結合しない抗体であることが好ましい。
一実施形態において、抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる観点から、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドは、そのＯ－結合型糖鎖付加位置にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を含むことが好ましい。
一実施形態において、抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる観点から、抗体は、野生型ヒトディスアドヘリン（配列番号１）の４９～５６番目のアミノ酸配列（配列番号７３）を含むペプチドに結合しない抗体であることが好ましい。
一実施形態において、抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる観点から、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドは、そのＯ－結合型糖鎖付加位置にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を含むことが好ましい。
【0024】
一実施形態において、抗体は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体である。
【0025】
一実施形態において、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／または配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【0026】
一実施形態において、抗体は、配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号６若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
【0027】
一実施形態において、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／または配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【0028】
一実施形態において、抗体は、配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
【0029】
一実施形態において、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／または配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【0030】
一実施形態において、抗体は、配列番号１２若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１４若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
【0031】
一実施形態において、抗体は、配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における３つの各重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、または配列番号６若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における３つの各軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であってもよい。
【0032】
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、または配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることが好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であっても、または配列番号１９、配列番号２０、及び２配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であっても、または配列番号１９、配列番号２０、及び２配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0033】
一実施形態において、抗体は、配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における４つの重鎖フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、または配列番号６若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における４つの軽鎖フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
【0034】
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であっても、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であっても、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0035】
一実施形態において、抗体は、配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに／または配列番号６若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における４つの重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに／または配列番号６若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における４つの軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
【0036】
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0037】
一実施形態において、配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における３つの各重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、または配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における３つの各軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であってもよい。
【0038】
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、または配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることが好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であっても、または配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であっても、または配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0039】
一実施形態において、抗体は、配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における４つの重鎖フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、または配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における４つの軽鎖フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
【0040】
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、または配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であっても、または配列番号４０、４１、４２、及び４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であっても、または配列番号４０、４１、４２、及び４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0041】
一実施形態において、抗体は、配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに／または配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における４つの重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに／または配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における４つの軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
【0042】
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号３６、３７、３８、及び３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号４０、４１、４２、及び４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号４０、４１、４２、及び４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0043】
一実施形態において、配列番号１２若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における３つの各重鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、または配列番号１４若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における３つの各軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であってもよい。
【0044】
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、または配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることが好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であっても、または配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であっても、または配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0045】
一実施形態において、抗体は、配列番号１２若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における４つの重鎖フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、または配列番号１４若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における４つの軽鎖フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
【0046】
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、または配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であっても、または配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であっても、または配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であってもよい。
抗体は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0047】
一実施形態において、抗体は、配列番号１２若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに／または配列番号１４若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１２若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域における４つの重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに／または配列番号１４若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域における４つの軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることが好ましい。
【0048】
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがより好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列のそれぞれに対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体であることがさらに好ましい。
抗体は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に記載される３つの各重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９に記載される３つの各軽鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、かつ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３に記載される４つの各重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列、並びに配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に記載される４つの各軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列を含む抗体であることがさらに好ましい。
【0049】
一実施形態において、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
【0050】
一実施形態において、抗体は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
【0051】
一実施形態において、抗体は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６３に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６３に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６３に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６３に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
一実施形態において、抗体は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体であってもよい。
【0052】
一実施形態において、本発明に係る抗体の定常領域のアミノ酸配列は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する限り限定されない。
例えば、重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ、またはμのいずれであってもよく、軽鎖定常領域は、λ、κ、またはιのいずれであってもよい。
一実施形態において、本発明に係る抗体のアイソタイプは、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する限り限定されず、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのいずれであってもよく、サブクラスは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、Ｉｇ４、またはＩｇＭのいずれであってもよい。
例えば、重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ、またはμのいずれであってもよく、軽鎖定常領域は、λ、κ、またはιのいずれであってもよい。
一実施形態において、本発明に係る抗体のアイソタイプは、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する限り限定されず、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのいずれであってもよく、サブクラスは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、Ｉｇ４、またはＩｇＭのいずれであってもよい。
【0053】
一実施形態において、抗体は、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０（受託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構、受領日：２０２２年６月１４日）、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１（受託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構、受領日：２０２２年６月１４日）、及び／若しくは受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２（受託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構、受領日：２０２２年６月１４日）により特定される細胞株であるハイブリドーマにより産生される抗体、または該ハイブリドーマの子孫により産生される抗体である。当該子孫には、寄託したハイブリドーマそのもの、寄託されたハイブリドーマを培養したもの、寄託したハイブリドーマから分譲されたもの、これらのさらなる継代培養細胞等が含まれる。
【0054】
一実施形態において、抗体は、低分子化抗体であってもよく、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する限り、全長抗体の一部分が欠損している抗体断片も許容される。すなわち、抗体は、抗体の部分であってもよく、好ましくはその抗原結合領域または可変領域を含む抗原結合断片である。
【0055】
抗原結合断片の具体例として、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＣＤＲ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、ナノボディ、アフィボディ、ダイアボディ、アビマー、ミニボディ、バーサボディ等が挙げられる。
【0056】
抗原結合断片は、当業者に周知の方法を用いて取得することができ、例えば、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。得られた抗原結合断片は、抗体と同様にして抗原との反応性、特異性等を評価することができる。
【0057】
一実施形態において、抗体は、多重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体とは、異なる複数のエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。
多重特異性抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。例えば、二重特異性抗体の場合、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる２種類の抗体は、それぞれが重鎖と軽鎖を有する抗体の１／２分子であっても良いし、重鎖のみからなる抗体の１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、本技術分野で当業者に周知の遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することもできる。
多重特異性抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。例えば、二重特異性抗体の場合、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる２種類の抗体は、それぞれが重鎖と軽鎖を有する抗体の１／２分子であっても良いし、重鎖のみからなる抗体の１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、本技術分野で当業者に周知の遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することもできる。
【0058】
〔ペプチド〕
本実施形態に係るペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下若しくは１以下のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下若しくは１以下のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む単離されたペプチドである。
本実施形態に係るペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下若しくは１以下のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくは１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下若しくは１以下のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む単離されたペプチドである。
【0059】
ペプチドは、野生型ヒトディスフェリンのアミノ酸配列（配列番号１）において、２４番目～４６番目に対応するアミノ酸配列（配列番号２）を含むペプチド、または５８番目～６６番目に対応するアミノ酸配列（配列番号３）を含むペプチドであることが好ましい。
【0060】
一実施形態において、ペプチドは、１または複数のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖付加位置を含んでいてもよく、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドであってもよい。
【0061】
〔抗体〕に記載されるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体は、一実施形態において、本実施形態に係るいずれかのペプチドをエピトープとしてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合してもよい。
従って、一実施形態において、本実施形態に係るいずれかのペプチドは、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体を作製するための抗原ペプチドとして使用することができる。
抗原ペプチドとして、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドが好ましい。これにより、取得される抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる。
従って、一実施形態において、本実施形態に係るいずれかのペプチドは、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体を作製するための抗原ペプチドとして使用することができる。
抗原ペプチドとして、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドが好ましい。これにより、取得される抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる。
【0062】
一実施形態において、抗体が、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合し易くなる観点から、抗原ペプチドとして、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドは、そのＯ－結合型糖鎖付加位置にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を含むことが好ましい。
【0063】
該抗原ペプチドは、例えば〔抗体の作製〕に記載した方法において用いることができる。
一実施形態として、ペプチドを抗原ペプチドとして用いる場合、〔抗体の作製〕に説明するとおり、ペプチドは、適切な担体に結合していてもよい。
一実施形態として、ペプチドを抗原ペプチドとして用いる場合、〔抗体の作製〕に説明するとおり、ペプチドは、適切な担体に結合していてもよい。
【0064】
一実施形態において、本実施形態に係るペプチドは、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を選択するための方法に用いることができる。
【0065】
〔抗体の作製〕に説明するとおり、例えば、作製した候補ハイブリドーマの中から、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するために、ペプチド（抗原ペプチド）を使用することができる。
具体的には、ＥＬＩＳＡ法またはウェスタンブロット法等によって、該ペプチドを含むタンパク質または抗原ペプチドに対する産生抗体の結合性を評価することにより、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
具体的には、ＥＬＩＳＡ法またはウェスタンブロット法等によって、該ペプチドを含むタンパク質または抗原ペプチドに対する産生抗体の結合性を評価することにより、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【0066】
〔抗体の作製〕
本実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体として作製することも、ポリクローナル抗体として作製することもできる。
本実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体として作製することも、ポリクローナル抗体として作製することもできる。
【0067】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主を用いた遺伝子工学的手法等の、本技術分野で当業者に周知の方法によって作製することができる。
【0068】
具体的には、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合するモノクローナル抗体は、本技術分野で当業者に周知の方法により、生物学的試料から単離したディスアドヘリン分子、または〔ペプチド〕に記載のいずれかのペプチドを、抗原ペプチドとして哺乳動物に対して投与することにより、すなわち、抗体産生が可能な部位にそれ自体、または担体、希釈剤と共に投与することにより、作製することができる。
抗原タンパク質またはペプチドが合成タンパク質またはペプチドである場合、これらを大量に発現させ、精製して、免疫原として用いることができる。
抗原タンパク質またはペプチドが合成タンパク質またはペプチドである場合、これらを大量に発現させ、精製して、免疫原として用いることができる。
【0069】
担体としては、抗原性刺激のあるキャリアタンパク質、例えば、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシサイログロブリン、オボアルブミン（ＯＶＡ）を使用することができる。
担体と抗原ペプチドとの混合比、及び抗原と担体との結合のための縮合剤は、所望の抗体が得られる範囲で限定されない。
担体と抗原ペプチドとの混合比、及び抗原と担体との結合のための縮合剤は、所望の抗体が得られる範囲で限定されない。
【0070】
抗原ペプチドの投与に際し、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバント、または不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。その投与頻度は本技術分野で当業者に周知の方法に従って適宜決定することができる。
【0071】
モノクローナル抗体の作製のために用いられる哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、アルパカ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌであってもよいが、細胞融合の工程でのミエローマ細胞との適合性を考慮すれば、マウス、ラット、またはハムスターが好ましく、マウスがより好ましい。
【0072】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製のため、抗原ペプチドを免疫された哺乳動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２～５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させる。
哺乳動物における抗血清中の抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法等の当業者に周知の方法に従って行えばよい。
細胞融合操作は当業者に周知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５（１９７５年）］に従って行えばよい。ミエローマ細胞は、本技術分野で周知の細胞から適宜選択すればよく、例えば、ＮＳ－１、Ｐ３Ｕ１、及びＳＰ２／０から選択することができる。
細胞融合条件は、当業者が適宜決定できるが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを通常約１：１～２０：１の比で混合し、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ１０００～ＰＥＧ６０００）を１０～８０％程度の濃度で添加し、約２０～４０℃、好ましくは約３０～３７℃で約１～１０分間インキュベートすることにより、効率よく細胞融合を実施できる。細胞融合促進のため、センダイウイルス由来の膜タンパク質（ＨＶＪ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ）等のＰＥＧ以外の周知の試薬を用いることもできる。
哺乳動物における抗血清中の抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法等の当業者に周知の方法に従って行えばよい。
細胞融合操作は当業者に周知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５（１９７５年）］に従って行えばよい。ミエローマ細胞は、本技術分野で周知の細胞から適宜選択すればよく、例えば、ＮＳ－１、Ｐ３Ｕ１、及びＳＰ２／０から選択することができる。
細胞融合条件は、当業者が適宜決定できるが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを通常約１：１～２０：１の比で混合し、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ１０００～ＰＥＧ６０００）を１０～８０％程度の濃度で添加し、約２０～４０℃、好ましくは約３０～３７℃で約１～１０分間インキュベートすることにより、効率よく細胞融合を実施できる。細胞融合促進のため、センダイウイルス由来の膜タンパク質（ＨＶＪ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ）等のＰＥＧ以外の周知の試薬を用いることもできる。
【0073】
細胞融合した、ハイブリドーマの選択は、本技術分野で当業者に周知の方法に従って行うことができ、ハイブリドーマが選択できる範囲で限定されないが、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地を用いることができる。
例えば、１～２０％、好ましくは１０～２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１～１０％のウシ胎児血清を含むＧＩＴ培地（富士フイルム和光純薬（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ－１０１、日水製薬（株））、１０～２０％のウシ胎児血清を含むハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、インビトロジェン）等を用いてもよい。
ハイブリドーマ選択のための培養条件は、当業者が適宜決定できるが、例えば、培養温度は、通常２０～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日～３週間、好ましくは１週間～２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なってもよい。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定することができる。
例えば、１～２０％、好ましくは１０～２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１～１０％のウシ胎児血清を含むＧＩＴ培地（富士フイルム和光純薬（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ－１０１、日水製薬（株））、１０～２０％のウシ胎児血清を含むハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、インビトロジェン）等を用いてもよい。
ハイブリドーマ選択のための培養条件は、当業者が適宜決定できるが、例えば、培養温度は、通常２０～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日～３週間、好ましくは１週間～２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なってもよい。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定することができる。
【0074】
所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、本技術分野で当業者に周知の方法に従って行うことができる。
例えば、ＥＬＩＳＡ法またはウェスタンブロット法等の、抗原タンパク質または抗原ペプチドに対する産生抗体の結合性を評価する方法によって、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
例えば、ＥＬＩＳＡ法またはウェスタンブロット法等の、抗原タンパク質または抗原ペプチドに対する産生抗体の結合性を評価する方法によって、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【0075】
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の作製は、本技術分野で当業者に周知の方法に従って行うことができる。
例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよく、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。
モノクローナル抗体の精製は、ハイブリドーマの培養上清又は培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、またはハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳動物から採取した腹水を、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、またはこれらの方法を適宜組み合わせた、当業者に周知の方法により行うことができる。
例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよく、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。
モノクローナル抗体の精製は、ハイブリドーマの培養上清又は培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、またはハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳動物から採取した腹水を、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、またはこれらの方法を適宜組み合わせた、当業者に周知の方法により行うことができる。
【0076】
ハイブリドーマとしては、例えば、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されている細胞株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されている細胞株、及び／または受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されている細胞株を用いることができる。
【0077】
一実施形態において、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生される抗体をコードする塩基配列を解析し、その抗体遺伝子またはその一部を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を用い、遺伝子工学的に作製することもできる。
【0078】
ここで、抗体をコードする塩基配列は、〔抗体〕において説明したいずれかの抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることが好ましい。
【0079】
一実施形態において、ポリクローナル抗体は、上記の方法により、抗原ペプチドを投与することにより免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳等、好ましくは血液から採取することができ、ニワトリを免疫した場合は血液及び卵黄から採取できる。
【0080】
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定、抗原ペプチドに対する結合性の評価、ポリクローナル抗体の分離精製等は、上記のモノクローナル抗体の作製方法に従って行うことができる。
【0081】
〔ハイブリドーマ〕
本実施形態に係るハイブリドーマは、〔抗体〕で説明したシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を産生する、ハイブリドーマである。
本実施形態に係るハイブリドーマは、〔抗体〕で説明したシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を産生する、ハイブリドーマである。
【0082】
一実施形態において、ハイブリドーマは、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されている細胞株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１で寄託されている細胞株、及び／または受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０で寄託されている細胞株である、ハイブリドーマである。
【0083】
ハイブリドーマは、〔抗体の作製〕において、モノクローナル抗体の作製方法として説明した本技術分野で当業者に周知の方法によって作製することができる。
【0084】
〔核酸及び発現ベクター〕
本実施形態に係る核酸は、〔抗体〕において説明したいずれかの抗体、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸である。
本実施形態に係る核酸は、〔抗体〕において説明したいずれかの抗体、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸である。
【0085】
〔抗体の作製〕で説明したとおり、一実施形態において、本実施形態に係る核酸、すなわち抗体遺伝子を、適切な発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入することによって、抗体を遺伝子工学的に作製することができる。
抗体遺伝子の単離、抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されており（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775）、本技術分野で周知の方法に従って、当業者が行うことができる。
抗体遺伝子の単離、抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されており（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775）、本技術分野で周知の方法に従って、当業者が行うことができる。
【0086】
一実施形態に係る核酸は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、若しくは配列番号６３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはそれらのいずれかの一部のアミノ酸配列を有するものであることが好ましいが、該各塩基配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する塩基配列を有する核酸であってもよい。
ここで、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３に記載のアミノ酸配列の一部とは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖フレームワーク１～４、または軽鎖フレームワーク１～４であってもよい。
一実施形態において、核酸は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、若しくは配列番号６３に記載のアミノ酸配列、またはそれらのいずれかの一部のアミノ酸配列に対し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０アミノ酸残基が付加、欠失、及び／または置換したアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、並びに、そのような変異を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸に相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、核酸同士の、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列同一性が高い核酸、すなわち塩基配列が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより配列同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件は、当該分野で周知の方法に従って当業者が適宜選択することができる。
ここで、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３に記載のアミノ酸配列の一部とは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖フレームワーク１～４、または軽鎖フレームワーク１～４であってもよい。
一実施形態において、核酸は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、若しくは配列番号６３に記載のアミノ酸配列、またはそれらのいずれかの一部のアミノ酸配列に対し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０アミノ酸残基が付加、欠失、及び／または置換したアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、並びに、そのような変異を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸に相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、核酸同士の、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列同一性が高い核酸、すなわち塩基配列が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより配列同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件は、当該分野で周知の方法に従って当業者が適宜選択することができる。
【0087】
本実施形態に係る発現ベクターは、上記核酸のいずれかを含む発現ベクターである。
【0088】
該発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、培養することにより、核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む抗体、または抗体の一部を産生することができ、本発明に係る抗体を作製することができる。
【0089】
使用する発現ベクターは、当業者が周知のベクターから適宜選択することができ、抗体またはその抗原結合断片を発現することができる範囲で限定されない。
【0090】
〔検出方法〕
本実施形態に係る検出方法は、〔抗体〕に記載のいずれかの抗体、またはその抗原結合断片を使用することを含む、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出方法である。
本実施形態に係る検出方法は、〔抗体〕に記載のいずれかの抗体、またはその抗原結合断片を使用することを含む、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出方法である。
【0091】
〔抗体〕に記載の抗体、またはその抗原結合断片は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する。すなわち、一実施形態において、抗体、またはその抗原結合断片は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合し、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有さないディスアドヘリンに対し、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに対する結合性と比較して結合性が低い若しくは結合しない抗体、またはその抗原結合断片である。従って、〔抗体〕に記載の抗体、またはその抗原結合断片を使用することにより、生物学的試料において、ディスアドヘリンの中でも、特にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することができる。
【0092】
ここで、本実施形態において、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体の例及び好ましい例は、〔抗体〕に記載のとおりである。
【0093】
一実施形態において、生物学的試料は、その由来生物種が特に限定されるものではなく、使用する抗体が、少なくとも特異的に結合し得るシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを有する生物種であればよいが、その検出感度を考慮すれば、抗体が、哺乳動物のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合する抗体である場合、生物学的試料は、哺乳動物由来であることが好ましい。抗体が、特定の哺乳動物のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である場合、生物学的試料は、同一の哺乳動物由来であることがより好ましい。例えば、抗体が、ヒトのシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体である場合、生物学的試料はヒト由来であることが好ましい。
【0094】
がん細胞では、正常細胞と比較して、ディスアドヘリン上のＯ－結合型糖鎖が高度にシアル酸修飾されている。よって、抗体が、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する場合、がん細胞で発現するシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを特異的に検出することができる。
【0095】
従って、一実施形態において、生物学的試料は、好ましくはヒトである哺乳動物由来の、がん組織またはがん組織であると疑われる組織に由来することが好ましい。生物学的試料は、単離された細胞であっても、組織であってもよい。
がんの種類は、その細胞または組織にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが含まれる可能性のある範囲で限定されず、例えば、膵臓がん、肝臓がん、胆道がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がんを含む）、乳がん、頭頸部がん、甲状腺がん、唾液腺がん、中皮腫、食道がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、腎盂・尿管がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮肉腫、皮膚がん、メラノーマ、肉腫、脳腫瘍が挙げられるが、膵臓がんであることが好ましい。
がんの種類は、その細胞または組織にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが含まれる可能性のある範囲で限定されず、例えば、膵臓がん、肝臓がん、胆道がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がんを含む）、乳がん、頭頸部がん、甲状腺がん、唾液腺がん、中皮腫、食道がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、腎盂・尿管がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮肉腫、皮膚がん、メラノーマ、肉腫、脳腫瘍が挙げられるが、膵臓がんであることが好ましい。
【0096】
生物学的試料は、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出するために用いることのできるあらゆる生物学的試料を包含する。
一実施形態において、生物学的試料は、血液関連試料（例えば、全血、血清、血漿、または他の血液由来試料）、尿、精液、脳脊髄液等の体液、若しくは気管支肺胞洗浄液等の液体生物学的試料であっても、または培養細胞、培養組織、生体由来細胞、若しくは生体由来固形組織であってもよい。生物学的試料が生体由来である場合には、生検によって取得してもよく、または外科手術により切除された組織から取得してもよい。
一実施形態において、生物学的試料は、血液関連試料（例えば、全血、血清、血漿、または他の血液由来試料）、尿、精液、脳脊髄液等の体液、若しくは気管支肺胞洗浄液等の液体生物学的試料であっても、または培養細胞、培養組織、生体由来細胞、若しくは生体由来固形組織であってもよい。生物学的試料が生体由来である場合には、生検によって取得してもよく、または外科手術により切除された組織から取得してもよい。
【0097】
生物学的試料は、新鮮な試料であっても、組織固定液等の中で保存された試料であってもよく、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出の方法に従って、当業者が適宜選択することができる。
【0098】
一実施形態において、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出は、抗体を用いた方法として当業者に周知の免疫学的手法によって行うことができ、例えば、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）を含むＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等が挙げられる。
免疫学的手法に用いる緩衝液、陽性または陰性対照試料、二次抗体、シグナル可視化試薬等は、当該分野で周知の方法に従って当業者が適宜選択することができる。
免疫学的手法に用いる緩衝液、陽性または陰性対照試料、二次抗体、シグナル可視化試薬等は、当該分野で周知の方法に従って当業者が適宜選択することができる。
【0099】
免疫学的手法に供するために、例えば、生物学的試料を、適切な緩衝液中において超音波装置やホモジナイザー等で処理し、溶解物を取得してもよい。処理済試料において、必要に応じ、タンパク質を濃縮する等の前処理を行ってもよい。このように調製した試料に対し、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を反応させることによって、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することができる。
【0100】
または、免疫学的手法に供するために、生物学的試料が組織の場合、当業者に周知の方法に従って生物学的試料の組織切片を作製してプレパラートを調製してもよい。組織切片に対し、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を反応させることによって、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することができる。特に、組織切片を用いた場合には、生物学的試料内のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの局在も併せて検出することができる。
【0101】
〔検出キット〕
本実施形態に係る検出キットは、生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出するための、〔抗体〕に記載のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を含む検出キットである。
本実施形態に係る検出キットは、生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出するための、〔抗体〕に記載のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を含む検出キットである。
【0102】
シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体の例及び好ましい例は〔抗体〕に記載のとおりである。
【0103】
一実施形態において、本発明に係る検出キットは、〔検出方法〕で説明した方法を実施するために用いることができる。
【0104】
一実施形態において、検出キットを適用する生物学的試料は、がん組織に由来することが好ましい。
【0105】
一実施形態において、検出キットを適用する生物学的試料は、好ましくはヒトである哺乳動物由来のがん組織に由来することが好ましい。
【0106】
一実施形態において、検出キットは、生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに対する、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の結合を検出するための試薬として、緩衝液またはその濃縮液、陽性または陰性対照試料、生物学的試料調製用試薬、二次抗体、シグナル可視化試薬、防腐剤、ブロッキング試薬、安定剤等を、１つ以上含んでいてもよい。
【0107】
一実施形態において、検出キットに含まれるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片は、検出工程に必要な修飾が付されたものであってもよい。修飾は、当業者が周知の技術から適宜選択することができるが、例えば、ビオチン、蛍光物質、酵素等であってもよい。
【0108】
一実施形態において、検出キットは、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が固定化された媒体を含んでいてもよい。
媒体は、当業者に周知の物質から適宜選択することができ、例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等からなるフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ、または磁性素材等からなる粒子等であってもよい。
媒体は、当業者に周知の物質から適宜選択することができ、例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等からなるフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ、または磁性素材等からなる粒子等であってもよい。
【0109】
一実施形態において、媒体は、例えば、〔検出方法〕で説明したとおり、免疫学的手法に供するために生物学的試料を処理して得られた溶解物等を滴下する部分または試料を浸す第一の部分と、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が固定化された第二の部分と、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有する。
一実施形態において、媒体として、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識された、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むクロマトグラフ媒体を挙げることができる。
クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。このようなクロマトグラフ媒体を用いることにより、生物学的試料中にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが含まれるか否かを検出することが可能である。
一実施形態において、媒体として、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識された、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むクロマトグラフ媒体を挙げることができる。
クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。このようなクロマトグラフ媒体を用いることにより、生物学的試料中にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが含まれるか否かを検出することが可能である。
【0110】
その原理としては、生物学的試料を処理して得られた溶解物等をクロマトグラフ媒体の第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、第一の部分に含まれる標識された抗体またはその抗原結合断片と反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出が可能となる。第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。これに対して、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの抗原を含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識された抗体またはその抗原結合断片が、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが含まれるか否かを検出することが可能である。
【0111】
〔検査キット、診断キット〕
〔検出キット〕に記載の検出キットを使用することで、生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することができる。
よって、下記のとおり、〔検出キット〕に記載の検出キットを含む検査キット、または診断キットを提供することができる。
〔検出キット〕に記載の検出キットを使用することで、生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することができる。
よって、下記のとおり、〔検出キット〕に記載の検出キットを含む検査キット、または診断キットを提供することができる。
【0112】
がん細胞では、正常細胞と比較して、ディスアドヘリン上のＯ－結合型糖鎖が高度にシアル酸修飾されており、細胞接着を著しく低下させてがんの浸潤や転移に関与することが報告されている。従って、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、がんの治療標的となり得る。
例えば、生物学的試料ががん組織に由来する場合、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することによって、該がんが、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性が高いか否かを決定することができる。
例えば、生物学的試料ががん組織に由来する場合、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することによって、該がんが、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性が高いか否かを決定することができる。
【0113】
よって、一実施形態において、〔検出キット〕に記載の検出キットは、がん患者から取得した生物学的試料（がん組織）におけるシアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することによって、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定するための、検査キット、または診断キットとして用いることができる。
【0114】
〔がん患者特定方法、診断方法〕
本実施形態に係るがん患者を特定するための方法は、〔抗体〕に記載の抗体または抗原結合断片を用いて生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定するための方法である。
本実施形態に係るがん患者を特定するための方法は、〔抗体〕に記載の抗体または抗原結合断片を用いて生物学的試料におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを検出することを含む、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定するための方法である。
【0115】
がん細胞では、正常細胞と比較して、ディスアドヘリン上のＯ－結合型糖鎖が高度にシアル酸修飾されており、細胞接着を著しく低下させてがんの浸潤や転移に関与することが報告されている。従って、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンは、がんの治療標的となり得る。よって、例えば、生物学的試料ががん組織に由来する場合、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出を実施し、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが検出されることを基準として、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定することができる。
【0116】
また、一実施形態において、例えば、生物学的試料ががん組織に由来する場合、がん患者から取得した生物学的試料（がん組織）におけるシアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンの検出を実施し、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが検出されることを基準として、シアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高いがん患者を特定することができ、特定されたがん患者はシアル酸Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に適用であると診断することができる。
【0117】
一実施形態において、本実施形態に係るがん患者を特定するための方法、及び診断方法は、〔検出キット〕、〔検査キット、診断キット〕に記載のキットを用いて実施してもよい。
【0118】
〔医薬、治療方法、使用〕
本実施形態に係る医薬は、〔抗体〕に記載される少なくとも１の抗体または抗体断片を含む、がんを治療するための医薬である。
本実施形態に係る医薬は、〔抗体〕に記載される少なくとも１の抗体または抗体断片を含む、がんを治療するための医薬である。
【0119】
本実施形態に係る治療方法は、〔抗体〕に記載される少なくとも１の抗体または抗体断片の治療上有効量を、それを必要とするがん患者に投与することを含む、がんの治療方法である。
【0120】
本実施形態に係る抗体または抗体断片は、〔抗体〕に記載される少なくとも１の抗体または抗体断片であって、がんの治療における使用のための抗体または抗体断片である。
【0121】
本実施形態に係る使用は、がんの治療用医薬の製造における、〔抗体〕に記載される少なくとも１の抗体または抗体断片の使用である。
【0122】
ここで、「医薬」、「治療方法」、「抗体または抗体断片」、及び「使用」についての本実施形態において、抗体の例及び好ましい例は、〔抗体〕に記載されるとおりである。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び／またはライブラリー由来であってもよく、抗体の一部がヒト由来、それ以外がヒト以外に由来するアミノ酸配列を有する抗体であってもよいが、治療対象の動物種に従って、改変されていることが好ましい。例えば、ヒトの治療用の医薬に使用する場合は、ヒト化された抗体であってもよい。
【0123】
治療対象は、がん細胞においてＯ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが高度にシアル酸修飾されており、〔抗体〕に記載のいずれかの抗体が、がん細胞におけるシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する範囲で限定されないが、抗体の結合親和性を考慮すれば、抗体が、哺乳動物のシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合する抗体である場合、哺乳動物由来であることが好ましい。抗体が、ヒトのシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに結合する抗体である場合、治療対象は、ヒトであることが好ましい。
【0124】
がんの種類は、その細胞または組織にシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが含まれる可能性のある範囲で限定されず、例えば、膵臓がん、肝臓がん、胆道がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がんを含む）、乳がん、頭頸部がん、甲状腺がん、唾液腺がん、中皮腫、食道がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、腎盂・尿管がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮肉腫、皮膚がん、メラノーマ、肉腫、脳腫瘍が挙げられるが、膵臓がんであることが好ましい。
【0125】
本実施形態において、抗体または抗体断片は、製剤化されていてもよく、１または複数の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製されてもよい。
薬学的に許容される担体は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の、砂糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン系表面活性剤であってもよい。
薬学的に許容される担体は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の、砂糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン系表面活性剤であってもよい。
【0126】
抗体または抗体断片は、全身的または局所的に、経口投与または非経口で治療対象に投与することができる。
【0127】
抗体または抗体断片は、その他の有効成分と共に製剤化されて、治療対象に投与されても、その他の有効成分とは別に製剤化された併用医薬として治療対象に投与されてもよい。併用医薬として用いられる場合、その他の有効成分と同時に、別々に、または連続して投与されてもよい。
【0128】
一実施形態において、「医薬」、「治療方法」、「抗体または抗体断片」、及び「使用」において、〔がん患者特定方法、診断方法〕に記載の方法によって、生物学的試料においてシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンが検出された対象に、抗体または抗体断片が投与されてもよい。これにより、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンを標的とした治療に応答する可能性の高い対象に対する治療を行うことができる。
【実施例0129】
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例により本発明の解釈が限定されるものではない。
【0130】
［実施例１］がん組織におけるレクチンマイクロアレイ解析
ディスアドへリン上にがんに特徴的な糖鎖が生じるかを予備的に検証するために、ランダムに選抜された膵がん患者３症例（ＩＤ：２９６Ｔ、３２３Ｔ、３２５Ｔ）のがん部領域組織を用い、以下の実験を実施した。
なお、非がん部を対照として実施すべきだが、当該タンパク質の発現が非がん部において認められなかったため以後の実験には用いなかった。
ディスアドへリン上にがんに特徴的な糖鎖が生じるかを予備的に検証するために、ランダムに選抜された膵がん患者３症例（ＩＤ：２９６Ｔ、３２３Ｔ、３２５Ｔ）のがん部領域組織を用い、以下の実験を実施した。
なお、非がん部を対照として実施すべきだが、当該タンパク質の発現が非がん部において認められなかったため以後の実験には用いなかった。
【0131】
（既存抗ディスアドへリン抗体を用いた組織標本中ディスアドへリンのエンリッチ）
膵がん患者３症例のがん部凍結組織を、常法に則り可溶化し、取得溶液を組織溶解物とした。なお、その際用いた可溶化緩衝液は１％プロテアーゼインヒビター（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）緩衝液である。各サンプルの組織ライセートの液量として１０μＬ相当を用い、久野らや我妻らの方法（Ｋｕｎｏ Ａ. ｅｔ ａｌ．, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８， ９９－１０８（２００９）、Ｗａｇａｔｓｕｍａ Ｔ. ｅｔ ａｌ．, Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０， ３３８（２０２０））に準じ、免疫沈降を行った。
膵がん患者３症例のがん部凍結組織を、常法に則り可溶化し、取得溶液を組織溶解物とした。なお、その際用いた可溶化緩衝液は１％プロテアーゼインヒビター（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）緩衝液である。各サンプルの組織ライセートの液量として１０μＬ相当を用い、久野らや我妻らの方法（Ｋｕｎｏ Ａ. ｅｔ ａｌ．, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８， ９９－１０８（２００９）、Ｗａｇａｔｓｕｍａ Ｔ. ｅｔ ａｌ．, Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０， ３３８（２０２０））に準じ、免疫沈降を行った。
【0132】
上記免疫沈降において、プレクリアに使用したストレプトアビジン固定磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１、ＤＹＮＡＬ社製）は１０μＬ分であり、免疫沈降には当該磁気ビーズ１０μＬ、及びビオチン化抗ディスアドへリン抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ（ＮＣＣ－Ｍ５３、Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２１（４）６５９－６６７（２００３）に説明される。国立がん研究センターにて作製された。））１μｇを用いた。ビーズの洗浄には１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴｘ）を用いた。磁気ビーズに捕捉されたディスアドへリンの溶出のために、沈降後の磁気ビーズペレットへ０．２％ＳＤＳ含有ＴＢＳ緩衝液を１０μＬ加え、９５℃で１０分間加熱処理をした。回収専用磁石により磁気ビーズをトラップし、取得された上清に上記磁気ビーズ２０μＬ分を加え、加熱により該当タンパク質とともに溶出されたビオチン化抗体を、磁気ビーズにトラップ除去し、最終取得上清をディスアドへリン溶出液（ディスアドへリンエンリッチ）とした。該溶出液の半量を用いて常法に従ってウェスタンブロットを行った。なお、泳動ゲルには１０－２０％グラジェントポリアクリルアミドゲルを用い、検出１次抗体には上記ビオチン化抗体を用い、検出にはストレプトアビジン－ＨＲＰ及び検出用基質（ＩｍｍｎｏＳｔａｒＬＤ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）を用いた。これによりがん部より免疫沈降によりディスアドへリン分子のエンリッチが確認できた。ただし、免疫沈降による組織ライセート中ディスアドへリンの回収率が悪かったため、非結合画分を用い、上記と同様の方法により再度ディスアドへリンのエンリッチを行った。２回分のエンリッチ溶液の半量について以後のレクチンアレイ解析に用いた。
【0133】
（レクチンアレイによる組織中ディスアドへリンの糖鎖プロファイリング）
次に、がん部組織におけるディスアドへリンの糖鎖のそれぞれを認識するレクチンの種類を確認するために、上記方法により取得されたディスアドへリンエンリッチを用い、久野らや我妻らの方法（Ｋｕｎｏ Ａ. ｅｔ ａｌ．,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８， ９９－１０８（２００９）、Ｗａｇａｔｓｕｍａ Ｔ. ｅｔ ａｌ., Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０， ３３８（２０２０））に準じ、レクチンアレイ解析（抗体オーバーレイ法）を行った。その際に用いたレクチンアレイチップは、市販チップＬｅｃＣｈｉｐ ｖｅｒ１．０である（グライコテクニカ社製）。
各サンプル（ディスアドへリンエンリッチ）を、上記ＬｅｃＣｈｉｐ ｖｅｒ１．０に、液量として半量をアプライし、１０時間以上、２０℃で結合反応させた。未反応の基板上レクチンに検出用抗体上の糖鎖が結合し、ノイズとして生じてしまうことを避けるため、ヒト血清由来ＩｇＧ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２μＬ加え、３０分反応させた。その後、上記ビオチン化抗体を１００ｎｇ添加し１時間、２０℃反応し、次いでＣｙ３標識ストレプトアビジンを２００ｎｇ添加し３０分、２０℃反応し、余剰蛍光物質をＰＢＳＴｘ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＰＢＳ）で洗浄したのちに、ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ１２００（グライコテクニカ社製）でアレイスキャンすることで結合シグナルの検出を行った。
次に、がん部組織におけるディスアドへリンの糖鎖のそれぞれを認識するレクチンの種類を確認するために、上記方法により取得されたディスアドへリンエンリッチを用い、久野らや我妻らの方法（Ｋｕｎｏ Ａ. ｅｔ ａｌ．,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８， ９９－１０８（２００９）、Ｗａｇａｔｓｕｍａ Ｔ. ｅｔ ａｌ., Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０， ３３８（２０２０））に準じ、レクチンアレイ解析（抗体オーバーレイ法）を行った。その際に用いたレクチンアレイチップは、市販チップＬｅｃＣｈｉｐ ｖｅｒ１．０である（グライコテクニカ社製）。
各サンプル（ディスアドへリンエンリッチ）を、上記ＬｅｃＣｈｉｐ ｖｅｒ１．０に、液量として半量をアプライし、１０時間以上、２０℃で結合反応させた。未反応の基板上レクチンに検出用抗体上の糖鎖が結合し、ノイズとして生じてしまうことを避けるため、ヒト血清由来ＩｇＧ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２μＬ加え、３０分反応させた。その後、上記ビオチン化抗体を１００ｎｇ添加し１時間、２０℃反応し、次いでＣｙ３標識ストレプトアビジンを２００ｎｇ添加し３０分、２０℃反応し、余剰蛍光物質をＰＢＳＴｘ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＰＢＳ）で洗浄したのちに、ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ１２００（グライコテクニカ社製）でアレイスキャンすることで結合シグナルの検出を行った。
【0134】
結果を図１に示す。なお、図１の各グラフにおいて、縦軸は相対シグナル値を示し、横軸にはレクチンアレイチップｖｅｒ１．０に含まれる４５種レクチンのうち特徴的なものを抜粋している。
図１に示すように、それぞれの症例（Ａ）～（Ｃ）（ＩＤ：２９６Ｔ、３２３Ｔ、３２５Ｔ）において、酷似したシグナルパターンを有していることが分かった。すなわち、Ｏ－結合型糖鎖のシアル酸クラスターを認識するＷＧＡ、ジシアリルコア１構造を認識するＭＡＨ、及びコア１構造を認識するＪａｃａｌｉｎにおいてシグナルが得られた。この特徴は、膵臓がん細胞株（ＰＳＮ－１）由来ディスアドへリンのレクチンアレイの結果（Ｄに示す）と一致した。
なお、ＣａｌｓｅｐａはＮ－結合型糖鎖認識レクチンであり、Ｏ－結合型糖鎖のみを有するディスアドへリンとの結合性について、原因は不明である。
図１に示すように、それぞれの症例（Ａ）～（Ｃ）（ＩＤ：２９６Ｔ、３２３Ｔ、３２５Ｔ）において、酷似したシグナルパターンを有していることが分かった。すなわち、Ｏ－結合型糖鎖のシアル酸クラスターを認識するＷＧＡ、ジシアリルコア１構造を認識するＭＡＨ、及びコア１構造を認識するＪａｃａｌｉｎにおいてシグナルが得られた。この特徴は、膵臓がん細胞株（ＰＳＮ－１）由来ディスアドへリンのレクチンアレイの結果（Ｄに示す）と一致した。
なお、ＣａｌｓｅｐａはＮ－結合型糖鎖認識レクチンであり、Ｏ－結合型糖鎖のみを有するディスアドへリンとの結合性について、原因は不明である。
【0135】
以上から、膵がん患者組織のがん部にはディスアドへリンが存在し、その糖鎖構造としてシアル酸の修飾を高度に受けるＯ－結合型糖鎖を有している特徴があることが明らかになった。
【0136】
［実施例２］シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体の作製のための免疫原の作製
【0137】
（ＧＦＰタグ付きディスアドへリンＤＡ－ＧＦＰの発現）
マウス免疫抗原用タンパク質発現コンストラクトを図２に示す。
ヒトディスアドへリン（ＤＡ）のアミノ酸配列情報（ＵｎｉＰｒｏｔ： Ｑ９６ＤＢ９）を配列番号１に示す。
膵臓がんの培養細胞の発現量比較解析に基づき、ＢｘＰＣ－３細胞をディスアドへリン高発現細胞として用いた。ＢｘＰＣ－３細胞からＲＮＡを調製しｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法により細胞外ドメイン（１～１４５アミノ酸）のｃＤＮＡを合成し、ＧＦＰタンパク質との融合ｃＤＮＡ（ＤＡ－ＧＦＰ）配列番号６４を作製した。発現ベクターにクローニングしてＤＡ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡを調製し、ＨＥＫ２９３ＴまたはＢｘＰＣ－３細胞の形質転換に用いた。
マウス免疫抗原用タンパク質発現コンストラクトを図２に示す。
ヒトディスアドへリン（ＤＡ）のアミノ酸配列情報（ＵｎｉＰｒｏｔ： Ｑ９６ＤＢ９）を配列番号１に示す。
膵臓がんの培養細胞の発現量比較解析に基づき、ＢｘＰＣ－３細胞をディスアドへリン高発現細胞として用いた。ＢｘＰＣ－３細胞からＲＮＡを調製しｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法により細胞外ドメイン（１～１４５アミノ酸）のｃＤＮＡを合成し、ＧＦＰタンパク質との融合ｃＤＮＡ（ＤＡ－ＧＦＰ）配列番号６４を作製した。発現ベクターにクローニングしてＤＡ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡを調製し、ＨＥＫ２９３ＴまたはＢｘＰＣ－３細胞の形質転換に用いた。
【0138】
（ＤＡ－ＧＦＰ融合タンパク質の調製）
ＢｘＰＣ－３細胞の形質転換はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて行った。
形質転換２４時間後に血清を含まない完全合成培地に交換し、さらに２日間培養を続けた。培養上清を回収し、遠心（８０００ ｒｐｍ ｘ １５ ｍｉｎ）後に０．４５ μｍのフィルターで濾過した。さらにＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ + ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）に置換・濃縮した。１０ ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）を用いて透析した後に、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いてＨＰＬＣにて分離し（０．２ Ｍ、０．３ Ｍ、０．４ Ｍ 、１ Ｍ ＮａＣｌ溶出）、ＤＡ－ＧＦＰフラクションを精製した。
なお、当該融合タンパク質を高発現させた場合、細胞培養上清には高い割合でプロテアーゼにより切断された後に生じるフリーなＧＦＰが存在し、ＧＦＰ抗体での融合タンパク質の精製効率を低下させる。よって、この過程でフリーのＧＦＰタンパク質を除去し、ＧＦＰ抗体ビーズを用いてＤＡ－ＧＦＰをアフィニティ精製した。この処理は、ＧＦＰを認識する抗体の生産を抑制する効果もある。
ＢｘＰＣ－３細胞の形質転換はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて行った。
形質転換２４時間後に血清を含まない完全合成培地に交換し、さらに２日間培養を続けた。培養上清を回収し、遠心（８０００ ｒｐｍ ｘ １５ ｍｉｎ）後に０．４５ μｍのフィルターで濾過した。さらにＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ + ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）に置換・濃縮した。１０ ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）を用いて透析した後に、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いてＨＰＬＣにて分離し（０．２ Ｍ、０．３ Ｍ、０．４ Ｍ 、１ Ｍ ＮａＣｌ溶出）、ＤＡ－ＧＦＰフラクションを精製した。
なお、当該融合タンパク質を高発現させた場合、細胞培養上清には高い割合でプロテアーゼにより切断された後に生じるフリーなＧＦＰが存在し、ＧＦＰ抗体での融合タンパク質の精製効率を低下させる。よって、この過程でフリーのＧＦＰタンパク質を除去し、ＧＦＰ抗体ビーズを用いてＤＡ－ＧＦＰをアフィニティ精製した。この処理は、ＧＦＰを認識する抗体の生産を抑制する効果もある。
【0139】
［実施例３］シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合する抗体の作製
（マウスの免疫）
３匹のマウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）（Ｂａｌｂ／ｃマウス、８週齢のメス）に対し、Ｄａｙ０、５、１２、３３に、上記の通り調製したＤＡ－ＧＦＰ ４１．５μｇ、５μｇ、５μｇ、２μｇを完全フロイント アジュバントと混合して投与し、免疫した。
マウスの眼窩採血を定期的に行い、血清中の抗原に対する抗体価の上昇をモニタリングしながら免疫を行った。
なお、抗体価の上昇が期待できることから、血清及び免疫Ｂ細胞の回収を行う３日前（Ｄａｙ３３）の免疫時において、尾静脈への免疫原の投与を行ったが、その際＃３のマウスにはＤＡ－ＧＦＰでなくＢｘＰＣ－３の細胞溶解物から調製した内在性ＤＡを投与した。このＧＦＰを有さないディスアドへリンへの免疫原の変更は、ＧＦＰを認識する抗体の生産を抑制する効果がある。抗体価が十分に上昇したことを確認した免疫マウスから抗体産生細胞（脾細胞）を採取した（Ｄａｙ３６）。マウス免疫のスケジュール及び概要を図３に示す。
（マウスの免疫）
３匹のマウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）（Ｂａｌｂ／ｃマウス、８週齢のメス）に対し、Ｄａｙ０、５、１２、３３に、上記の通り調製したＤＡ－ＧＦＰ ４１．５μｇ、５μｇ、５μｇ、２μｇを完全フロイント アジュバントと混合して投与し、免疫した。
マウスの眼窩採血を定期的に行い、血清中の抗原に対する抗体価の上昇をモニタリングしながら免疫を行った。
なお、抗体価の上昇が期待できることから、血清及び免疫Ｂ細胞の回収を行う３日前（Ｄａｙ３３）の免疫時において、尾静脈への免疫原の投与を行ったが、その際＃３のマウスにはＤＡ－ＧＦＰでなくＢｘＰＣ－３の細胞溶解物から調製した内在性ＤＡを投与した。このＧＦＰを有さないディスアドへリンへの免疫原の変更は、ＧＦＰを認識する抗体の生産を抑制する効果がある。抗体価が十分に上昇したことを確認した免疫マウスから抗体産生細胞（脾細胞）を採取した（Ｄａｙ３６）。マウス免疫のスケジュール及び概要を図３に示す。
【0140】
（抗体価の確認）
免疫に用いた抗原（ＤＡ－ＧＦＰ）をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、検出側として免疫マウスの抗血清あるいは既存の抗ＤＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ測定系での検討を行った。
免疫に用いた抗原（ＤＡ－ＧＦＰ）をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、検出側として免疫マウスの抗血清あるいは既存の抗ＤＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ測定系での検討を行った。
【0141】
まず、精製ＤＡ－ＧＦＰをＰＢＳで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ Ａｍｉｎｏ）に１００μＬ／ウエルずつ添加しアミノ基を介して共有結合させた。室温で３時間抗原をプレートに吸着（固相化）させた後、ウエルをＰＢＳ－Ｔ （ＰＢＳ, ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
次に、ＴＢＳ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３）を用い４℃一晩ブロッキングした。ウエルをＰＢＳ－Ｔで洗浄後、抗血清（Ｄａｙ０、２１、２８）の希釈系列溶液１００μＬを各ウエルに添加した。室温で２時間反応させた後、ウエル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、１０，０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社、１１５－０３５－０６２）を室温で１時間反応させた。その後、反応液を廃棄、洗浄した後、１ＳｔｅｐＵｌｔｒａ ＴＭＢ基質液（Ｐｉｅｒｃｅ社）による発色を４５０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を図４（右グラフ）に示す。３匹のマウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）において、抗体価の十分な上昇が認められた。
次に、ＴＢＳ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３）を用い４℃一晩ブロッキングした。ウエルをＰＢＳ－Ｔで洗浄後、抗血清（Ｄａｙ０、２１、２８）の希釈系列溶液１００μＬを各ウエルに添加した。室温で２時間反応させた後、ウエル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、１０，０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社、１１５－０３５－０６２）を室温で１時間反応させた。その後、反応液を廃棄、洗浄した後、１ＳｔｅｐＵｌｔｒａ ＴＭＢ基質液（Ｐｉｅｒｃｅ社）による発色を４５０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を図４（右グラフ）に示す。３匹のマウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）において、抗体価の十分な上昇が認められた。
【0142】
（細胞染色による抗血清の確認）
免疫後の抗血清に膵臓がん細胞を認識する抗体が存在することを確認するためにＢｘＰＣ－３細胞の染色を行った。
ＢｘＰＣ－３細胞を９６－ｗｅｌｌプレートに５×１０３細胞/ウエルで播種し、培養後にＰＢＳで洗浄し４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで洗浄した後に、ＰＢＳで５００倍または１０００倍希釈した、３匹の免疫マウスからそれぞれ得た抗血清を１００μＬ／ウエルで加え、室温で２時間インキュベーションした。
ＰＢＳで洗浄した後に２０００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬ／ウエルで加え、室温で１時間インキュベーションした。細胞染色画像はＣｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて取得し、二次抗体のみの細胞染色画像と比較した。
免疫後の抗血清に膵臓がん細胞を認識する抗体が存在することを確認するためにＢｘＰＣ－３細胞の染色を行った。
ＢｘＰＣ－３細胞を９６－ｗｅｌｌプレートに５×１０３細胞/ウエルで播種し、培養後にＰＢＳで洗浄し４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで洗浄した後に、ＰＢＳで５００倍または１０００倍希釈した、３匹の免疫マウスからそれぞれ得た抗血清を１００μＬ／ウエルで加え、室温で２時間インキュベーションした。
ＰＢＳで洗浄した後に２０００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬ／ウエルで加え、室温で１時間インキュベーションした。細胞染色画像はＣｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて取得し、二次抗体のみの細胞染色画像と比較した。
【0143】
図４（左上及び左下グラフ、ＨＣＳ）に示すように、３匹のマウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）において、図４（右グラフ）に示されるＥＬＩＳＡ測定系と同様のＤａｙ２１からＤａｙ２８の抗体価の上昇が認められた。
また、ＢｘＰＣ－３細胞の細胞膜上にシグナルが観察され、免疫後の抗血清に膵臓がん細胞に結合する抗体が含まれることが示された（写真は示さず）。
また、ＢｘＰＣ－３細胞の細胞膜上にシグナルが観察され、免疫後の抗血清に膵臓がん細胞に結合する抗体が含まれることが示された（写真は示さず）。
【0144】
（ハイブリドーマの作製）
抗体産生細胞と骨髄腫（ミエローマ）細胞との細胞融合を行うことでハイブリドーマを作製し、ＤＡを認識するモノクローナル抗体のスクリーニングを行った。
免疫マウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）（由来脾細胞とマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１細胞）を使用して、それぞれの細胞をＲＰＭＩ培地（無血清）で洗浄した後に５：１の比で混合し、細胞融合促進剤（ＧｅｎｏｍＯＮＥ－ＣＦ Ｋｉｔ、コスモバイオ）による細胞融合作業（氷上５分、３７℃ １５分）を行った。
抗体産生細胞と骨髄腫（ミエローマ）細胞との細胞融合を行うことでハイブリドーマを作製し、ＤＡを認識するモノクローナル抗体のスクリーニングを行った。
免疫マウス（マウスＩＤ：ＤＡ＃１～＃３）（由来脾細胞とマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１細胞）を使用して、それぞれの細胞をＲＰＭＩ培地（無血清）で洗浄した後に５：１の比で混合し、細胞融合促進剤（ＧｅｎｏｍＯＮＥ－ＣＦ Ｋｉｔ、コスモバイオ）による細胞融合作業（氷上５分、３７℃ １５分）を行った。
【0145】
細胞融合後、２０％ Ｓ－ｃｌｏｎｅ ｍｅｄｉｕｍ（積水メディカル）と１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０（＋ペニシリン、＋ストレプトマイシン)に懸濁し、９６－ｗｅｌｌプレートに５×１０４細胞／ウエルで播種した。選択培地としてＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地に１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０－４Ｍヒポキサンチン、１．５×１０－５Ｍチミジン及び４×１０－７Ｍアミノプテリンを加えた培地）を用いて培養を行い、融合細胞のみが生存するように選択的な培養を行った。
選択培地で培養開始後約１０日以降に、コロニーを形成した細胞をハイブリドーマとして選択するために、限界希釈法によってモノクローンの細胞を得た。具体的には、９６－ｗｅｌｌプレートに細胞懸濁溶液の希釈系列を作製して播種し、数の限定された細胞由来のハイブリドーマ群を選択するとともに、後述のスクリーニングによってＤＡに対する抗体を産生するクローンを選択した。３匹のマウスのうちの１匹（マウスＩＤ：ＤＡ＃２）の条件について図５に示す。
選択培地で培養開始後約１０日以降に、コロニーを形成した細胞をハイブリドーマとして選択するために、限界希釈法によってモノクローンの細胞を得た。具体的には、９６－ｗｅｌｌプレートに細胞懸濁溶液の希釈系列を作製して播種し、数の限定された細胞由来のハイブリドーマ群を選択するとともに、後述のスクリーニングによってＤＡに対する抗体を産生するクローンを選択した。３匹のマウスのうちの１匹（マウスＩＤ：ＤＡ＃２）の条件について図５に示す。
【0146】
融合の結果、８８０ウエル全てにおいてコロニーの生育が認められた。
【0147】
次に、８８０ウエルにコロニーが生育したハイブリドーマが産生する抗体について、以下実施例４～７に記載のとおりスクリーニングを行った（図６）。
【0148】
［実施例４］ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）よる抗体の選抜
８８０ウエルに生育したハイブリドーマの培養上清中にＤＡ－ＧＦＰを抗原とする目的の抗ＤＡモノクローナル抗体が含まれる否かを、上述の様にＨｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ法（Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５）によりスクリーニングした。
ＢｘＰＣ－３細胞をＮｕｎｃ Ｏｐｔｉｃａｌ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈＰｏｌｙｍｅｒ Ｂａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社） に５×１０３細胞/ウエルで播種し、染色前に４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した後に１％ヤギ血清でブロッキングした。ハイブリドーマを培養したウエル中に含まれる培養上清１００μＬを採取し、固定したＢｘＰＣ－３細胞の各ウエルに加え、室温で２時間インキュベーションした。ポジティブコントロールとして既存ＤＡ抗体である３Ｇ１０抗体を６２．５～５００ ｎｇ／ｍＬで希釈したものを用いた。二次抗体には２０００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧとＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（０．５μｇ／ｍＬ）の混合液を用い、室温で１時間インキュベーションした。
Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５を用いて核染色と細胞染色を最適の露光で４視野/ウエルで画像を取得した。二次抗体のみの染色を基準として陽性ウエルを選定し、画像を確認し細胞膜が染色されているウエルを候補として（１ｓｔ ＨＣＳ Ｈｉｔクローン数１２９）、拡大培養してさらにＨＣＳを行い、有力候補として１７クローン（２ｎｄ ＨＣＳ Ｈｉｔ）に絞り込んだ。図７にその結果の一部を示す。
８８０ウエルに生育したハイブリドーマの培養上清中にＤＡ－ＧＦＰを抗原とする目的の抗ＤＡモノクローナル抗体が含まれる否かを、上述の様にＨｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ法（Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５）によりスクリーニングした。
ＢｘＰＣ－３細胞をＮｕｎｃ Ｏｐｔｉｃａｌ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈＰｏｌｙｍｅｒ Ｂａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社） に５×１０３細胞/ウエルで播種し、染色前に４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した後に１％ヤギ血清でブロッキングした。ハイブリドーマを培養したウエル中に含まれる培養上清１００μＬを採取し、固定したＢｘＰＣ－３細胞の各ウエルに加え、室温で２時間インキュベーションした。ポジティブコントロールとして既存ＤＡ抗体である３Ｇ１０抗体を６２．５～５００ ｎｇ／ｍＬで希釈したものを用いた。二次抗体には２０００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧとＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（０．５μｇ／ｍＬ）の混合液を用い、室温で１時間インキュベーションした。
Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５を用いて核染色と細胞染色を最適の露光で４視野/ウエルで画像を取得した。二次抗体のみの染色を基準として陽性ウエルを選定し、画像を確認し細胞膜が染色されているウエルを候補として（１ｓｔ ＨＣＳ Ｈｉｔクローン数１２９）、拡大培養してさらにＨＣＳを行い、有力候補として１７クローン（２ｎｄ ＨＣＳ Ｈｉｔ）に絞り込んだ。図７にその結果の一部を示す。
【0149】
（ハイブリドーマからの産生抗体の回収）
スクリーニングで陽性と認められたハイブリドーマ細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳを添加した培地を用いて３７℃で拡大培養した。得られたハイブリドーマの培養上清（１００ｍＬ～１Ｌ程度、必要量に応じて適宣調整）から抗体を精製した。
抗ＤＡモノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能であり、抗体の精製が必要な場合には、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテインＡ又はプロテインＧ等によるアフィニティークロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィー法、硫酸アンモニウム塩析法等公知の方法を用いて精製した。
スクリーニングで陽性と認められたハイブリドーマ細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳを添加した培地を用いて３７℃で拡大培養した。得られたハイブリドーマの培養上清（１００ｍＬ～１Ｌ程度、必要量に応じて適宣調整）から抗体を精製した。
抗ＤＡモノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能であり、抗体の精製が必要な場合には、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテインＡ又はプロテインＧ等によるアフィニティークロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィー法、硫酸アンモニウム塩析法等公知の方法を用いて精製した。
【0150】
［実施例５］ウェスタンブロット解析による抗体の選抜
ＤＡに対する抗体活性の確認方法としてウェスタンブロット法を行った。
まず、抗原として用いたＢｘＰＣ－３細胞で発現、調製したＤＡ－ＧＦＰ、大腸菌で生産した組換えＤＡ（ｒＤＡ、１００ ｎｇ）、ＢｘＰＣ－３細胞及びＭＣＦ－７細胞の溶解物（５μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元条件下で１０－２０％ゲルを用いて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。
５％スキムミルク含有ＰＢＳでブロッキング後、精製抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ、３Ｇ１０ ｍＡｂ）、１００倍希釈したハイブリドーマ（実施例４で選抜された１７種）培養上清、または３匹の免疫マウスの抗血清（実施例３で取得）と室温にて１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜の洗浄後、二次抗体（０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰラベル化抗マウスＩｇＧ抗体）と室温で１時間反応させた。これらのＰＶＤＦ膜を洗浄後ウェスタンブロッティング検出試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）により化学発光にて検出した。
ＤＡに対する抗体活性の確認方法としてウェスタンブロット法を行った。
まず、抗原として用いたＢｘＰＣ－３細胞で発現、調製したＤＡ－ＧＦＰ、大腸菌で生産した組換えＤＡ（ｒＤＡ、１００ ｎｇ）、ＢｘＰＣ－３細胞及びＭＣＦ－７細胞の溶解物（５μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元条件下で１０－２０％ゲルを用いて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。
５％スキムミルク含有ＰＢＳでブロッキング後、精製抗体（Ｍ５３ ｍＡｂ、３Ｇ１０ ｍＡｂ）、１００倍希釈したハイブリドーマ（実施例４で選抜された１７種）培養上清、または３匹の免疫マウスの抗血清（実施例３で取得）と室温にて１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜の洗浄後、二次抗体（０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰラベル化抗マウスＩｇＧ抗体）と室温で１時間反応させた。これらのＰＶＤＦ膜を洗浄後ウェスタンブロッティング検出試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）により化学発光にて検出した。
【0151】
実施例４で選抜された１７種のうち１４種のハイブリドーマの培養上清、及び免疫マウスの抗血清により、ディスアドヘリンに対する特異的バンドが検出された。
１４種のハイブリドーマの培養上清による結果を図８及び９に示す。
１４種のハイブリドーマの培養上清による結果を図８及び９に示す。
【0152】
ＢｘＰＣ－３は、ディスアドヘリン陽性のヒト膵臓腺がん細胞株である。図８及び９に示されるとおり、ＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の７種の抗体により、ディスアドヘリン陽性細胞であるＢｘＰＣ－３の溶解物において、ディスアドヘリンに対するバンドが検出された。
【0153】
ＭＣＦ－７は、ディスアドヘリン陰性のヒト乳腺がん細胞株であり、本実施例ではネガティブコントロールとして用いた。図８及び９に示されるとおり、試験した１４種全ての抗体で、ディスアドヘリン陰性細胞であるＭＣＦ－７の溶解物において、ディスアドヘリンに対する特異的なバンドは検出されなかった。
【0154】
ＢｘＰＣ－３溶解物及びＭＣＦ－７溶解物を用いて得られた以上の結果は、ＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の７種の抗体が、ディスアドヘリンに特異的に結合することを示す。
【0155】
ｒＤＡは、大腸菌により発現された糖鎖修飾のないリコンビナントヒトディスアドヘリンである。図８及び９に示されるとおり、ディスアドヘリンに特異的に結合する７種の抗体のうち、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の３種の抗体では、ｒＤＡ対する特異的なバンドは検出されなかった。
【0156】
以上の結果は、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の３種の抗体が、シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに特異的に結合することを示す。
【0157】
ここで、Ｍ５３ ｍＡｂは、ディスアドヘリンに対する既存抗体である。図８のブロットに示されるとおり、Ｍ５３ ｍＡｂを用いた場合、ＢｘＰＣ－３溶解物においてディスアドヘリンに対するバンドが検出されたが、ｒＤＡに対する結合も認められた。
このＭ５３ ｍＡｂを用いて得られた結果は、Ｍ５３ ｍＡｂは、ディスアドヘリンに対する特異性が低く、糖鎖修飾のないディスアドヘリンに対しても結合性を有するものであることを示す。
このＭ５３ ｍＡｂを用いて得られた結果は、Ｍ５３ ｍＡｂは、ディスアドヘリンに対する特異性が低く、糖鎖修飾のないディスアドヘリンに対しても結合性を有するものであることを示す。
【0158】
［実施例６］シアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するディスアドヘリンに対する結合による抗体の選抜
細胞溶解緩衝液を用い、Ａ５４９（ヒト肺腺がん由来上皮細胞株）溶解物、ＨＣＣ８２７（ヒト肺腺がん由来上皮細胞株）溶解物、ＢｘＰＣ－３（ヒト膵臓腺がん細胞株）溶解物、Ｃａｐａｎ－２（ヒト膵臓がん細胞株）溶解物、ＨＴ２９（ヒト結腸腺がん細胞株）溶解物、ＨＡＫ１Ｂ（ヒト肝がん細胞株）溶解物、ＨＬＦ（ヒト肝がん細胞株）溶解物、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）溶解物、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞株）溶解物を調製し、その疎水画分を取得した。
さらに、各溶解物の疎水画分をシアリダーゼＡで処理し、シアル酸非含有ディスアドヘリン含む試料を調製した。
細胞溶解緩衝液を用い、Ａ５４９（ヒト肺腺がん由来上皮細胞株）溶解物、ＨＣＣ８２７（ヒト肺腺がん由来上皮細胞株）溶解物、ＢｘＰＣ－３（ヒト膵臓腺がん細胞株）溶解物、Ｃａｐａｎ－２（ヒト膵臓がん細胞株）溶解物、ＨＴ２９（ヒト結腸腺がん細胞株）溶解物、ＨＡＫ１Ｂ（ヒト肝がん細胞株）溶解物、ＨＬＦ（ヒト肝がん細胞株）溶解物、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）溶解物、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞株）溶解物を調製し、その疎水画分を取得した。
さらに、各溶解物の疎水画分をシアリダーゼＡで処理し、シアル酸非含有ディスアドヘリン含む試料を調製した。
【0159】
各細胞溶解物の疎水画分、及びシアリダーゼＡ処理疎水画分を、タンパク質量として０．５μｇずつＳＤＳ電気泳動ゲルに添加して電気泳動を行った。ウェスタンブロッティングの条件は実施例５と同様である。
【0160】
ウェスタンブロット解析の結果を図１０に示す。
【0161】
図１０に示されるとおり、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４によって、シアリダーゼＡ処理した各種がん細胞株の溶解物（ＳＡ（－））においてバンドは検出されなかった。一方で、シアリダーゼＡ処理していない各種がん細胞株のなかで固有のシアル化ディスアドへリンを発現している細胞の溶解物において、ディスアドヘリンに対するバンドが検出された。特に、膵臓がん由来の細胞株であるＢｘＰＣ－３及びＣａｐａｎ－２では、「ＳＡ（＋）」で強陽性であった。
【0162】
一方、Ｍ５３ ｍＡｂは、シアリダーゼＡ処理した溶解物、シアリダーゼＡ処理していない溶解物（ＳＡ（＋））の両方において、ディスアドヘリンに対するバンドが検出された。
【0163】
この結果は、既存抗体Ｍ５３ ｍＡｂはシアル酸含有ディスアドヘリン、シアル酸非含有ディスアドヘリンの両方に結合し、シアル酸含有ディスアドヘリンを特異的に検出することができないこと、一方で、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４がシアル酸含有ディスアドヘリンに特異的に結合することを示す。
【0164】
［実施例７］免疫組織化学染色による抗体の選抜
ヒト膵がん患者３９症例から取得した膵臓がん組織、ヒト個体から取得した正常膵臓組織、ヒト慢性膵炎患者から取得した膵炎組織をそれぞれ１０％緩衝ホルマリン固定３μｍのパラフィン切片を作製した。
ヒト膵がん患者３９症例から取得した膵臓がん組織、ヒト個体から取得した正常膵臓組織、ヒト慢性膵炎患者から取得した膵炎組織をそれぞれ１０％緩衝ホルマリン固定３μｍのパラフィン切片を作製した。
【0165】
ライカバイオシステムズ社の自動免疫染色装置Ｂｏｎｄ Ｍａｘを用いて、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログＮｏ．ＤＳ９８００、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により免疫染色を行った。一次抗体として用いた抗ＦＸＹＤ５マウスモノクローナル抗体及び抗体濃度は３Ｇ１０（１０ ｍｇ／ｍＬ）、Ｍ５３ ｍＡｂ（０．２５ ｍｇ／ｍＬ）、ＤＡＰ－７（１０ ｍｍ／ｍＬ）、ＤＡＰ－１３（１０ ｍｇ／ｍＬ）、ＤＡＰ－１４（１０ ｍｇ／ｍＬ）であった。賦活化として、クエン酸ベースｐＨ６緩衝液ＥＲ１（カタログＮｏ．ＡＲ９９６１、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で９８℃、１０分処理した。
【0166】
３Ｇ１０ ｍＡｂ、Ｍ５３ ｍＡｂ、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４を使用した場合、膵臓がん組織において、がん細胞膜にシグナルが認められ、クローン間で明らかな染色性の違いは見られなかったが、膵臓がん組織・正常膵臓組織・膵炎組織にみられる非がん成分について、染色性に違いが認められた。
３Ｇ１０ ｍＡｂ、Ｍ５３ ｍＡｂを使用した場合は血管内皮細胞（矢尻、図１１）や末梢神経（矢印、図１１）にシグナルがみられたが、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１４ではそれらのシグナルは不明瞭であり、ＤＡＰ－１３を使用した場合は弱いシグナルがみられるのみであった。ランゲルハンス島（Ｌ）の細胞については、ＤＡＰ－１４で最も強いシグナルがみられ、３Ｇ１０とＤＡＰ－１３で中等度のシグナル、Ｍ５３ ｍＡｂとＤＡＰ－７では弱いシグナルがみられた。ＤＡＰ－１３では、腺房細胞に陽性となる特徴がみられた。
図１１には、既存抗体としてＭ５３ ｍＡｂの結果を代表例として示し、開発抗体としてＤＡＰ－７の結果を代表例として示す。
３Ｇ１０ ｍＡｂ、Ｍ５３ ｍＡｂを使用した場合は血管内皮細胞（矢尻、図１１）や末梢神経（矢印、図１１）にシグナルがみられたが、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１４ではそれらのシグナルは不明瞭であり、ＤＡＰ－１３を使用した場合は弱いシグナルがみられるのみであった。ランゲルハンス島（Ｌ）の細胞については、ＤＡＰ－１４で最も強いシグナルがみられ、３Ｇ１０とＤＡＰ－１３で中等度のシグナル、Ｍ５３ ｍＡｂとＤＡＰ－７では弱いシグナルがみられた。ＤＡＰ－１３では、腺房細胞に陽性となる特徴がみられた。
図１１には、既存抗体としてＭ５３ ｍＡｂの結果を代表例として示し、開発抗体としてＤＡＰ－７の結果を代表例として示す。
【0167】
すなわち、新規抗体であるＤＡＰ－７を使用した場合、既存抗体Ｍ５３ ｍＡｂを使用した場合と比較して、高い特異性でがん細胞膜にシグナルが認められた。
【0168】
［実施例８］抗ＤＡ抗体の遺伝子工学的作製
（抗ＤＡ抗体ｃＤＮＡのクローニング）
抗ＤＡ抗体であるＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、及びＤＡＰ－１４を産生する、約１×１０３のハイブリドーマ（順に、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０、ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１、ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２）を培地から回収した。
それぞれのハイブリドーマのｍＲＮＡを調製し、抗体遺伝子（ＩｇＧ 重鎖と軽鎖）の定常領域に特異的なプライマーを用いてｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、可変領域を含むｃＤＮＡを増幅し調製した（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔ. Ｍｅｄ.（２００９）１５： １０８８－１０９２を参照）。定常領域の相同な配列を含むプラスミドＤＮＡを導入して大腸菌を形質転換し、抗体産生プラスミドを作製した。
得られた抗体産生プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞等にトランスフェクションし、抗体を含む培養上清を用いて再度抗原（ＤＡ－ＧＦＰ）との反応性を確認した。
抗原反応性を有するプラスミドＤＮＡについてのみ配列を確認し、それぞれの確定抗体ｃＤＮＡとした。プラスミドＤＮＡの配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とＣＭＶプロモーター用プライマーを用いサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）にて反応、未反応試薬をＦａｓｔＧｅｎｅ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）で除去した後に、キャピラリーシーケンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。得られたＤＮＡ配列はホモロジー検索を行い既存のＤＮＡ配列との比較を行った。
（抗ＤＡ抗体ｃＤＮＡのクローニング）
抗ＤＡ抗体であるＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、及びＤＡＰ－１４を産生する、約１×１０３のハイブリドーマ（順に、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７０、ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７１、ＮＩＴＥ Ｐ－０３６７２）を培地から回収した。
それぞれのハイブリドーマのｍＲＮＡを調製し、抗体遺伝子（ＩｇＧ 重鎖と軽鎖）の定常領域に特異的なプライマーを用いてｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、可変領域を含むｃＤＮＡを増幅し調製した（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔ. Ｍｅｄ.（２００９）１５： １０８８－１０９２を参照）。定常領域の相同な配列を含むプラスミドＤＮＡを導入して大腸菌を形質転換し、抗体産生プラスミドを作製した。
得られた抗体産生プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞等にトランスフェクションし、抗体を含む培養上清を用いて再度抗原（ＤＡ－ＧＦＰ）との反応性を確認した。
抗原反応性を有するプラスミドＤＮＡについてのみ配列を確認し、それぞれの確定抗体ｃＤＮＡとした。プラスミドＤＮＡの配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とＣＭＶプロモーター用プライマーを用いサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）にて反応、未反応試薬をＦａｓｔＧｅｎｅ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）で除去した後に、キャピラリーシーケンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。得られたＤＮＡ配列はホモロジー検索を行い既存のＤＮＡ配列との比較を行った。
【0169】
（抗ＤＡ抗体ｃＤＮＡの発現）
発現ベクターに組み込まれた抗体ｃＤＮＡ（重鎖（Ｇ）と軽鎖（Ｋ））（実施例８で得られた抗体産生プラスミド）をＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ ＨＰ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。タンパク質フリーの培地に交換して３日後の培養液から抗体を精製した。マウスＩｇＧ抗体をＰｒｏＧビーズを用いて回収し、０．１ Ｍ グリシン（ｐＨ２．５）にて溶出し、３ Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）で中和後にＰＢＳにバッファー交換した。所望の抗体が得られたことは、精製した抗体を１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開し銀染色法あるいはＨＲＰラベル化抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロット法にて確認した。
発現ベクターに組み込まれた抗体ｃＤＮＡ（重鎖（Ｇ）と軽鎖（Ｋ））（実施例８で得られた抗体産生プラスミド）をＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ ＨＰ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。タンパク質フリーの培地に交換して３日後の培養液から抗体を精製した。マウスＩｇＧ抗体をＰｒｏＧビーズを用いて回収し、０．１ Ｍ グリシン（ｐＨ２．５）にて溶出し、３ Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）で中和後にＰＢＳにバッファー交換した。所望の抗体が得られたことは、精製した抗体を１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開し銀染色法あるいはＨＲＰラベル化抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロット法にて確認した。
【0170】
［実施例９］エピトープマッピング
実施例４でハイブリドーマから取得され、実施例５～７で選抜された抗ＤＡ抗体（ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）及び既存抗ＤＡ抗体（３Ｇ１０ ｍＡｂ、Ｍ５３ ｍＡｂ）について、株式会社エピトープサイエンス社によってエピトープマッピング解析が実施された。
実施例４でハイブリドーマから取得され、実施例５～７で選抜された抗ＤＡ抗体（ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４）及び既存抗ＤＡ抗体（３Ｇ１０ ｍＡｂ、Ｍ５３ ｍＡｂ）について、株式会社エピトープサイエンス社によってエピトープマッピング解析が実施された。
【0171】
図１２に示すとおり、ヒトディスアドヘリンタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９６ＤＢ９－１）について、分子の全体の高次構造を保持したまま、部分的に構造を破壊した変異体８種を設計した（配列番号６５～７２）。
変異体８におけるＳ１２７のアラニンによる置換は、Ｓ３２９へのＯ－結合型糖鎖修飾がエピトープ構造に関与するか否かを検討するために導入された。各変異体ではディスアドヘリン分子の全体の高次構造を保持したまま、部分的に構造が破壊されているため、抗体検体の、各変異体への反応性の消失は、抗体のエピトープ構造の変異を反映する。
変異体８におけるＳ１２７のアラニンによる置換は、Ｓ３２９へのＯ－結合型糖鎖修飾がエピトープ構造に関与するか否かを検討するために導入された。各変異体ではディスアドヘリン分子の全体の高次構造を保持したまま、部分的に構造が破壊されているため、抗体検体の、各変異体への反応性の消失は、抗体のエピトープ構造の変異を反映する。
【0172】
野生型ヒトディスアドヘリンタンパク質（ＷＴ）と、各変異体のアミノ酸配列を元に合成したｃＤＮＡを発現プラスミドベクターにクローニングし、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞上に一過性に発現させた。
【0173】
（フローサイトメトリー（ＦＣＭ））
各変異体の発現レベルと、各抗ＤＡ抗体検体の発現細胞に対する結合性とを２次元のフローサイトメトリー（２Ｄ－ＦＣＭ）により同時に分析した。
トランスフェクション後２日目のＮｅｕｒｏ２ａ細胞をＦＣＭに用いた。回収した細胞を５％ＦＢＳ、２５％ＤＭＥＭと０．０５％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ）で２×１０６ 個／ｍｌになるように懸濁した。この細胞懸濁液２５ μｌと、各抗体サンプルを２ μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した抗体溶液２５ μｌを、９６－ｗｅｌｌ Ｖ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ中で混合し（ｆｉｎａｌ ５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、各抗体１μｇ／ｍｌ）、４°Ｃで３０分間反応させた。プレートを遠心し、上清を除いた後、新しいＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ ２００ μｌ／ｗｅｌｌ で懸濁し再遠心する方法で一回洗浄した。洗浄した細胞は、２次抗体のＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ希釈液を２５ μｌ／ｗｅｌｌで加えて再懸濁し、４℃で３０分間反応させた。２次抗体としては、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， １１５－１１６－１４６）の４００倍希釈液を用いた。１回の洗浄後、各ｗｅｌｌの細胞を１００ μｌのＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ×２０フローサイトメーターを用いて分析し、ＦＳＣ－ＳＳＣプロット中の細胞イベント８０００個のデータを取得した。データ解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を用いた。
各変異体の発現レベルと、各抗ＤＡ抗体検体の発現細胞に対する結合性とを２次元のフローサイトメトリー（２Ｄ－ＦＣＭ）により同時に分析した。
トランスフェクション後２日目のＮｅｕｒｏ２ａ細胞をＦＣＭに用いた。回収した細胞を５％ＦＢＳ、２５％ＤＭＥＭと０．０５％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ）で２×１０６ 個／ｍｌになるように懸濁した。この細胞懸濁液２５ μｌと、各抗体サンプルを２ μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した抗体溶液２５ μｌを、９６－ｗｅｌｌ Ｖ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ中で混合し（ｆｉｎａｌ ５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、各抗体１μｇ／ｍｌ）、４°Ｃで３０分間反応させた。プレートを遠心し、上清を除いた後、新しいＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ ２００ μｌ／ｗｅｌｌ で懸濁し再遠心する方法で一回洗浄した。洗浄した細胞は、２次抗体のＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ希釈液を２５ μｌ／ｗｅｌｌで加えて再懸濁し、４℃で３０分間反応させた。２次抗体としては、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， １１５－１１６－１４６）の４００倍希釈液を用いた。１回の洗浄後、各ｗｅｌｌの細胞を１００ μｌのＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ×２０フローサイトメーターを用いて分析し、ＦＳＣ－ＳＳＣプロット中の細胞イベント８０００個のデータを取得した。データ解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を用いた。
【0174】
ＦＣＭの結果、以下の抗体と変異体の組み合わせにおいて、反応消失が観察され、当該変異体における抗体特異的エピトープの破壊が検出された。
・ＤＡＰ－７：変異体１
・ＤＡＰ－１３：変異体１
・ＤＡＰ－１４：変異体２、４
・Ｇ３１０ ｍＡｂ：変異体２、３
・Ｍ５３ ｍＡｂ：変異体２、３
・ＤＡＰ－７：変異体１
・ＤＡＰ－１３：変異体１
・ＤＡＰ－１４：変異体２、４
・Ｇ３１０ ｍＡｂ：変異体２、３
・Ｍ５３ ｍＡｂ：変異体２、３
【0175】
図１２にＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４、Ｍ５３ ｍＡｂのエピトープ部位を示す。
ＤＡＰ－７及びＤＡＰ－１３は、野生型ヒトディスアドヘリン（ヒト ＦＸＹＤ５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９６ＤＢ９－１、配列番号１）の２４～４６番目のアミノ酸配列（配列番号２）を含み、Ｏ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒまたはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドをエピトープとし、ＤＡＰ－１４は、野生型ヒトディスアドヘリンの５８～６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）を含み、Ｏ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒまたはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドをエピトープとし、Ｍ５３ ｍＡｂ及びＧ３１０ ｍＡｂは、野生型ヒトディスアドヘリンの４９～５６番目のアミノ酸配列（配列番号７３）を含み、Ｏ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒまたはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドをエピトープとすることが示された。
ＤＡＰ－７及びＤＡＰ－１３は、野生型ヒトディスアドヘリン（ヒト ＦＸＹＤ５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９６ＤＢ９－１、配列番号１）の２４～４６番目のアミノ酸配列（配列番号２）を含み、Ｏ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒまたはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドをエピトープとし、ＤＡＰ－１４は、野生型ヒトディスアドヘリンの５８～６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）を含み、Ｏ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒまたはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドをエピトープとし、Ｍ５３ ｍＡｂ及びＧ３１０ ｍＡｂは、野生型ヒトディスアドヘリンの４９～５６番目のアミノ酸配列（配列番号７３）を含み、Ｏ－結合型糖鎖付加位置であるＳｅｒまたはＴｈｒにシアル酸修飾Ｏ－結合型糖鎖を有するペプチドをエピトープとすることが示された。
【0176】
以上のことから、新規抗体であるＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４は、ディスアドヘリンにおいて、既存抗体であるＭ５３ ｍＡｂとは異なるエピトープを認識することが明らかになった。
【0177】
［実施例１０］結合親和性測定
各抗体の抗原結合親和性（解離定数（ＫＤ））を、野生型ヒトディスアドヘリン発現細胞に対する見かけの親和性（Ａｐｐａｒｅｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ）として、算出した。実施例９で作製した、野生型ヒトディスアドヘリンタンパク質（ＷＴ）を一過性発現させたＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、各抗体の１００ ｎＭ（１５ μｇ／ｍｌ）からの３．１５倍希釈系列を１２点反応させた。実施例９と同様の方法によりＦＣＭにより取得されたデータを解析し、ＴａｇＢＦＰ由来の蛍光をレポーターとして抗原発現陽性の細胞分画を選び、それらの細胞に結合した各抗体の結合量を、ＰＥ－ラベル２次抗体由来の蛍光量の８０ｔｈ Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＦＩ）として算出した。算出されたＦＩ値を抗体濃度の対数に対してプロットし、それぞれの抗体の結合曲線を得て、４－パラメーターロジスティック曲線回帰を用いてフィッティングした（Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）。
得られた５０％効果濃度（ＩＣ５０）より解離定数（ＫＤ）を算出した。
各抗体の抗原結合親和性（解離定数（ＫＤ））を、野生型ヒトディスアドヘリン発現細胞に対する見かけの親和性（Ａｐｐａｒｅｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ）として、算出した。実施例９で作製した、野生型ヒトディスアドヘリンタンパク質（ＷＴ）を一過性発現させたＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、各抗体の１００ ｎＭ（１５ μｇ／ｍｌ）からの３．１５倍希釈系列を１２点反応させた。実施例９と同様の方法によりＦＣＭにより取得されたデータを解析し、ＴａｇＢＦＰ由来の蛍光をレポーターとして抗原発現陽性の細胞分画を選び、それらの細胞に結合した各抗体の結合量を、ＰＥ－ラベル２次抗体由来の蛍光量の８０ｔｈ Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＦＩ）として算出した。算出されたＦＩ値を抗体濃度の対数に対してプロットし、それぞれの抗体の結合曲線を得て、４－パラメーターロジスティック曲線回帰を用いてフィッティングした（Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）。
得られた５０％効果濃度（ＩＣ５０）より解離定数（ＫＤ）を算出した。
【0178】
ＤＡＰ－１４及びＭ５３ ｍＡｂにおいて得られた抗原結合親和性は図１２に示すとおりであった。
【0179】
［実施例１１］モノクローナル抗体のアイソタイピング
実施例３で得られたハイブリドーマにより産生されるＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の７種のモノクローナル抗体について、ＩｓｏＳｔｒｉｐＴＭマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ社）でアイソタイプを決定した。
実施例３で得られたハイブリドーマにより産生されるＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の７種のモノクローナル抗体について、ＩｓｏＳｔｒｉｐＴＭマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ社）でアイソタイプを決定した。
【0180】
各アイソタイプは図９の「ｍＩｇ ｓｕｂｃｌａｓｓ（ｔｅｓｔ ｋｉｔ）」の項に示すとおりであった。
【0181】
［実施例１２］抗体グループの特定
実施例３で得られたハイブリドーマにより産生されるＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の７種のモノクローナル抗体について、実施例８の記載に準じてＤＮＡ配列を特定し、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子（ＩＧＨＶ）及び免疫グロブリンカッパ可変遺伝子（ＩＧＫＶ）を同定し、これらの遺伝子の組み合わせに基づき抗体をグループ分けした。
実施例３で得られたハイブリドーマにより産生されるＤＡＰ－２、ＤＡＰ－３、ＤＡＰ－７、ＤＡＰ－８、ＤＡＰ－１２、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の７種のモノクローナル抗体について、実施例８の記載に準じてＤＮＡ配列を特定し、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子（ＩＧＨＶ）及び免疫グロブリンカッパ可変遺伝子（ＩＧＫＶ）を同定し、これらの遺伝子の組み合わせに基づき抗体をグループ分けした。
【0182】
各抗体のグループは図９の「ＤＮＡ ｓｅｑ」の項に示すとおりであった。
【0183】
［実施例１３］抗体のＣＤＲ配列の特定
実施例３で得られたハイブリドーマにより産生されるＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の３種のモノクローナル抗体について、実施例８の記載に準じてＤＮＡ配列を特定し、ＮＣＢＩで提供されるＩＧＢＬＡＳＴ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いたアライメントの結果に基づき各抗体の推定ＣＤＲ部位を決定した。
実施例３で得られたハイブリドーマにより産生されるＤＡＰ－７、ＤＡＰ－１３、ＤＡＰ－１４の３種のモノクローナル抗体について、実施例８の記載に準じてＤＮＡ配列を特定し、ＮＣＢＩで提供されるＩＧＢＬＡＳＴ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いたアライメントの結果に基づき各抗体の推定ＣＤＲ部位を決定した。
【0184】
抗体ＤＡＰ－７について、推定重鎖ＣＤＲ部位は、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を有し、推定軽鎖ＣＤＲ部位は配列番号１９～２１を有することが明らかになった。
抗体ＤＡＰ－１３について、推定重鎖ＣＤＲ部位は、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を有し、推定軽鎖ＣＤＲ部位は配列番号３３～３５を有することが明らかになった。
抗体ＤＡＰ－１４について、推定重鎖ＣＤＲ部位は、配列番号４４～４６のアミノ酸配列を有し、推定軽鎖ＣＤＲ部位は配列番号４７～４９を有することが明らかになった。
抗体ＤＡＰ－１３について、推定重鎖ＣＤＲ部位は、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を有し、推定軽鎖ＣＤＲ部位は配列番号３３～３５を有することが明らかになった。
抗体ＤＡＰ－１４について、推定重鎖ＣＤＲ部位は、配列番号４４～４６のアミノ酸配列を有し、推定軽鎖ＣＤＲ部位は配列番号４７～４９を有することが明らかになった。
【0185】
本明細書に記載のアミノ酸配列を以下表１にまとめて示す。
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】