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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024105740
(43)【公開日】2024-08-07
(54)【発明の名称】ゲノム改変微生物株
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20240731BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240731BHJP
C12N 1/18 20060101ALI20240731BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240731BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240731BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240731BHJP
C12G 3/022 20190101ALI20240731BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19 ZNA
C12N15/09 110
C12N15/09 100
C12N1/18
C12N15/31
C12N15/10 200Z
C12N15/55
C12G3/022 119G
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021082633
(22)【出願日】2021-05-14
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(71)【出願人】
【識別番号】301025634
【氏名又は名称】独立行政法人酒類総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】大矢 禎一
(72)【発明者】
【氏名】茶谷 朋哉
(72)【発明者】
【氏名】赤尾 健
(72)【発明者】
【氏名】五島 徹也
【テーマコード（参考）】
4B065
4B115
【Ｆターム（参考）】
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB15
4B065BC13
4B065CA06
4B065CA42
4B115CN43
(57)【要約】 （修正有）
【課題】糖をアルコールに代謝する微生物に対して、直列育種工程により２以上の遺伝子に変異を導入する工程を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法を提供する。
【解決手段】単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程とを含む、遺伝子改変微生物を製造する方法であって、前記２以上の遺伝子が、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択されてよく、前記遺伝子改変微生物が清酒酵母であってよい、方法である。
【選択図】図１
【解決手段】単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程とを含む、遺伝子改変微生物を製造する方法であって、前記２以上の遺伝子が、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択されてよく、前記遺伝子改変微生物が清酒酵母であってよい、方法である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法。
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法。
【請求項2】
前記２以上の遺伝子が、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される、請求項１に記載の伝子改変微生物を製造する方法。
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される、請求項１に記載の伝子改変微生物を製造する方法。
【請求項3】
前記遺伝子改変微生物が清酒酵母である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物。
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物。
【請求項5】
ａ）高泡形成性遺伝子がＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子がＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子がＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子がＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である、
請求項４に記載の微生物。
ｂ）アルギナーゼ遺伝子がＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子がＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子がＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である、
請求項４に記載の微生物。
【請求項6】
前記微生物が多倍体真核生物であり、前記変異がホモ接合性変異である、請求項４～５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項7】
前記微生物が清酒酵母である請求項４～６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項8】
前記微生物が清酒酵母協会６号、協会７号、協会９号、協会１０号のいずれかである請求項７に記載の微生物。
【請求項9】
前記糖が、グルコースである請求項４～８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項10】
前記アルコールがエチルアルコールである、請求項４～９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項11】
製造された遺伝子変異微生物は、対応する変異導入前の微生物に対して、上記ａ）～ｄ）から選択された遺伝子以外の２以下の遺伝子に変異を有する、請求項４～１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項12】
製造された遺伝子変異微生物は、対応する変異導入前の微生物と比して、５０％以上のアルコール生産能力を有する、請求項４～１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項13】
請求項４～１２に記載の微生物により醸造されたアルコール含有飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、直列育種工程により２以上の遺伝子に変異を導入した、糖をアルコールに代謝する遺伝子改変微生物株およびその使用、並びに糖をアルコールに代謝する微生物に対して、直列育種工程により２以上の遺伝子に変異を導入する工程を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
グルコースなどの糖をエチルアルコールなどのアルコールに代謝する微生物は醸造による酒類の製造等に広範に利用されてきた。これらの微生物は遺伝的背景の相違によって、製造中間物質及び最終製品の性質に様々な相違をもたらすことが知られている。これら製造中間物質の性質は製造工程の効率等に影響を与え、また、最終製品の性質は、例えば、製造される酒類の味、香り等に影響を与える。清酒を製造するのに使用される清酒酵母株では、もろみ中で分厚い泡の層（高泡）を形成しない酵母株が知られており、高い醸造効率をもたらす当該酵母株として利用されている。このような微生物の遺伝的背景と表現型の関係が研究された結果、醸造特性に重要ないくつかの遺伝子が明らかになってきた。これらの情報に基づいて遺伝子工学により、優れた特性を持つパン酵母株の構築が可能になってきた。例えば、代表的な清酒酵母きょうかい酵母（登録商標）７号（Ｋ７）に自然突然変異が導入された酵母株を交配、スクリーニングすることにより、高泡形成遺伝子ＡＷＡ１が一部欠損した泡なし酵母Ｋ７０１などが作製されている（非特許文献１）。同様に、ＡＷＡ１遺伝子が欠損した清酒酵母として、きょうかい酵母（登録商標）６号（Ｋ６）にＡＷＡ１欠損を導入した酵母Ｋ６０１、きょうかい酵母（登録商標）１０号（Ｋ１０）にＡＷＡ１欠損を導入した酵母Ｋ１００１などが育種されている（並列育種）。
【0003】
しかしながら、このような交配とスクリーニングによる新規微生物育種株の取得は、意図された遺伝子変異以外の変異（オフターゲット変異）の蓄積を伴い得る。例えば、上記酵母Ｋ７０１については、ゲノム配列比較の結果、意図されたＡＷＡ１の一部欠損の他に、意図されない変異（オフターゲット変異）が蓄積していることが明らかになった（非特許文献２）。具体的には、Ｋ７０１はＫ７に対して、５個の遺伝子において７３個のヘテロ接合性またはホモ接合性の非同義変異を有していた。育種株におけるオフターゲット変異の存在は親株の優良な醸造特性の損失につながることが懸念され、意図された変異以外の変異は最小限に抑制されることが好ましい。
【0004】
発明者らはオフターゲット変異を持たない理想的な清酒酵母育種の作製を目的として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いた清酒酵母の遺伝子破壊株の作製を行ってきた。その結果、世界にさきがけてＫ７から泡なし表現型を持つａｗａ１Δ／ａｗａ１Δ株、Ｋ７ＧＥ０１を単離した（非特許文献２、３）。
【0005】
一方、香りや有害物質の産生に関係する様々な遺伝子およびその変異が同定されており、これら複数の遺伝子に変異を有する微生物育種を製造することができれば、優れた特質を兼ね備えた新規微生物育種が取得されることが期待される。
【0006】
例えば、清酒醸造酵母が生成するジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）は、清酒を貯蔵した際に生じる好ましくない劣化臭「老香（ひねか）」の原因物質であることが知られている（非特許文献４）。清酒醸造酵母においてはＤＭＴＳの生成に酵母代謝系におけるメチオニンサルベージ経路が関与することが示唆されており、当該経路に関係するＭＤＥ１遺伝子またはＭＲＩ１遺伝子を欠失させることにより、ＤＭＴＳの前駆体であるＤＭＴＳ－Ｐ１の生成が著明に減少することが知られている（非特許文献５）。
【0007】
また、例えば清酒において好まれる果実香様吟醸香の主体は、清酒醸造酵母が生成するカプロン酸エチルと酢酸イソアミルであることが知られている（非特許文献４）。清酒醸造酵母においては、脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードするＦＡＳ２遺伝子おいて１２５０番目のグリシンをセリンに置換した変異（Ｇｌｙ１２５０Ｓｅｒ変異）を有する変異株は、カプロン酸エチルの産生が増強され、強い吟醸香を有することが知られている（非特許文献６）。
【0008】
また、例えば清酒醸造酵母が生成する尿素からは、清酒の保存時に発癌性物質であるカルバミン酸エチルが生じるため、清酒醸造酵母による尿素生成を抑制することが好ましい。清酒酵母ではアルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲ１）を欠失させることで、尿素生成が抑制されることが知られている（非特許文献７）。
【0009】
しかしながら、遺伝子工学的手法を利用したとしても、これら複数の遺伝子のそれぞれに変異を有する微生物株を作成し、これらを交配とスクリーニング通じて複数の変異を同時に有する新規微生物育種株の取得する方法（直列育種）は、異なる親株に単一の変異を導入する並行育種に比して多大な時間を要することとなる。また、清酒酵母のように多倍体の微生物の場合には、劣性突然変異を導入する場合にホモ接合対立遺伝子を準備する必要がある。さらに、清酒酵母のように遺伝子組み換えの生じた微生物株を選択するためのマーカーが存在しない微生物では、直列育種によって、複数の遺伝子に意図された変異を同時に有する微生物株を製造することは極めて困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｋ．Ｏｕｃｈｉ，ａｎｄ Ｈ．Ａｋｉｙａｍａ,Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１，Ｖｏｌ．３５，ｐｐ．１０２４－１０３２
【非特許文献2】Ｏｈｎｕｋｉ Ｓ ｅｔ Ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ,２０１９，Ｖｏｌ．８３，ｎｏ．８，ｐｐ．１－１１
【非特許文献3】山田駿一 修士論文２０１８
【非特許文献4】科学と教育、２０１５、Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１０，ｐｐ．５０６－５０７
【非特許文献5】Ｍａｋｉｍｏｔｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０２０，Ｖｏｌ．１３０，Ｎｏ．６，ｐｐ．６１０－６１５
【非特許文献6】Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．,１９９１，Ｖｏｌ．５５，ｎｏ．８，ｐｐ．２１５３－２１５４
【非特許文献7】Ｋｉｔａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，Ｖｏｌ．５７，ｎｏ．１，ｐｐ．３０１－３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本開示は、直列育種工程により２以上の遺伝子に同時に変異を導入した、糖をアルコールに代謝する遺伝子改変微生物株およびその使用、並びに糖をアルコールに代謝する微生物に対して、直列育種工程により２以上の遺伝子に変異を導入する工程を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
発明者らが鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに、ゲノム編集技術を適用した直列育種工程により、微生物に対して極めて高効率で２以上の遺伝子に変異を導入することができ、かつ、オフターゲット変異を極めて低頻度に抑制し得ることが見いだされた。特に、２倍体ゲノムを有し、選択するためのマーカーを有しない清酒酵母において上記結果が得られたことから、多倍体真核生物において直列育種工程が極めて有利な特性を有することが見いだされた。
【0013】
本開示は一態様において、
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法、および当該方法で製造された遺伝子改変微生物を提供する。
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法、および当該方法で製造された遺伝子改変微生物を提供する。
【0014】
本開示は一態様において、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に欠損変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物を提供する。
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に欠損変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物を提供する。
【0015】
本開示は一態様において、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物により醸造されたアルコール含有飲料を提供する。
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物により醸造されたアルコール含有飲料を提供する。
【0016】
より具体的には、本開示は以下を提供する。
[項目１]
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法。
[項目２]
前記２以上の遺伝子が、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される、項目１に記載の伝子改変微生物を製造する方法。
[項目３]
前記遺伝子改変微生物が清酒酵母である、項目１または２に記載の方法。
[項目４]
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物。
[項目５]
ａ）高泡形成性遺伝子がＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子がＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子がＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子がＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である、
項目４に記載の微生物。
[項目６]
前記微生物が多倍体真核生物であり、前記変異がホモ接合性変異である、項目４～５のいずれか一項に記載の微生物。
[項目７]
前記微生物が清酒酵母である項目４～６のいずれか一項に記載の微生物。
[項目８]
前記微生物が清酒酵母協会６号、協会７号、協会９号、協会１０号のいずれかである項目７に記載の微生物。
[項目９]
前記糖が、グルコースである項目３～８のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１０]
前記アルコールがエチルアルコールである、項目３～９のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１１]
製造された遺伝子変異微生物は、対応する変異導入前の微生物に対して、上記ａ）～ｄ）から選択された遺伝子以外の２以下の遺伝子に変異を有する、項目４～１０のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１２]
製造された遺伝子変異微生物は、対応する変異導入前の微生物と比して、５０％以上のアルコール生産能力を有する、項目４～１１のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１３]
項目４～１２に記載の微生物により醸造されたアルコール含有飲料。
[項目１]
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法。
[項目２]
前記２以上の遺伝子が、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される、項目１に記載の伝子改変微生物を製造する方法。
[項目３]
前記遺伝子改変微生物が清酒酵母である、項目１または２に記載の方法。
[項目４]
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物。
[項目５]
ａ）高泡形成性遺伝子がＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子がＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子がＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子がＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である、
項目４に記載の微生物。
[項目６]
前記微生物が多倍体真核生物であり、前記変異がホモ接合性変異である、項目４～５のいずれか一項に記載の微生物。
[項目７]
前記微生物が清酒酵母である項目４～６のいずれか一項に記載の微生物。
[項目８]
前記微生物が清酒酵母協会６号、協会７号、協会９号、協会１０号のいずれかである項目７に記載の微生物。
[項目９]
前記糖が、グルコースである項目３～８のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１０]
前記アルコールがエチルアルコールである、項目３～９のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１１]
製造された遺伝子変異微生物は、対応する変異導入前の微生物に対して、上記ａ）～ｄ）から選択された遺伝子以外の２以下の遺伝子に変異を有する、項目４～１０のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１２]
製造された遺伝子変異微生物は、対応する変異導入前の微生物と比して、５０％以上のアルコール生産能力を有する、項目４～１１のいずれか一項に記載の微生物。
[項目１３]
項目４～１２に記載の微生物により醸造されたアルコール含有飲料。
【発明の効果】
【0017】
本開示は、直列育種工程により２以上の遺伝子に変異を導入した、糖をアルコールに代謝する遺伝子改変微生物株およびその使用、並びに糖をアルコールに代謝する微生物に対して、直列育種工程により２以上の遺伝子に変異を導入する工程を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法を提供する、という効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は８重変異を有する清酒酵母株の連続育種を示す模式図である。二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって標的遺伝子に導入された。遺伝子欠失または点変異を導入するために、ドナーＤＮＡ（１５０ ｂｐ）を使用して相同組換え修復を行った。ＡＷＡ１の欠失を有するＫ７ＧＥ０１（Ａ）から始まり、ＣＡＲ１の欠失を有するＫ７ＧＥ２１（Ｂ）、ＭＤＥ１の欠失を有するＫ７ＧＥ３１（Ｃ）、ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）の点変異を有するＫ７ＧＥ４１（Ｄ）を連続的に生成した。最終的な清酒酵母株Ｋ７ＧＥ４１は、優れた醸造特性を与えるホモ接合性の８重変異を有していた。
【図2】図２は清酒酵母株のゲノム編集効率を示す。（Ａ）ＡＷＡ１、ＣＡＲ１、ＭＤＥ１およびＦＡＳ２遺伝子座でのゲノム編集効率。エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。（Ｂ）コロニーＰＣＲで増幅されたＤＮＡフラグメント（各１０サンプル）を例として示す。正しい欠失（ＡＷＡ１、ＣＡＲ１およびＭＤＥ１）または変異ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）を有する酵母形質転換体の番号を、下線を付して示す。
【図3】図３はゲノム編集酵母株で製造した日本酒における尿素（Ａ）、ＤＭＴＳの前駆体であるＤＭＴＳ－Ｐ１（Ｂ）、カプロン酸エチル（Ｃ）の測定量を示す。エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。アスタリスクは、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定の結果を示す（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。
【図5】図５は１９成分で主成分分析（ＰＣＡ）を実行した後のＰＣ１／ＰＣ２直交空間におけるゲノム編集酵母株の分布（Ａ）および、意図的に改変した３つの成分を除く１６成分でＰＣＡを実行した後のＰＣ１／ＰＣ２直交空間での日本酒成分の分布（Ｂ）を示す。ピルビン酸、日本酒度（ＳＭＶ）、酢酸エチル、酢酸イソアミル、およびアミノ酸を矢印で示す。
【図6】図６はゲノム編集酵母株で製造した日本酒におけるピルビン酸（Ａ）、ＳＭＶ（Ｂ）、酢酸エチル（Ｃ）、酢酸イソアミル（Ｄ）、アミノ酸（Ｅ）の測定結果を示す。エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。アスタリスクは、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定の結果を示す（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。
【図9】図９はゲノム編集酵母株で製造した日本酒におけるイソブチルアルコール（Ａ）、リン酸（Ｂ）、クエン酸（Ｃ）、酢酸（Ｄ）の量を示す。エラーバーはＳＥ（ｎ＝３）を示す。アスタリスクは、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定の結果を示す（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。
【図10】図１０はゲノム編集酵母株で製造した日本酒におけるイソアミルアルコール（Ａ）、１－プロパノール（Ｂ）、コハク酸（Ｃ）、乳酸（Ｄ）の量を示す。エラーバーはＳＥ（ｎ＝３）を示す。アスタリスクは、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定の結果を示す（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。
【図11】図１１は連続繁殖中の形態変化を示す。（Ａ）直交形態空間における酒酵母分離株の分布を示す。主成分分析を、４つのゲノム編集株Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１（それぞれｎ＝４）および標準Ｋ７株（ｎ＝７）の５０１の形態学的形質に適用した。菌株名と領域を図１と同様に示す。最初の２つの主成分（ｘ軸のＰＣ１とｙ軸のＰＣ２）は、括弧内に示されているように４３．８２％の分散を捕捉した。各株の中心をＰＣスコアの平均によって計算して示す。矢印は繁殖の方向を示している。（Ｂ）親株からのユークリッド距離。全体的な形態異常を、５０１形質の分散の９０％を捕捉する、１１の主成分の直交形態空間における親株の中心からの各反復結果のユークリッド距離によって計算した。ゲノム編集株Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１およびＫ７ＧＥ４１とこれらの親株を、それぞれ濃い色、薄い色で示す。エラーバーは標準偏差を示す。アスタリスクは、ガンマ分布を使用した一元配置分散分析の尤度比検定によるボンフェローニ補正後のＰ＜０．０５での有意差を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
（定義）
本開示において、遺伝子の欠損とは、遺伝子を構成する塩基配列の変異に起因して、野生型に比して当該遺伝子の機能が一部または全部失われていることを意味する。このような遺伝子の機能の一部または全部が失われる塩基配列の変異は特に限定されないが、例えば、遺伝子のコードするアミノ酸配列を変異させる塩変異、利用コドンを変更する変異、ストップコドンを挿入する変異、ｍＲＮＡスプライシングを変更する変異、遺伝子の転写量を変更する変異、遺伝子配列全体を欠失させる変異などを含む。
本開示において、遺伝子の欠損とは、遺伝子を構成する塩基配列の変異に起因して、野生型に比して当該遺伝子の機能が一部または全部失われていることを意味する。このような遺伝子の機能の一部または全部が失われる塩基配列の変異は特に限定されないが、例えば、遺伝子のコードするアミノ酸配列を変異させる塩変異、利用コドンを変更する変異、ストップコドンを挿入する変異、ｍＲＮＡスプライシングを変更する変異、遺伝子の転写量を変更する変異、遺伝子配列全体を欠失させる変異などを含む。
【0020】
本開示において、遺伝子の相同体とは、異なる生物由来の同一機能をもつタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ある遺伝子が別の遺伝子の相同体であることは、これら遺伝子に関する生物学的知見に基づいて理解することができる。典型的には、互いに相同体の関係にある遺伝子がコードする同一機能をもつタンパク質は、典型的にはアミノ酸配列上の類似を有しており、例えば、これらのタンパク質のアミノ酸配列の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上は同一である。また、ある遺伝子の相同体は、該遺伝子と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の塩基配列において同一であってもよい。
【0021】
本開示において、並列育種とは、異なる遺伝的背景を有する株から単一の同じ遺伝子変異を有する株を、並行して取得する方法を意味する。本開示において、直列育種とは、親株から、複数の異なる遺伝子変異を同時に有する株を取得する方法を意味する。本開示の直列育種は一例において、ゲノム編集技術など、遺伝子工学的手法による遺伝子変異導入を含む。一度の変異導入工程により、１つまたは複数の変異を導入することができる。
【0022】
本開示において、ある微生物株Ａが他の微生物株Ｂの親株であるとは、微生物株Ｂが微生物株Ａと他の微生物株との交配から得られた株である、あるいは、微生物株Ｂが微生物株Ａに遺伝子変異が生じた結果あるいは、遺伝子工学的に改変することで得られた株であることを意味する。微生物株Ｂは、微生物株Ａと他の微生物株との交配から直接得られた株であってもよく、当該交配から得られた株と、他の微生物株との交配を１以上経た結果得られた株であってもよい。微生物株Ｂは、微生物株Ａの遺伝子変異あるいは遺伝子工学的な改変により直接得られた株であってもよく、当該遺伝子変異または改変により直接得られた株に対してさらに遺伝子変異が生じ、または遺伝子工学的改変を加えて得られた株であってもよい。また、微生物株Ｂは、微生物株Ａに対して１以上の交配および１以上の遺伝子変異および／または遺伝子工学的改変を経た結果得られた株であってもよい。
【0023】
１．本開示の微生物
本開示の微生物は、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物である。
本開示の微生物は、細胞外の糖を取り込んでアルコールに代謝し、該産生されたアルコールを細胞外に放出する特性を有している。当該微生物は、例えば酒類の醸造、例えば、日本酒、焼酎、ウイスキー、ワイン、ビールなどの醸造において有利な特性を有していることが好ましい。
本開示の微生物は、
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；または
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に変異を有する、
糖をアルコールへ代謝する微生物である。
本開示の微生物は、細胞外の糖を取り込んでアルコールに代謝し、該産生されたアルコールを細胞外に放出する特性を有している。当該微生物は、例えば酒類の醸造、例えば、日本酒、焼酎、ウイスキー、ワイン、ビールなどの醸造において有利な特性を有していることが好ましい。
【0024】
本開示の微生物は、ａ）高泡形成性遺伝子、ｂ）アルギナーゼ遺伝子、ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子、またはｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子を有する微生物であれば特に限定されない。好ましくは、本開示の微生物は真核生物である。本開示の微生物は、例えば、真菌類、例えば酵母、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ウィッケルハミア（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）属、フェロマイセス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母である。本開示の微生物は、好ましくは酒類の醸造に用いられる酵母であり、例えば、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウイスキー酵母等、各種酒類を製造するのに使用される酵母であることが好ましい。
【0025】
一態様において、本開示の上記微生物において、
ａ）高泡形成性遺伝子はＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子はＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子はＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子はＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である。
ａ）高泡形成性遺伝子はＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子はＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子はＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子はＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である。
【0026】
本開示の微生物の変異は、典型的にはゲノム編集技術を用いて導入することができる。当該ゲノム編集技術として公知の技術、例えばＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システム、ＴＡＬＥＮシステムなどを利用できるが、これらに限定されない。２以上の変異は異なる技術によって導入されたものでもよく、例えば、並列育種によって１の変異が導入されている微生物に対して、ゲノム編集技術を利用して、更なる１以上の変異を直列育種により導入してもよい。
【0027】
本開示の微生物の有する変異は、直接的あるいは間接的に遺伝子の機能を欠損または付加させるあらゆる変異を包含する。一態様において、本開示の微生物の有する変異は遺伝子の機能を付加させる変異である。当該遺伝子の機能を付加させる変異は、当業者に公知のあらゆる変異を含み、例えば、塩基の置換を行う点変異、外来塩基配列の追加であってもよい。一態様において、本開示の微生物の有する変異は遺伝子を欠損させる変異（欠損変異）である。欠損変異は、当該遺伝子の機能を一部または全部喪失させるあらゆる変異を含む。例えば、欠損変異は遺伝子を構成する塩基配列の全部をゲノム上から削除する欠失変異であってもよく、遺伝子を構成する塩基配列の一部領域の削除、外来塩基配列の追加、塩基の置換を行う点変異であってもよい。
【0028】
一態様において、本開示の上記２以上の変異を有する微生物は、
ａ）高泡形成性遺伝子の変異が遺伝子欠失であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子の変異が遺伝子欠失であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子の変異が遺伝子欠失であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の変異が点変異である
糖をアルコールへ代謝する微生物である。
脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の点変異は、結果的にカプロン酸エチルの産生を促進させる変異であり、好ましくは酒醸造酵母のＦＡＳ２遺伝子における１２５０番目のグリシン残基がセリンに置換されたＧ１２５０Ｓ変異に対応する変異である。
ａ）高泡形成性遺伝子の変異が遺伝子欠失であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子の変異が遺伝子欠失であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子の変異が遺伝子欠失であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の変異が点変異である
糖をアルコールへ代謝する微生物である。
脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の点変異は、結果的にカプロン酸エチルの産生を促進させる変異であり、好ましくは酒醸造酵母のＦＡＳ２遺伝子における１２５０番目のグリシン残基がセリンに置換されたＧ１２５０Ｓ変異に対応する変異である。
【0029】
一態様において、本開示の微生物は多倍体真核生物である。このような多倍体真核生物では、並列育種による遺伝子改変株の作成に多大な労力および時間を要し、また、これに伴い意図しないオフターゲット変異も蓄積しやすいことから、本開示の微生物は典型的にはゲノム編集技術を利用した直列育種を適用して製造される。このように、ゲノム編集技術を利用した直列育種によって得られた多倍体真核生物は、優れた安全性および希少価値を有する。
【0030】
一態様において、本開示の微生物は清酒酵母である。清酒酵母ではＡＷＡ１遺伝子を欠失することで、もろみ中での分厚い泡の層（高泡）の形成が抑制されるため、高い醸造効率を得られることが知られている。また、清酒酵母ではＣＡＲ１遺伝子を欠失することで尿素生成が抑制されることが知られており、これにより清酒の保存時に尿素から生成される発癌性物質カルバミン酸エチルの生成を阻害し、清酒の健康安全性を向上することが知られている。また、清酒酵母ではＭＤＥ１遺伝子またはＭＲＩ１遺伝子を欠失させることにより、１，２－ジヒドロキシ－５－（メチルスルフィニル）ペンタン－３－オン（ＤＭＴＳ－Ｐ１）の生成が著明に減少することが知られており、ＤＭＴＳを原因物質として生じる劣化臭「老香（ひねか）」を抑制し得ることが知られている。また、清酒酵母ではＦＡＳ２遺伝子において１２５０番目のグリシンをセリンに置換した変異（Ｇｌｙ１２５０Ｓｅｒ変異）を導入することにより、カプロン酸エチルの産生が増強され、強い吟醸香を有することが知られている。本開示の微生物が清酒酵母である場合、上記複数の特性を兼ね備えた、日本酒醸造のために極めて有利な特性を有する清酒酵母となる。
【0031】
一態様において、本開示の微生物は公益財団法人日本醸造協会の頒布する協会６号、協会７号、協会９号、または協会１０号のいずれかを親株とするものである。これらの清酒酵母は、日本酒醸造用酵母として優れた特性を有することが知られ、日本酒醸造に広く用いられている。本開示の微生物の親株が協会６号、協会７号、協会９号、または協会１０号のいずれかである場合、本開示の微生物はこれら親株の有する優れた特性を兼ね備えるため、酒醸造のために極めて有利な特性を有する清酒酵母となる。
【0032】
一態様において、本開示の微生物は糖としてグルコースをアルコールへ代謝する。このような微生物として、例えば清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母などが広く用いられている。デンプンなど他の糖をグルコースに代謝する他の微生物、例えばコウジカビ等を併用してもよい。
【0033】
一態様において、本開示の微生物は糖をエチルアルコールに代謝する。このような微生物は、酒類の醸造用酵母として利用することができ、例えば清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母などが広く用いられている。
【0034】
一態様において、本開示の微生物は、意図しない遺伝子変異が極めて低頻度に抑制されている。遺伝子変異導入の際には、意図しない遺伝子変異が追加で生じる（オフターゲット変異）が生じることが知られている。このようなオフターゲット変異は、予期しない生物学的変化をもたらす可能性があり、例えば毒性物質の産生、有用物質の産生低下など望ましくない特性を変異微生物にもたらし得る。したがって、意図しない遺伝子変異はより少ないことが望ましい。本開示の微生物が、対応する変異導入前の微生物に対して、例えば、８、７、６、５、４、３、２または１以下の意図しない遺伝子に変異を有する場合、当該微生物は高い安全性を有することが期待される。
【0035】
一態様において、本開示の微生物は、対応する変異導入前の微生物と異なるアルコール生産能力を有してもよい。例えば、本開示の微生物は、対応する変異導入前の微生物に比して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、２００％、３００％以上のアルコール生産能力を有する。微生物への遺伝子変異の導入は、微生物の生理学的特性に様々な影響を与える可能性があり、特に複数の遺伝子変異を導入する場合には、生理学的特性に予期しない変化が生じる可能性が高くなる。本開示の微生物が、対応する変異導入前の微生物と比して、あまり異ならないアルコール生産能力を有する場合、当該微生物は酒類の醸造に有利な特性を有する微生物となる。
【0036】
一態様において、本開示の微生物は、下記実施例にて協会７号を親株として作成された清酒酵母株Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１およびＫ７ＧＥ４１である。これら変異株は下記実施例にて詳述する特性を有しており、生物学的機能に影響を与えるオフターゲット変異を有していない。本明細書の開示に従い、同様の優れた特性を有する遺伝子変異微生物を得ることができる。
【0037】
２．直列育種により変異を導入する工程を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法
一態様において、本開示は
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法を提供する。典型的には、当該直列育種はゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステムなどを用いて行うことができる。直列育種により変異を導入することで、意図しない遺伝子変異（オフターゲット変異）の発生を抑制し、安全性の高い遺伝子改変微生物を得ることが可能となる。
一態様において、本開示は
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変微生物を製造する方法を提供する。典型的には、当該直列育種はゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステムなどを用いて行うことができる。直列育種により変異を導入することで、意図しない遺伝子変異（オフターゲット変異）の発生を抑制し、安全性の高い遺伝子改変微生物を得ることが可能となる。
【0038】
一態様において、本開示の上記方法に用いる微生物は多倍体真核生物である。多倍体真核生物では、劣性突然変異を導入する場合にホモ接合対立遺伝子を準備する必要があるため、遺伝子工学による変異導入を併用したとしても、各遺伝子変異を導入した変異株を並列育種することにより複数遺伝子に変異を有する多重変異株を得ることは多大な労力を要する。遺伝子組み換えの生じた微生物株を選択するためのマーカーが存在しない微生物では、並列育種による多重変異株の取得はさらに困難である。一方、本開示の直列育種によって2つ以上の遺伝子に対して変異を導入する方法では、極めて高確率でホモ接合性変異を導入し得るため、多倍体真核生物に適用する態様において特に有利である。
【0039】
好ましくは、本開示の上記方法に用いる微生物は清酒酵母である。清酒酵母ではＡＷＡ１遺伝子を欠失することで、もろみ中での分厚い泡の層（高泡）の形成が抑制されるため、高い醸造効率を得られることが知られている。また、清酒酵母ではＣＡＲ１遺伝子を欠失することで尿素生成が抑制されることが知られており、これにより清酒の保存時に尿素から生成される発癌性物質カルバミン酸エチルの生成を阻害し、清酒の健康安全性を向上することが知られている。また、清酒酵母ではＭＤＥ１遺伝子またはＭＲＩ１遺伝子を欠失させることにより、ジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）の生成が著明に減少することが知られており、ＤＭＴＳを原因物質として生じる劣化臭「老香（ひねか）」を抑制し得ることが知られている。また、清酒酵母ではＦＡＳ２遺伝子おいて１２５０番目のグリシンをセリンに置換した変異（Ｇｌｙ１２５０Ｓｅｒ変異）を導入することにより、カプロン酸エチルの産生が増強され、強い吟醸香を有することが知られている。本開示の上記方法に用いる微生物が清酒酵母である場合、上記複数の特性を兼ね備えた、酒醸造のために極めて有利な特性を有する遺伝子改変微生物を得ることができる。また、本開示の上記方法に用いる微生物が清酒酵母である場合、特に高確率でホモ接合性変異を導入しつつ、オフターゲット変異を抑制することで、酒醸造のために極めて有利な特性を有する遺伝子改変微生物を得ることができる。
【0040】
一態様において、本開示の上記方法に用いる微生物は日本醸造協会の頒布する協会６号、協会７号、協会９号、または協会１０号のいずれかである。これらの清酒酵母は、清酒酵母として優れた特性を有することが知られ、日本酒醸造に広く用いられている。本開示の上記方法に用いる微生物が協会６号、協会７号、協会９号、または協会１０号のいずれかである場合、本開示の方法によって、これら清酒酵母の有する優れた特性を兼ね備えた、酒醸造のために極めて有利な特性を有する遺伝子改変微生物を得ることができる。
【0041】
一態様において、本開示は
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変多倍体真核生物を製造する方法を提供する。典型的には、当該直列育種はゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステムなどを用いて行うことができる。直列育種により変異を導入することで、意図しない遺伝子変異（オフターゲット変異）の発生を抑制し、安全性の高い多倍体真核生物を得ることが可能となる。本開示の方法は、並列育種によって変異を導入する工程を併用してもよく、例えば、ａ）～ｄ）の遺伝子の１以上に対して並列育種によって変異を導入した後に、他の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入してもよい。また、ａ）～ｄ）の遺伝子から選択される２以上の遺伝子に変異を導入する順序は限定されない。
単糖をアルコール類へ代謝する微生物を準備する工程と、
前記微生物ゲノム上の
ａ）高泡形成性遺伝子；
ｂ）アルギナーゼ遺伝子；
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子；および
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子、
から選択される２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入する工程と
を含む、遺伝子改変多倍体真核生物を製造する方法を提供する。典型的には、当該直列育種はゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステムなどを用いて行うことができる。直列育種により変異を導入することで、意図しない遺伝子変異（オフターゲット変異）の発生を抑制し、安全性の高い多倍体真核生物を得ることが可能となる。本開示の方法は、並列育種によって変異を導入する工程を併用してもよく、例えば、ａ）～ｄ）の遺伝子の１以上に対して並列育種によって変異を導入した後に、他の２以上の遺伝子に対して、直列育種により変異を導入してもよい。また、ａ）～ｄ）の遺伝子から選択される２以上の遺伝子に変異を導入する順序は限定されない。
【0042】
一態様において、本開示の上記方法において、
ａ）高泡形成性遺伝子はＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子はＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子はＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子はＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である。
ａ）高泡形成性遺伝子はＡＷＡ１遺伝子またはその相同体であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子はＣＡＲ１遺伝子又はその相同体であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子はＭＤＥ１遺伝子若しくはＭＲＩ１遺伝子又はこれらの相同体であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子はＦＡＳ２遺伝子又はその相同体である。
【0043】
一態様において、本開示の上記方法において
ａ）高泡形成性遺伝子の欠損は遺伝子欠失であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子の欠損は遺伝子欠失であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子の欠損は遺伝子欠失であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の欠損は点変異である。
脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の点変異は、結果的にカプロン酸エチルの産生を促進させる変異であり、好ましくは酒醸造酵母のＦＡＳ２遺伝子における１２５０番目のグリシン残基がセリンに置換されたＧ１２５０Ｓ変異に対応する変異である。
ａ）高泡形成性遺伝子の欠損は遺伝子欠失であり、
ｂ）アルギナーゼ遺伝子の欠損は遺伝子欠失であり、
ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子の欠損は遺伝子欠失であり、
ｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の欠損は点変異である。
脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子の点変異は、結果的にカプロン酸エチルの産生を促進させる変異であり、好ましくは酒醸造酵母のＦＡＳ２遺伝子における１２５０番目のグリシン残基がセリンに置換されたＧ１２５０Ｓ変異に対応する変異である。
【0044】
一態様において、本開示は上記方法により製造された遺伝子変異微生物を提供する。当該遺伝子変異微生物は、個々の変異に起因する好ましい特性を合わせ有する利用価値の高い微生物となる。
【0045】
３．遺伝子改変微生物により製造されたアルコール飲料
一態様において、本開示は遺伝子改変微生物により製造されたアルコール飲料を提供する。本開示のアルコール飲料は、ａ）高泡形成性遺伝子が欠損していることによる製造効率の高さ、ｂ）アルギナーゼ遺伝子が欠損していることによる安全性の高さ、ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子が欠損していることによるヒネカ発生抑制効果、およびｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子が欠損していることによる高い吟醸香、から選択される２以上の特性を合わせ有している。このようなアルコール飲料は、日本酒、焼酎、ワイン、リキュールなどとして提供することができる。
一態様において、本開示は遺伝子改変微生物により製造されたアルコール飲料を提供する。本開示のアルコール飲料は、ａ）高泡形成性遺伝子が欠損していることによる製造効率の高さ、ｂ）アルギナーゼ遺伝子が欠損していることによる安全性の高さ、ｃ）メチオニンサルベージ経路の遺伝子が欠損していることによるヒネカ発生抑制効果、およびｄ）脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子が欠損していることによる高い吟醸香、から選択される２以上の特性を合わせ有している。このようなアルコール飲料は、日本酒、焼酎、ワイン、リキュールなどとして提供することができる。
【0046】
以下の実施例は、本発明がより完全に理解されるように提供される。これらの実施例は単なる例示であり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例0047】
（実験方法）
１．細胞株と培地
清酒酵母株として、発泡性分離株Ｋ７とゲノム編集された非泡形成分離株Ｋ７ＧＥ０１を使用した（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．；Ｙａｍａｄａ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１９，Ｖｏｌ．８３，ｐｐ．１５８３－１５９３，）。本実施例においてゲノム編集株Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１を作成した。各酵母菌株は、１％（ｗ／ｖ）バクト酵母エキス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および２％グルコースを含む酵母エキスペプトンデキストロース培地において、３０℃で培養した。酵母菌株の形質転換、酵母ＤＮＡの抽出、発酵試験における前培養においても同様の培地を使用した。２％寒天培地（Ｓｈｏｕｅｉ、東京、日本）を含む酵母エキスペプトンデキストロース寒天プレートにオートクレーブ後のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｔａｋａｒａ、京都、日本）を３５０μｇ／ｍＬで添加した。
１．細胞株と培地
清酒酵母株として、発泡性分離株Ｋ７とゲノム編集された非泡形成分離株Ｋ７ＧＥ０１を使用した（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．；Ｙａｍａｄａ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１９，Ｖｏｌ．８３，ｐｐ．１５８３－１５９３，）。本実施例においてゲノム編集株Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１を作成した。各酵母菌株は、１％（ｗ／ｖ）バクト酵母エキス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および２％グルコースを含む酵母エキスペプトンデキストロース培地において、３０℃で培養した。酵母菌株の形質転換、酵母ＤＮＡの抽出、発酵試験における前培養においても同様の培地を使用した。２％寒天培地（Ｓｈｏｕｅｉ、東京、日本）を含む酵母エキスペプトンデキストロース寒天プレートにオートクレーブ後のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｔａｋａｒａ、京都、日本）を３５０μｇ／ｍＬで添加した。
【0048】
２．清酒酵母株へのゲノム編集技術の応用
染色体ＸＶ、ＸＶＩ、Ｘ、およびＸＶＩにそれぞれ位置するＡＷＡ１、ＣＡＲ１、ＭＤＥ１、およびＦＡＳ２遺伝子にゲノム編集技術を適用した。ヌクレアーゼタンパク質Ｃａｓ９とＣａｓ９を標的ＡＷＡ１配列に導くリボザイムｓｇＲＮＡを共発現するｐＣＡＳＰｒｏＡＷＡ１プラスミドはＯｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１９，Ｖｏｌ．８３，ｐｐ．１５８３－１５９３に記載されているものを用いた。制限酵素フリーのクローニング法（Ｖａｎ，Ｄｅｎ，Ｅｎｔ，Ｆ．；Ｌｏｗｅ，Ｊ．ＲＦ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００６，Ｖｏｌ．６７，ｐｐ．６７－７４）により、ＣＡＲ１ターゲット配列（下記表１に示す）を使用してｐＣＡＳ Ｐｒｏｌｉｎ ＵＲＡ３（Ｒｙａｎ，Ｏ．Ｗ．；Ｓｋｅｒｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ． Ｅｌｉｆｅ．，２０１４，ｐ．１９）からｐＣＡＳＰｒｏＣＡＲ１プラスミドを構築した。
表１ ゲノム編集に用いたオリゴヌクレオチド
使用した修復ＤＮＡの長さは１５０ｂｐ（Ｋ７ＧＥ２１の場合はＣＡＲ１ ｄｏｎｏｒ ｓｅｎｓｅおよびＣＡＲ１ ｄｏｎｏｒ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）であり、等モル量の一本鎖オリゴヌクレオチドを次のようにアニーリングすることによって生成した。混合物を１００℃で５分間変性させた後、０．１°Ｃ／秒の傾斜で２５°Ｃまで冷却した（ＤｉＣａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．；Ｎｏｒｖｉｌｌｅ，Ｊ．Ｅ．；Ｍａｌｉ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３，Ｖｏｌ．４１，ｐｐ．４３３６－４３４３）。同様の方法で、ｐＣＡＳ ＰｒｏＭＤＥ１およびｐＣＡＳＰｒｏ ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）プラスミドを構築した。
染色体ＸＶ、ＸＶＩ、Ｘ、およびＸＶＩにそれぞれ位置するＡＷＡ１、ＣＡＲ１、ＭＤＥ１、およびＦＡＳ２遺伝子にゲノム編集技術を適用した。ヌクレアーゼタンパク質Ｃａｓ９とＣａｓ９を標的ＡＷＡ１配列に導くリボザイムｓｇＲＮＡを共発現するｐＣＡＳＰｒｏＡＷＡ１プラスミドはＯｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１９，Ｖｏｌ．８３，ｐｐ．１５８３－１５９３に記載されているものを用いた。制限酵素フリーのクローニング法（Ｖａｎ，Ｄｅｎ，Ｅｎｔ，Ｆ．；Ｌｏｗｅ，Ｊ．ＲＦ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００６，Ｖｏｌ．６７，ｐｐ．６７－７４）により、ＣＡＲ１ターゲット配列（下記表１に示す）を使用してｐＣＡＳ Ｐｒｏｌｉｎ ＵＲＡ３（Ｒｙａｎ，Ｏ．Ｗ．；Ｓｋｅｒｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ． Ｅｌｉｆｅ．，２０１４，ｐ．１９）からｐＣＡＳＰｒｏＣＡＲ１プラスミドを構築した。
表１ ゲノム編集に用いたオリゴヌクレオチド
【0049】
３．各清酒酵母株のゲノム編集効率の測定
各清酒酵母株のゲノム編集効率を測定するために、改良された酢酸リチウム形質転換法を用いて、Ｋ７をプラスミドｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＡＷＡ１、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＣＡＲ１、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＭＤＥ１、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）、および対応する修復ＤＮＡで同時形質転換した。株Ｋ７ＧＥ２１を構築するために、Ｋ７ＧＥ０１をｐＣＡＳ ＰｒｏＣＡＲ１プラスミドおよび対応する修復ＤＮＡで同時形質転換した。Ｇ４１８ｒコロニーを選択した後、コロニーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって酵母形質転換体のゲノムを増幅し、目的のフラグメントの存在を確認した。使用したプライマーを下記表２に示す。
表２ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用したオリゴヌクレオチド
ＣＡＲ１遺伝子の削除されたコピーと無傷のコピーでそれぞれ７５５塩基対と１７５７塩基対のＰＣＲフラグメントを増幅した。削除されたコピーと無傷のコピーの両方が検出された場合、単一コロニー単離後にヘテロ接合性を再検査した。ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δアレルの存在を確認した後、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＣＡＲ１プラスミドを自然に除去させ、ゲノム編集株Ｋ７ＧＥ２１を作成した。ｐＣＡＳ ＰｒｏＭＤＥ１およびｐＣＡＳＰｒｏ ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）プラスミドを使用して、同様の方法でＫ７ＧＥ３１株およびＫ７ＧＥ４１株を構築した。
各清酒酵母株のゲノム編集効率を測定するために、改良された酢酸リチウム形質転換法を用いて、Ｋ７をプラスミドｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＡＷＡ１、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＣＡＲ１、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＭＤＥ１、ｐＣＡＳ Ｐｒｏ ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）、および対応する修復ＤＮＡで同時形質転換した。株Ｋ７ＧＥ２１を構築するために、Ｋ７ＧＥ０１をｐＣＡＳ ＰｒｏＣＡＲ１プラスミドおよび対応する修復ＤＮＡで同時形質転換した。Ｇ４１８ｒコロニーを選択した後、コロニーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって酵母形質転換体のゲノムを増幅し、目的のフラグメントの存在を確認した。使用したプライマーを下記表２に示す。
表２ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用したオリゴヌクレオチド
【0050】
４．全ゲノムシーケンス
Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１株からＤＮＡを抽出して、それらの全ゲノム配列を決定した。まず、製造元の指示に従って、Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ １００／Ｇキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して高分子量ＤＮＡ（１０μｇ、２４ｋｂ以下のフラグメント）を単離した。分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＤＮＡサンプルの純度を推定した。全ゲノムシークエンスをＧｅｎｅＢａｙ，Ｉｎｃ （横浜、日本）に外部委託した。その後、ＤＮＡサンプルをＮｏｖｏｇｅｎｅ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）に送付し、ＰＣＲフリーのペアエンドシーケンスライブラリおよびＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００シーケンスプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した～１００倍の公称カバレッジ（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｖｅｒａｇｅ）による全ゲノムシーケンス分析（２×１５０ｂｐ）を準備した。ＢＧＩ Ｊａｐａｎ研究所は、アダプターの夾雑を取り除き、低品質の塩基をトリミングした。Ｋ７参照ゲノム（ＮＲＩＢ＿ＳＹＧＤ、ｔｘｉｄ７２１０３２）をＳａｋｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｒｉｂｆ１．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ＳＹＧＤ／、ｖｅｒｓｉｏｎ １．０）から入手し、シーケンシングデータ分析に使用できるように準備した。シーケンシングデータ分析に使用したソフトウェアパッケージは以下のとおり。「ｓａｍ」フォーマットを「ｂａｍ」フォーマットに変換し、ペアードリードに関する情報を変更するためのシーケンスアラインメント／マップツール（バージョン１．１１）（Ｌｉ，Ｈ．；Ｈａｎｄｓａｋｅｒ，Ｂ．；Ｗｙｓｏｋｅｒ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００９，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０７８－２０７９）。リードをＫ７参照ゲノムにマッピングするためのＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（バージョン０．７．１２）（Ｌｉ，Ｈ．；Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，２００９，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１７５４－１７６０）。重複する読み取りを削除するためのＰｉｃａｒｄ－ｔｏｏｌｓ（バージョン２．２５．０；ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）。ｂａｍ形式を再配置し、変異候補を抽出し、Ｋ７に関連するバリアントを識別およびフィルタリングし、変異を識別するためのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴＫ（バージョン４．１．８．０）（ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．；Ｈａｎｎａ，Ｍ．；Ｂａｎｋｓ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２９７－１３０３）；。最後に、ｓｎｐＥｆｆ（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．３；ｈｔｔｐｓ：／／ｐｃｉｎｇｏｌａ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＳｎｐＥｆｆ／）（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，Ａ．；Ｐｌａｔｔｓ，Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．．Ｆｌｙ．２０２１，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．８０－９２）を利用して、バリアントを手作業でアノテートした。
Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１株からＤＮＡを抽出して、それらの全ゲノム配列を決定した。まず、製造元の指示に従って、Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ １００／Ｇキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して高分子量ＤＮＡ（１０μｇ、２４ｋｂ以下のフラグメント）を単離した。分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＤＮＡサンプルの純度を推定した。全ゲノムシークエンスをＧｅｎｅＢａｙ，Ｉｎｃ （横浜、日本）に外部委託した。その後、ＤＮＡサンプルをＮｏｖｏｇｅｎｅ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）に送付し、ＰＣＲフリーのペアエンドシーケンスライブラリおよびＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００シーケンスプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した～１００倍の公称カバレッジ（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｖｅｒａｇｅ）による全ゲノムシーケンス分析（２×１５０ｂｐ）を準備した。ＢＧＩ Ｊａｐａｎ研究所は、アダプターの夾雑を取り除き、低品質の塩基をトリミングした。Ｋ７参照ゲノム（ＮＲＩＢ＿ＳＹＧＤ、ｔｘｉｄ７２１０３２）をＳａｋｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｒｉｂｆ１．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ＳＹＧＤ／、ｖｅｒｓｉｏｎ １．０）から入手し、シーケンシングデータ分析に使用できるように準備した。シーケンシングデータ分析に使用したソフトウェアパッケージは以下のとおり。「ｓａｍ」フォーマットを「ｂａｍ」フォーマットに変換し、ペアードリードに関する情報を変更するためのシーケンスアラインメント／マップツール（バージョン１．１１）（Ｌｉ，Ｈ．；Ｈａｎｄｓａｋｅｒ，Ｂ．；Ｗｙｓｏｋｅｒ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００９，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０７８－２０７９）。リードをＫ７参照ゲノムにマッピングするためのＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（バージョン０．７．１２）（Ｌｉ，Ｈ．；Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，２００９，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１７５４－１７６０）。重複する読み取りを削除するためのＰｉｃａｒｄ－ｔｏｏｌｓ（バージョン２．２５．０；ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）。ｂａｍ形式を再配置し、変異候補を抽出し、Ｋ７に関連するバリアントを識別およびフィルタリングし、変異を識別するためのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴＫ（バージョン４．１．８．０）（ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．；Ｈａｎｎａ，Ｍ．；Ｂａｎｋｓ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２９７－１３０３）；。最後に、ｓｎｐＥｆｆ（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．３；ｈｔｔｐｓ：／／ｐｃｉｎｇｏｌａ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＳｎｐＥｆｆ／）（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，Ａ．；Ｐｌａｔｔｓ，Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．．Ｆｌｙ．２０２１，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．８０－９２）を利用して、バリアントを手作業でアノテートした。
【0051】
５．蛍光染色、顕微鏡、および画像処理
Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１株の細胞を対数増殖期の初期（＜５×１０６）まで培養し、ホルムアルデヒド（ＷＡＫＯ、大阪、日本）で固定した。次に、以前に報告されている方法（Ｏｈｙａ，Ｙ．；Ｓｅｓｅ，Ｊ．；Ｙｕｋａｗａ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１９０１５－１９０２０．）で、フルオレセインイソチオシアネート結合コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ。Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で細胞壁を、ローダミン－ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でアクチン細胞骨格を、４’，６ジアミジノ２フェニルインドール（Ｓｉｇｍａ）で細胞核ＤＮＡを三重染色した。特殊レンズ（６１００ ＥＣｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、冷却電荷結合デバイスカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ；Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）、および適切なソフトウェア（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して細胞の蛍光顕微鏡画像を取得した。二倍体細胞用に設計された画像処理ソフトウェア（ＣａｌＭｏｒｐｈ、バージョン１．３）を用いて、顕微鏡画像を分析した（Ｙｖｅｒｔ，Ｇ．；Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｎｏｇａｍｉ，Ｓ．；ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３，Ｖｏｌ．７，ｐ．５４）。単一細胞データから５０１形質の形態学的データを取得した。各特性の説明は以前に提示されている（Ｏｈｙａ，Ｙ．；Ｓｅｓｅ，Ｊ．；Ｙｕｋａｗａ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１９０１５－１９０２０．）。ＣａｌＭｏｒｐｈのユーザーマニュアルは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔ．ｉｂ．ｋ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ＣａｌＭｏｒｐｈ／）で入手できる。
Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１株の細胞を対数増殖期の初期（＜５×１０６）まで培養し、ホルムアルデヒド（ＷＡＫＯ、大阪、日本）で固定した。次に、以前に報告されている方法（Ｏｈｙａ，Ｙ．；Ｓｅｓｅ，Ｊ．；Ｙｕｋａｗａ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１９０１５－１９０２０．）で、フルオレセインイソチオシアネート結合コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ。Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で細胞壁を、ローダミン－ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でアクチン細胞骨格を、４’，６ジアミジノ２フェニルインドール（Ｓｉｇｍａ）で細胞核ＤＮＡを三重染色した。特殊レンズ（６１００ ＥＣｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、冷却電荷結合デバイスカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ；Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）、および適切なソフトウェア（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して細胞の蛍光顕微鏡画像を取得した。二倍体細胞用に設計された画像処理ソフトウェア（ＣａｌＭｏｒｐｈ、バージョン１．３）を用いて、顕微鏡画像を分析した（Ｙｖｅｒｔ，Ｇ．；Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｎｏｇａｍｉ，Ｓ．；ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３，Ｖｏｌ．７，ｐ．５４）。単一細胞データから５０１形質の形態学的データを取得した。各特性の説明は以前に提示されている（Ｏｈｙａ，Ｙ．；Ｓｅｓｅ，Ｊ．；Ｙｕｋａｗａ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１９０１５－１９０２０．）。ＣａｌＭｏｒｐｈのユーザーマニュアルは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔ．ｉｂ．ｋ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ＣａｌＭｏｒｐｈ／）で入手できる。
【0052】
６．縮退した形態空間における次元削減とユークリッド距離の計算のための主成分分析（ＰＣＡ）
本実験（Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１株）で得られた形態学的データを統計分析に使用した。株Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１のサンプル数は、それぞれ８、４、４、４、および４であった。一般線形モデルを使用して計算されたすべての５０１形質の各株の平均Ｚ値にＰＣＡを適用した。５つの清酒酵母株のＰＣＡ分析によると、最初の１１の主成分の累積寄与率は９０％に達した。
２つの菌株間の形態学的差異を評価するためにユークリッド距離（Ｄｅｚａ，Ｍ．；Ｄｅｚａ，Ｅ．，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ．２００９）を使用した。２つの株の細胞形態が類似している場合、この距離はほぼゼロであるが、それ以外の場合は大きくなる。以前の報告（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｋａｄａ．Ｈ．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ａ．；ｅｔ ａｌ． Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１７，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２８０７－２８２０）のように、最初の１１の主成分の主成分スコア（累積寄与率９０％）から計算された各菌株の間のユークリッド距離を計算した。各株の主成分スコアを計算するために、各株の各独立実験からのＺ値１１の主成分に投影した。平均値と標準偏差は、１１の主成分の直交形態空間における親株の中心からの、各反復結果のユークリッド距離から計算された。
本実験（Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１株）で得られた形態学的データを統計分析に使用した。株Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１のサンプル数は、それぞれ８、４、４、４、および４であった。一般線形モデルを使用して計算されたすべての５０１形質の各株の平均Ｚ値にＰＣＡを適用した。５つの清酒酵母株のＰＣＡ分析によると、最初の１１の主成分の累積寄与率は９０％に達した。
２つの菌株間の形態学的差異を評価するためにユークリッド距離（Ｄｅｚａ，Ｍ．；Ｄｅｚａ，Ｅ．，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ．２００９）を使用した。２つの株の細胞形態が類似している場合、この距離はほぼゼロであるが、それ以外の場合は大きくなる。以前の報告（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｋａｄａ．Ｈ．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ａ．；ｅｔ ａｌ． Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１７，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２８０７－２８２０）のように、最初の１１の主成分の主成分スコア（累積寄与率９０％）から計算された各菌株の間のユークリッド距離を計算した。各株の主成分スコアを計算するために、各株の各独立実験からのＺ値１１の主成分に投影した。平均値と標準偏差は、１１の主成分の直交形態空間における親株の中心からの、各反復結果のユークリッド距離から計算された。
【0053】
７．小規模発酵試験
清酒もろみを、白米１００ｇに相当するアルファ化米７２．８ｇ、乾燥麹（白米２０ｇに相当する麹菌カビ入り米）１９．２ｇ、９０％乳酸１３６μｌ、１×１０９の前培養された酵母細胞を含む水１７０ｍｌを混合して作成した。もろみを振とうせずに１５℃で２０日間インキュベートした。清酒もろみの重量減少を測定することにより、発生したＣＯ２の量を定量化することで、発酵を毎日モニターした。日本酒の発酵が完了した後、清酒もろみを５０ｍｌの遠心分離管に集め、１５℃、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄みをマイクロファイバークロスでろ過して日本酒製品を取得し、－８０℃で保存した。
清酒もろみを、白米１００ｇに相当するアルファ化米７２．８ｇ、乾燥麹（白米２０ｇに相当する麹菌カビ入り米）１９．２ｇ、９０％乳酸１３６μｌ、１×１０９の前培養された酵母細胞を含む水１７０ｍｌを混合して作成した。もろみを振とうせずに１５℃で２０日間インキュベートした。清酒もろみの重量減少を測定することにより、発生したＣＯ２の量を定量化することで、発酵を毎日モニターした。日本酒の発酵が完了した後、清酒もろみを５０ｍｌの遠心分離管に集め、１５℃、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄みをマイクロファイバークロスでろ過して日本酒製品を取得し、－８０℃で保存した。
【0054】
８．発酵試験で作った日本酒の成分分析
日本酒の密度（水に対する酒の密度）を測定した後、酒メーター値（ＳＭＶ）を計算した。密度は、オートサンプラー（ＣＨＤ－５０２；Ｋｙｏｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を備えた密度／比重計（ＤＡ－６５０；Ｋｙｏｔｏ Ｄｅｎｓｈｉ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，京都、日本）で測定した。１０ｍｌ以上の解凍サンプルを２０ｍｌバイアルに加えて測定した。ＳＭＶは、ＳＭＶ ＝（１ ／比重－ １）×１，４４３として計算された。より大きな負のＳＭＶは、より高い比重と糖度を示す。エタノール濃度を、自動注入装置（７６８３Ｂ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたガスクロマトグラフィー（６８９０ Ｎ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で測定した。内部標準として、１％イソプロパノール（９６０μｌ）をサンプル（４０μｌ）と混合した。酢酸エチル、１－プロパノール、イソブタノール、イソアミルアルコール、酢酸イソアミル、カプロン酸エチルなどの芳香成分を、ヘッドスペースサンプラー（ＨＳＳ ７６９７Ａ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたガスクロマトグラフィー（６８９０ Ｎ；Ａｇｉｌｅｎｔ）で測定した。内部標準（１００μｌ）をサンプル（９００μｌ）と混合した。酸性度とアミノ酸含有量を自動滴定装置（ＣＯＭ－１７００；平沼、茨城、日本）で測定した。１０ｍｌのサンプルを用いて測定を行った。リンゴ酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、酢酸、リン酸などの有機酸を液体クロマトグラフィー（ＳＣＲ－１０２Ｈカラムを備えたＣＢＭ４０、島津、京都、日本）で測定した。測定のために、解凍した１ｍｌのサンプルを注入した。ジメチルトリスルフィドの前駆体（１，２－ジヒドロキシ－５－（メチルスルフィニル）ペンタン－３－オン；ＤＭＴＳ－Ｐ１）を、［メチル－ｄ３］－ＤＭＴＳ－Ｐ１を内部標準として使用して（Ｉｓｏｇａｉ，Ａ．；Ｋａｎｄａ，Ｒ．；Ｈｉｒａｇａ，Ｙ．；ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２０１０，Ｖｏｌ．５８，ｐｐ．７７５６－７７６１、Ｉｓｏｇａｉ，Ａ．；Ｋａｎｄａ，Ｒ．；Ｓｕｄｏ，Ｓ．；Ｍａｔｓｕｍａｒｕ，Ｋ． Ｊ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｊａｐａｎ．，２０１３，Ｖｏ．１０８，ｐｐ．６０５－６１４）、ＬＣ－ＭＳ（ＬＣＭＳ８０４０、島津製作所）で分析した。
日本酒の密度（水に対する酒の密度）を測定した後、酒メーター値（ＳＭＶ）を計算した。密度は、オートサンプラー（ＣＨＤ－５０２；Ｋｙｏｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を備えた密度／比重計（ＤＡ－６５０；Ｋｙｏｔｏ Ｄｅｎｓｈｉ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，京都、日本）で測定した。１０ｍｌ以上の解凍サンプルを２０ｍｌバイアルに加えて測定した。ＳＭＶは、ＳＭＶ ＝（１ ／比重－ １）×１，４４３として計算された。より大きな負のＳＭＶは、より高い比重と糖度を示す。エタノール濃度を、自動注入装置（７６８３Ｂ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたガスクロマトグラフィー（６８９０ Ｎ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で測定した。内部標準として、１％イソプロパノール（９６０μｌ）をサンプル（４０μｌ）と混合した。酢酸エチル、１－プロパノール、イソブタノール、イソアミルアルコール、酢酸イソアミル、カプロン酸エチルなどの芳香成分を、ヘッドスペースサンプラー（ＨＳＳ ７６９７Ａ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたガスクロマトグラフィー（６８９０ Ｎ；Ａｇｉｌｅｎｔ）で測定した。内部標準（１００μｌ）をサンプル（９００μｌ）と混合した。酸性度とアミノ酸含有量を自動滴定装置（ＣＯＭ－１７００；平沼、茨城、日本）で測定した。１０ｍｌのサンプルを用いて測定を行った。リンゴ酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、酢酸、リン酸などの有機酸を液体クロマトグラフィー（ＳＣＲ－１０２Ｈカラムを備えたＣＢＭ４０、島津、京都、日本）で測定した。測定のために、解凍した１ｍｌのサンプルを注入した。ジメチルトリスルフィドの前駆体（１，２－ジヒドロキシ－５－（メチルスルフィニル）ペンタン－３－オン；ＤＭＴＳ－Ｐ１）を、［メチル－ｄ３］－ＤＭＴＳ－Ｐ１を内部標準として使用して（Ｉｓｏｇａｉ，Ａ．；Ｋａｎｄａ，Ｒ．；Ｈｉｒａｇａ，Ｙ．；ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２０１０，Ｖｏｌ．５８，ｐｐ．７７５６－７７６１、Ｉｓｏｇａｉ，Ａ．；Ｋａｎｄａ，Ｒ．；Ｓｕｄｏ，Ｓ．；Ｍａｔｓｕｍａｒｕ，Ｋ． Ｊ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｊａｐａｎ．，２０１３，Ｖｏ．１０８，ｐｐ．６０５－６１４）、ＬＣ－ＭＳ（ＬＣＭＳ８０４０、島津製作所）で分析した。
【0055】
９．日本酒成分のＰＣＡ
小規模発酵試験で生産された日本酒１２サンプル（４株×３サンプル）の成分分析で得られた平均値に対して、１６または１９のパラメーターを使用してＰＣＡを実行した。各株の平均値と各サンプルの値を、２つの成分でプロットした。１２個のサンプルの値をマッピングして得られた相関係数の中で、ボンフェローニ補正後のｐ ＜０．０５の相関係数を統計的に有意であると見なした。
小規模発酵試験で生産された日本酒１２サンプル（４株×３サンプル）の成分分析で得られた平均値に対して、１６または１９のパラメーターを使用してＰＣＡを実行した。各株の平均値と各サンプルの値を、２つの成分でプロットした。１２個のサンプルの値をマッピングして得られた相関係数の中で、ボンフェローニ補正後のｐ ＜０．０５の相関係数を統計的に有意であると見なした。
【0056】
１０．Ｎｒｄ１のＮ５３２Ｋの変化によって予測される構造変化
Ｓ２８８Ｃリファレンスゲノム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ；ＳＧＤ）のＮｒｄ１の二次および三次タンパク質構造は、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ ＡＳＳＥｍｂｌｙ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ）によって予測された（Ｙａｎｇ，Ｊ．；Ｙａｎ，Ｒ．；Ｒｏｙ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１５，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．７－８）。ＣスコアとＴＭスコア（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，２００８，Ｖｏｌ．９，ｐ．４０）によって、最初にランク付けされたＰＤＢファイルは、ＵＣＦＳ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．；Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．；ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．，２００４，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．１６０５－１６１２）によって視覚化された。
Ｓ２８８Ｃリファレンスゲノム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ；ＳＧＤ）のＮｒｄ１の二次および三次タンパク質構造は、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ ＡＳＳＥｍｂｌｙ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ）によって予測された（Ｙａｎｇ，Ｊ．；Ｙａｎ，Ｒ．；Ｒｏｙ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１５，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．７－８）。ＣスコアとＴＭスコア（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，２００８，Ｖｏｌ．９，ｐ．４０）によって、最初にランク付けされたＰＤＢファイルは、ＵＣＦＳ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．；Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．；ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．，２００４，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．１６０５－１６１２）によって視覚化された。
【0057】
（実験結果）
１．８重変異を有するゲノム編集された清酒酵母株の単離
以前の研究においてゲノム編集技術を使用して構築された非泡形成酵母株Ｋ７ＧＥ０１を出発材料として使用した（図１）。改良されたＣＲＩＳＰＲＣａｓ９システムを使用したゲノム編集技術（Ｒｙａｎ，Ｏ．Ｗ．；Ｓｋｅｒｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．，２０１４，Ｖｏｌ．１９）を使用して追加の３ステップの直列育種を実行した。このシステムは、シングルステップ形質転換、マーカーレス清酒酵母分離株に適した優勢な選択マーカー（Ｇ４１８ｒ）の使用、マーカーレスアレルを生成する能力、およびゲノム編集プラスミドの除去の容易さといった利点を有する。ａｗａ１Δ／ａｗａ１Δは非泡形成特性を持っているため、この実験で作成されたゲノム編集清酒酵母のいずれかを使用することにより、醸造タンクの有効容量を増やすことができる。２番目に導入された変異ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δは、尿素回路に欠損を生じさせる。このため、直列育種におけるＫ７ＧＥ２１以降のゲノム編集酵母は、カルバミン酸エチルの含有量が少なく、安全性が向上した日本酒を製造することが意図される（図１Ｂ）。３番目に導入された変異であるｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δによって、ＤＭＴＳはほとんど生成されない。この変異は、Ｋ７ＧＥ３１以降の菌株の保管中に不快な香りのヒネカを生成しない日本酒を生産することを意図している（図１Ｃ）。最後に、吟醸の香りが強い日本酒が好きな人もいるため、ＦＡＳ２に点変異を導入してＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）株を生成した（図１Ｄ）。最終的なゲノム編集株Ｋ７ＧＥ４１は、標準的な清酒酵母株Ｋ７で構成され、８重変異ａｗａ１Δ／ａｗａ１Δ、ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ、ｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ、およびＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）を有している。全ゲノム配列の比較により、育種プロセスの４つのステップの間に、１つのヘテロ接合変異と１つのヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）がゲノムに導入されたことが明らかとなった（表３）。
表３ ゲノム編集清酒酵母株の全ゲノムシークエンス比較
１．８重変異を有するゲノム編集された清酒酵母株の単離
以前の研究においてゲノム編集技術を使用して構築された非泡形成酵母株Ｋ７ＧＥ０１を出発材料として使用した（図１）。改良されたＣＲＩＳＰＲＣａｓ９システムを使用したゲノム編集技術（Ｒｙａｎ，Ｏ．Ｗ．；Ｓｋｅｒｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．，２０１４，Ｖｏｌ．１９）を使用して追加の３ステップの直列育種を実行した。このシステムは、シングルステップ形質転換、マーカーレス清酒酵母分離株に適した優勢な選択マーカー（Ｇ４１８ｒ）の使用、マーカーレスアレルを生成する能力、およびゲノム編集プラスミドの除去の容易さといった利点を有する。ａｗａ１Δ／ａｗａ１Δは非泡形成特性を持っているため、この実験で作成されたゲノム編集清酒酵母のいずれかを使用することにより、醸造タンクの有効容量を増やすことができる。２番目に導入された変異ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δは、尿素回路に欠損を生じさせる。このため、直列育種におけるＫ７ＧＥ２１以降のゲノム編集酵母は、カルバミン酸エチルの含有量が少なく、安全性が向上した日本酒を製造することが意図される（図１Ｂ）。３番目に導入された変異であるｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δによって、ＤＭＴＳはほとんど生成されない。この変異は、Ｋ７ＧＥ３１以降の菌株の保管中に不快な香りのヒネカを生成しない日本酒を生産することを意図している（図１Ｃ）。最後に、吟醸の香りが強い日本酒が好きな人もいるため、ＦＡＳ２に点変異を導入してＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）株を生成した（図１Ｄ）。最終的なゲノム編集株Ｋ７ＧＥ４１は、標準的な清酒酵母株Ｋ７で構成され、８重変異ａｗａ１Δ／ａｗａ１Δ、ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ、ｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ、およびＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）を有している。全ゲノム配列の比較により、育種プロセスの４つのステップの間に、１つのヘテロ接合変異と１つのヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）がゲノムに導入されたことが明らかとなった（表３）。
表３ ゲノム編集清酒酵母株の全ゲノムシークエンス比較
【0058】
Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１には、Ｎｒｄ１複合体のＲＮＡ結合サブユニットをコードする必須遺伝子であるＮｒｄ１のＮ５３２Ｋに対応する単一のヘテロ接合変異が含まれていた（表３）。この変異は親のＫ７ＧＥ０１株には存在しなかったため、Ｋ７ＧＥ２１の形質転換、培養、または貯蔵プロセス中に出現したものと考えられる。この変異はヘテロ接合であり、Ｎｒｄ１のＮ５３２Ｋは当該領域の予測されるタンパク質構造に明らかな変化を引き起こさない。さらに当該変異はＮｒｄ１の機能ドメイン、例えばＣＴＤ相互作用ドメイン（６２－１３７ａａ）およびＲＮＡ認識モチーフ（３４１－３９６ａａ）の遥か下流に位置している。これらの結果は、Ｋ７ＧＥ２１のヘテロ接合のオフターゲット変異の影響は無視できることを示している。
【0059】
Ｋ７ＧＥ３１とＫ７ＧＥ４１は、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）のために同じホモ接合ＳＮＰを有していた。対応するヘテロ接合ＳＮＰは、元のＫ７分離株であるＫ７ＧＥ０１およびＫ７ＧＥ２１にすでに存在しており、Ｋ７ＧＥ３１が作成されたときに単一のＬＯＨが導入されたことが示唆される。ＬＯＨの発生機序は不明であるが、ＬＯＨは、特に清酒酵母分離株で非常に高い頻度で観察されている（Ｐｅｔｅｒ，Ｊ．；Ｄｅ Ｃｈｉａｒａ，Ｍ．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１８，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．３３９－３４４）。ゲノム編集されたＭＤＥ１とＬＯＨ遺伝子座は両方とも同じ染色体Ｘ上にあり、非常に近い遺伝距離（～７０ｋｂ）を有していることから、ＬＯＨはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９依存性の二本鎖切断によって誘導される可能性があることが示唆される。
【0060】
２．日本酒醸造酵母のゲノム編集効率
変異が意図したとおりに育種中に導入されたかどうかをＰＣＲを使用して調査した。意図した変異が導入された酵母形質転換体の数を、調べた形質転換体の数で除することにより、ゲノム編集効率を計算した。当該ゲノム編集効率はＣＡＲ１遺伝子座で最も高く、形質転換体の９６±４％が正しく遺伝子改変された（ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ；図２）。当該ゲノム編集効率はＡＷＡ１遺伝子座で最も低く、形質転換体の１６±３％のみが正しく遺伝子改変されていた（ａｗａ１Δ／ａｗａ１Δ；図２）。すべての株においてホモ接合性変異が導入され、ヘテロ接合性変異はなかった。これらの結果は、日本酒醸造酵母のゲノム編集においては常にホモ接合変異が導入されること、また、ゲノム編集効率が遺伝子座に依存していることを示唆した。
変異が意図したとおりに育種中に導入されたかどうかをＰＣＲを使用して調査した。意図した変異が導入された酵母形質転換体の数を、調べた形質転換体の数で除することにより、ゲノム編集効率を計算した。当該ゲノム編集効率はＣＡＲ１遺伝子座で最も高く、形質転換体の９６±４％が正しく遺伝子改変された（ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ；図２）。当該ゲノム編集効率はＡＷＡ１遺伝子座で最も低く、形質転換体の１６±３％のみが正しく遺伝子改変されていた（ａｗａ１Δ／ａｗａ１Δ；図２）。すべての株においてホモ接合性変異が導入され、ヘテロ接合性変異はなかった。これらの結果は、日本酒醸造酵母のゲノム編集においては常にホモ接合変異が導入されること、また、ゲノム編集効率が遺伝子座に依存していることを示唆した。
【0061】
３．ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ酵母株で醸造された日本酒における尿素生成抑制
発がん性の可能性のあるカルバミン酸エチルは、日本酒の貯蔵中に尿素から変換される（Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．；Ｏｄａ，Ｋ．；Ｇｏｍｉ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９１，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．３０１－３０６）。尿素は、尿素回路のアルギナーゼによってアルギニンから生成される。安全性の問題が少ない日本酒醸造酵母を得るために、アルギナーゼをコードするＣＡＲ１遺伝子を削除し、ホモ接合のｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ変異を持つ組換え清酒酵母、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１を作成した（図１）。
ゲノム編集されたｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ株で作られた日本酒の特性を確認するために、小規模発酵試験で作られた日本酒の成分を分析した。予想通り、これらの菌株で醸造された酒は、親のＣＡＲ１／ＣＡＲ１菌株であるＫ７ＧＥ０１で醸造された酒よりも有意に低いレベルの尿素を含んでいた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図３Ａ）。低レベルの尿素は、既存の非尿素生産酒株であるＫａｒｇ７およびＫ１９０１（Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ． Ｊ Ｓｏｃ Ｂｒｅｗ Ｊｐｎ．，１９９３，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．１０６－１１４）で製造されたものとほぼ同等であり、ゲノム編集されたｃａｒ１Δ／ｃａｒ１株を実際に非尿素生産清酒酵母として利用できることを示している。
発がん性の可能性のあるカルバミン酸エチルは、日本酒の貯蔵中に尿素から変換される（Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．；Ｏｄａ，Ｋ．；Ｇｏｍｉ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９１，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．３０１－３０６）。尿素は、尿素回路のアルギナーゼによってアルギニンから生成される。安全性の問題が少ない日本酒醸造酵母を得るために、アルギナーゼをコードするＣＡＲ１遺伝子を削除し、ホモ接合のｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ変異を持つ組換え清酒酵母、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１を作成した（図１）。
ゲノム編集されたｃａｒ１Δ／ｃａｒ１Δ株で作られた日本酒の特性を確認するために、小規模発酵試験で作られた日本酒の成分を分析した。予想通り、これらの菌株で醸造された酒は、親のＣＡＲ１／ＣＡＲ１菌株であるＫ７ＧＥ０１で醸造された酒よりも有意に低いレベルの尿素を含んでいた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図３Ａ）。低レベルの尿素は、既存の非尿素生産酒株であるＫａｒｇ７およびＫ１９０１（Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ． Ｊ Ｓｏｃ Ｂｒｅｗ Ｊｐｎ．，１９９３，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．１０６－１１４）で製造されたものとほぼ同等であり、ゲノム編集されたｃａｒ１Δ／ｃａｒ１株を実際に非尿素生産清酒酵母として利用できることを示している。
【0062】
４．ｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ酵母株で醸造された日本酒におけるＤＭＴＳ前駆体の減少
特に比較的高温で日本酒を長期保存すると、ヒネカの主要な不快成分であるＤＭＴＳが、その前駆体であるＤＭＴＳ－Ｐ１から誘導される。ＤＭＴＳ－Ｐ１は、メチオニンサルベージ経路に関与するＭｄｅ１とＭｒｉ１の酵素作用により、日本酒の発酵中に生成される。したがって、ＭＤＥ１遺伝子に欠損のある清酒酵母は、ＤＭＴＳの産生の低下を示す（Ｍａｋｉｍｏｔｏ，Ｊ．；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．；Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．，２０２０，Ｖｏｌ．１３０，ｐｐ．６１０－６１５）。本実験では、ＭＤＥ１遺伝子を削除して、不快な香りの少ない日本酒を作る清酒酵母を得た。ホモ接合型のｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ変異を持つ組換え清酒酵母Ｋ７ＧＥ３１およびＫ７ＧＥ４１を作成した（図１）。
小規模発酵試験により、いくつかのゲノム編集株で作られた日本酒の前駆体ＤＭＴＳ－Ｐ１の濃度を測定した。予想通り、ｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ株で作られた日本酒は、直接の祖先であるＭＤＥ１／ＭＤＥ１株であるＫ７ＧＥ０１およびＫ７ＧＥ２１で作られた日本酒よりも有意に低いレベルのＤＭＴＳ－Ｐ１を含んでいた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図３Ｂ）。ＤＭＴＳ Ｐ１のレベルは２０分の１に減少した。これは、ゲノム編集されたｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ株を使用して、不快な香りの少ない日本酒を醸造できることを示している。
特に比較的高温で日本酒を長期保存すると、ヒネカの主要な不快成分であるＤＭＴＳが、その前駆体であるＤＭＴＳ－Ｐ１から誘導される。ＤＭＴＳ－Ｐ１は、メチオニンサルベージ経路に関与するＭｄｅ１とＭｒｉ１の酵素作用により、日本酒の発酵中に生成される。したがって、ＭＤＥ１遺伝子に欠損のある清酒酵母は、ＤＭＴＳの産生の低下を示す（Ｍａｋｉｍｏｔｏ，Ｊ．；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．；Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．，２０２０，Ｖｏｌ．１３０，ｐｐ．６１０－６１５）。本実験では、ＭＤＥ１遺伝子を削除して、不快な香りの少ない日本酒を作る清酒酵母を得た。ホモ接合型のｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ変異を持つ組換え清酒酵母Ｋ７ＧＥ３１およびＫ７ＧＥ４１を作成した（図１）。
小規模発酵試験により、いくつかのゲノム編集株で作られた日本酒の前駆体ＤＭＴＳ－Ｐ１の濃度を測定した。予想通り、ｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ株で作られた日本酒は、直接の祖先であるＭＤＥ１／ＭＤＥ１株であるＫ７ＧＥ０１およびＫ７ＧＥ２１で作られた日本酒よりも有意に低いレベルのＤＭＴＳ－Ｐ１を含んでいた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図３Ｂ）。ＤＭＴＳ Ｐ１のレベルは２０分の１に減少した。これは、ゲノム編集されたｍｄｅ１Δ／ｍｄｅ１Δ株を使用して、不快な香りの少ない日本酒を醸造できることを示している。
【0063】
５．ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）酵母株で醸造された日本酒におけるカプロン酸エチル含有量の向上
吟醸香は、エタノールとカプロン酸から生成されるカプロン酸エチルによって引き起こされる。カプロン酸は、脂肪酸合成経路において、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸から合成される。そして、脂肪酸シンターゼのαサブユニットをコードするＦＡＳ２遺伝子のＧｌｙ１２５０Ｓｅｒ変異は、カプロン酸エチルの産生を増強する。そこで、この変異を導入して吟醸香が強い酒を生産する清酒酵母を得た。ホモ接合型ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）変異を有する組換え清酒酵母株、Ｋ７ＧＥ４１を作成した（図１）。
小規模発酵試験により、ゲノム編集された、いくつかの菌株で作られた日本酒のカプロン酸エチルの濃度を測定した。ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）株で作られた日本酒は、その直接の祖先株であるＫ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、およびＫ７ＧＥ３１で作られた日本酒よりも有意に高いレベルのカプロン酸エチルを含むこと見いだされた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図３Ｃ）。Ｋ７ＧＥ４１によって生成されたカプロン酸エチルの濃度は、その親株によって生成された濃度の４．５倍であり、標準的なカプロン酸エチル生成株であるＫ１８０１によって生成された濃度と同等であった（Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．；Ｏｋａｄａ，Ｈ．；Ｋｕｍｅ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１５，Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．１１９１－１１９９）。これらの結果は、最終的なゲノム編集酵母株Ｋ７ＧＥ４１が強い吟醸香を持つ日本酒を生産することを示している。
吟醸香は、エタノールとカプロン酸から生成されるカプロン酸エチルによって引き起こされる。カプロン酸は、脂肪酸合成経路において、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸から合成される。そして、脂肪酸シンターゼのαサブユニットをコードするＦＡＳ２遺伝子のＧｌｙ１２５０Ｓｅｒ変異は、カプロン酸エチルの産生を増強する。そこで、この変異を導入して吟醸香が強い酒を生産する清酒酵母を得た。ホモ接合型ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）変異を有する組換え清酒酵母株、Ｋ７ＧＥ４１を作成した（図１）。
小規模発酵試験により、ゲノム編集された、いくつかの菌株で作られた日本酒のカプロン酸エチルの濃度を測定した。ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）／ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）株で作られた日本酒は、その直接の祖先株であるＫ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、およびＫ７ＧＥ３１で作られた日本酒よりも有意に高いレベルのカプロン酸エチルを含むこと見いだされた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図３Ｃ）。Ｋ７ＧＥ４１によって生成されたカプロン酸エチルの濃度は、その親株によって生成された濃度の４．５倍であり、標準的なカプロン酸エチル生成株であるＫ１８０１によって生成された濃度と同等であった（Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．；Ｏｋａｄａ，Ｈ．；Ｋｕｍｅ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１５，Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．１１９１－１１９９）。これらの結果は、最終的なゲノム編集酵母株Ｋ７ＧＥ４１が強い吟醸香を持つ日本酒を生産することを示している。
【0064】
６．ゲノム編集された菌株の発酵活性
小規模発酵試験を実施し、日本酒醸造におけるゲノム編集菌株の発酵特性を調査した。発酵もろみの重量から推定される１日あたりのＣＯ２排出レベルは、調べたすべての菌株で４日目にピークを示した（図４Ａ）。しかし、吟醸香が強い日本酒を生産するＫ７ＧＥ４１では、発酵の開始が遅いことが見いだされた。このため、当該菌株によるピーク後の発酵減少は遅れており（図４Ａ）、Ｋ７ＧＥ４１による発酵が酒造りの初期段階でわずかに遅れたことを示唆していた。発酵終了時の総ＣＯ２排出量において相違は検出されなかった（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図４Ｂ）。本結果は、これらのゲノム編集株が同様のエタノール生産を行ったことを示している（図７）。
小規模発酵試験を実施し、日本酒醸造におけるゲノム編集菌株の発酵特性を調査した。発酵もろみの重量から推定される１日あたりのＣＯ２排出レベルは、調べたすべての菌株で４日目にピークを示した（図４Ａ）。しかし、吟醸香が強い日本酒を生産するＫ７ＧＥ４１では、発酵の開始が遅いことが見いだされた。このため、当該菌株によるピーク後の発酵減少は遅れており（図４Ａ）、Ｋ７ＧＥ４１による発酵が酒造りの初期段階でわずかに遅れたことを示唆していた。発酵終了時の総ＣＯ２排出量において相違は検出されなかった（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５；図４Ｂ）。本結果は、これらのゲノム編集株が同様のエタノール生産を行ったことを示している（図７）。
【0065】
７．発酵試験で製造した日本酒の成分分析
ゲノム編集された菌株によって作られた日本酒の特徴を明らかにするために、日本酒の標準的な１９成分を分析した。上記で説明したように、菌株間で発酵速度に相違が示されたため（図４Ａ）、Ｋ７ＧＥ４１と他の菌株の間で日本酒の成分に相違が観察されることが予想された。違いを視覚的に特徴づけるために、小規模発酵試験で作られた日本酒の成分でＰＣＡを実行した後、縮退した直交空間内のすべての菌株を調べた。２種類のＰＣＡ、つまり、３つの変更されたターゲット成分（尿素、ＤＭＴＳ―Ｐ１、およびカプロン酸エチル）がある場合とない場合のＰＣＡを実行した。どちらの場合も、Ｋ７ＧＥ４１は、第１主成分－第２主成分（ＰＣ１－ＰＣ２）の直交空間で、他の株からかなりに遠くに位置した（図５Ａ、Ｂ）。意図的に変更された３個の成分を削除した後の１６個の成分でＰＣＡを実行した場合、ＰＣ１とＰＣ２の寄与はそれぞれ分散の６９％と１５％を占め（図５Ｂ）、累積寄与は８４％であった（図８Ａ、Ｂ）。ゲノム編集された菌株、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、およびＫ７ＧＥ３１は共に、退化した空間において左側に位置した。対照的に、Ｋ７ＧＥ４１株は、ピルビン酸やＳＭＶなどの発酵関連成分、酢酸エチルや酢酸イソアミルおよびアミノ酸性などの芳香成分の方向とほぼ平行に、右中央に位置した。
ゲノム編集された菌株によって作られた日本酒の特徴を明らかにするために、日本酒の標準的な１９成分を分析した。上記で説明したように、菌株間で発酵速度に相違が示されたため（図４Ａ）、Ｋ７ＧＥ４１と他の菌株の間で日本酒の成分に相違が観察されることが予想された。違いを視覚的に特徴づけるために、小規模発酵試験で作られた日本酒の成分でＰＣＡを実行した後、縮退した直交空間内のすべての菌株を調べた。２種類のＰＣＡ、つまり、３つの変更されたターゲット成分（尿素、ＤＭＴＳ―Ｐ１、およびカプロン酸エチル）がある場合とない場合のＰＣＡを実行した。どちらの場合も、Ｋ７ＧＥ４１は、第１主成分－第２主成分（ＰＣ１－ＰＣ２）の直交空間で、他の株からかなりに遠くに位置した（図５Ａ、Ｂ）。意図的に変更された３個の成分を削除した後の１６個の成分でＰＣＡを実行した場合、ＰＣ１とＰＣ２の寄与はそれぞれ分散の６９％と１５％を占め（図５Ｂ）、累積寄与は８４％であった（図８Ａ、Ｂ）。ゲノム編集された菌株、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、およびＫ７ＧＥ３１は共に、退化した空間において左側に位置した。対照的に、Ｋ７ＧＥ４１株は、ピルビン酸やＳＭＶなどの発酵関連成分、酢酸エチルや酢酸イソアミルおよびアミノ酸性などの芳香成分の方向とほぼ平行に、右中央に位置した。
【0066】
上記のＰＣＡから推定された結果は、個々の成分の直接的な統計的比較によって確認された。発酵関連の成分を考慮すると、Ｋ７ＧＥ４１で作られた日本酒は、Ｋ７ＧＥ０１で作られた日本酒よりもピルビン酸が有意に高く（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１；図６Ａ）、ＳＭＶが有意に低かった（ｐ＜０．０５；図６Ｂ）。Ｋ７ＧＥ４１から作られた日本酒では、酢酸エチルや酢酸イソアミルなどの芳香成分が大幅に減少した（ｐ＜０．０５；図６Ｃ、Ｄ）。Ｋ７ＧＥ４１から作られた日本酒では、アミノ酸性度が大幅に増加した（ｐ＜０．０５；図６Ｅ）。図９および図１０に、Ｋ７ＧＥ４１で意図せず変更された他の成分を要約した。Ｋ７ＧＥ４１の育種中に変化した１４の成分と比較して、他の育種プロセスではほとんど変化が観察されなかった。ｃａｒ１Δ／ｃａｒ１ΔをＫ７ＧＥ０１に導入してＫ７ＧＥ２１を作成した場合、４つの成分（イソアミルアルコール、１プロパノール、コハク酸、および乳酸）のみが大幅かつ意図せずに変更された（ｐ＜０．０５；図１０）。Ｋ７ＧＥ３１の培養中に予期しない成分は変更されなかった。一連の直列育種ステップ中に、エタノール、酸性度、およびリンゴ酸は変化しなかった（図７）。これらの清酒酵母株の直列育種の間に、多くの成分が意図せずに変化した。
【0067】
８．ゲノム編集された酒酵母株の形態素解析
以前、Ｋ７系統間の酒酵母分離株の形態的多様性が報告されている（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｋａｄａ． Ｈ．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．．Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．，２０１７，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２８０７－２８２０）。さらに、非泡形成酵母株をゲノム編集技術で生成した場合、顕著な形態学的変化が観察された。そこで、本実験では、連続繁殖段階でどのような形態変化が観察されたかを調査した。Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１の高次元形態学的表現型を、細胞壁、アクチン、および核ＤＮＡを染色した後、画像解析システムＣａｌＭｏｒｐｈを使用して実行した。育種の４つの段階のそれぞれが特徴的な形態学的変化を示したことが２次元形態学的空間で明らかにされた（図１１Ａ）。特に、Ｋ７ＧＥ４１の生成段階における大きな形態変化が著明であった。
以前、Ｋ７系統間の酒酵母分離株の形態的多様性が報告されている（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｋａｄａ． Ｈ．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．．Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．，２０１７，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２８０７－２８２０）。さらに、非泡形成酵母株をゲノム編集技術で生成した場合、顕著な形態学的変化が観察された。そこで、本実験では、連続繁殖段階でどのような形態変化が観察されたかを調査した。Ｋ７、Ｋ７ＧＥ０１、Ｋ７ＧＥ２１、Ｋ７ＧＥ３１、およびＫ７ＧＥ４１の高次元形態学的表現型を、細胞壁、アクチン、および核ＤＮＡを染色した後、画像解析システムＣａｌＭｏｒｐｈを使用して実行した。育種の４つの段階のそれぞれが特徴的な形態学的変化を示したことが２次元形態学的空間で明らかにされた（図１１Ａ）。特に、Ｋ７ＧＥ４１の生成段階における大きな形態変化が著明であった。
【0068】
全体的な形態学的異常（ＨＭＡ）は、形態学的変化がどれだけ大きく発生したかを示す尺度である（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｇ．；Ｗａｎｇ，Ｙ．；Ｋｕｂｏ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，２０１８，Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．１４９）。各ステップでのＨＭＡの検査により、Ｋ７ＧＥ４１が生成されたときに実際に有意で最大の形態変化が発生したことが明らかとなった（ガンマ分布を伴う一元配置分散分析の尤度比検定によるボンフェローニ補正後のＰ＜０．０５、図１１Ｂ）。Ｋ７ＧＥ３１の生成時に、ＨＭＡに検出可能な変化はなかった（図７Ｂ）。各ステップでの形態学的変化を、尤度比検定によって検出した（ＦＤＲ＝０．０１、表Ｓ４）。最も顕著な形態学的変化は、Ｋ７ＧＥ４１の繁殖中に検出された。Ｋ７ＧＥ４１の細胞は明らかに大きくなり（図１１Ｃ）、これは甘い吟醸の香りを生み出す酒酵母株が大きいという以前の観察とよく一致していた（Ｙｏｄａ，Ｔ．；Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．，２０２０，Ｖｏｌｌ．１０，ｐ．４４２）。さらに、Ｋ７ＧＥ４１は、非局在化アクチンパッチを持つ細胞の割合の増加、Ｇ２細胞の増加、母細胞における核局在化などの形態学的変化を示した（図１２）。これらは、ＦＡＳ２（Ｇ１２５０Ｓ）変異によって引き起こされた結果であると考えられた。まとめると、育種プロセスの４つのステップで導入された変異により、さまざまな特徴的な形態変化が発生することが結論付けられた。
【0069】
以上の結果は、選択マーカーを有しない倍数体微生物である酒醸造酵母を例として、本開示のゲノム編集技術を用いた直列育種により、極めて高効率に意図した遺伝子変異を導入し、意図しない遺伝子変異の導入を抑制し、優れた特性を有する醸造微生物を取得し得ことを示している。
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明は、商業的に重要なアルコール発酵微生物の改変において極めて重要な技術を提供する。したがって、本発明は、例えば、酒醸造関連産業などで利用可能である。また、本開示は微生物の発酵プロセスなどに関する研究機関においても利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】