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特開2024-116471ＥＦ－Ｐ応答性人工開始ｔＲＮＡを用いた外来アミノ酸による翻訳開始
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024116471
(43)【公開日】2024-08-28
(54)【発明の名称】ＥＦ－Ｐ応答性人工開始ｔＲＮＡを用いた外来アミノ酸による翻訳開始
(51)【国際特許分類】
C07K 1/00 20060101AFI20240821BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240821BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20240821BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240821BHJP
【ＦＩ】
C07K1/00 ZNA
C12N15/11 Z
C40B40/10
C40B40/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023022106
(22)【出願日】2023-02-16
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】菅 裕明
(72)【発明者】
【氏名】加藤 敬行
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA20
4H045BA01
4H045BA10
4H045EA50
4H045FA70
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に汎用的に導入することができるペプチドの製造方法、並びにかかる製造方法に用いるための開始ｔＲＮＡ及び翻訳系等を提供すること。
【解決手段】配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
（配列番号１において、Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。）
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
（配列番号１において、Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。）
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
（配列番号１において、
Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、
ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。）
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
（配列番号１において、
Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、
ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。）
【請求項2】
前記製造されるペプチドが、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記開始ｔＲＮＡが、α位、β位若しくはγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、若しくはＬ－プロリン、又はペプチドをチャージしている、請求項１に記載の製造方法。
【請求項4】
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号２で示される塩基配列をさらに含有する、請求項１に記載の製造方法。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号２）
（配列番号２において、
Ｎ１４～Ｎ２０は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１０は、Ａ又はＧを示し、Ｎ１１は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１２は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１３は、Ｇ又はＵを示し、Ｎ２１は、Ａ又はＣを示し、Ｎ２２は、Ａ又はＧを示し、Ｎ２３はＡ又はＧを示し、
Ｎ１４～Ｎ２０は、アンチコドンループを形成し、
Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成する。）
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号２）
（配列番号２において、
Ｎ１４～Ｎ２０は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１０は、Ａ又はＧを示し、Ｎ１１は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１２は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１３は、Ｇ又はＵを示し、Ｎ２１は、Ａ又はＣを示し、Ｎ２２は、Ａ又はＧを示し、Ｎ２３はＡ又はＧを示し、
Ｎ１４～Ｎ２０は、アンチコドンループを形成し、
Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成する。）
【請求項5】
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列をさらに含有する、請求項１に記載の製造方法。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２４）ｍＣＣＧＧＣ （配列番号３）
（配列番号３において、
Ｎ２４は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２４）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成する。）
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２５）ｍＣＣＧＧＵ （配列番号４）
（配列番号４において、
Ｎ２５は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２５）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＣＧＧ（Ｎ２６）ｍＣＣＧＣＵ （配列番号５）
（配列番号５において、
Ｎ２６は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２６）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＣＧＧが、ＣＣＧＣＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＡＧＧ（Ｎ２７）ｍＣＣＵＣＵ （配列番号６）
（配列番号６において、
Ｎ２７は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２７）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＡＧＧが、ＣＣＵＣＵとＴステムを形成する。）
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２４）ｍＣＣＧＧＣ （配列番号３）
（配列番号３において、
Ｎ２４は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２４）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成する。）
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２５）ｍＣＣＧＧＵ （配列番号４）
（配列番号４において、
Ｎ２５は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２５）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＣＧＧ（Ｎ２６）ｍＣＣＧＣＵ （配列番号５）
（配列番号５において、
Ｎ２６は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２６）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＣＧＧが、ＣＣＧＣＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＡＧＧ（Ｎ２７）ｍＣＣＵＣＵ （配列番号６）
（配列番号６において、
Ｎ２７は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２７）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＡＧＧが、ＣＣＵＣＵとＴステムを形成する。）
【請求項6】
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号７で示される塩基配列をさらに含有する、請求項１に記載の製造方法。
Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣ （配列番号７）
（配列番号７において、
Ｎ２８はＡ又はＧを示し、Ｎ２９はＡ又はＧを示し、Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣは、可変ループを形成する。）
Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣ （配列番号７）
（配列番号７において、
Ｎ２８はＡ又はＧを示し、Ｎ２９はＡ又はＧを示し、Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣは、可変ループを形成する。）
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の開始ｔＲＮＡ。
【請求項8】
請求項７に記載の開始ｔＲＮＡを含む、翻訳系。
【請求項9】
請求項８に記載の翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドライブラリの製造方法。
【請求項10】
請求項８に記載の翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法。
【請求項11】
請求項９に記載の方法によって製造されるペプチドライブラリ。
【請求項12】
請求項１０に記載の方法によって製造されるペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
【請求項13】
α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドを含む、請求項１１に記載のペプチドライブラリ。
【請求項14】
α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体を含む、請求項１２に記載のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＥＦ－Ｐ応答性人工開始ｔＲＮＡを用いた外来アミノ酸による翻訳開始に関する。具体的には、本発明は、ペプチドの製造方法、開始ｔＲＮＡ、翻訳系、並びにペプチドライブラリ及びペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリの製造方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
翻訳開始において、Ｐ－サイトのＮ－ホルミルメチオニル開始ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ－ｔＲＮＡｉｎｉ）は、翻訳開始因子ＩＦ３によって認識され、コドン－アンチコドン相互作用の安定性が調べられることで、活性位置に配置される（非特許文献１～３）。ＩＦ３によって活性位置に配置されない場合、ｆＭｅｔ－ｔＲＮＡｉｎｉは最終的にリボソームから脱落し、Ａサイトの２番目のアミノアシルｔＲＮＡから翻訳が再開され、再開ペプチド（ｒｅｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＲｉＰ）と呼ばれる、Ｎ末端のｆＭｅｔ（Ｎ－ホルミルメチオニン）が欠失したペプチドが合成される（非特許文献４）。この現象は、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｒｏｐ－ｏｆｆ－ｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）と呼ばれている。
【0003】
遺伝子コードのリプログラミングによって、ｆＭｅｔだけでなく、様々な非標準的な基質も、ペプチドのＮ末端に人工的に導入することができる。しかしながら、Ｎ－アセチル－Ｌ－プロリン（ＡｃＰｒｏ）のような、低いペプチジルドナー活性を有する非標準的な基質の取り込みは、より頻繁にＮ末端ドロップオフ翻訳再開を引き起こす（非特許文献４～５）。したがって、そのような非タンパク質性アミノ酸をＮ末端に導入することは非常に困難である。
【0004】
また、天然においては、リボソーム翻訳系は、１９のタンパク質性Ｌ－アミノ酸及びグリシンを利用するが、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のような非タンパク質性アミノ酸は、リボソーム翻訳系によるペプチド合成及びタンパク質合成においては除外されている。Ｄ－アミノ酸及びβ－アミノ酸は、様々な天然ペプチドに見出されているが、通常、非リボソーム翻訳系により合成されている。そこで、これらの非タンパク質性アミノ酸を導入するための様々な方法が開発されている。
例えば、特許文献１には、無細胞翻訳系で翻訳する際に、非タンパク質性アミノ酸が連続して結合したペプチドを合成することのできる翻訳系が開示されている。特許文献２には、複数の異なるＮ－メチルアミノ酸の同時取込みを可能にするペプチドの合成方法が開示されている。
例えば、特許文献１には、無細胞翻訳系で翻訳する際に、非タンパク質性アミノ酸が連続して結合したペプチドを合成することのできる翻訳系が開示されている。特許文献２には、複数の異なるＮ－メチルアミノ酸の同時取込みを可能にするペプチドの合成方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１９／０７７８８７号
【特許文献2】国際公開第２０２１／１００８３３号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Simonetti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O. and Klaholz, B.P. (2008) Structure of the 30S translation initiation complex. Nature, 455, 416-420.
【非特許文献2】Hussain, T., Llacer, J.L., Wimberly, B.T., Kieft, J.S. and Ramakrishnan, V. (2016) Large-scale movements of IF3 and tRNA during bacterial translation initiation. Cell, 167, 133-144.e113.
【非特許文献3】Kaledhonkar, S., Fu, Z., Caban, K., Li, W., Chen, B., Sun, M., Gonzalez, R.L. and Frank, J. (2019) Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature, 570, 400-404.
【非特許文献4】Katoh, T. and Suga, H. (2022) Drop-off-reinitiation at the N-termini of nascent peptides and its regulation by IF3, EF-G, and RRF. Nucleic Acids Res.,
【非特許文献5】Muto, H. and Ito, K. (2008) Peptidyl-prolyl-tRNA at the ribosomal P-site reacts poorly with puromycin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 366, 1043-1047.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、翻訳のメカニズムにおいて開始反応と伸長反応は明確に異なるため、特許文献１及び２に記載のような伸長ｔＲＮＡを翻訳の開始に用いることはできない。
したがって、アセチル－Ｌ－プロリン（ＡｃＰｒｏ）、並びにＤ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のような非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸をペプチドのＮ末端に導入するための新規な方法が求められている。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に汎用的に導入することができるペプチドの製造方法、並びにかかる製造方法に用いるための開始ｔＲＮＡ及び翻訳系等を提供することである。
したがって、アセチル－Ｌ－プロリン（ＡｃＰｒｏ）、並びにＤ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のような非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸をペプチドのＮ末端に導入するための新規な方法が求められている。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に汎用的に導入することができるペプチドの製造方法、並びにかかる製造方法に用いるための開始ｔＲＮＡ及び翻訳系等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らが鋭意検討した結果、所定の構造を有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することで、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開を抑制でき、種々のアミノ酸を用いた翻訳開始を実現できることを見出し、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
（配列番号１において、
Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、
ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。）
［２］
前記製造されるペプチドが、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドである、［１］に記載の製造方法。
［３］
前記開始ｔＲＮＡが、α位、β位若しくはγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、若しくはＬ－プロリン、又はペプチドをチャージしている、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号２で示される塩基配列をさらに含有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号２）
（配列番号２において、
Ｎ１４～Ｎ２０は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１０は、Ａ又はＧを示し、Ｎ１１は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１２は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１３は、Ｇ又はＵを示し、Ｎ２１は、Ａ又はＣを示し、Ｎ２２は、Ａ又はＧを示し、Ｎ２３はＡ又はＧを示し、
Ｎ１４～Ｎ２０は、アンチコドンループを形成し、
Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成する。）
［５］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列をさらに含有する、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２４）ｍＣＣＧＧＣ （配列番号３）
（配列番号３において、
Ｎ２４は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２４）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成する。）
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２５）ｍＣＣＧＧＵ （配列番号４）
（配列番号４において、
Ｎ２５は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２５）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＣＧＧ（Ｎ２６）ｍＣＣＧＣＵ （配列番号５）
（配列番号５において、
Ｎ２６は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２６）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＣＧＧが、ＣＣＧＣＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＡＧＧ（Ｎ２７）ｍＣＣＵＣＵ （配列番号６）
（配列番号６において、
Ｎ２７は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２７）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＡＧＧが、ＣＣＵＣＵとＴステムを形成する。）
［６］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号７で示される塩基配列をさらに含有する、［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣ （配列番号７）
（配列番号７において、
Ｎ２８はＡ又はＧを示し、Ｎ２９はＡ又はＧを示し、Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣは、可変ループを形成する。）
［６－１］
前記開始ｔＲＮＡの５’末端の塩基が、対合する塩基とミスマッチになっている、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－２］
前記開始ｔＲＮＡの５’末端の塩基がＧであり、対合する塩基がＡである、［１］～［６－１］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－３］
前記開始ｔＲＮＡは、５’末端から数えて１番目の塩基と、３’末端から数えて５番目の塩基とがミスマッチである、［１］～［６－２］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－４］
前記開始ｔＲＮＡは、５’末端から数えて１番目の塩基がＧであり、３’末端から数えて５番目の塩基がＡである、［１］～［６－３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－５］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号２４３で示される塩基配列をさらに含有する、［１］～［６－４］のいずれか１つに記載の製造方法。
ＧＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３ （配列番号２４３）
（配列番号２４３において、
Ｎ３０はＣ又はＧを示し、Ｎ３１はＵ又はＧを示し、Ｎ３２はＡ又はＧを示し、Ｎ３３はＵ又はＧを示し、１番目のＧは対合する塩基と塩基対を形成しておらず、ＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３のそれぞれの塩基は、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣのいずれかと塩基対を形成することで、アクセプターステムを形成する。配列番号２４３における１番目のＧは本実施形態の開始ｔＲＮＡの５’末端であることが好ましい。）
［７］
［１］～［６］（［６－１］～［６－５］も含む。）のいずれか１つに記載の開始ｔＲＮＡ。
［８］
［７］に記載の開始ｔＲＮＡを含む、翻訳系。
［９］
［７］に記載の開始ｔＲＮＡ又は［８］に記載の翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドライブラリの製造方法。
［１０］
［７］に記載の開始ｔＲＮＡ又は［８］に記載の翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法。
［１１］
［９］に記載の方法によって製造されるペプチドライブラリ。
［１２］
［１０］に記載の方法によって製造されるペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
［１３］
α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドを含む、［１１］に記載のペプチドライブラリ。
［１４］
α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体を含む、［１２］に記載のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
［１］
配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
（配列番号１において、
Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、
ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。）
［２］
前記製造されるペプチドが、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドである、［１］に記載の製造方法。
［３］
前記開始ｔＲＮＡが、α位、β位若しくはγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、若しくはＬ－プロリン、又はペプチドをチャージしている、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号２で示される塩基配列をさらに含有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号２）
（配列番号２において、
Ｎ１４～Ｎ２０は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１０は、Ａ又はＧを示し、Ｎ１１は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１２は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１３は、Ｇ又はＵを示し、Ｎ２１は、Ａ又はＣを示し、Ｎ２２は、Ａ又はＧを示し、Ｎ２３はＡ又はＧを示し、
Ｎ１４～Ｎ２０は、アンチコドンループを形成し、
Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成する。）
［５］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列をさらに含有する、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２４）ｍＣＣＧＧＣ （配列番号３）
（配列番号３において、
Ｎ２４は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２４）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成する。）
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２５）ｍＣＣＧＧＵ （配列番号４）
（配列番号４において、
Ｎ２５は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２５）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＣＧＧ（Ｎ２６）ｍＣＣＧＣＵ （配列番号５）
（配列番号５において、
Ｎ２６は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２６）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＣＧＧが、ＣＣＧＣＵとＴステムを形成する。）
ＧＧＡＧＧ（Ｎ２７）ｍＣＣＵＣＵ （配列番号６）
（配列番号６において、
Ｎ２７は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２７）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＡＧＧが、ＣＣＵＣＵとＴステムを形成する。）
［６］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号７で示される塩基配列をさらに含有する、［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣ （配列番号７）
（配列番号７において、
Ｎ２８はＡ又はＧを示し、Ｎ２９はＡ又はＧを示し、Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣは、可変ループを形成する。）
［６－１］
前記開始ｔＲＮＡの５’末端の塩基が、対合する塩基とミスマッチになっている、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－２］
前記開始ｔＲＮＡの５’末端の塩基がＧであり、対合する塩基がＡである、［１］～［６－１］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－３］
前記開始ｔＲＮＡは、５’末端から数えて１番目の塩基と、３’末端から数えて５番目の塩基とがミスマッチである、［１］～［６－２］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－４］
前記開始ｔＲＮＡは、５’末端から数えて１番目の塩基がＧであり、３’末端から数えて５番目の塩基がＡである、［１］～［６－３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６－５］
前記開始ｔＲＮＡが、配列番号２４３で示される塩基配列をさらに含有する、［１］～［６－４］のいずれか１つに記載の製造方法。
ＧＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３ （配列番号２４３）
（配列番号２４３において、
Ｎ３０はＣ又はＧを示し、Ｎ３１はＵ又はＧを示し、Ｎ３２はＡ又はＧを示し、Ｎ３３はＵ又はＧを示し、１番目のＧは対合する塩基と塩基対を形成しておらず、ＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３のそれぞれの塩基は、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣのいずれかと塩基対を形成することで、アクセプターステムを形成する。配列番号２４３における１番目のＧは本実施形態の開始ｔＲＮＡの５’末端であることが好ましい。）
［７］
［１］～［６］（［６－１］～［６－５］も含む。）のいずれか１つに記載の開始ｔＲＮＡ。
［８］
［７］に記載の開始ｔＲＮＡを含む、翻訳系。
［９］
［７］に記載の開始ｔＲＮＡ又は［８］に記載の翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドライブラリの製造方法。
［１０］
［７］に記載の開始ｔＲＮＡ又は［８］に記載の翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法。
［１１］
［９］に記載の方法によって製造されるペプチドライブラリ。
［１２］
［１０］に記載の方法によって製造されるペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
［１３］
α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドを含む、［１１］に記載のペプチドライブラリ。
［１４］
α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾された、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、又はＬ－プロリンをＮ末端に有するペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体を含む、［１２］に記載のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に汎用的に導入することができるペプチドの製造方法、並びにかかる製造方法に用いるための開始ｔＲＮＡ及び翻訳系等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＥＦ－ＰがＰサイトのｔＲＮＡのＤアームを認識し、ペプチド結合の形成を促進する際の模式図を示す。図１Ａは、ＥＦ－Ｐの媒介による、翻訳伸長におけるＰサイトとＡサイトの、連続した二つのＰｒｏ塩基の間のペプチド結合の形成促進を示す。ＥＦ－Ｐは、ペプチド結合の形成を促進するため、Ｐサイトのペプチジル－プロリル－ｔＲＮＡＰｒｏの特異的なＤアームモチーフを認識する。図１Ｂは、ＰサイトのｆＭｅｔ－ｔＲＮＡ及びＡサイトのアミノアシルｔＲＮＡの間のペプチド結合の形成のＥＦ－Ｐによる促進を示す。この反応は翻訳開始時に起こる。図１Ｃは、ペプチド結合の形成を促進するための、ＥＦ－Ｐにより効率的に認識される新規な開始ｔＲＮＡの開発の構想を示す。ｔＲＮＡｉｎｉＷＴのヌクレオチド配列は、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるヌクレオチド修飾を除いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｆＭｅｔ２のヌクレオチド配列と同一である。ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇの５’末端ＣはＧで置き換えられる。ｔＲＮＡＰｒｏ１のＤアームモチーフは、ＥＦ－Ｐによって認識される（濃い灰色の点線で示す）。ｔＲＮＡｉｎｉＷＴとｔＲＮＡＰｒｏ１の構造的特徴を組み合わせることにより、人工的なｔＲＮＡであるｔＲＮＡｉｎｉＰを考案した。ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇに由来するヌクレオチドは灰色で、ｔＲＮＡＰｒｏ１に由来するヌクレオチドは濃い灰色で示され、共通するヌクレオチドは黒で示される。
【図2】Ｎ末端でのＡｃＰｒｏの取り込みにおける、ｔＲＮＡｉｎｉ変異体の評価のためのモデルペプチドの転写について示す。図２Ａは、ｍＲＮＡ（ｍＲ１）の配列、及び対応するペプチド配列Ｐ１を示す。Ｐ１－ＦＬＰは、Ｎ末端にＮ－アセチル－Ｌ－プロリン（ＡｃＰｒｏ）を有する全長ペプチドである。Ｐ１－ＲｉＰは、ＡｃＰｒｏが欠けた再開ペプチドである。Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓは、翻訳されたＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰに導入される（２つのＡＡＧ、２つのＬｙｓ、ｆｌａｇにおける２つのＫ）。フラグのｍＲＮＡ配列は、ＧＡＣ－ＴＡＣ－ＡＡＧ－ＧＡＣ－ＧＡＣ－ＧＡＣ－ＧＡＣ－ＡＡＧである。図２Ｂは、転写産物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを示す。５μＭ ＥＦ－Ｐの存在下で、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇを用いた翻訳を行った。［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ値の計算値（ｃａｌｃ．）及び実測値（ｏｂｓ．）を示す。翻訳されたＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの濃度は、内部コントロールＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰ（０．５μＭ）のピーク強度と比較して決定された。図２Ｃは、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇの二次構造を示す。ｔＲＮＡのアンチコドンステム、アクセプターステム、Ｔステム、及び可変ループは、それぞれＡｎ１、Ａｃ１、Ｔ１、及びＶ１と呼ばれる。このｔＲＮＡは、ｔＲＮＡＡｎ１Ａｃ１Ｔ１Ｖ１とも言う。図２Ｄは、Ｐ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの発現レベルの定量化を示す。これらのペプチドの翻訳は、ＥＦ－Ｐの存在下、又は非存在下で、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ、及びｔＲＮＡＡｎ１Ａｃ１Ｔ１Ｖ１を用いて行われた。バーの上の数字はＰ１－ＦＬＰ％、及びＥＦ－Ｐ（＋）／ＥＦ－Ｐ（－）に対する、Ｐ１－ＦＬＰレベルの増加割合（ｆｏｌｄ）を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図3】アンチコドンステム、アクセプターステム、Ｔステム、及び可変ループに変異を有するｔＲＮＡｉｎｉの評価を示す。図３Ａは、ｔＲＮＡｉｎｉに導入された、アンチコドンステム、アクセプターステム、及び可変ループの構造的なバリエーションを示す。図３Ｂ－Ｄは、アンチコドンステムの変異（Ｂ）、アクセプターステムの変異（Ｃ）、及びＴステム／可変ループの変異（Ｄ）に対する、Ｐ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの発現レベルの定量化を示す。ペプチドの翻訳は、ＥＦ－Ｐの存在下、及び非存在下で行われた。バーの上の数字はＰ１－ＦＬＰ％、及びＥＦ－Ｐ（＋）／ＥＦ－Ｐ（－）に対する、Ｐ１－ＦＬＰレベルの増加割合（ｆｏｌｄ）を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。ｔＲＮＡｉｎｉ変異体の二次構造は図７及び８も参照できる。
【図4】Ｐ１ペプチドの翻訳における翻訳因子とＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰの滴定を示す。図４Ａは、ＩＦ３の滴定を示す。図４Ｂは、ＥＦ－Ｇの滴定を示す。図４Ｃは、ＲＲＦの滴定を示す。図４Ｄは、ＥＦ－Ｐの滴定を示す。図４Ｅは、ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡを示す。濃い灰色と灰色の点は、それぞれＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの発現レベルを示す。濃い灰色の点の上の数字はＰ１－ＦＬＰ％を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図5】コドン－アンチコドンの組み合わせの最適化を示す。図５Ａは、ｍＲ１から翻訳されたＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの発現レベルを示す。ここで、ＡｃＰｒｏの取り込みのために使われた開始コドンは、下部に示されるように変更した。１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１０μＭ ＥＦ－Ｐ、及び１６０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰを使用した。ｔＲＮＡｉｎｉＰのアンチコドンは、同様に、下部に示されるように変更した。バーの上の数字はＰ１－ＦＬＰ％を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。図５Ｂは、ｍＲＮＡであるｍＲ１－ｍＲ６を示す。シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列、及びＳＤと開始コドンとの間位のスペーサーを最適化した。１６Ｓ ｒＲＮＡのａｎｔｉ－ＳＤに相補的なヌクレオチドは濃い灰色で、非相補的なヌクレオチドは灰色で示す。ＡＵＧ又はＡＡＧを開始コドンとして用いた。図５Ｃは、ｍＲ１－ｍＲ６から翻訳されたＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの発現レベルを示した。１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１０μＭ ＥＦ－Ｐ、及び１６０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰを使用した。バーの上の数字はＰ１－ＦＬＰ％を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図6】ＥＦ－Ｐが、ｔＲＮＡｉｎｉＰとの組み合わせにおいて、Ｎ末端におけるＤ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のリボソーム取り込みを増強することを示したことを示す。図６Ａは、Ｎ末端におけるリボソーム取り込みのために試験された、非タンパク質性アミノ酸の構造を示す。ＡｃＤＴｒｐ及びＡｃＤＴｙｒは、Ｄ－アミノ酸の代表物質であり、ＡｃβＰｈｇ及びＡｃ３Ａｂｚは、それぞれβ－アミノ酸及びγ－アミノ酸の代表物質である。図６Ｂは、転写産物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを示す。翻訳は、ＥＦ－Ｐの存在下、及び非存在下で、ｍＲ５－ＡＡＧ及びアミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉＰ
ＣＵＵを用いて行われた。１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１０μＭ又は０μＭ ＥＦ－Ｐ、及び１６０μＭ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉＰ
ＣＵＵを使用した。ＥＦ－Ｐの存在下での翻訳のために、ペプチドはＵ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓでラベル化され、非ラベル化ＬｙｓはＥＦ－Ｐ（－）翻訳のために取り込まれた。ＥＦ－Ｐ（＋）及びＥＦ－Ｐ（－）翻訳溶液を共に混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで分析した。［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ値の計算値（ｃａｌｃ．）及び実測値（ｏｂｓ．）を示す。ＥＦ－Ｐ（＋）／ＥＦ－Ｐ（－）に対する、Ｐ１－ＦＬＰレベルの増加割合は、相対ピーク強度によって推定された。
【図8】ｔＲＮＡｉｎｉ変異体（Ｔステム／可変ループ変異体）の二次構造を示す。
【図9】ペプチドのＮ末端における、ペプチドの環状化のためのＮ－クロロアセチル－Ｌ－プロリン又はＮ－クロロアセチル－３－アミノ安息香酸の取り込みを示す。図９Ａは、用いたｍＲＮＡ（ｍＲ７）の配列及びこれに対応するペプチド（Ｐ７）の配列を示す。Ｐ７－ＦＬＰは、全長の環状ペプチドであり、Ｐ７－ＲｉＰはＮ末端のクロロアセチルアミノ酸（ＣｌＡｃＸａａ）が欠損した再開ペプチドである。ｍＲＮＡ及びペプチドのフラグ（ｆｌａｇ）は、それぞれＧＡＣ－ＵＡＣ－ＡＡＧ－ＧＡＣ－ＧＡＣ－ＧＡＣ－ＧＡＣ－ＡＡＧ、及びＡｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓである。図９Ｂ及びＣは、それぞれ導入されたＣｌＡｃＰｒｏ及びＣｌＡｃ３Ａｂｚの構造を示す。図９Ｄ及びＥは、翻訳ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを示す。翻訳は、ｔＲＮＡｉｎｉＰ
ＣＵＵを用いて実施された。［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ値の計算値（ｃａｌｃ．）及び実測値（ｏｂｓ．）を示す。図９Ｆ及びＧは、ＡｃＰｒｏ又はＡｃ３Ａｂｚを含む環状ペプチドＰ７－ＦＬＰの化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の
実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することが
できる。
実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することが
できる。
【0013】
本実施形態の製造方法は、配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む、ペプチドの製造方法である。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
配列番号１において、Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。
配列番号１において、ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成するとは、配列番号１における１位～４位の５’－ＧＣＧＣ－３’が、１７位～１４位の３’－ＣＧＣＧ－５’と塩基対を形成すると換言してもよい。
ＧＣＧＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９ＧＣＧＣ （配列番号１）
配列番号１において、Ｎ１～Ｎ９は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１～Ｎ９は、Ｄループを形成し、ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成する。
配列番号１において、ＧＣＧＣが、ＧＣＧＣと塩基対を形成するとは、配列番号１における１位～４位の５’－ＧＣＧＣ－３’が、１７位～１４位の３’－ＣＧＣＧ－５’と塩基対を形成すると換言してもよい。
【0014】
本発明者らは、無細胞翻訳系によるペプチドの製造において、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開によりペプチドのＮ末端に導入することができるアミノ酸が限定的であることに関して、ペプチドの伸長反応においてペプチド結合の形成を促進する翻訳因子ＥＦ－Ｐ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｐ）に着目した。ＥＦ－Ｐは、プロリン－プロリン（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ）結合形成の伸長を促進する上で重要な役割を担っていて、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ配列においてペプチジル－ｔＲＮＡの脱落によって引き起こされる翻訳伸長の停止（リボソームストール）を緩和する（図１Ａ）。本発明者らは、ＥＦ－Ｐは伸長反応だけでなく、開始反応においても機能し（図１Ｂ）、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開もＥＦ－Ｐによって抑制できると仮説を立てた。さらに、本発明者らは、ＥＦ－ＰによってＮ末端ドロップオフ翻訳再開を抑制できれば、ＥＦ－Ｐの存在下で、Ｌ－プロリン、並びにＤ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のような非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸がＮ末端に導入された外来ペプチドを効率的に合成することができると考えた。
【0015】
ＥＦ－Ｐは、Ｐｒｏのペプチジル転移を促進するため、ｔＲＮＡＰｒｏアイソアクセプターであるｔＲＮＡＰｒｏ１、ｔＲＮＡＰｒｏ２、及びｔＲＮＡＰｒｏ３の特異的なＤアームを認識する。本発明者らは、開始ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｉｎｉ）のＤアームを、ｔＲＮＡＰｒｏアイソアクセプターのＤアームに置き換えることにより、Ｎ末端のアミノ酸（開始ｔＲＮＡにチャージされているアミノ酸）と２番目のアミノ酸との間のペプチジル転移が増強されると予想し、Ｎ末端に種々のアミノ酸を効率よく取り込むため、野生型（ＷＴ）ｔＲＮＡｉｎｉとｔＲＮＡＰｒｏアイソアクセプターの特徴的な構造を融合した、新規の開始ｔＲＮＡを発明した。
【0016】
本発明によれば、詳細は後述する特定の開始ｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系によりペプチドを製造することにより、翻訳開始に用いることのできるアミノ酸の種類を飛躍的に増加させることができ、多様なＮ末端のアミノ酸を有するペプチドを製造可能な方法を提供することができる。すなわち、本発明は、無細胞翻訳系によるペプチドの製造に関して、極めて汎用性の高い方法を提供する。
【0017】
本明細書において、開始ｔＲＮＡとは、ｍＲＮＡの翻訳の開始に利用されるｔＲＮＡを意味する。開始ｔＲＮＡは、アクセプターステム、Ｄアーム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、可変ループ、及びＴアームを含んでいてよい。無細胞翻訳系において、翻訳開始因子ＩＦ２が、開始ｔＲＮＡにチャージされているアミノ酸のアミノ基（プロリンのような二級アミノ酸についてはイミノ基）が修飾されていることを認識することにより、翻訳が開始される。また、修飾されたアミノ酸だけでなく、ペプチドがチャージされている場合にも、開始ｔＲＮＡが翻訳開始因子ＩＦ２により認識され、翻訳開始される可能性がある。また、開始ｔＲＮＡにチャージされたメチオニンのアミノ基を修飾するメチオニルｔＲＮＡトランスホルミラーゼは、ｔＲＮＡの５’末端の塩基が、対合する塩基と塩基対を形成していない（ミスマッチになっている）ことを認識して、ホルミル化を行う。
したがって、開始ｔＲＮＡは、アミノ基（プロリンのような第二級アミノ酸についてはイミノ基）が修飾されているアミノ酸をチャージするｔＲＮＡであるか、そのようなアミノ酸をチャージしているｔＲＮＡであってよく、５’末端の塩基が、対合する塩基とミスマッチになっているｔＲＮＡであってよい。
したがって、開始ｔＲＮＡは、アミノ基（プロリンのような第二級アミノ酸についてはイミノ基）が修飾されているアミノ酸をチャージするｔＲＮＡであるか、そのようなアミノ酸をチャージしているｔＲＮＡであってよく、５’末端の塩基が、対合する塩基とミスマッチになっているｔＲＮＡであってよい。
【0018】
開始ｔＲＮＡにチャージされているアミノ酸は、好ましくはアミノ基又はイミノ基の窒素原子、より好ましくはα位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されている。より詳細には、第一級アミノ酸であればアミノ基の窒素原子が、プロリンのような第二級アミノ酸であればイミノ基の窒素原子が修飾されていることが好ましく、α－アミノ酸であればα位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が、β－アミノ酸であればβ位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が、γ－アミノ酸であればγ位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が修飾されていることがより好ましい。
本実施形態の製造方法において、修飾されたアミノ酸がチャージされた開始ｔＲＮＡを無細胞翻訳系に加えてもよいし、未修飾のアミノ酸がチャージされた開始ｔＲＮＡ、及びメチオニル－ｔＲＮＡトランスフェラーゼ等の修飾酵素を無細胞翻訳系に加え、系内で修飾してもよい。
上記修飾は、置換基を有していてもよいアシル基による修飾（アシル化）であることが好ましく、置換基を有していてもよいアセチル基、又はホルミル基による修飾（アセチル化又はホルミル化）であることがより好ましい。ここで、置換基としては特に限定されないが、例えばアルキル基（好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル基）、及びハロゲン原子（好ましくは塩素原子）が挙げられる。
本実施形態の製造方法において、修飾されたアミノ酸がチャージされた開始ｔＲＮＡを無細胞翻訳系に加えてもよいし、未修飾のアミノ酸がチャージされた開始ｔＲＮＡ、及びメチオニル－ｔＲＮＡトランスフェラーゼ等の修飾酵素を無細胞翻訳系に加え、系内で修飾してもよい。
上記修飾は、置換基を有していてもよいアシル基による修飾（アシル化）であることが好ましく、置換基を有していてもよいアセチル基、又はホルミル基による修飾（アセチル化又はホルミル化）であることがより好ましい。ここで、置換基としては特に限定されないが、例えばアルキル基（好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル基）、及びハロゲン原子（好ましくは塩素原子）が挙げられる。
【0019】
本明細書においては、開始ｔＲＮＡの１番の塩基のミスマッチの組み合わせは特に限定されない。ミスマッチである塩基の組み合わせとしては、Ｇ（グアニン）とアデニン（Ａ）、Ｇとウラシル（Ｕ）、Ａとシトシン（Ｃ）、ＣとＵ、ＡとＡ、ＧとＧ、ＣとＣ、及びＵとＵが挙げられ、好ましくは、ＧとＡの組み合わせである。したがって、本実施形態の開始ｔＲＮＡの５’末端の塩基がＧであり、対合する塩基がＡであると好ましい。野生型の開始ｔＲＮＡにおいては、典型的には７２番の塩基対が１番の塩基対と対応しているため、１番と７２番の塩基がミスマッチである。したがって、本実施形態の開始ｔＲＮＡは、１番目の塩基と、野生型の開始ｔＲＮＡとアライメントした際に野生型の開始ｔＲＮＡの７２番目の塩基に対応する塩基とがミスマッチであることが好ましい。あるいは、本実施形態の開始ｔＲＮＡは、５’末端から数えて１番目の塩基と、３’末端から数えて５番目の塩基とがミスマッチであることも好ましく、５’末端から数えて１番目の塩基がＧ又はＣ（好ましくはＧ）であり、３’末端から数えて５番目の塩基がＡであり、これらの塩基が対合していることがより好ましい。
【0020】
本明細書においては、「チャージする」、「チャージされた」という用語は、「結合する」、「結合した」あるいは「連結する」、「連結した」と同義で用いられる。したがって、「アミノ酸をチャージする（している）開始ｔＲＮＡ」とは、アミノ酸が開始ｔＲＮＡにアシル化される（されている）開始ｔＲＮＡであることを意味し、アミノ酸が開始ｔＲＮＡに「アミノアシル化」されていることとも同義となる。
【0021】
ＥＦ－Ｐは、ｔＲＮＡＰｒｏアイソアクセプターに見出される特定のＤアームモチーフである、４塩基対の安定なＤステム配列によって閉じた構造を有する９塩基のＤループを認識する。
本実施形態において、配列番号１で示される塩基配列は、ＤループとＤステムからなるＤアームの塩基配列を示す。本発明者らは、配列番号１で示される塩基配列を開始ｔＲＮＡに導入することにより、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進でき、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に導入することができることを見出した。
本実施形態において、配列番号１で示される塩基配列は、ＤループとＤステムからなるＤアームの塩基配列を示す。本発明者らは、配列番号１で示される塩基配列を開始ｔＲＮＡに導入することにより、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進でき、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に導入することができることを見出した。
【0022】
本実施形態の配列番号１で示される塩基配列を含有する開始ｔＲＮＡにおける、他の構造、すなわち、アクセプターステム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、可変ループ、及びＴアームの塩基配列は、任意であってよい。中でも、アンチコドンループは、本実施形態の開始ｔＲＮＡにより導入するアミノ酸を割り当てるコドンに対応した塩基配列を適宜有していればよい。開始ｔＲＮＡの３’末端は、ＣＣＡ配列を有し、任意のアミノ酸と結合してよい。
【0023】
配列番号１におけるＮ１～Ｎ９の塩基配列は、配列番号８で示される塩基配列であることが好ましい。
ＡＧＣＣＵＧＧＵＡ （配列番号８）
配列番号８で示される塩基配列は、開始ｔＲＮＡにおけるＤループを形成する。
配列番号８においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号８の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号８の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号８の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、１～６個の塩基が挿入されていてもよく、１～５個の塩基が挿入されていてもよく、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号８で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、配列番号８で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
ＡＧＣＣＵＧＧＵＡ （配列番号８）
配列番号８で示される塩基配列は、開始ｔＲＮＡにおけるＤループを形成する。
配列番号８においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号８の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号８の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号８の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、１～６個の塩基が挿入されていてもよく、１～５個の塩基が挿入されていてもよく、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号８で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、配列番号８で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0024】
配列番号１で示される塩基配列は、配列番号９で示される塩基配列であることが好ましい。
ＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣ （配列番号９）
配列番号９で示される塩基配列は、開始ｔＲＮＡにおけるＤループとＤステムからなるＤアームを形成する。
配列番号９においては、１位～４位のＧＣＧＣ及び１４位～１７位のＧＣＧＣ以外の部分において、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号９の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
また、配列番号９で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換されている場合、当該塩基配列は、配列番号９で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
ＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣ （配列番号９）
配列番号９で示される塩基配列は、開始ｔＲＮＡにおけるＤループとＤステムからなるＤアームを形成する。
配列番号９においては、１位～４位のＧＣＧＣ及び１４位～１７位のＧＣＧＣ以外の部分において、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号９の塩基配列のＤループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
また、配列番号９で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換されている場合、当該塩基配列は、配列番号９で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0025】
本実施形態の開始ｔＲＮＡは、配列番号２で示される塩基配列をさらに含有する開始ｔＲＮＡであることが好ましい。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号２）
配列番号２において、
Ｎ１４～Ｎ２０は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１０は、Ａ又はＧを示し、Ｎ１１は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１２は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１３は、Ｇ又はＵを示し、Ｎ２１は、Ａ又はＣを示し、Ｎ２２は、Ａ又はＧを示し、Ｎ２３はＡ又はＧを示し、
Ｎ１４～Ｎ２０は、アンチコドンループを形成し、
Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成する。
配列番号２において、Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成するとは、配列番号２における２位～６位の５’－Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧ－３’が、１８位～１４位の３’－Ｎ２３Ｎ２２Ｎ２１ＣＣ－５’と塩基対を形成すると換言してもよい。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号２）
配列番号２において、
Ｎ１４～Ｎ２０は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、Ｎ１０は、Ａ又はＧを示し、Ｎ１１は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１２は、Ｃ又はＵを示し、Ｎ１３は、Ｇ又はＵを示し、Ｎ２１は、Ａ又はＣを示し、Ｎ２２は、Ａ又はＧを示し、Ｎ２３はＡ又はＧを示し、
Ｎ１４～Ｎ２０は、アンチコドンループを形成し、
Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成する。
配列番号２において、Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧが、ＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３と塩基対を形成するとは、配列番号２における２位～６位の５’－Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧ－３’が、１８位～１４位の３’－Ｎ２３Ｎ２２Ｎ２１ＣＣ－５’と塩基対を形成すると換言してもよい。
【0026】
本実施形態において、配列番号２で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループからなる部分の塩基配列であり、配列番号２で示される塩基配列を開始ｔＲＮＡに導入することにより、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進でき、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を一層効率よくペプチドのＮ末端に導入することができる。
【0027】
配列番号２は、配列番号１０又は１１で示されることが好ましい。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２ＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＮ２２Ｎ２３ （配列番号１０）
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２ＵＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＡＮ２２Ｎ２３ （配列番号１１）
配列番号１０～１１で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成する。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２ＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＮ２２Ｎ２３ （配列番号１０）
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２ＵＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＡＮ２２Ｎ２３ （配列番号１１）
配列番号１０～１１で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成する。
【0028】
配列番号２は、配列番号１２～１６のいずれかで示されることがより好ましく、配列番号１５で示されることがさらに好ましい。
ＧＵＣＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＧＡ （配列番号１２）
ＡＵＣＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＧＡ （配列番号１３）
ＡＣＣＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＧＧ （配列番号１４）
ＡＣＵＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＡＧ （配列番号１５）
ＡＣＵＵＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＡＡＧ （配列番号１６）
配列番号１２～１６で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成する。
ＧＵＣＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＧＡ （配列番号１２）
ＡＵＣＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＧＡ （配列番号１３）
ＡＣＣＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＧＧ （配列番号１４）
ＡＣＵＧＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＣＡＧ （配列番号１５）
ＡＣＵＵＧＧＮ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０ＣＣＡＡＧ （配列番号１６）
配列番号１２～１６で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成する。
【0029】
配列番号２は、配列番号１７で示されることも好ましい。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＣＵＮ１６Ｎ１７Ｎ１８ＡＡＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号１７）
配列番号１７で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成する。
Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３ＧＧＣＵＮ１６Ｎ１７Ｎ１８ＡＡＣＣＮ２１Ｎ２２Ｎ２３ （配列番号１７）
配列番号１７で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成する。
【0030】
配列番号２、及び１０～１７におけるＮ１６～Ｎ１８の塩基配列は、アンチコドンを形成する。
開始ｔＲＮＡのアンチコドンは、開始コドンに相補的な塩基配列を有する。天然においては、開始ｔＲＮＡは必ずメチオニン（ホルミルメチオニン）をコードするため、開始ｔＲＮＡはメチオニンに対応するアンチコドンを有する。この際、開始コドンとしては一般的にはメチオニンのコドンであるＡＵＧが用いられる。
これに対し、本実施形態においては、開始コドンはＡＵＧに限定されず、後述の表１に示す「天然の遺伝暗号表」に記載された全てのコドンを含む、任意のコドンを開始コドンとすることができる。つまり、本実施形態のｔＲＮＡは、任意の開始コドンに相補的な塩基配列をアンチコドンとすることができるため、配列番号２、及び１０～１７におけるＮ１６～Ｎ１８の塩基配列は任意である
開始ｔＲＮＡのアンチコドンは、開始コドンに相補的な塩基配列を有する。天然においては、開始ｔＲＮＡは必ずメチオニン（ホルミルメチオニン）をコードするため、開始ｔＲＮＡはメチオニンに対応するアンチコドンを有する。この際、開始コドンとしては一般的にはメチオニンのコドンであるＡＵＧが用いられる。
これに対し、本実施形態においては、開始コドンはＡＵＧに限定されず、後述の表１に示す「天然の遺伝暗号表」に記載された全てのコドンを含む、任意のコドンを開始コドンとすることができる。つまり、本実施形態のｔＲＮＡは、任意の開始コドンに相補的な塩基配列をアンチコドンとすることができるため、配列番号２、及び１０～１７におけるＮ１６～Ｎ１８の塩基配列は任意である
【0031】
本明細書においては、相補的である塩基配列とは、各塩基がＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する塩基配列に限定されず、揺らぎ塩基対（Ｗｏｂｂｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成する塩基配列も含まれる。揺らぎ塩基対とは、ＧとＵ、イノシン（Ｉ）－Ｕ、Ｉ－Ａ及びＩ－Ｃの間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、相補的な塩基配列とは、対象となる塩基配列と１００％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、１～３個、１～２個又は１個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
【0032】
本実施形態において、開始コドン：アンチコドンの組み合わせが、ＡＵＵ：ＡＡＵ、ＡＵＵ：ＧＡＵ、ＡＵＣ：ＧＡＵ、ＡＵＧ：ＣＡＵ、ＡＡＧ：ＣＵＵ、ＡＧＡ：ＵＣＵ、ＧＵＡ：ＵＡＣ、又はＧＧＡ：ＵＣＣであることが好ましく、ＡＡＧ：ＣＵＵ、ＧＵＡ：ＵＡＣ、又はＡＵＧ：ＣＡＵであることがより好ましい。開始ｔＲＮＡは、上記の組み合わせにおけるアンチコドンのいずれかをＮ１６～Ｎ１８の塩基配列として有していることが好ましい。
【0033】
配列番号２は、配列番号１８～２２のいずれかで示されることが好ましく、配列番号２１で示されることがより好ましい。
ＧＵＣＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＧＡ （配列番号１８）
ＡＵＣＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＧＡ （配列番号１９）
ＡＣＣＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＧＧ （配列番号２０）
ＡＣＵＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＡＧ （配列番号２１）
ＡＣＵＵＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＡＡＧ （配列番号２２）
配列番号１８～２２で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成し、ＮＮＮは任意のアンチコドンを示す。ＮＮＮは開始コドン：アンチコドンの好ましい組み合わせとして上述したアンチコドンであってもよい。
ＧＵＣＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＧＡ （配列番号１８）
ＡＵＣＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＧＡ （配列番号１９）
ＡＣＣＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＧＧ （配列番号２０）
ＡＣＵＧＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＣＡＧ （配列番号２１）
ＡＣＵＵＧＧＣＵＮＮＮＡＡＣＣＡＡＧ （配列番号２２）
配列番号１８～２２で示される塩基配列は、アンチコドンステムとアンチコドンループを形成し、ＮＮＮは任意のアンチコドンを示す。ＮＮＮは開始コドン：アンチコドンの好ましい組み合わせとして上述したアンチコドンであってもよい。
【0034】
配列番号２、及び１０～２２においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号２、及び１０～２２の塩基配列のアンチコドンステムとアンチコドンループを形成する１８個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が置換されていてもよく、１～１０個の塩基が置換されていてもよく、１～９個の塩基が置換されていてもよく、１～８個の塩基が置換されていてもよく、１～７個の塩基が置換されていてもよく、１～６個の塩基が置換されていてもよく、１～５個の塩基が置換されていてもよく、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号２、及び１０～２２の塩基配列のアンチコドンステムとアンチコドンループを形成する１８個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が欠失されていてもよく、１～１０個の塩基が欠失されていてもよく、１～９個の塩基が欠失されていてもよく、１～８個の塩基が欠失されていてもよく、１～７個の塩基が欠失されていてもよく、１～６個の塩基が欠失されていてもよく、１～５個の塩基が欠失されていてもよく、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号２、１０～２２の塩基配列のアンチコドンステムとアンチコドンループを形成する１８個の塩基において、１～１１個の塩基が挿入されていてもよく、１～１０個の塩基が挿入されていてもよく、１～９個の塩基が挿入されていてもよく、１～８個の塩基が挿入されていてもよく、１～７個の塩基が挿入されていてもよく、１～６個の塩基が挿入されていてもよく、１～５個の塩基が挿入されていてもよく、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号２、及び１０～２２で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号２、及び１０～２２で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号２、及び１０～２２の塩基配列のアンチコドンステムとアンチコドンループを形成する１８個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が置換されていてもよく、１～１０個の塩基が置換されていてもよく、１～９個の塩基が置換されていてもよく、１～８個の塩基が置換されていてもよく、１～７個の塩基が置換されていてもよく、１～６個の塩基が置換されていてもよく、１～５個の塩基が置換されていてもよく、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号２、及び１０～２２の塩基配列のアンチコドンステムとアンチコドンループを形成する１８個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が欠失されていてもよく、１～１０個の塩基が欠失されていてもよく、１～９個の塩基が欠失されていてもよく、１～８個の塩基が欠失されていてもよく、１～７個の塩基が欠失されていてもよく、１～６個の塩基が欠失されていてもよく、１～５個の塩基が欠失されていてもよく、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号２、１０～２２の塩基配列のアンチコドンステムとアンチコドンループを形成する１８個の塩基において、１～１１個の塩基が挿入されていてもよく、１～１０個の塩基が挿入されていてもよく、１～９個の塩基が挿入されていてもよく、１～８個の塩基が挿入されていてもよく、１～７個の塩基が挿入されていてもよく、１～６個の塩基が挿入されていてもよく、１～５個の塩基が挿入されていてもよく、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号２、及び１０～２２で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号２、及び１０～２２で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0035】
本実施形態の開始ｔＲＮＡは、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列をさらに含有する開始ｔＲＮＡであることが好ましい。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２４）ｍＣＣＧＧＣ （配列番号３）
配列番号３において、
Ｎ２４は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２４）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成する。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２５）ｍＣＣＧＧＵ （配列番号４）
配列番号４において、
Ｎ２５は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２５）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＵとＴステムを形成する。
ＧＧＣＧＧ（Ｎ２６）ｍＣＣＧＣＵ （配列番号５）
配列番号５において、
Ｎ２６は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２６）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＣＧＧが、ＣＣＧＣＵとＴステムを形成する。
ＧＧＡＧＧ（Ｎ２７）ｍＣＣＵＣＵ （配列番号６）
配列番号６において、
Ｎ２７は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２７）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＡＧＧが、ＣＣＵＣＵとＴステムを形成する。
配列番号３において、ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成するとは、５’－ＧＵＣＧＧ－３’が、３’－ＣＧＧＣＣ－５’と適宜塩基対を形成して、Ｔステムを形成すると換言してもよい。配列番号４～６についても同様である。なお、Ｔステムでは、必ずしも全ての塩基が塩基対を形成していなくてもよい。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２４）ｍＣＣＧＧＣ （配列番号３）
配列番号３において、
Ｎ２４は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２４）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成する。
ＧＵＣＧＧ（Ｎ２５）ｍＣＣＧＧＵ （配列番号４）
配列番号４において、
Ｎ２５は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２５）ｍはＴループを形成し、
ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＵとＴステムを形成する。
ＧＧＣＧＧ（Ｎ２６）ｍＣＣＧＣＵ （配列番号５）
配列番号５において、
Ｎ２６は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２６）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＣＧＧが、ＣＣＧＣＵとＴステムを形成する。
ＧＧＡＧＧ（Ｎ２７）ｍＣＣＵＣＵ （配列番号６）
配列番号６において、
Ｎ２７は、それぞれ独立に任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ２７）ｍはＴループを形成し、
ＧＧＡＧＧが、ＣＣＵＣＵとＴステムを形成する。
配列番号３において、ＧＵＣＧＧが、ＣＣＧＧＣとＴステムを形成するとは、５’－ＧＵＣＧＧ－３’が、３’－ＣＧＧＣＣ－５’と適宜塩基対を形成して、Ｔステムを形成すると換言してもよい。配列番号４～６についても同様である。なお、Ｔステムでは、必ずしも全ての塩基が塩基対を形成していなくてもよい。
【0036】
本実施形態において、配列番号３～６で示される塩基配列は、ＴループとＴステムからなるＴアームであり、配列番号３～６で示される塩基配列を開始ｔＲＮＡに導入することにより、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進でき、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を一層効率よくペプチドのＮ末端に導入することができる。
【0037】
配列番号３～６においては、ｍは、（Ｎ２４）ｍ、（Ｎ２５）ｍ、（Ｎ２６）ｍ、及び（Ｎ２７）ｍがＴループを形成する限り特に限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の整数であってもよく、これらの数値を上限値及び下限値とする任意の範囲にあってよく、５～９の整数であることが好ましく、６～８の整数であることが好ましい。
【0038】
（Ｎ２４）ｍ、（Ｎ２５）ｍ、（Ｎ２６）ｍ、及び（Ｎ２７）ｍは、実施例に記載のｔＲＮＡｉｎｉＷＴのＴループに由来する配列番号２３で示される塩基配列であることが好ましい。
ＵＵＣＡＡＡＵ （配列番号２３）
配列番号２３で示される塩基配列は、開始ｔＲＮＡにおけるＴループを形成する。
配列番号２３においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号２３の塩基配列のＴループを形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号２３の塩基配列のＴループを形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号２３の塩基配列のＴループを形成する７個の塩基において、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号２３で示される塩基配列で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、配列番号２３で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
ＵＵＣＡＡＡＵ （配列番号２３）
配列番号２３で示される塩基配列は、開始ｔＲＮＡにおけるＴループを形成する。
配列番号２３においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号２３の塩基配列のＴループを形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号２３の塩基配列のＴループを形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号２３の塩基配列のＴループを形成する７個の塩基において、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号２３で示される塩基配列で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、配列番号２３で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0039】
配列番号３～６は、それぞれ配列番号２４～２７で示されることが好ましい。また、本実施形態の開始ｔＲＮＡは、配列番号２６で示される塩基配列を有していることが好ましい。
ＧＵＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＧＣ （配列番号２４）
ＧＵＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＧＵ （配列番号２５）
ＧＧＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＣＵ （配列番号２６）
ＧＧＡＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＵＣＵ （配列番号２７）
配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列おいては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよく、好ましくは、Ｔループを構成する塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列のＴアームを形成する１７個の塩基において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、又は１７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が置換されていてもよく、１～１０個の塩基が置換されていてもよく、１～９個の塩基が置換されていてもよく、１～８個の塩基が置換されていてもよく、１～７個の塩基が置換されていてもよく、１～６個の塩基が置換されていてもよく、１～５個の塩基が置換されていてもよく、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列のＴアームを形成する１７個の塩基において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、又は１７個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が欠失されていてもよく、１～１０個の塩基が欠失されていてもよく、１～９個の塩基が欠失されていてもよく、１～８個の塩基が欠失されていてもよく、１～７個の塩基が欠失されていてもよく、１～６個の塩基が欠失されていてもよく、１～５個の塩基が欠失されていてもよく、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列のＴアームを形成する１７個の塩基において、１～１１個の塩基が挿入されていてもよく、１～１０個の塩基が挿入されていてもよく、１～９個の塩基が挿入されていてもよく、１～８個の塩基が挿入されていてもよく、１～７個の塩基が挿入されていてもよく、１～６個の塩基が挿入されていてもよく、１～５個の塩基が挿入されていてもよく、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号３～６、及び２４～２７で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号３～６、及び２４～２７で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
ＧＵＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＧＣ （配列番号２４）
ＧＵＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＧＵ （配列番号２５）
ＧＧＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＣＵ （配列番号２６）
ＧＧＡＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＵＣＵ （配列番号２７）
配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列おいては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよく、好ましくは、Ｔループを構成する塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列のＴアームを形成する１７個の塩基において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、又は１７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が置換されていてもよく、１～１０個の塩基が置換されていてもよく、１～９個の塩基が置換されていてもよく、１～８個の塩基が置換されていてもよく、１～７個の塩基が置換されていてもよく、１～６個の塩基が置換されていてもよく、１～５個の塩基が置換されていてもよく、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列のＴアームを形成する１７個の塩基において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、又は１７個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～１１個の塩基が欠失されていてもよく、１～１０個の塩基が欠失されていてもよく、１～９個の塩基が欠失されていてもよく、１～８個の塩基が欠失されていてもよく、１～７個の塩基が欠失されていてもよく、１～６個の塩基が欠失されていてもよく、１～５個の塩基が欠失されていてもよく、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号３～６、及び２４～２７の塩基配列のＴアームを形成する１７個の塩基において、１～１１個の塩基が挿入されていてもよく、１～１０個の塩基が挿入されていてもよく、１～９個の塩基が挿入されていてもよく、１～８個の塩基が挿入されていてもよく、１～７個の塩基が挿入されていてもよく、１～６個の塩基が挿入されていてもよく、１～５個の塩基が挿入されていてもよく、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号３～６、及び２４～２７で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号３～６、及び２４～２７で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0040】
本実施形態の開始ｔＲＮＡは、配列番号７で示される塩基配列をさらに含有する開始ｔＲＮＡであることが好ましい。
Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣ （配列番号７）
配列番号７において、
Ｎ２８はＡ又はＧを示し、Ｎ２９はＡ又はＧを示し、Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣは、可変ループを形成する。
Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣ （配列番号７）
配列番号７において、
Ｎ２８はＡ又はＧを示し、Ｎ２９はＡ又はＧを示し、Ｎ２８ＧＮ２９ＵＣは、可変ループを形成する。
【0041】
本実施形態において、配列番号７で示される塩基配列は、可変ループであり、配列番号７で示される塩基配列を開始ｔＲＮＡに導入することにより、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進でき、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を一層効率よくペプチドのＮ末端に導入することができる。
【0042】
配列番号７は、配列番号２８～３１のいずれかで示されることが好ましく、配列番号３０で示されることがより好ましい。
ＡＧＡＵＣ （配列番号２８）
ＧＧＡＵＣ （配列番号２９）
ＡＧＧＵＣ （配列番号３０）
ＧＧＧＵＣ （配列番号３１）
配列番号２８～３１で示される塩基配列は、可変ループを形成する。
配列番号７、及び２８～３１においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号７、及び２８～３１の塩基配列の可変ループを形成する５個の塩基において、２個、３個、４個、又は５個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号７、及び２８～３１の塩基配列の可変ループを形成する５個の塩基において、２個、３個、４個、又は５個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号７、及び２８～３１の塩基配列の可変ループを形成する５個の塩基において、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号７、及び２８～３１で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号７、及び２８～３１で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
ＡＧＡＵＣ （配列番号２８）
ＧＧＡＵＣ （配列番号２９）
ＡＧＧＵＣ （配列番号３０）
ＧＧＧＵＣ （配列番号３１）
配列番号２８～３１で示される塩基配列は、可変ループを形成する。
配列番号７、及び２８～３１においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号７、及び２８～３１の塩基配列の可変ループを形成する５個の塩基において、２個、３個、４個、又は５個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号７、及び２８～３１の塩基配列の可変ループを形成する５個の塩基において、２個、３個、４個、又は５個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号７、及び２８～３１の塩基配列の可変ループを形成する５個の塩基において、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号７、及び２８～３１で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号７、及び２８～３１で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0043】
本実施形態の開始ｔＲＮＡは、配列番号２４３で示される塩基配列をさらに含有する開始ｔＲＮＡであることが好ましい。
ＧＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３ （配列番号２４３）
配列番号２４３において、
Ｎ３０はＣ又はＧを示し、Ｎ３１はＵ又はＧを示し、Ｎ３２はＡ又はＧを示し、Ｎ３３はＵ又はＧを示し、１番目のＧは対合する塩基と塩基対を形成しておらず、ＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３のそれぞれの塩基は、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣのいずれかと塩基対を形成することで、アクセプターステムを形成する。配列番号２４３における１番目のＧは本実施形態の開始ｔＲＮＡの５’末端であることが好ましい。
ＧＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３ （配列番号２４３）
配列番号２４３において、
Ｎ３０はＣ又はＧを示し、Ｎ３１はＵ又はＧを示し、Ｎ３２はＡ又はＧを示し、Ｎ３３はＵ又はＧを示し、１番目のＧは対合する塩基と塩基対を形成しておらず、ＧＮ３０Ｎ３１ＧＮ３２Ｎ３３のそれぞれの塩基は、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣのいずれかと塩基対を形成することで、アクセプターステムを形成する。配列番号２４３における１番目のＧは本実施形態の開始ｔＲＮＡの５’末端であることが好ましい。
【0044】
配列番号２４３は、配列番号２４４～２４８のいずれかで示されることが好ましく、配列番号２４４で示されることがより好ましい。
ＧＧＣＧＧＧＧ （配列番号２４４）
ＧＧＣＧＧＧＵ （配列番号２４５）
ＧＧＣＧＧＡＵ （配列番号２４６）
ＧＧＣＵＧＡＵ （配列番号２４７）
ＧＧＧＵＧＡＵ （配列番号２４８）
配列番号２４４～２４８で示される塩基配列は、対合する塩基対と共にアクセプターステムを形成する。
配列番号２４３～２４８においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号２４３～２４８の塩基配列を形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号２４３～２４８の塩基配列を形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号２４３～２４８の塩基配列を形成する７個の塩基において、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号２４３～２４８で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号２４３～２４８で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
ＧＧＣＧＧＧＧ （配列番号２４４）
ＧＧＣＧＧＧＵ （配列番号２４５）
ＧＧＣＧＧＡＵ （配列番号２４６）
ＧＧＣＵＧＡＵ （配列番号２４７）
ＧＧＧＵＧＡＵ （配列番号２４８）
配列番号２４４～２４８で示される塩基配列は、対合する塩基対と共にアクセプターステムを形成する。
配列番号２４３～２４８においては、１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、配列番号２４３～２４８の塩基配列を形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数欠失されるとは、配列番号２４３～２４８の塩基配列を形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の塩基が欠失されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が欠失されていてもよく、１～３個の塩基が欠失されていてもよく、１～２個の塩基が欠失されていてもよく、１個の塩基が欠失されていてもよい。
塩基が挿入されるとき、配列番号２４３～２４８の塩基配列を形成する７個の塩基において、１～４個の塩基が挿入されていてもよく、１～３個の塩基が挿入されていてもよく、１～２個の塩基が挿入されていてもよく、１個の塩基が挿入されていてもよい。
また、配列番号２４３～２４８で示される塩基配列に１又は複数の塩基が置換、欠失又は挿入されている場合、当該塩基配列は、それぞれ配列番号２４３～２４８で示される塩基配列と相同性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。
【0045】
本実施形態の製造方法に用いられる好適な開始ｔＲＮＡとしては、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進できる観点から、配列番号１で示される塩基配列に加えて、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列、配列番号７で示される塩基配列、及び配列番号２４３で示される塩基配列のいずれかを含有することが好ましく、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列、配列番号７で示される塩基配列、及び配列番号２４３で示される塩基配列の全てを含有することがより好ましい。配列番号２で示される塩基配列、配列番号３～６の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列、及び配列番号２４３で示される塩基配列の好ましい態様は上述のとおりであり、それぞれについて説明する好ましい塩基配列、より好ましい塩基配列、特に好ましい塩基配列等を任意に組み合わせることができる。
【0046】
本実施形態の製造方法に用いられる好適な開始ｔＲＮＡを、本明細書においては、ｔＲＮＡｉｎｉＰと呼ぶ。本実施形態の開始ｔＲＮＡは、実施例に記載のｔＲＮＡｉｎｉＰで示されるいずれかの開始ｔＲＮＡであってよい。
【0047】
本実施形態の製造方法に用いられる開始ｔＲＮＡにおいて、配列番号１以外の塩基配列については、野生型ｔＲＮＡに由来する配列であってもよく、大腸菌由来野生型ｔＲＮＡに由来する配列であってもよく、大腸菌由来野生型開始ｔＲＮＡに由来する配列であってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写で調製した人工ｔＲＮＡに由来する配列であってもよい。
【0048】
本実施形態の製造方法に用いられる開始ｔＲＮＡにおいて、アクセプターステム、Ｄアーム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、可変ループ、及びＴアームのそれぞれについて上述した態様を任意に組み合わせてよい。
【0049】
本実施形態の製造方法では、上述の開始ｔＲＮＡのいずれかにアミノ酸をチャージしたものを翻訳系に加えることで、当該チャージされたアミノ酸をＮ末端に含むペプチドを製造する。上述のとおり、無細胞翻訳系において、開始ｔＲＮＡは、修飾されたアミノ酸がチャージされている場合に翻訳開始因子ＩＦ２に認識され、翻訳が開始される。また、ペプチドがチャージされている場合には、ペプチドが未修飾であっても翻訳開始因子ＩＦ２に認識され得る。
【0050】
したがって、本実施形態の製造方法において、翻訳系には、上述の開始ｔＲＮＡのいずれかにおいて、修飾されたアミノ酸がチャージされているもの、及び／又はペプチドがチャージされているものが含まれていることが好ましい。開始ｔＲＮＡにチャージされているアミノ酸の修飾の例示及び好ましい態様等については上述のとおりである。開始ｔＲＮＡにチャージされているペプチドを構成するアミノ酸は、修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。
【0051】
本明細書において、「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。また、本明細書において、用語「アミノ酸」は、タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、及び非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）を包含する。
タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）は、１９の天然タンパク質性Ｌ－アミノ酸及びグリシンを意味し、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。また、タンパク質性アミノ酸は、当業界に周知の１文字表記により表すと、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶである。
非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）は、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）は、１９の天然タンパク質性Ｌ－アミノ酸及びグリシンを意味し、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。また、タンパク質性アミノ酸は、当業界に周知の１文字表記により表すと、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶである。
非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）は、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
【0052】
非タンパク質性アミノ酸としては、非天然アミノ酸；及びアミノ酸の性質として当業界で公知の性質を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
非タンパク質性アミノ酸は、例えば、修飾されたタンパク質性アミノ酸；β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、及び修飾されたこれらのアミノ酸；並びに、主鎖又は側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸及び修飾されたこれらのアミノ酸等が挙げられる。
アミノ酸が修飾されている場合の態様は特に限定されないが、例えばヘテロ原子の修飾が挙げられ、窒素原子、好ましくはアミノ基又はイミノ基の窒素原子、より好ましくはα位、β位又はγ位の窒素原子の修飾が挙げられる。より詳細には、第一級アミノ酸であればアミノ基の窒素原子が、プロリンのような第二級アミノ酸であればイミノ基の窒素原子が修飾されていることが好ましく、α－アミノ酸であればα位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が、β－アミノ酸であればβ位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が、γ－アミノ酸であればγ位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が修飾されていることがより好ましい。修飾により結合する基としては、例えば置換基を有していてもよいアルキル基、及び置換基を有していてもよいアシル基が挙げられ、好ましくは置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアセチル基、及びホルミル基である。置換基としては特に限定されないが、例えばアルキル基（好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル基）、及びハロゲン原子（好ましくは塩素原子）が挙げられる。
主鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸としては、例えば、α－メチルアラニン等のα，α－二置換アミノ酸、α－ヒドロキシ酸等が挙げられる。
側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸としては、例えば、ノルロイシン、ホモヒスチジン等が挙げられる。非タンパク質性アミノ酸は、さらに、特に限定されないが、「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、及びホモヒスチジン等の側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸、システイン酸等の側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されているアミノ酸を含んでいてよい。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
β－アミノ酸及びγ－アミノ酸には、環状のβ－及びγ－アミノ酸も含まれ、芳香族環の１位と２位の位置にそれぞれアミノ基及びカルボキシ基が結合したアミノ酸、及び１位と３位の位置にそれぞれアミノ基及びカルボキシ基が結合したアミノ酸等も含まれる。
非タンパク質性アミノ酸は、例えば、修飾されたタンパク質性アミノ酸；β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、及び修飾されたこれらのアミノ酸；並びに、主鎖又は側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸及び修飾されたこれらのアミノ酸等が挙げられる。
アミノ酸が修飾されている場合の態様は特に限定されないが、例えばヘテロ原子の修飾が挙げられ、窒素原子、好ましくはアミノ基又はイミノ基の窒素原子、より好ましくはα位、β位又はγ位の窒素原子の修飾が挙げられる。より詳細には、第一級アミノ酸であればアミノ基の窒素原子が、プロリンのような第二級アミノ酸であればイミノ基の窒素原子が修飾されていることが好ましく、α－アミノ酸であればα位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が、β－アミノ酸であればβ位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が、γ－アミノ酸であればγ位のアミノ基又はイミノ基の窒素原子が修飾されていることがより好ましい。修飾により結合する基としては、例えば置換基を有していてもよいアルキル基、及び置換基を有していてもよいアシル基が挙げられ、好ましくは置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアセチル基、及びホルミル基である。置換基としては特に限定されないが、例えばアルキル基（好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル基）、及びハロゲン原子（好ましくは塩素原子）が挙げられる。
主鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸としては、例えば、α－メチルアラニン等のα，α－二置換アミノ酸、α－ヒドロキシ酸等が挙げられる。
側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸としては、例えば、ノルロイシン、ホモヒスチジン等が挙げられる。非タンパク質性アミノ酸は、さらに、特に限定されないが、「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、及びホモヒスチジン等の側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸、システイン酸等の側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されているアミノ酸を含んでいてよい。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
β－アミノ酸及びγ－アミノ酸には、環状のβ－及びγ－アミノ酸も含まれ、芳香族環の１位と２位の位置にそれぞれアミノ基及びカルボキシ基が結合したアミノ酸、及び１位と３位の位置にそれぞれアミノ基及びカルボキシ基が結合したアミノ酸等も含まれる。
【0053】
上述の開始ｔＲＮＡのいずれかにおいて修飾されたアミノ酸がチャージされている場合において、当該アミノ酸としては特に限定されないが、好ましくはＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－プロリンを含む。）、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸である。これらのアミノ酸において、α－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸は、それぞれ、α位、β位、及びγ位の窒素原子が修飾されていることが好ましい。上記Ｄ－アミノ酸としては、グリシンを除く１９種の天然タンパク質性アミノ酸のＤ体が挙げられ、Ｄ－Ｔｒｐ及びＤ－Ｔｙｒが好ましい。β－アミノ酸としては、３－アミノプロパン酸、Ｌ及びＤ－β－ホモフェニルグリシン、グリシンを除く１９種の天然タンパク質性アミノ酸の主鎖に余分な炭素原子を１つ有するＬ－β－ホモアミノ酸、及びそれらのＤ体が挙げられ、Ｌ－β－ホモフェニルグリシンが好ましい。γ－アミノ酸としては、ベンゼン環のメタ位にアミノ基及びカルボキシ基を有するアミノ酸、γ－アミノ酪酸、グリシンを除く１９種の天然タンパク質性アミノ酸の主鎖に余分な炭素原子を２つ有するＬ－γ－アミノ酸、及びそれらのＤ体が挙げられ、３－アミノ安息香酸が好ましい。
開始ｔＲＮＡは、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をチャージしていることが好ましく、α位、β位又はγ位の窒素原子がアシル化されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をチャージしていることがより好ましい。
本実施形態において、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、又はγ－アミノ酸等の非タンパク質性アミノ酸でプレチャージされたｔＲＮＡｉｎｉＰとＥＦ－Ｐとの組み合わせにより、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、又はγ－アミノ酸等を含む、種々のアミノ酸のＮ末端への取り込みを増強することができる。
開始ｔＲＮＡは、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をチャージしていることが好ましく、α位、β位又はγ位の窒素原子がアシル化されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をチャージしていることがより好ましい。
本実施形態において、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、又はγ－アミノ酸等の非タンパク質性アミノ酸でプレチャージされたｔＲＮＡｉｎｉＰとＥＦ－Ｐとの組み合わせにより、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、又はγ－アミノ酸等を含む、種々のアミノ酸のＮ末端への取り込みを増強することができる。
【0054】
上述の開始ｔＲＮＡのいずれかにおいてペプチドがチャージされている場合、当該ペプチドとしては特に限定されず、上述の定義におけるアミノ酸が複数ペプチド結合により結合したものが挙げられる。当該ペプチドは、２個以上又は３個以上のアミノ酸で構成されることが好ましく、３個以上２０個以下、３個以上１５個以下、３個以上１０個以下、３個以上５個以下、５個以上２０個以下、５個以上１５個以下、５個以上１０個以下、１０個以上２０個以下、又は１０個以上１５個以下のアミノ酸で構成されることがより好ましい。当該ペプチドは、直鎖状のペプチドであることが好ましい。
【0055】
本実施形態において、開始ｔＲＮＡの３’末端は、５’－ＣＣＡ－３’配列を有し、アミノ酸又はペプチドと結合してよい。アミノ酸又はペプチドとしては、上述したアミノ酸又はペプチドが挙げられる。
【0056】
本実施形態の製造方法において、上述の開始ｔＲＮＡに対してアミノ酸及びペプチドをチャージする方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いてよい。例えば、アミノ酸及びペプチドのチャージは、人工アミノアシル化ＲＮＡ触媒フレキシザイム（Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅ）を利用する方法により行われてよい。
【0057】
本実施形態の製造方法において、修飾されたアミノ酸を開始ｔＲＮＡにチャージしてもよいし、未修飾のアミノ酸を開始ｔＲＮＡにチャージした後に、チャージされた状態のアミノ酸を修飾してもよい。アミノ酸のチャージ及び／又はアミノ酸の修飾は、翻訳系に開始ｔＲＮＡを添加した後に行ってもよく、添加前に行ってもよい。アミノ酸のチャージ効率を高める観点からは、開始ｔＲＮＡにアミノ酸をチャージした後に、アミノ酸を修飾することが好ましい。操作の簡便性を高める観点からは、修飾したアミノ酸を開始ｔＲＮＡに直接チャージすることが好ましい。
【0058】
本実施形態の製造方法は、上述のいずれかの開始ｔＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で翻訳することを含む。本実施形態の無細胞翻訳系（以下、単に「翻訳系」ともいう。）は、当該開始ｔＲＮＡを含むことにより、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を効率よくペプチドのＮ末端に導入することができる。
【0059】
本明細書においては、「無細胞翻訳系」とは、細胞を含まない翻訳系をいい、無細胞翻訳系としては、例えば、大腸菌抽出液、小麦胚芽抽出液、ウサギ赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液等を用いることができる。また、それぞれ精製したリボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｒＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）、伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、及びリボソーム再生因子（ＲＲＦ）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した、再構成型の無細胞翻訳系を用いても良い。
ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ－１００（登録商標）、再構成型翻訳系としてはＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）やＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社のＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓＲＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：Ｈ． Ｆ． Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７７． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２５２， Ｎｏ． １９， ６８８９－６８９４； Ｍ． Ｃ． Ｇｏｎｚａ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｖｏｌ． ８２， １６４８－１６５２； Ｍ． Ｙ． Ｐａｖｌｏｖ ａｎｄ Ｍ． Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ， １９９６， Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｖｏｌ． ３２８， Ｎｏ． １， ９－１６； Ｙ． Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １９， Ｎｏ． ８， ７５１－７５５； Ｈ． Ｏｈａｓｈｉ ｅｔａｌ．， ２００７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌ．３５２， Ｎｏ． １， ２７０－２７６。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。なお、本実施形態の無細胞翻訳系は、転写に必要な因子を加えて、翻訳のみならず転写に用いてもよい。
無細胞翻訳系を用いたペプチドの製造方法として、例えば、Ｇｏｔｏ， Ｙ．， Ｋａｔｏｈ， Ｔ． ＆ Ｓｕｇａ， Ｈ． Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６， ７７９－７９０， （２０１１）に記載の方法の、Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎシステム（ＦＩＴシステム）を用いてもよい。
ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ－１００（登録商標）、再構成型翻訳系としてはＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）やＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社のＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓＲＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：Ｈ． Ｆ． Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７７． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２５２， Ｎｏ． １９， ６８８９－６８９４； Ｍ． Ｃ． Ｇｏｎｚａ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｖｏｌ． ８２， １６４８－１６５２； Ｍ． Ｙ． Ｐａｖｌｏｖ ａｎｄ Ｍ． Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ， １９９６， Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｖｏｌ． ３２８， Ｎｏ． １， ９－１６； Ｙ． Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １９， Ｎｏ． ８， ７５１－７５５； Ｈ． Ｏｈａｓｈｉ ｅｔａｌ．， ２００７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌ．３５２， Ｎｏ． １， ２７０－２７６。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。なお、本実施形態の無細胞翻訳系は、転写に必要な因子を加えて、翻訳のみならず転写に用いてもよい。
無細胞翻訳系を用いたペプチドの製造方法として、例えば、Ｇｏｔｏ， Ｙ．， Ｋａｔｏｈ， Ｔ． ＆ Ｓｕｇａ， Ｈ． Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６， ７７９－７９０， （２０１１）に記載の方法の、Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎシステム（ＦＩＴシステム）を用いてもよい。
【0060】
本実施形態の製造方法において用いる翻訳系は、本実施形態の開始ｔＲＮＡを含む限り、特に限定されず、無細胞翻訳系で用いられる任意の構成要素を含んでいてよい。
翻訳系は、ＥＦ－Ｐタンパク質を含有することが好ましい。また、従来公知の無細胞翻訳系において用いられる他の構成要素を含むことが好ましい。
本実施形態の翻訳系においては、本実施形態の開始ｔＲＮＡに加えて、さらにタンパク質性アミノ酸、又は非タンパク質性アミノ酸をコードする伸長ｔＲＮＡを含んでいてよい。伸長ｔＲＮＡは、１番の塩基が塩基対を形成している限り、その他の塩基配列は特に限定されない。伸長ｔＲＮＡは、１番目の塩基と、野生型の伸長ｔＲＮＡとアライメントした際に野生型の伸長ｔＲＮＡの７２番目の塩基に対応する塩基とが相補的であることが好ましい。
翻訳系は、ＥＦ－Ｐタンパク質を含有することが好ましい。また、従来公知の無細胞翻訳系において用いられる他の構成要素を含むことが好ましい。
本実施形態の翻訳系においては、本実施形態の開始ｔＲＮＡに加えて、さらにタンパク質性アミノ酸、又は非タンパク質性アミノ酸をコードする伸長ｔＲＮＡを含んでいてよい。伸長ｔＲＮＡは、１番の塩基が塩基対を形成している限り、その他の塩基配列は特に限定されない。伸長ｔＲＮＡは、１番目の塩基と、野生型の伸長ｔＲＮＡとアライメントした際に野生型の伸長ｔＲＮＡの７２番目の塩基に対応する塩基とが相補的であることが好ましい。
【0061】
翻訳系における各構成要素の濃度は製造するペプチド、及び開始ｔＲＮＡの種類等によって適宜調整すればよいが、例えば各構成要素について、以下の濃度を参考にしてよい。
ＩＦ３： ４～５０μＭ（両端値を含む）
ＥＦ－Ｇ： ０．５～１２μＭ（両端値を含む）
ＲＲＦ： ０．５～１０μＭ（両端値を含む）
ＥＦ－Ｐ： ２～５０μＭ（両端値を含む）
アミノアシル－開始ｔＲＮＡ： ２０～２００μＭ（両端値を含む）
ＩＦ３： ４～５０μＭ（両端値を含む）
ＥＦ－Ｇ： ０．５～１２μＭ（両端値を含む）
ＲＲＦ： ０．５～１０μＭ（両端値を含む）
ＥＦ－Ｐ： ２～５０μＭ（両端値を含む）
アミノアシル－開始ｔＲＮＡ： ２０～２００μＭ（両端値を含む）
【0062】
本実施形態における翻訳系では、フレキシザイムを利用したコドンの再割当において、ＮＮＮとして適宜選択したコドンに対して、アミノ酸、又はペプチドを割り当てることが好ましい。
本実施形態における翻訳系では、天然の翻訳系を使用してもよい。天然の翻訳系においては、各アミノ酸に対応したアンチコドンを有するｔＲＮＡが存在し、各ｔＲＮＡは、アンチコドンループ以外の領域においてもそれぞれ固有の配列を有する。
本実施形態における翻訳系では、天然の翻訳系を使用してもよい。天然の翻訳系においては、各アミノ酸に対応したアンチコドンを有するｔＲＮＡが存在し、各ｔＲＮＡは、アンチコドンループ以外の領域においてもそれぞれ固有の配列を有する。
【0063】
本実施形態においては、まず、Ｎ末端に導入するアミノ酸又はペプチドを割り当てるＮＮＮを選択し、ＮＮＮのアンチコドンをアンチコドンループ内に有し、Ｎ末端に導入するアミノ酸又はペプチドをチャージした本実施形態の開始ｔＲＮＡを、フレキシザイム等を用いて調製する。必要に応じて、開始ｔＲＮＡにチャージされたアミノ酸を修飾して、非タンパク質性アミノ酸がチャージされた開始ｔＲＮＡを得てもよい。
次いで、ｍＲＮＡが、Ｎ末端に導入するアミノ酸又はペプチドをコードするＮＮＮを開始コドンとして含むｍＲＮＡを調製し、翻訳することで、当該開始コドンに割り当てられたアミノ酸又はペプチドをＮ末端に含むペプチドを発現させることができる。
次いで、ｍＲＮＡが、Ｎ末端に導入するアミノ酸又はペプチドをコードするＮＮＮを開始コドンとして含むｍＲＮＡを調製し、翻訳することで、当該開始コドンに割り当てられたアミノ酸又はペプチドをＮ末端に含むペプチドを発現させることができる。
【0064】
本明細書においては、「ＮＮＮ」は、アミノ酸を指定するコドンを意味し、コドンを形成する３つのＮは、それぞれ独立に、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）から選択される。ｍＲＮＡには、Ｎ末端に導入するアミノ酸又はペプチドがコードされたＮＮＮが開始コドンとして含まれていてよい。
【0065】
本実施形態においては、Ｎ末端に導入するアミノ酸又はペプチドをコードしないＮＮＮには、任意のアミノ酸が再割当されていてもよいし、天然の遺伝暗号に基づいたコドンとアミノ酸との関係を用いてもよい。
再割当においては、天然の遺伝暗号表におけるコドンとアミノ酸の関係とは異なるものを割り当てることもできるし、同一のものを割り当てることもできる。
「天然の遺伝暗号表」とは、生体においてｍＲＮＡのトリプレット（コドン）に割り当てられたアミノ酸を示した表であり、下記表１に示す表である。
再割当においては、天然の遺伝暗号表におけるコドンとアミノ酸の関係とは異なるものを割り当てることもできるし、同一のものを割り当てることもできる。
「天然の遺伝暗号表」とは、生体においてｍＲＮＡのトリプレット（コドン）に割り当てられたアミノ酸を示した表であり、下記表１に示す表である。
【0066】
【表1】
【0067】
各コドンに対する、天然の遺伝暗号表とは異なるアミノ酸の割り当ては、例えば、上述のフレキシザイムを利用したコドン再割当によって実現される。フレキシザイムによれば、任意のアンチコドンを有するｔＲＮＡに所望のアミノ酸を結合させることができるため、任意のコドンに任意のアミノ酸を割り当てることが可能となる。
【0068】
本実施形態の製造方法によれば、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開を抑制しながらペプチドを製造することができる。製造されるペプチドのＮ末端は、窒素原子が修飾されたアミノ酸であることが好ましく、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸であることがより好ましく、α位、β位又はγ位の窒素原子がアシル化されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸であることがより好ましい。これらのアミノ酸において、α－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸は、それぞれ、α位、β位、及びγ位の窒素原子が修飾されていることが好ましい。
【0069】
製造されるペプチドを構成するアミノ酸の個数は特に限定されず、例えば２以上１００以下であってよい。アミノ酸の個数は上記範囲で、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、又は２０以上であってよい。アミノ酸の個数は上記範囲で、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、又は１０以下であってよい。製造されるペプチドは、直鎖状又は環状であってよい。製造されるペプチドは、アミノ酸からなるペプチド鎖以外の部分を含んでいてよく、そのような部分としては特に限定されないが、例えばペプチドの検出又は分離に用いられる基、ｍＲＮＡ及びＤＮＡのような核酸が挙げられる。製造されるペプチドは、当該ペプチドをコードするｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含んでいてもよい。
【0070】
本実施形態において、上述した開始ｔＲＮＡも提供する。本実施形態の開始ｔＲＮＡは、上述したペプチドの製造方法に用いられる開始ｔＲＮＡと同じ構成を有していてもよく、上述した態様を任意に組み合わせてもよい。本実施形態の開始ｔＲＮＡは、配列番号１で示される塩基配列を含有すれば、他の塩基配列は限定されないが、プロリン及び非タンパク質性アミノ酸を含む、種々のアミノ酸を一層効率よくペプチドのＮ末端に導入することができる観点から、配列番号２～３１で示される塩基配列を１以上含有することが好ましい。さらに、本実施形態の開始ｔＲＮＡは、アクセプターステム、Ｄアーム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、可変ループ、及びＴアームを有することが好ましく、アクセプターステム、Ｄアーム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、可変ループ、及びＴアームのそれぞれについて上述した態様を任意に組み合わせてよい。アクセプターステム、Ｄアーム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、可変ループ、及びＴアームは、それぞれについて説明する好ましい塩基配列であってもよく、より好ましい塩基配列であってもよく、特に好ましい塩基配列であってもよい。また、例えば、アクセプターステムとしては、好ましい塩基配列が選択され、Ｄアームとしては、より好ましい塩基配列が選択されてもよい。
【0071】
本実施形態の好適な開始ｔＲＮＡとしては、ＥＦ－Ｐによるペプチジル転移が促進できる観点から、配列番号１で示される塩基配列に加えて、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列、配列番号７で示される塩基配列、及び配列番号２４３で示される塩基配列のいずれかを含有することが好ましく、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３～６から選択される１つの塩基配列、配列番号７で示される塩基配列、及び配列番号２４３で示される塩基配列の全てを含有することがより好ましい。配列番号２で示される塩基配列、配列番号３～６の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列、及び配列番号２４３で示される塩基配列の好ましい態様は上述のとおりであり、それぞれについて説明する好ましい塩基配列、より好ましい塩基配列、特に好ましい塩基配列等を任意に組み合わせることができる。
【0072】
本実施形態の開始ｔＲＮＡは、アミノ酸、又はペプチドをチャージしていても、チャージしていなくてもよい。また、アミノ酸又はペプチドがチャージされている場合、アミノ酸が修飾されていても、されていなくてもよい。チャージされているアミノ酸及びペプチド、並びにそれらの修飾態様としては、上述した態様が挙げられる。
【0073】
本実施形態において、本実施形態の開始ｔＲＮＡを含む翻訳系も提供する。本実施形態においては、本実施形態の翻訳系とする際に、本実施形態の開始ｔＲＮＡにアミノ酸又はペプチドをチャージして、当該アミノ酸又はペプチドがチャージされた開始ｔＲＮＡを準備する。修飾されていないアミノ酸がチャージされた開始ｔＲＮＡを準備した場合、翻訳系内で当該アミノ酸を修飾してもよい。
【0074】
本実施形態の開始ｔＲＮＡ及び／又は翻訳系を用いて、ｍＲＮＡライブラリを翻訳することによりペプチドライブラリ、及びペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリを製造することができる。すなわち、本実施形態において、本実施形態の開始ｔＲＮＡを含む翻訳系を用いて翻訳する工程を含む、ペプチドライブラリの製造方法、及び、本実施形態の開始ｔＲＮＡを含む翻訳系を用いて翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリも提供する。ペプチドライブラリの製造方法、及びペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法において、本実施形態の開始ｔＲＮＡ（特にアミノ酸又はペプチドがチャージされた開始ｔＲＮＡ）を含む翻訳系を準備する。当該翻訳系においては、ＥＦ－Ｐを含むことが好適である。
【0075】
本実施形態のペプチドライブラリの製造方法及びペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法においては、本実施形態の開始ｔＲＮＡ又は翻訳系を用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含み、当該無細胞翻訳系で翻訳する前には、本実施形態の翻訳系を準備する工程を含むことが好ましい。
【0076】
プロリン及び非タンパク質性アミノ酸は、本実施形態の開始ｔＲＮＡにチャージして、無細胞翻訳系による翻訳を実施することで、効率よくペプチドのＮ末端に取り込まれる。
翻訳の効率化のため、プロリン又は非タンパク質性アミノ酸をチャージした開始ｔＲＮＡとＥＦ－Ｐとの親和性が、当該開始ｔＲＮＡ以外のｔＲＮＡにおけるＥＦ－Ｐとの親和性よりも高いことが好ましい。
翻訳の効率化のため、プロリン又は非タンパク質性アミノ酸をチャージした開始ｔＲＮＡとＥＦ－Ｐとの親和性が、当該開始ｔＲＮＡ以外のｔＲＮＡにおけるＥＦ－Ｐとの親和性よりも高いことが好ましい。
【0077】
本実施形態のペプチドライブラリの製造方法においては、アミノ酸又はペプチドをコードするＮＮＮを含むｍＲＮＡライブラリを調製する工程と；
ＮＮＮのコドンに対するアンチコドンを有し、該コドンに対応するアミノ酸又はペプチドがチャージされた本実施形態の開始ｔＲＮＡを加えた無細胞翻訳系で、ｍＲＮＡライブラリの各ｍＲＮＡを翻訳する工程と、を含むことが好ましい。必要に応じて、開始ｔＲＮＡにチャージされたアミノ酸を修飾する工程を含んでいてもよい。
ＮＮＮのコドンに対するアンチコドンを有し、該コドンに対応するアミノ酸又はペプチドがチャージされた本実施形態の開始ｔＲＮＡを加えた無細胞翻訳系で、ｍＲＮＡライブラリの各ｍＲＮＡを翻訳する工程と、を含むことが好ましい。必要に応じて、開始ｔＲＮＡにチャージされたアミノ酸を修飾する工程を含んでいてもよい。
【0078】
本実施形態のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリの製造方法は、上述したペプチドライブラリの製造方法において、ｍＲＮＡライブラリを調製する際、各ｍＲＮＡのＯＲＦ（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の下流領域にピューロマイシンを結合させることによって行われる。
ピューロマイシンは、ペプチド及び／又は核酸で構成されるリンカーを介してｍＲＮＡに結合させてもよい。ｍＲＮＡのＯＲＦ下流領域にピューロマイシンを結合させることにより、ｍＲＮＡのＯＲＦを翻訳したリボソームがピューロマイシンを取り込み、ｍＲＮＡとペプチドの複合体が形成される。このようなペプチド－ｍＲＮＡ複合体は、遺伝子型と表現型を対応付けることができ、ｉｎｖｉｔｒｏディスプレイに応用できる。
ピューロマイシンは、ペプチド及び／又は核酸で構成されるリンカーを介してｍＲＮＡに結合させてもよい。ｍＲＮＡのＯＲＦ下流領域にピューロマイシンを結合させることにより、ｍＲＮＡのＯＲＦを翻訳したリボソームがピューロマイシンを取り込み、ｍＲＮＡとペプチドの複合体が形成される。このようなペプチド－ｍＲＮＡ複合体は、遺伝子型と表現型を対応付けることができ、ｉｎｖｉｔｒｏディスプレイに応用できる。
【0079】
本実施形態において、ペプチドライブラリ又はペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリも提供する。
本実施形態の開始ｔＲＮＡを用いてペプチドライブラリを製造することで、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの発現レベルと同程度で、Ｎ末端がプロリン又は非タンパク質性アミノ酸であるペプチドを合成できるため、従来のペプチドライブラリに比して、非タンパク質性アミノ酸の導入において多様性に富むペプチドライブラリとすることができる。
また、本実施形態の開始ｔＲＮＡを用いてペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリを製造することで、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの発現レベルと同程度で、Ｎ－末端がプロリン又は非タンパク質性アミノ酸であるペプチド－ｍＲＮＡ複合体を合成できるため、従来のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリに比して、非タンパク質性アミノ酸の導入において多様性に富むペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリとすることができる。
本実施形態において、ペプチドライブラリ又はペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリは、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をＮ末端に有するペプチドを含むことが好ましく、α位、β位又はγ位の窒素原子がアシル化されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をＮ末端に有するペプチドを含むことがより好ましい。
本実施形態の開始ｔＲＮＡを用いてペプチドライブラリを製造することで、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの発現レベルと同程度で、Ｎ末端がプロリン又は非タンパク質性アミノ酸であるペプチドを合成できるため、従来のペプチドライブラリに比して、非タンパク質性アミノ酸の導入において多様性に富むペプチドライブラリとすることができる。
また、本実施形態の開始ｔＲＮＡを用いてペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリを製造することで、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの発現レベルと同程度で、Ｎ－末端がプロリン又は非タンパク質性アミノ酸であるペプチド－ｍＲＮＡ複合体を合成できるため、従来のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリに比して、非タンパク質性アミノ酸の導入において多様性に富むペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリとすることができる。
本実施形態において、ペプチドライブラリ又はペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリは、α位、β位又はγ位の窒素原子が修飾されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をＮ末端に有するペプチドを含むことが好ましく、α位、β位又はγ位の窒素原子がアシル化されたＬ－プロリン、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はγ－アミノ酸をＮ末端に有するペプチドを含むことがより好ましい。
【0080】
後述の実施例に示すように、本発明は、ＥＦ－Ｐが様々なＮ末端基質の取り込みを促進することを示した。本発明者らは、以前、ＥＦ－ＰがｔＲＮＡＰｒｏアイソアクセプターの特有のＤアームモチーフを認識することを報告した。ｔＲＮＡｆＭｅｔ２及びｔＲＮＡＰｒｏ１のＤアームは、Ｄステムにおける１１位及び２４位の塩基対（ｔＲＮＡｆＭｅｔ２ではＡ／Ｕの塩基対であり、ｔＲＮＡＰｒｏ１ではＣ／Ｇの塩基対である）を除きほとんど同一である。したがって、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１ＧのＡ／Ｕ塩基対をＣ／Ｇ塩基対に置換したことによりＥＦ－ＰによるＰ１－ＦＬＰのレベル及び割合の向上を極めて改善したことは合理的である。ピリミジン１１／プリン２４の塩基対は、ユニークであり、原核生物の開始ｔＲＮＡで広く保存されている。しかしながら、この位置にＣ／Ｇ塩基対を持つ変異型開始ｔＲＮＡが、生体内のタンパク質合成に極めて高い活性を示すことが報告されている。同様に、本発明の人工ｔＲＮＡにおけるＣ／Ｇ変異は、ＡｃＰｒｏの取り込みをも許容した。本発明は、ｔＲＮＡｉｎｉＰを用いることでＮ末端におけるＡｃＰｒｏの効率的な取り込みを野生型のｔＲＮＡｉｎｉＷＴと比較して１０００倍の発現レベルで成功した。さらに、Ｎ末端ドロップオフ再開を完全に抑制することができた。
【0081】
Ｎ末端のＰｒｏ残基は、その環状構造の制約から、生理活性フォルダマーペプチドの魅力的な構成要素である。Ｎ末端のＰｒｏは、ペプチドのターンコンフォメーション及びヘリカルコンフォメーションの安定化に寄与していることが報告されている。また、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、及びＤ－アミノ酸も、本発明により導入可能な生理活性ペプチドの有用な構成要素である。これらのアミノ酸は、ターン／ヘリックス誘導能等のユニークで強いフォールディング特性を示すことが多いため、これらのアミノ酸を含むペプチドは、より医薬に近い性質を持つ様々な構造にフォールディングすることが可能である。さらに、マクロ環状化は、ペプチドの拘束された形状を構築するための強力なアプローチである。本発明は、人工開始ｔＲＮＡが環状化のためのＮ－クロロアセチル基質をペプチドのＮ末端に導入できることも示した。これらのフォルダマーペプチドは、標的分子に対する高い結合親和性と阻害活性、膜透過性の向上、タンパク質分解安定性が期待できる。Ｌ－αアミノ酸のみからなるペプチドは、血清中及び細胞内でペプチダーゼにより速やかに分解されるのに対し、Ｎ末端に特殊アミノ酸を導入することで、エキソペプチダーゼに対するタンパク質分解安定性が飛躍的に向上する。さらに、Ｎ－アセチル化により、タンパク質分解安定性も向上する。
【0082】
このような外来性ペプチドをリボソームで合成する利点は、ランダムな配列を持つｍＲＮＡを翻訳することで、ランダムペプチドライブラリーを容易に調製でき、ＲａＰＩＤ（Ｒａｎｄｏｍ ｎｏｎｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）システムなどのディスプレイベースのスクリーニング手法に適用できることである。本発明によれば、Ｎ末端に外来性アミノ酸を持つ新規生理活性ペプチドのＲａＰＩＤスクリーニングを行うことができる。
【実施例0083】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【0084】
ｔＲＮＡ
ｉｎｉ
変異体及びフレキシザイムの調製
ｔＲＮＡｉｎｉ変異体及びフレキシザイム（ｄＦｘ及びｅＦｘ）のテンプレートＤＮＡは、フォワード及びリバース伸長プライマー対の伸長によって調製され、次いで、フォワード及びリバース伸長プライマー対を用いてＰＣＲを行った（ｄＦｘ及びｅＦｘの配列、及び使用したプライマーは表２を参照）。
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、３．７５ｍＭ又は５ｍＭ ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ｍｉｘ、５ｍＭ又は０ｍＭ グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、０．０４ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び０．１２μＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物２５０μＬ及び２ｍＬ中で、３７℃で一晩、ｔＲＮＡｉｎｉ及びフレキシザイムの転写を行った。２００μＬ又は２ｍＬスケールのＰＣＲ産物を、ｔＲＮＡｉｎｉ及びフレキシザイムの転写のために、前記反応混合物にそれぞれ加えた。ＮＴＰｍｉｘの濃度は、ｔＲＮＡｉｎｉで３．７５ｍＭ、フレキシザイムで５ｍＭであり、ＧＭＰの濃度は、それぞれ５ｍＭ及び０ｍＭであった。転写されたｔＲＮＡｉｎｉ及びフレキシザイムは、ＲＱ１ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で３０分間処理され、次いで、６Ｍ 尿素を含む８％（ｔＲＮＡｉｎｉ）あるいは１２％（フレキシザイム）ポリアクリルアミドゲルで精製した。得られたＲＮＡをゲルから溶離し、エタノールで沈殿させ、水に溶解した。
ｔＲＮＡｉｎｉ変異体及びフレキシザイム（ｄＦｘ及びｅＦｘ）のテンプレートＤＮＡは、フォワード及びリバース伸長プライマー対の伸長によって調製され、次いで、フォワード及びリバース伸長プライマー対を用いてＰＣＲを行った（ｄＦｘ及びｅＦｘの配列、及び使用したプライマーは表２を参照）。
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、３．７５ｍＭ又は５ｍＭ ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ｍｉｘ、５ｍＭ又は０ｍＭ グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、０．０４ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び０．１２μＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物２５０μＬ及び２ｍＬ中で、３７℃で一晩、ｔＲＮＡｉｎｉ及びフレキシザイムの転写を行った。２００μＬ又は２ｍＬスケールのＰＣＲ産物を、ｔＲＮＡｉｎｉ及びフレキシザイムの転写のために、前記反応混合物にそれぞれ加えた。ＮＴＰｍｉｘの濃度は、ｔＲＮＡｉｎｉで３．７５ｍＭ、フレキシザイムで５ｍＭであり、ＧＭＰの濃度は、それぞれ５ｍＭ及び０ｍＭであった。転写されたｔＲＮＡｉｎｉ及びフレキシザイムは、ＲＱ１ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で３０分間処理され、次いで、６Ｍ 尿素を含む８％（ｔＲＮＡｉｎｉ）あるいは１２％（フレキシザイム）ポリアクリルアミドゲルで精製した。得られたＲＮＡをゲルから溶離し、エタノールで沈殿させ、水に溶解した。
【0085】
【表2】
【0086】
表２に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号３２～４１に対応する。
【0087】
アミノアシル－ｔＲＮＡの調製
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ ７．５）、Ｂｉｃｉｎｅ－ＫＯＨ（ｐＨ ９．０）又はＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ １０．０）、６００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、２５μＭ ｄＦｘ又はｅＦｘ、２５μＭ ｔＲＮＡｉｎｉ変異体、及び５ｍＭ 活性化アミノ酸を含む反応混合物中で、０℃で、ｔＲＮＡｉｎｉ変異体のアミノアシル化を行った。ｔＲＮＡｉｎｉ変異体にＰｒｏ、ＡｃＤＴｙｒ、ＡｃＤＴｒｐ、βＰｈｇ及び３Ａｂｚをチャージするために、Ｌ－プロリン－３，５－ジニトロベンジルエステル（Ｐｒｏ－ＤＢＥ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－チロシン－シアノメチルエステル（ＡｃＤＴｙｒ－ＣＭＥ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－トリプトファン－シアノメチルエステル（ＡｃＤＴｒｐ－ＣＭＥ）、Ｌ－β－ホモフェニルグリシン－３，５－ジニトロベンジルエステル（βＰｈｇ－ＤＢＥ）、及び３－アミノ安息香酸－シアノメチルエステル（３Ａｂｚ－ＣＭＥ）を活性化アミノ酸として用いた。反応はそれぞれ２、３、３、２２及び１４４時間行われた。βＰｈｇ及び３Ａｂｚのアシル化は、それぞれｐＨ ９．０及びｐＨ １０．０で行われ、その他の基質はｐＨ ７．５でアシル化された。これらの活性化アミノ酸は、後述の参考文献１～３に記載の方法にしたがって合成された。ｄＦｘはＤＢＥに使用され、ｅＦｘはＣＭＥに使用された。得られたアミノアシル－ｔＲＮＡを、エタノールで沈殿させ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）で２回洗浄し、次いで、１ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。Ｐｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉ、βＰｈｇ－ｔＲＮＡｉｎｉ、及び３Ａｂｚ－ｔＲＮＡｉｎｉのアセチル化のために、２５０ ｐｍｏｌ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉを６０ μＬ ０．３Ｍ 酢酸ナトリウム／０．５Ｍ 無水酢酸溶液（ｐＨ ５．２）に溶解し、２５度で３０分間インキュベートし、次いで、エタノール沈殿により回収した。得られたＮ－アセチル－アミノアシル－ｔＲＮＡを、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）を含む７０％エタノールで洗浄し、次いで、１ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。Ｐｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉ及び３Ａｂｚ－ｔＲＮＡｉｎｉのＮ－クロロアセチル化のために、５００ｐｍｏｌのアミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉを７５μＬの０．３Ｍ 酢酸ナトリウム／４０ｍＭ 無水クロロ酢酸溶液（ｐＨ ５．２）に溶解し、２５度で５分間インキュベートし、次いで、エタノール沈殿により回収した。得られたＮ－アセチル又はＮ－クロロアセチルアミノアシル－ｔＲＮＡを、０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む７０％エタノール（ｐＨ ５．２）で２回洗浄し、１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ ７．５）、Ｂｉｃｉｎｅ－ＫＯＨ（ｐＨ ９．０）又はＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ １０．０）、６００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、２５μＭ ｄＦｘ又はｅＦｘ、２５μＭ ｔＲＮＡｉｎｉ変異体、及び５ｍＭ 活性化アミノ酸を含む反応混合物中で、０℃で、ｔＲＮＡｉｎｉ変異体のアミノアシル化を行った。ｔＲＮＡｉｎｉ変異体にＰｒｏ、ＡｃＤＴｙｒ、ＡｃＤＴｒｐ、βＰｈｇ及び３Ａｂｚをチャージするために、Ｌ－プロリン－３，５－ジニトロベンジルエステル（Ｐｒｏ－ＤＢＥ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－チロシン－シアノメチルエステル（ＡｃＤＴｙｒ－ＣＭＥ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－トリプトファン－シアノメチルエステル（ＡｃＤＴｒｐ－ＣＭＥ）、Ｌ－β－ホモフェニルグリシン－３，５－ジニトロベンジルエステル（βＰｈｇ－ＤＢＥ）、及び３－アミノ安息香酸－シアノメチルエステル（３Ａｂｚ－ＣＭＥ）を活性化アミノ酸として用いた。反応はそれぞれ２、３、３、２２及び１４４時間行われた。βＰｈｇ及び３Ａｂｚのアシル化は、それぞれｐＨ ９．０及びｐＨ １０．０で行われ、その他の基質はｐＨ ７．５でアシル化された。これらの活性化アミノ酸は、後述の参考文献１～３に記載の方法にしたがって合成された。ｄＦｘはＤＢＥに使用され、ｅＦｘはＣＭＥに使用された。得られたアミノアシル－ｔＲＮＡを、エタノールで沈殿させ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）で２回洗浄し、次いで、１ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。Ｐｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉ、βＰｈｇ－ｔＲＮＡｉｎｉ、及び３Ａｂｚ－ｔＲＮＡｉｎｉのアセチル化のために、２５０ ｐｍｏｌ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉを６０ μＬ ０．３Ｍ 酢酸ナトリウム／０．５Ｍ 無水酢酸溶液（ｐＨ ５．２）に溶解し、２５度で３０分間インキュベートし、次いで、エタノール沈殿により回収した。得られたＮ－アセチル－アミノアシル－ｔＲＮＡを、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）を含む７０％エタノールで洗浄し、次いで、１ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。Ｐｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉ及び３Ａｂｚ－ｔＲＮＡｉｎｉのＮ－クロロアセチル化のために、５００ｐｍｏｌのアミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉを７５μＬの０．３Ｍ 酢酸ナトリウム／４０ｍＭ 無水クロロ酢酸溶液（ｐＨ ５．２）に溶解し、２５度で５分間インキュベートし、次いで、エタノール沈殿により回収した。得られたＮ－アセチル又はＮ－クロロアセチルアミノアシル－ｔＲＮＡを、０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む７０％エタノール（ｐＨ ５．２）で２回洗浄し、１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。
【0088】
モデルペプチドの翻訳
モデルペプチドＰ１は、ｍＲＮＡ ｍＲ１－ｍＲ６がコードされたテンプレートＤＮＡを用いて翻訳された。テンプレートＤＮＡは、フォワード及びリバース伸長プライマー対によって調製され、次いで、フォワード及びリバース伸長プライマー対を用いてＰＣＲを行った（ｍＲＮＡ ｍＲ１－ｍＲ６の配列は表３、使用したプライマーは表４及び表５を参照）。特に指定のない限り、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ ７．６）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１２．６ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、２ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍｇ／ｍＬ Ｅ． ｃｏｌｉトータルｔＲＮＡ、１．２μＭ Ｅ． ｃｏｌｉリボソーム、０．６μＭ メチオニル－ｔＲＮＡホルミルトランスフェラーゼ、２．７μＭ ＩＦ１、３μＭ ＩＦ２、１．５μＭ ＩＦ３、０．１μＭ ＥＦ－Ｇ、２０μＭ ＥＦ－Ｔｕ／Ｔｓ、０μＭ又は５μＭ ＥＦ－Ｐ、０．２５μＭ ＲＦ２、０．１７μＭ ＲＦ３、０．５μＭ ＲＲＦ、４μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍＬ ミオキナーゼ、０．１μＭ 無機ピロホスファターゼ、０．１μＭ ヌクレオチド二リン酸キナーゼ、０．１μＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、０．１３μＭ ＡｓｐＲＳ、０．１１μＭ ＬｙｓＲＳ、０．０２μＭ ＴｙｒＲＳ、０．５ｍＭ Ａｓｐ、０．５ｍＭ Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓ、０．５ｍＭ Ｔｙｒ、２０μＭ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉ変異体、０．５μＭ ＤＮＡテンプレート、及び０．５μＭ 内部コントロールペプチド（コントロール－Ｐ１－ＦＬＰ及びコントロール－Ｐ１－ＲｉＰ）を含む組成の、２．５μＬスケールＦＩＴ（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）システム（参考文献４）で、３７℃で３０分間、翻訳を行った。コントロール－Ｐ１－ＦＬＰ及びコントロール－Ｐ１－ＲｉＰの配列は、Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓラベルを除き、それぞれ翻訳－Ｐ１－ＦＬＰ及び翻訳－Ｐ１－ＲｉＰの配列と同一であった。ＩＦ３、ＥＦ－Ｇ、ＥＦ－Ｐ、ＲＲＦ、及びアミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉの滴定において、図４に示すように濃度が変化した。なお、図６に示す実験では、内部コントロールペプチドは加えられず、Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓは、ＥＦ－Ｐの存在下での翻訳に用いられ、ＥＦ－Ｐの非存在下での翻訳に用いられなかった。
モデルペプチドＰ１は、ｍＲＮＡ ｍＲ１－ｍＲ６がコードされたテンプレートＤＮＡを用いて翻訳された。テンプレートＤＮＡは、フォワード及びリバース伸長プライマー対によって調製され、次いで、フォワード及びリバース伸長プライマー対を用いてＰＣＲを行った（ｍＲＮＡ ｍＲ１－ｍＲ６の配列は表３、使用したプライマーは表４及び表５を参照）。特に指定のない限り、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ ７．６）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１２．６ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、２ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍｇ／ｍＬ Ｅ． ｃｏｌｉトータルｔＲＮＡ、１．２μＭ Ｅ． ｃｏｌｉリボソーム、０．６μＭ メチオニル－ｔＲＮＡホルミルトランスフェラーゼ、２．７μＭ ＩＦ１、３μＭ ＩＦ２、１．５μＭ ＩＦ３、０．１μＭ ＥＦ－Ｇ、２０μＭ ＥＦ－Ｔｕ／Ｔｓ、０μＭ又は５μＭ ＥＦ－Ｐ、０．２５μＭ ＲＦ２、０．１７μＭ ＲＦ３、０．５μＭ ＲＲＦ、４μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍＬ ミオキナーゼ、０．１μＭ 無機ピロホスファターゼ、０．１μＭ ヌクレオチド二リン酸キナーゼ、０．１μＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、０．１３μＭ ＡｓｐＲＳ、０．１１μＭ ＬｙｓＲＳ、０．０２μＭ ＴｙｒＲＳ、０．５ｍＭ Ａｓｐ、０．５ｍＭ Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓ、０．５ｍＭ Ｔｙｒ、２０μＭ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉ変異体、０．５μＭ ＤＮＡテンプレート、及び０．５μＭ 内部コントロールペプチド（コントロール－Ｐ１－ＦＬＰ及びコントロール－Ｐ１－ＲｉＰ）を含む組成の、２．５μＬスケールＦＩＴ（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）システム（参考文献４）で、３７℃で３０分間、翻訳を行った。コントロール－Ｐ１－ＦＬＰ及びコントロール－Ｐ１－ＲｉＰの配列は、Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓラベルを除き、それぞれ翻訳－Ｐ１－ＦＬＰ及び翻訳－Ｐ１－ＲｉＰの配列と同一であった。ＩＦ３、ＥＦ－Ｇ、ＥＦ－Ｐ、ＲＲＦ、及びアミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉの滴定において、図４に示すように濃度が変化した。なお、図６に示す実験では、内部コントロールペプチドは加えられず、Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓは、ＥＦ－Ｐの存在下での翻訳に用いられ、ＥＦ－Ｐの非存在下での翻訳に用いられなかった。
【0089】
【表3】
【0090】
【表4】
【0091】
【表5】
【0092】
表３に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号１７７～１８８に該当する。また、表４に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号１８９～２１２に該当する。さらに、表５に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号２１３～２３６に該当する。
【0093】
モデルペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析
翻訳されたペプチドを、ＳＰＥ Ｃ－ｔｉｐ（日京テクノス）で脱塩し、次いで、試料プレート上で、α―シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸と共結晶化した。図６に示す解析では、ＥＦ－Ｐ（＋）及びＥＦ－Ｐ（－）実験に由来する２つの翻訳溶液を共に混合し、次いで、Ｃ－ｔｉｐ及び共結晶化に供した。ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅモードでｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析（ＭＳ）を行った。ペプチド質量標準ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を外部質量較正に使用した。
翻訳されたペプチドを、ＳＰＥ Ｃ－ｔｉｐ（日京テクノス）で脱塩し、次いで、試料プレート上で、α―シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸と共結晶化した。図６に示す解析では、ＥＦ－Ｐ（＋）及びＥＦ－Ｐ（－）実験に由来する２つの翻訳溶液を共に混合し、次いで、Ｃ－ｔｉｐ及び共結晶化に供した。ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅモードでｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析（ＭＳ）を行った。ペプチド質量標準ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を外部質量較正に使用した。
【0094】
ＥＦ－ＰによるＮ末端ドロップオフ翻訳再開の抑制
Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開を観察するため、ｍＲＮＡ ｍＲ１を用いてモデルペプチドＰ１にＡｃＰｒｏ（アセチルプロリン）を導入した（図２Ａ）。ＡｃＰｒｏの取り込みのために、最初に３つの開始ｔＲＮＡ変異体、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ、及びｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇで試験した（図１Ｃの左上、図２Ｃ、それぞれのｔＲＮＡの配列は表６、使用したプライマーは表７及び表８を参照）。これらのｔＲＮＡは全て、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｆＭｅｔ２に由来するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって、ヌクレオチド修飾を欠いている。加えて、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ及びｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇは、Ｃ１Ｇ変異及びＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異をそれぞれ有している。Ｃ１Ｇ変異は、転写効率の改善を目的とし、Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異はＥＦ－Ｐによる効率的な認識を目的とした。ＥＦ－Ｐは、ｔＲＮＡＰｒｏ１のＤアームを認識し、ｔＲＮＡｆＭｅｔ２及びｔＲＮＡＰｒｏ１のＤアームにおける唯一の違いがこの位置に見られることから（図１Ｃ、ｔＲＮＡｆＭｅｔ２のＡ１１／Ｕ２４、及びｔＲＮＡＰｒｏ１のＣ１１／Ｇ２４）、Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異がＥＦ－Ｐによる認識を高めるはずであると仮定した。フレキシザイム変異体の１つであるｄＦｘを用いて、これらのｔＲＮＡ上にＰｒｏをプレチャージし、無水酢酸によってＮ－アセチル化し、ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡを調製した。
Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開を観察するため、ｍＲＮＡ ｍＲ１を用いてモデルペプチドＰ１にＡｃＰｒｏ（アセチルプロリン）を導入した（図２Ａ）。ＡｃＰｒｏの取り込みのために、最初に３つの開始ｔＲＮＡ変異体、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ、及びｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇで試験した（図１Ｃの左上、図２Ｃ、それぞれのｔＲＮＡの配列は表６、使用したプライマーは表７及び表８を参照）。これらのｔＲＮＡは全て、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｆＭｅｔ２に由来するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって、ヌクレオチド修飾を欠いている。加えて、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ及びｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇは、Ｃ１Ｇ変異及びＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異をそれぞれ有している。Ｃ１Ｇ変異は、転写効率の改善を目的とし、Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異はＥＦ－Ｐによる効率的な認識を目的とした。ＥＦ－Ｐは、ｔＲＮＡＰｒｏ１のＤアームを認識し、ｔＲＮＡｆＭｅｔ２及びｔＲＮＡＰｒｏ１のＤアームにおける唯一の違いがこの位置に見られることから（図１Ｃ、ｔＲＮＡｆＭｅｔ２のＡ１１／Ｕ２４、及びｔＲＮＡＰｒｏ１のＣ１１／Ｇ２４）、Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異がＥＦ－Ｐによる認識を高めるはずであると仮定した。フレキシザイム変異体の１つであるｄＦｘを用いて、これらのｔＲＮＡ上にＰｒｏをプレチャージし、無水酢酸によってＮ－アセチル化し、ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡを調製した。
【0095】
翻訳は、非ラベル化Ｌｙｓの代わりにＵ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓを含む、ＦＩＴ系と呼ばれるＥ．ｃｏｌｉ再構成型翻訳系において行われた。したがって、翻訳されたペプチドは、４つのＵ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓでラベル化されている（図２Ａ、薄い灰色部分）。その結果、全長Ｐ１（Ｐ１－ＦＬＰ）とＮ－末端ＡｃＰｒｏが欠けた再開ペプチド（Ｐ１－ＲｉＰ）の両方がＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって検出された（図２Ｂ、ＥＦ－Ｐの存在下におけるｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇの代表的な結果）。翻訳されたＰ１－ＦＬＰ及びＰ１－ＲｉＰの発現レベルは、非ラベル化Ｌｙｓを有する、０．５μＭ 合成内部コントロールペプチド（コントロール－Ｐ１－ＦＬＰ、及びコントロール－Ｐ１－ＲｉＰ）の相対ピーク強度に対する、それらの相対ピーク強度によって推定された。翻訳されたペプチド及びコントロールＰ１ペプチドは、同位体標識を除いて、同一のアミノ酸配列であるため、等しいイオン化効率を有すると推定した。その結果、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ、及びｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇを用いたＰ１－ＦＬＰのレベルは、ＥＦ－Ｐの存在下では、それぞれ０．０６７μＭ、０．０６１μＭ、及び０．８７μＭであったが、ＥＦ－Ｐの非存在下では、それぞれ０．０４５μＭ、０．０３８μＭ、及び０．２３μＭであった（図２Ｄ）。Ｐ１－ＦＬＰのパーセンテージ［Ｐ１－ＦＬＰ％：Ｐ１－ＦＬＰ／（Ｐ１－ＦＬＰ＋Ｐ１－ＲｉＰ）×１００］は、ＥＦ－Ｐの非存在下では、それぞれ１７％、１７％、及び３４％であり、ＥＦ－Ｐの存在下では、それぞれ２４％、２３％、及び４３％であった（図２Ｄ）。ＥＦ－Ｐの添加は、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ及びｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇの発現レベルの１．５－１．６倍の改善をもたらしたが、ｔＲＮＡｉｎｉＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇの発現レベルでは３．８倍の改善をもたらした。これらの結果は、ｔＲＮＡｆＭｅｔ２由来のｔＲＮＡｉｎｉＷＴ及びｔＲＮＡｉｎｉｃ１ＧのＤアームがＥＦ－Ｐによって認識され、Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異はＥＦ－Ｐ認識を増強したことを示す。一方で、Ｃ１Ｇ変異は、開始ｔＲＮＡの機能に影響しなかった。そこで、以後、全ての開始ｔＲＮＡにＣ１Ｇ変異を導入することとした。興味深いことに、ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇは、ＥＦ－Ｐの非存在下でも、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ及びｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇより有意に高い発現レベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示し、Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇ変異によって誘導されるその立体配座変化もＡｃＰｒｏの取り込みに好ましいことを示した。
【0096】
ＥＦ－Ｐをより効率的に取り込むためのｔＲＮＡ
ｉｎｉ
構造の最適化
以上の結果は、ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇの局所構造をさらに最適化し、Ｐ１－ＦＬＰレベルおよびＰ１－ＦＬＰ％を改善する動機となった。ここでは、５つのアンチコドンステムの変異（Ａｎ１－５）、５つのアクセプターステムの変異（Ａｃ１－５）、４つのＴステムの変異（Ｔ１－４）、４つの可変ループの変異（Ｖ１－４）、およびそれらの組み合わせを導入した。ここで、ｔＲＮＡＰｒｏ１の配列は、ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇに部分的に埋め込まれている（図３、図７、図８；ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ由来の塩基は灰色、ｔＲＮＡＰｒｏ１由来の塩基は濃い灰色、共通する塩基は黒）。ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇは、Ａｎ１、Ａｃ１、Ｔ１、及びＶ１を有し、以下ｔＲＮＡＡｎ１Ａｃ１Ｔ１Ｖ１ととし（図２Ｃ）、他の変異体も同様に、それらの局所構造に因んで、ｔＲＮＡＡｎＸＡｃＸＴＸＶＸと命名され、ここで、Ｘは図３Ａに示す局所構造のナンバリングを示す。
はじめに、アンチコドンステムの変異を評価した（図３Ｂ、図７Ａ、ｔＲＮＡＡｎ２－５Ａｃ１Ｔ１Ｖ１）。これらのうち、ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ１Ｖ１は、ＥＦ－Ｐの存在下でＰ１－ＦＬＰの最も高いレベル及び比を示した（図３Ｂ、０．９８μＭ及び５８％）。ＥＦ－Ｐは、このｔＲＮＡのＰ１－ＦＬＰの発現レベルを劇的には改善しなかったものの（１．１倍）、ＥＦ－ＰによりＰ１－ＦＬＰ％は３９％から５８％に増加した。対照的に、他の変異体は、比較的低い発現レベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｂ、ｔＲＮＡＡｎ２Ａｃ１Ｔ１Ｖ１、ｔＲＮＡＡｎ３Ａｃ１Ｔ１Ｖ１、及びｔＲＮＡＡｎ５Ａｃ１Ｔ１Ｖ１について、それぞれ０．３０－０．９７μＭ及び７－３４％）。したがって、Ａｎ４はＡｎ１－５の中で最も良好なアンチコドンステム構造であると結論した。
以上の結果は、ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇの局所構造をさらに最適化し、Ｐ１－ＦＬＰレベルおよびＰ１－ＦＬＰ％を改善する動機となった。ここでは、５つのアンチコドンステムの変異（Ａｎ１－５）、５つのアクセプターステムの変異（Ａｃ１－５）、４つのＴステムの変異（Ｔ１－４）、４つの可変ループの変異（Ｖ１－４）、およびそれらの組み合わせを導入した。ここで、ｔＲＮＡＰｒｏ１の配列は、ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇに部分的に埋め込まれている（図３、図７、図８；ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ由来の塩基は灰色、ｔＲＮＡＰｒｏ１由来の塩基は濃い灰色、共通する塩基は黒）。ｔＲＮＡｉｎｉｃＣ１Ｇ／Ａ１１Ｃ／Ｕ２４Ｇは、Ａｎ１、Ａｃ１、Ｔ１、及びＶ１を有し、以下ｔＲＮＡＡｎ１Ａｃ１Ｔ１Ｖ１ととし（図２Ｃ）、他の変異体も同様に、それらの局所構造に因んで、ｔＲＮＡＡｎＸＡｃＸＴＸＶＸと命名され、ここで、Ｘは図３Ａに示す局所構造のナンバリングを示す。
はじめに、アンチコドンステムの変異を評価した（図３Ｂ、図７Ａ、ｔＲＮＡＡｎ２－５Ａｃ１Ｔ１Ｖ１）。これらのうち、ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ１Ｖ１は、ＥＦ－Ｐの存在下でＰ１－ＦＬＰの最も高いレベル及び比を示した（図３Ｂ、０．９８μＭ及び５８％）。ＥＦ－Ｐは、このｔＲＮＡのＰ１－ＦＬＰの発現レベルを劇的には改善しなかったものの（１．１倍）、ＥＦ－ＰによりＰ１－ＦＬＰ％は３９％から５８％に増加した。対照的に、他の変異体は、比較的低い発現レベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｂ、ｔＲＮＡＡｎ２Ａｃ１Ｔ１Ｖ１、ｔＲＮＡＡｎ３Ａｃ１Ｔ１Ｖ１、及びｔＲＮＡＡｎ５Ａｃ１Ｔ１Ｖ１について、それぞれ０．３０－０．９７μＭ及び７－３４％）。したがって、Ａｎ４はＡｎ１－５の中で最も良好なアンチコドンステム構造であると結論した。
【0097】
次に、アンチコドンステムがＡｎ４に固定されたアクセプターステムの変異を評価した（図３Ｃ、図７Ｂ、ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ２－５Ｔ１Ｖ１）。その結果、ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ１Ｖ１が最も高いＰ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｃ、ＥＦ－Ｐ存在下で、それぞれ０－０．２４μＭ及び０－１４％）。したがって、Ａｃ１はＡｃ１－５の中で最も良好なアクセプターステム構造であると結論した。
第３に、アンチコドン及びアクセプターステムがＡｎ４及びＡｃ１に固定されたｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ２－４Ｖ２－４を用いて、Ｔステムの変異と可変ループの変異の組み合わせを評価した（図３Ｄ、図８）。Ｔステムの変異として、Ｔ３はＴ１、Ｔ２、及びＴ４よりも一般的に高いＰ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｄ）。可変ループの変異として、Ｖ３はＶ１、Ｖ２及びＶ４よりも高いＰ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｄ）。したがって、Ｔ３とＶ３との組み合わせにより、Ｐ１－ＦＬＰ％と同様に、Ｐ１－ＦＬＰ％が最も高い値となった（図３Ｄ、ＥＦ－Ｐの存在下で、それぞれ１．１２μＭと５５％、ＥＦ－Ｐにより１．６倍に改善）。
ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ３Ｖ３は、本実験で評価した全てのｔＲＮＡの中で最も高いＰ１－ＦＬＰレベルを示したことから、今後の実験には、このｔＲＮＡを用いることとした。ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ３Ｖ３は、以下ｔＲＮＡｉｎｉＰとする（図１Ｃ、図８）（それぞれのｔＲＮＡの配列は表６、使用したプライマーは表７及び表８を参照）。
第３に、アンチコドン及びアクセプターステムがＡｎ４及びＡｃ１に固定されたｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ２－４Ｖ２－４を用いて、Ｔステムの変異と可変ループの変異の組み合わせを評価した（図３Ｄ、図８）。Ｔステムの変異として、Ｔ３はＴ１、Ｔ２、及びＴ４よりも一般的に高いＰ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｄ）。可変ループの変異として、Ｖ３はＶ１、Ｖ２及びＶ４よりも高いＰ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を示した（図３Ｄ）。したがって、Ｔ３とＶ３との組み合わせにより、Ｐ１－ＦＬＰ％と同様に、Ｐ１－ＦＬＰ％が最も高い値となった（図３Ｄ、ＥＦ－Ｐの存在下で、それぞれ１．１２μＭと５５％、ＥＦ－Ｐにより１．６倍に改善）。
ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ３Ｖ３は、本実験で評価した全てのｔＲＮＡの中で最も高いＰ１－ＦＬＰレベルを示したことから、今後の実験には、このｔＲＮＡを用いることとした。ｔＲＮＡＡｎ４Ａｃ１Ｔ３Ｖ３は、以下ｔＲＮＡｉｎｉＰとする（図１Ｃ、図８）（それぞれのｔＲＮＡの配列は表６、使用したプライマーは表７及び表８を参照）。
【0098】
【表6】
【0099】
【表7】
【0100】
【表8】
【0101】
表６に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号４２～６８に該当する。また、表７に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号６９～１２２に該当する。さらに、表８に記載の塩基配列は、上から順に、それぞれ配列番号１２３～１７６に該当する。
【0102】
Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開を抑制するための翻訳条件の最適化
Ｐ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を増強するため、ＩＦ３、ＥＦ－Ｇ、及びＲＲＦの濃度を最適化した（図４Ａ、Ｂ、Ｃ）。さらに、Ｐ１－ＦＬＰ合成のため、ＥＦ－Ｐ及びＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰの濃度についても滴定した（図４Ｄ、Ｅ）。ＩＦ３の滴定では、Ｐ１－ＦＬＰ濃度は５μＭ以上のＩＦ３でプラトーに達し、Ｐ１－ＦＬＰ％は１５μＭ以上で９０％を超えた（図４Ａ）。そこで、残りの実験には、１５μＭのＩＦ３を用いた。ＥＦ－Ｇの滴定において、Ｐ１－ＦＬＰレベルは１μＭのＥＦ－Ｇでピークに達し、９８％のＰ１－ＦＬＰ％であった。ＥＦ－Ｇの濃度が１μＭを超えると徐々に低下した（図４Ｂ）。このことは、ＥＦ－Ｇの濃度が高すぎると、頻繁に誤転写され、Ｐ－ｓｉｔｅからＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰが脱落する可能性があることを示している。ＲＲＦ及びＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰの濃度について、Ｐ１－ＦＬＰレベルはそれぞれ１μＭ ＲＲＦ及び８０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰでプラトーに達した（図４Ｃ、Ｅ）。ＥＦ－Ｐの濃度について、Ｐ１－ＦＬＰレベルは、５～１０μＭ ＥＦ－Ｐでピークに達し、より高いＥＦ－Ｐ濃度では徐々に低下した（図４Ｄ）。これは、ペプチジル転移が完了した後もＥＦ－ＰがリボソームのＥ－ｓｉｔｅを占め、Ｐ－ｓｉｔｅからＥ－ｓｉｔｅへのデアシルｔＲＮＡのトランスロケーションが阻害されるからであると考えられる。１０μＭ ＥＦ－ＰでのＰ１－ＦＬＰレベルと、０μＭ ＥＦ－ＰでのＰ１－ＦＬＰレベルを比較すると、２．８倍の改善が認められ（それぞれ図４Ｄ、２１．１μＭ、７．６μＭ）、これらの反応条件下で、ＥＦ－ＰによってｔＲＮＡｉｎｉＰが認識され、ペプチジル転移を増強することが示された。最適な翻訳条件（図４Ｃ、１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１０μＭ ＥＦ－Ｐ、及び８０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰ）では、Ｐ１－ＦＬＰレベルは２５μＭに達し、そこでは、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開は完全に抑制された（Ｐ１－ＦＬＰ％＝１００）。
Ｐ１－ＦＬＰレベル及びＰ１－ＦＬＰ％を増強するため、ＩＦ３、ＥＦ－Ｇ、及びＲＲＦの濃度を最適化した（図４Ａ、Ｂ、Ｃ）。さらに、Ｐ１－ＦＬＰ合成のため、ＥＦ－Ｐ及びＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰの濃度についても滴定した（図４Ｄ、Ｅ）。ＩＦ３の滴定では、Ｐ１－ＦＬＰ濃度は５μＭ以上のＩＦ３でプラトーに達し、Ｐ１－ＦＬＰ％は１５μＭ以上で９０％を超えた（図４Ａ）。そこで、残りの実験には、１５μＭのＩＦ３を用いた。ＥＦ－Ｇの滴定において、Ｐ１－ＦＬＰレベルは１μＭのＥＦ－Ｇでピークに達し、９８％のＰ１－ＦＬＰ％であった。ＥＦ－Ｇの濃度が１μＭを超えると徐々に低下した（図４Ｂ）。このことは、ＥＦ－Ｇの濃度が高すぎると、頻繁に誤転写され、Ｐ－ｓｉｔｅからＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰが脱落する可能性があることを示している。ＲＲＦ及びＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰの濃度について、Ｐ１－ＦＬＰレベルはそれぞれ１μＭ ＲＲＦ及び８０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰでプラトーに達した（図４Ｃ、Ｅ）。ＥＦ－Ｐの濃度について、Ｐ１－ＦＬＰレベルは、５～１０μＭ ＥＦ－Ｐでピークに達し、より高いＥＦ－Ｐ濃度では徐々に低下した（図４Ｄ）。これは、ペプチジル転移が完了した後もＥＦ－ＰがリボソームのＥ－ｓｉｔｅを占め、Ｐ－ｓｉｔｅからＥ－ｓｉｔｅへのデアシルｔＲＮＡのトランスロケーションが阻害されるからであると考えられる。１０μＭ ＥＦ－ＰでのＰ１－ＦＬＰレベルと、０μＭ ＥＦ－ＰでのＰ１－ＦＬＰレベルを比較すると、２．８倍の改善が認められ（それぞれ図４Ｄ、２１．１μＭ、７．６μＭ）、これらの反応条件下で、ＥＦ－ＰによってｔＲＮＡｉｎｉＰが認識され、ペプチジル転移を増強することが示された。最適な翻訳条件（図４Ｃ、１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１０μＭ ＥＦ－Ｐ、及び８０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰ）では、Ｐ１－ＦＬＰレベルは２５μＭに達し、そこでは、Ｎ末端ドロップオフ翻訳再開は完全に抑制された（Ｐ１－ＦＬＰ％＝１００）。
【0103】
ＡｃＰｒｏのＰ１への取り込みのためにｔＲＮＡｉｎｉＰを用いて９つのコドン－アンチコドンの組み合わせを検討した（図５Ａ、コドン：アンチコドン＝ＡＵＵ：ＡＡＵ、ＡＵＵ：ＧＡＵ、ＡＵＣ：ＧＡＵ、ＡＵＧ：ＣＡＵ、ＡＡＧ：ＣＵＵ、ＡＧＡ：ＵＣＵ、ＧＵＡ：ＵＡＣ、及びＧＧＡ：ＵＣＣ）。ｔＲＮＡｉｎｉＰのアンチコドンを、対応するコドン配列を認識するように変更した（それぞれのｔＲＮＡの配列は表６、使用したプライマーは表７及び表８を参照）。なお、この分析では、ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰの濃度を１６０μＭに増加した。その結果、ＡＵＵ：ＧＡＵ、ＡＵＣ：ＧＡＵ、ＡＡＧ：ＣＵＵ、及びＧＵＡ：ＵＡＣは、標準的なＡＵＧ：ＣＡＵよりも有意に高いＰ１－ＦＬＰレベルを示したが（図５Ａ、ＡＵＵ：ＧＡＵ、ＡＵＣ：ＧＡＵ、ＡＡＧ：ＣＵＵ、及びＧＵＡ：ＵＡＣについては５４．８－６３．４μＭ、ＡＵＧ：ＣＡＵについては２５．１μＭ）、ＡＵＵ：ＧＡＵとＡＵＣ：ＧＡＵは、Ｐ１－ＦＬＰ％が低下した（それぞれ８９％と９１％、他の組み合わせについては９９－１００％）。したがって、ＡＡＧ：ＣＵＵとＧＵＡ：ＵＡＣはＰ１－ＦＬＰ合成のための好ましいコドン－アンチコドンの組合せであると結論した。
【0104】
さらに、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列、及びＳＤ配列と開始コドンの間のスペーサーの効果を評価した。ｍＲ１に加えて、ＡＵＧとＡＡＧを開始コドンとして導入した５つのＳＤ＋スペーサー配列を評価した（図５Ｂ、ｍＲ２－ｍＲ６）。その結果、ＳＤ＋スペーサーのタイプに依存して、広範囲のＰ１－ＦＬＰレベルが観察された。ｍＲ５は、ＡＵＧ及びＡＡＧの両方のコドンに対して、最も高いＰ１－ＦＬＰを示した（図５Ｃ、０．３９－５９．１μＭ、（全てのＳＤ＋スペーサーに対するＰ１－ＦＬＰレベルの範囲）、ｍＲ５－ＡＵＧ及びｍＲ５－ＡＡＧに対して、それぞれ４３．８μＭ及び５９．１μＭ）。したがって、１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１０μＭ ＥＦ－Ｐ、及び１６０μＭ ＡｃＰｒｏ－ｔＲＮＡｉｎｉＰを有するｍＲ５－ＡＡＧの使用がＰ１－ＦＬＰの翻訳のための最良の条件であると結論づけた。これらの条件下では、５９．１μＭ Ｐ１－ＦＬＰが得られ、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴを使用した時と比較して、１０００倍以上改善した（図２Ｃ、ｔＲＮＡｉｎｉＷＴ、ＥＦ－Ｐ（－）、０．０４５μＭ）。
【0105】
ｔＲＮＡ
ｉｎｉＰ
及びＥＦ－Ｐを用いた、Ｎ末端におけるＤ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のリボソーム取り込み
Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸の代表物質として、Ｎ－アセチル－Ｄ－トリプトファン（ＡｃＤＴｒｐ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－チロシン（ＡｃＤＴｙｒ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－β－ホモフェニルグリシン（ＡｃβＰｈｇ）、及びＮ－アセチル－３－アミノ安息香酸（Ａｃ３Ａｂｚ）を用いて、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸の取込みにｔＲＮＡｉｎｉＰを適用することを目的とした（図６Ａ）。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡｉｎｉＰ ＣＵＵと表される、ＣＵＵアンチコドンを有するｔＲＮＡｉｎｉＰにプレチャージされ、次いで、ｍＲ５－ＡＡＧを用いてＰ１ペプチドのＮ末端に導入され、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｒｐ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｙｒ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃβＰｈｇ、及びＰ１－ＦＬＰ－Ａｃ３Ａｂｚを得た。１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１６０μＭ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉＰ ＣＵＵ、及び０μＭ又は１０μＭ ＥＦ－Ｐを含む反応溶液２．５μＬ中で、３７℃で３０分間、翻訳反応を行った。ＥＦ－Ｐ（＋）反応混合物にＵ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓを加えたが、ＥＦ－Ｐ（－）反応には、非ラベル化Ｌｙｓを加えた。ＥＤＴＡを加え混合することで、ＥＦ－Ｐ（＋）及びＥＦ－Ｐ（－）の両方の反応を停止し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供した（図６Ｂ）。ＥＦ－Ｐによる増強を評価するために、Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓ－ラベル化Ｐ１－ＦＬＰ及び非ラベル化Ｐ１－ＦＬＰのピーク強度を比較した。その結果、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＰｒｏ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｒｐ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｙｒ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃβＰｈｇ、及びＰ１－ＦＬＰ－Ａｃ３Ａｂｚの発現レベルは、それぞれ４．１倍、８１倍、３９０倍、７．１倍、及び１．７倍の改善が認められた。これらの結果は、ｔＲＮＡｉｎｉＰが、ＡｃＰｒｏの取り込みと同様に、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のＮ末端への取込みの増強に適用できることを示す。
Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸の代表物質として、Ｎ－アセチル－Ｄ－トリプトファン（ＡｃＤＴｒｐ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－チロシン（ＡｃＤＴｙｒ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－β－ホモフェニルグリシン（ＡｃβＰｈｇ）、及びＮ－アセチル－３－アミノ安息香酸（Ａｃ３Ａｂｚ）を用いて、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸の取込みにｔＲＮＡｉｎｉＰを適用することを目的とした（図６Ａ）。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡｉｎｉＰ ＣＵＵと表される、ＣＵＵアンチコドンを有するｔＲＮＡｉｎｉＰにプレチャージされ、次いで、ｍＲ５－ＡＡＧを用いてＰ１ペプチドのＮ末端に導入され、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｒｐ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｙｒ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃβＰｈｇ、及びＰ１－ＦＬＰ－Ａｃ３Ａｂｚを得た。１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、２．５μＭ ＲＲＦ、１６０μＭ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉＰ ＣＵＵ、及び０μＭ又は１０μＭ ＥＦ－Ｐを含む反応溶液２．５μＬ中で、３７℃で３０分間、翻訳反応を行った。ＥＦ－Ｐ（＋）反応混合物にＵ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓを加えたが、ＥＦ－Ｐ（－）反応には、非ラベル化Ｌｙｓを加えた。ＥＤＴＡを加え混合することで、ＥＦ－Ｐ（＋）及びＥＦ－Ｐ（－）の両方の反応を停止し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供した（図６Ｂ）。ＥＦ－Ｐによる増強を評価するために、Ｕ－１３Ｃ：Ｕ－１５Ｎ－Ｌｙｓ－ラベル化Ｐ１－ＦＬＰ及び非ラベル化Ｐ１－ＦＬＰのピーク強度を比較した。その結果、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＰｒｏ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｒｐ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃＤＴｙｒ、Ｐ１－ＦＬＰ－ＡｃβＰｈｇ、及びＰ１－ＦＬＰ－Ａｃ３Ａｂｚの発現レベルは、それぞれ４．１倍、８１倍、３９０倍、７．１倍、及び１．７倍の改善が認められた。これらの結果は、ｔＲＮＡｉｎｉＰが、ＡｃＰｒｏの取り込みと同様に、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、及びγ－アミノ酸のＮ末端への取込みの増強に適用できることを示す。
【0106】
ペプチドのマクロ環状化のために、Ｎ－アセチル化アミノ酸に代えてＮ－クロロアセチル化アミノ酸を用いた。ここでは、Ｎ－クロロアセチル－Ｌ－Ｐｒｏ（ＣｌＡｃＰｒｏ）及びＮ－クロロアセチル３Ａｂｚ（ＣｌＡｃ３Ａｂｚ）をｔＲＮＡｉｎｉＰ
ＣＵＵにプレチャージし、モデルペプチドＰ７のＮ末端に導入した（図９Ａ～Ｃ）。１５μＭ ＩＦ３、１μＭ ＥＦ－Ｇ、１０μＭ ＥＦ－Ｐ、２．５μＭ ＲＲＦ、及び２００μＭ アミノアシル－ｔＲＮＡｉｎｉＰ
ＣＵＵの存在下、翻訳を行った。Ｎ－クロロアセチル基は、自発的に下流のＣｙｓのスルフヒドリル基と反応し、還元されないチオエーテル結合を形成し、その結果ペプチドのマクロ環状化を生じた。翻訳物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳは、予想した環状ペプチドが開裂せずに発現したことを示した（図９Ｄ～Ｇ；Ｐ７－ＦＬＰ－ＣｌＡｃＰｒｏ、及びＰ７－ＦＬＰ－ＣｌＡｃ３Ａｂｚ）。
【0107】
参考文献１ Saito, H., Kourouklis, D. and Suga, H. (2001) An in vitro evolved precursor tRNA with aminoacylation activity. EMBO J., 20, 1797-1806.
参考文献２ Murakami, H., Ohta, A., Ashigai, H. and Suga, H. (2006) A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis. Nat. Methods, 3, 357-359.
参考文献３ Katoh, T. and Suga, H. (2020) Ribosomal elongation of aminobenzoic acid derivatives. J. Am. Chem. Soc., 142, 16518-16522.
参考文献４ Katoh, T. et al. Cell Chem. Biol. 24, 46-54 (2017).
参考文献２ Murakami, H., Ohta, A., Ashigai, H. and Suga, H. (2006) A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis. Nat. Methods, 3, 357-359.
参考文献３ Katoh, T. and Suga, H. (2020) Ribosomal elongation of aminobenzoic acid derivatives. J. Am. Chem. Soc., 142, 16518-16522.
参考文献４ Katoh, T. et al. Cell Chem. Biol. 24, 46-54 (2017).
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】