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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024117001
(43)【公開日】2024-08-28
(54)【発明の名称】新規な亜リン酸デヒドロゲナーゼおよびその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20240821BHJP
C12N 9/04 20060101ALI20240821BHJP
C12P 19/36 20060101ALI20240821BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53
C12N9/04 Z ZNA
C12P19/36
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023022904
(22)【出願日】2023-02-16
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、ＪＳＴ－ＡＬＣＡ「亜リン酸を用いたロバスト且つ封じ込めを可能とする微細藻類の培養技術開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】廣田 隆一
(72)【発明者】
【氏名】黒田 章夫
(72)【発明者】
【氏名】ガマル・ナッサー・アブデルハディ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC04
4B050DD02
4B050HH01
4B050LL05
4B064AE48
4B064AF28
4B064AF29
4B064CA21
4B064CC24
4B064DA16
(57)【要約】 （修正有）
【課題】イオンまたは有機溶媒の存在下において充分に高い活性を有している、新規な亜リン酸デヒドロゲナーゼを提供する。
【解決手段】本発明の一態様に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのバリアントである。
【選択図】図２
【解決手段】本発明の一態様に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのバリアントである。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ１）～（ａ８）のうち１つ以上の条件を満たしている、亜リン酸デヒドロゲナーゼ：
（ａ１）カルシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カルシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ２）アンモニウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、アンモニウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ３）マグネシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ４）カリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ５）ナトリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、ナトリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ６）メタノール濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、メタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ７）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ８）エタノール濃度が２０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、エタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１５０％以上である。
（ａ１）カルシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カルシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ２）アンモニウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、アンモニウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ３）マグネシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ４）カリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ５）ナトリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、ナトリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ６）メタノール濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、メタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ７）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ８）エタノール濃度が２０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、エタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１５０％以上である。
【請求項2】
下記（ｂ１）～（ｂ７）のいずれかのタンパク質である、亜リン酸デヒドロゲナーゼ：
（ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、かつ亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ４）配列番号２の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ５）配列番号２の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ６）配列番号２の塩基配列に対する配列同一性が９０％以上である塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ７）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質。
（ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、かつ亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ４）配列番号２の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ５）配列番号２の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ６）配列番号２の塩基配列に対する配列同一性が９０％以上である塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ７）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質。
【請求項3】
請求項１または２に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、
ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上と、
を備えている、酵素製剤。
ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上と、
を備えている、酵素製剤。
【請求項4】
請求項１または２に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、
ＮＡＤまたはＮＡＤＰと、
を含んでいる、複合体。
ＮＡＤまたはＮＡＤＰと、
を含んでいる、複合体。
【請求項5】
請求項１または２に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼによって、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上を還元する工程を有する、
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群より選択される１つ以上の製造方法。
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群より選択される１つ以上の製造方法。
【請求項6】
イオンおよび／または有機溶媒の存在下において、請求項１または２に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼにより基質を酸化する工程を有する、
酵素反応方法。
酵素反応方法。
【請求項7】
請求項１または２に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、有機溶媒とを共存させる工程を有する、
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法。
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法。
【請求項8】
請求項１または２に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上とを共存させる工程を有する、
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる方法。
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な亜リン酸デヒドロゲナーゼおよびその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔｘＤ）は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存的に亜リン酸を酸化する酵素である。この酵素により、亜リン酸はリン酸に酸化され、補酵素（ＮＡＤまたはＮＡＤＰ）は還元型補酵素（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）に還元される。この反応は、補酵素の再生反応として、様々な生化学反応に利用できる。また、この反応は、他の方法では分析が困難な亜リン酸の簡便な測定にも利用できる。
【0003】
従来知られている亜リン酸デヒドロゲナーゼの例として、非特許文献１は、土壌細菌であるRalstonia sp. 4506株から亜リン酸デヒドロゲナーゼを単離した旨を報告している。また、非特許文献２は、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼによりＮＡＤＰＨ再生系を確立した旨を報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Hirota, R., et al., Isolation and characterization of a soluble and thermostable phosphite dehydrogenase from Ralstonia sp. strain 4506, J. Biosci. Bioeng. (2011), doi:10.1016/j.jbiosc.2011.11.027
【非特許文献2】Abdel-Hady GN, et al., Engineering Cofactor Specificity of a Thermostable Phosphite Dehydrogenase for a Highly Efficient and RobustNADPH Regeneration System, Front. Bioeng. Biotechnol. 9:647176. (2021), doi: 10.3389/fbioe.2021.647176
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らの研究によると、非特許文献１、２が開示しているような従来公知の亜リン酸デヒドロゲナーゼは、イオンおよび有機溶媒に対する耐性が低いことが分かった。それゆえ、この亜リン酸デヒドロゲナーゼには、イオンまたは有機溶媒の存在下において、充分な活性が得られないという課題があった。
【0006】
本発明の一態様は、イオンまたは有機溶媒の存在下において充分に高い活性を有している、新規な亜リン酸デヒドロゲナーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明には、下記の態様が含まれる。
＜１＞
下記（ａ１）～（ａ８）のうち１つ以上の条件を満たしている、亜リン酸デヒドロゲナーゼ：
（ａ１）カルシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カルシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ２）アンモニウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、アンモニウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ３）マグネシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ４）カリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ５）ナトリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、ナトリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ６）メタノール濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、メタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ７）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ８）エタノール濃度が２０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、エタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１５０％以上である。
＜２＞
下記（ｂ１）～（ｂ７）のいずれかのタンパク質である、亜リン酸デヒドロゲナーゼ：
（ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、かつ亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ４）配列番号２の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ５）配列番号２の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ６）配列番号２の塩基配列に対する配列同一性が９０％以上である塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ７）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質。
＜３＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、
ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上と、
を備えている、酵素製剤。
＜４＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、
ＮＡＤまたはＮＡＤＰと、
を含んでいる、複合体。
＜５＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼによって、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上を還元する工程を有する、
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群より選択される１つ以上の製造方法。
＜６＞
イオンおよび／または有機溶媒の存在下において、＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼにより基質を酸化する工程を有する、
酵素反応方法。
＜７＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、有機溶媒とを共存させる工程を有する、
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法。
＜８＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上とを共存させる工程を有する、
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる方法。
＜１＞
下記（ａ１）～（ａ８）のうち１つ以上の条件を満たしている、亜リン酸デヒドロゲナーゼ：
（ａ１）カルシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カルシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ２）アンモニウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、アンモニウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ３）マグネシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ４）カリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ５）ナトリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、ナトリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ６）メタノール濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、メタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ７）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ８）エタノール濃度が２０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、エタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１５０％以上である。
＜２＞
下記（ｂ１）～（ｂ７）のいずれかのタンパク質である、亜リン酸デヒドロゲナーゼ：
（ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、かつ亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ４）配列番号２の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ５）配列番号２の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ６）配列番号２の塩基配列に対する配列同一性が９０％以上である塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ７）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質。
＜３＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、
ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上と、
を備えている、酵素製剤。
＜４＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、
ＮＡＤまたはＮＡＤＰと、
を含んでいる、複合体。
＜５＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼによって、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上を還元する工程を有する、
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群より選択される１つ以上の製造方法。
＜６＞
イオンおよび／または有機溶媒の存在下において、＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼにより基質を酸化する工程を有する、
酵素反応方法。
＜７＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、有機溶媒とを共存させる工程を有する、
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法。
＜８＞
＜１＞または＜２＞に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上とを共存させる工程を有する、
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明の一態様によれば、イオンまたは有機溶媒の存在下において充分に高い活性を有している、新規な亜リン酸デヒドロゲナーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＣｔＰｔｘＤ）の生化学的特性を表す図である。Ａは、至適ｐＨを表す。Ｂは、ｐＨ安定性を表す。Ｃは、至適温度を表す。Ｄは、耐熱性を表す。
【図2】イオンの存在下における、ＣｔＰｔｘＤの活性を表すグラフである。
【図4】有機溶媒の存在下における、ＣｔＰｔｘＤの活性を表すグラフである。
【図5】ＣｔＰｔｘＤとＮＡＤもしくはＮＡＤＰとの複合体化により、有機溶媒耐性が向上することを表すグラフである。
【図6】ＣｔＰｔｘＤを利用することにより、アンモニウムイオン存在下におけるトリメチルピルビン酸からＬ－ｔｅｒｔロイシンへの変換率が向上することを表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の一実施形態について、以下に説明する。ただし、本発明は、以下に説明する各構成に限定されない。本発明は、特許請求の範囲に示した範囲で種々に変更できる。本発明の技術的範囲は、本明細書に開示されている複数の技術的手段を適宜組合せて得られる実施形態または実施例にも及ぶ。このとき、複数の技術的手段は、複数の実施形態または実施例にわたって開示されていてもよい。
【0011】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【0012】
〔１．新規な亜リン酸デヒドロゲナーゼ〕
［１．１．亜リン酸デヒドロゲナーゼの特徴］
本発明者らは、海洋性シアノバクテリアの一種であるCyanothece sp. ATCC 51142のゲノムから、亜リン酸デヒドロゲナーゼのホモログと見られる塩基配列を特定し、この塩基配列にコードされているタンパク質（ＣｔＰｔｘＤ）が実際に亜リン酸脱水素活性を有していることを突き止めた。興味深いことに、ＣｔＰｔｘＤは、イオンまたは有機溶媒に対する耐性が、従来知られていた亜リン酸デヒドロゲナーゼよりも顕著に高かった。
［１．１．亜リン酸デヒドロゲナーゼの特徴］
本発明者らは、海洋性シアノバクテリアの一種であるCyanothece sp. ATCC 51142のゲノムから、亜リン酸デヒドロゲナーゼのホモログと見られる塩基配列を特定し、この塩基配列にコードされているタンパク質（ＣｔＰｔｘＤ）が実際に亜リン酸脱水素活性を有していることを突き止めた。興味深いことに、ＣｔＰｔｘＤは、イオンまたは有機溶媒に対する耐性が、従来知られていた亜リン酸デヒドロゲナーゼよりも顕著に高かった。
【0013】
それゆえ、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、イオン濃度または有機溶媒濃度が高い条件下においても、亜リン酸脱水素活性が維持される亜リン酸デヒドロゲナーゼとして特定できる。具体的に、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、下記（ａ１）～（ａ８）のうち１つ以上の条件を満たしている。好ましくは、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、下記（ａ１）～（ａ８）のうち２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上または８つ全ての条件を満たしている。
【0014】
（ａ１）カルシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カルシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ２）アンモニウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、アンモニウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ３）マグネシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ４）カリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ５）ナトリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、ナトリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ６）メタノール濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、メタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ７）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ８）エタノール濃度が２０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、エタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１５０％以上である。
（ａ２）アンモニウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、アンモニウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ３）マグネシウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ４）カリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、カリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ５）ナトリウムイオン濃度が５０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性が、ナトリウムイオン濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、８０％以上である；
（ａ６）メタノール濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、メタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ７）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が３０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１００％以上である；
（ａ８）エタノール濃度が２０体積％であるときの亜リン酸脱水素活性が、エタノール濃度が０ｍＭであるときの亜リン酸脱水素活性と比較して、１５０％以上である。
【0015】
（ａ１）～（ａ５）に関して、好ましくは、上述の活性の比率は、８５％以上または９０％以上である。（ａ６）および（ａ７）に関して、好ましくは、上述の活性の比率は、１２０％以上または１５０％以上である。（ａ８）に関して、好ましくは、上述の活性の比率は、１６０％以上である。
【0016】
本明細書において、亜リン酸脱水素活性とは、亜リン酸を酸化してリン酸に変換する活性を表す。亜リン酸デヒドロゲナーゼは、補酵素（ＮＡＤまたはＮＡＤＰ）とともに作用することが知られている。したがって、亜リン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応では、亜リン酸からリン酸が生じるとともに、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）からＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）が生じる。そのため、本明細書においては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成を測定することにより、亜リン酸脱水素活性を測定する。
【0017】
亜リン酸脱水素活性の測定方法は、下記の通りである。より具体的な方法に関しては、本願実施例を参照。
１． 反応液を用意する。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、ならびに１ｍＭの亜リン酸とする（いずれも酵素を加えた後の終濃度）。
２． 亜リン酸デヒドロゲナーゼを反応液に加えて、反応を開始させる。亜リン酸デヒドロゲナーゼの終濃度は、２．０μｇ／ｍＬとする。
３． ３７℃にてインキュベートしながら、３４０ｎｍの波長における吸光度の上昇量を測定する。これにより、単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を算出する。３４０ｎｍの波長におけるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのモル吸光係数は、６．３×１０３Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍとする。
４． １分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される活性を、１ユニットと定義する。測定されたユニットを使用したタンパク質の質量で除した値を、亜リン酸脱水活性とする。
１． 反応液を用意する。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、ならびに１ｍＭの亜リン酸とする（いずれも酵素を加えた後の終濃度）。
２． 亜リン酸デヒドロゲナーゼを反応液に加えて、反応を開始させる。亜リン酸デヒドロゲナーゼの終濃度は、２．０μｇ／ｍＬとする。
３． ３７℃にてインキュベートしながら、３４０ｎｍの波長における吸光度の上昇量を測定する。これにより、単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を算出する。３４０ｎｍの波長におけるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのモル吸光係数は、６．３×１０３Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍとする。
４． １分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される活性を、１ユニットと定義する。測定されたユニットを使用したタンパク質の質量で除した値を、亜リン酸脱水活性とする。
【0018】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、ナトリウムイオン、カリウムイオンおよびアンモニウムイオンに関して、高イオン濃度条件における活性を良好に維持することが判明している（実施例４を参照）。一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、（ａ２）、（ａ４）および（ａ５）からなる群より選択される条件のうち、１つ以上、２つ以上または３つ全てを満たしている。
【0019】
一実施形態において、塩化ナトリウムに対する亜リン酸デヒドロゲナーゼの阻害定数（Ｋｉ）は、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上または８００ｍＭ以上であってもよい。一実施形態において、塩化カリウムに対する亜リン酸デヒドロゲナーゼの阻害定数（Ｋｉ）は、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上または１０００ｍＭ以上であってもよい。一実施形態において、塩化アンモニウムに対する亜リン酸デヒドロゲナーゼの阻害定数（Ｋｉ）は、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上または７００ｍＭ以上であってもよい。阻害定数（Ｋｉ）とは、ある塩の濃度が０であるときの亜リン酸脱水素活性を１００％とすると、亜リン酸脱水素活性が５０％になるときの当該塩の濃度である。
【0020】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよびエタノールに関して、これらの有機溶媒の存在下では活性が向上することが判明している（実施例５を参照）。一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、（ａ６）、（ａ７）および（ａ８）からなる群より選択される条件のうち、１つ以上、２つ以上または３つ全てを満たしている。
【0021】
また、本発明者らは、Cyanothece sp. ATCC 51142由来の亜リン酸デアミナーゼ（ＣｔＰｔｘＤ）について、アミノ酸配列および塩基配列を特定している。それゆえ、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、特定のアミノ酸配列を有しているタンパク質およびそのバリアントとして特定できる。具体的に、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、下記（ｂ１）～（ｂ７）のいずれかのタンパク質である。
【0022】
（ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、かつ亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ４）配列番号２の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ５）配列番号２の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ６）配列番号２の塩基配列に対する配列同一性が９０％以上である塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ７）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質。
（ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、かつ亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ４）配列番号２の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ５）配列番号２の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ６）配列番号２の塩基配列に対する配列同一性が９０％以上である塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質；
（ｂ７）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸脱水素活性を有しているタンパク質。
【0023】
（ｂ２）に関して、「複数のアミノ酸」とは、例えば、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下または２個以下のアミノ酸である。
【0024】
（ｂ３）に関して、「配列同一性」とは、同一のアミノ酸数の割合を表す。配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴＸを利用して決定する。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する際のパラメーターは、例えば、score＝50, wordlength＝3を採用できる。これらの解析方法の具体的な手法は周知である。比較対象となるアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、ギャップを許容してもよい。
【0025】
（ｂ５）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下または２個以下の塩基である。
【0026】
（ｂ６）に関して、「配列同一性」とは、同一の塩基数の割合を表す。配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。塩基配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮを利用して決定するＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する際のパラメーターは、例えば、score＝100, wordlength＝12を採用できる。これらの解析方法の具体的な手法は周知である。比較対象となる塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、ギャップを許容してもよい。
【0027】
（ｂ７）に関して、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。ここで、１×ＳＳＣの組成は、塩化ナトリウム：１５０ｍＭ、クエン酸ナトリウム：１５ｍＭである。
【0028】
（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ５）～（ｂ７）に関して、「亜リン酸脱水素活性を有している」とは、亜リン酸をリン酸に変換する活性があることを表す。一実施形態においては、亜リン酸デヒドロゲナーゼの質量あたりの活性が、０．１Ｕ／ｍｇ以上、１．０Ｕ／ｍｇ以上または１０Ｕ／ｍｇ以上であることを、「亜リン酸脱水素活性を有している」と称する。亜リン酸脱水素活性の測定方法は、上述した通り、ＮＡＤまたはＮＡＤＨの生成量を介して測定する。１Ｕとは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される活性である。
【0029】
一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、Cyanothece属生物に由来する。Cyanothece属生物の例としては、Cyanothece sp. PCC7424、Cyanothece sp. PCC7822、Cyanothece sp. ATCC 51142、Cyanothece sp. PCC8801、Cyanothece sp. PCC8802、Cyanothece sp. BG0011が挙げられる。一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、Cyanothece sp. ATCC 51142に由来する。本明細書において、「ある生物に由来する」とは、起源が当該生物に由来することを表している。アミノ酸配列などの生物学的特徴が同じであるならば、当該生物とは異なる他の生物によって産生される組換えタンパク質も、「ある生物に由来する」の条件を満たしている。
【0030】
一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、天然には存在しない改変タンパク質である。改変タンパク質は、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼと他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
【0031】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸長の上限は、４００アミノ酸以下、３９０アミノ酸以下、３８０アミノ酸以下、３７０アミノ酸以下、３６０アミノ酸以下または３５０アミノ酸以下でありうる。本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸長の下限は、２６０アミノ酸以上、２７０アミノ酸以上、２８０アミノ酸以上、２９０アミノ酸以上、３００アミノ酸以上または３１０アミノ酸以上でありうる。
【0032】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ８．０～１０．０またはｐＨ８．５～９．５の範囲にあってもよい。本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの至適温度は、３０～５０℃または３５～４５℃の範囲にあってもよい。
【0033】
［１．２．亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素との組合せ］
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、水素受容体である補酵素とともに作用する。したがって、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素との組合せは、亜リン酸デヒドロゲナーゼを利用するに当たって有用である。ここで、補酵素とは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上である。
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、水素受容体である補酵素とともに作用する。したがって、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素との組合せは、亜リン酸デヒドロゲナーゼを利用するに当たって有用である。ここで、補酵素とは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上である。
【0034】
本発明の一実施形態に係る酵素製剤は、上述した亜リン酸デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上と、を備えている。酵素製剤は、さらなる要素として、亜リン酸を備えていてもよい。酵素製剤に備わっている各要素は、同じ容器の中で混合されていてもよいし、異なる容器に別々に収容されていてもよい。
【0035】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、補酵素と共存させると、耐熱性が向上したり（実施例３Ｄを参照）、有機溶媒への曝露に対する耐性が向上したり（実施例５を参照）することが判明している。これは、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素とが複合体化することにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼの構造が安定するためだと推定されている。
【0036】
本発明の一実施形態に係る複合体は、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤまたはＮＡＤＰと、を含んでいる。この複合体は、複合体を形成しない亜リン酸デヒドロゲナーゼと比較して、耐熱性および／または有機溶媒耐性の向上が見られる場合がある。複合体に含まれている亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素との個数の比率は、特に限定されない。亜リン酸デヒドロゲナーゼおよび補酵素が１個ずつ含まれている複合体であってもよいし、いずれか一方が２個以上含まれている複合体であってもよい。
【0037】
〔２．亜リン酸デヒドロゲナーゼの利用〕
［２．１．還元型補酵素の製造］
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、亜リン酸を酸化してリン酸に変換する。それと同時に、補酵素（ＮＡＤまたはＮＡＤＰ）を還元して還元型補酵素（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）に変換する。還元型補酵素は、生化学反応において非常に重要な物質であるが、購入すると高価である。それゆえ、補酵素の還元反応を利用して還元型補酵素を製造する方法は、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
［２．１．還元型補酵素の製造］
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、亜リン酸を酸化してリン酸に変換する。それと同時に、補酵素（ＮＡＤまたはＮＡＤＰ）を還元して還元型補酵素（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）に変換する。還元型補酵素は、生化学反応において非常に重要な物質であるが、購入すると高価である。それゆえ、補酵素の還元反応を利用して還元型補酵素を製造する方法は、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
【0038】
本発明の一実施形態に係る還元型補酵素の製造方法は、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼによって、補酵素を還元する工程を有する。還元される補酵素とは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上である。得られる還元型補酵素とは、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群より選択される１つ以上である。
【0039】
［２．２．イオンおよび／または有機溶媒存在下における高活性］
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、従来知られている亜リン酸デヒドロゲナーゼとは異なり、イオンおよび／または有機溶媒の存在下においても、亜リン酸脱水素活性を維持できる。そのため、イオンおよび／または有機溶媒が存在する反応系においても、例えば補酵素再生系を担う酵素として利用できる。化学反応の中には、イオンの存在下で進行するものがある。また、有機溶媒の存在下では、基質の溶解性が向上して有利となる化学反応もある。それゆえ、イオンおよび／または有機溶媒の存在下における化学反応への利用は、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、従来知られている亜リン酸デヒドロゲナーゼとは異なり、イオンおよび／または有機溶媒の存在下においても、亜リン酸脱水素活性を維持できる。そのため、イオンおよび／または有機溶媒が存在する反応系においても、例えば補酵素再生系を担う酵素として利用できる。化学反応の中には、イオンの存在下で進行するものがある。また、有機溶媒の存在下では、基質の溶解性が向上して有利となる化学反応もある。それゆえ、イオンおよび／または有機溶媒の存在下における化学反応への利用は、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
【0040】
本発明の一実施形態に係る酵素反応方法は、イオンおよび／または有機溶媒の存在下において、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼにより基質を酸化する工程を有する。通常、基質は亜リン酸である。この方法は、イオンおよび／または有機溶媒の存在下において、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼにより補酵素を還元する工程を有してもよい。還元される補酵素とは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上である。
【0041】
［２．３．有機溶媒存在下における活性向上］
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、有機溶媒の存在下において、亜リン酸脱水素活性が向上することが判明している（実施例５を参照）。つまり、有機溶媒と共存させることにより、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼが触媒する反応を促進できる。この点においても、有機溶媒の存在下における化学反応への利用は、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、有機溶媒の存在下において、亜リン酸脱水素活性が向上することが判明している（実施例５を参照）。つまり、有機溶媒と共存させることにより、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼが触媒する反応を促進できる。この点においても、有機溶媒の存在下における化学反応への利用は、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
【0042】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法は、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼと、有機溶媒とを共存させる工程を有する。亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性とは、亜リン酸脱水素活性および補酵素還元活性からなる群より選択される１つ以上である。通常、基質は亜リン酸である。還元される補酵素とは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上である。
【0043】
有機溶媒の存在下における亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、有機溶媒の非存在下における活性を１００％とすると、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上または１５０％以上であってもよい。
【0044】
［２．４．補酵素との共存による耐熱性向上］
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、補酵素との共存化において、耐熱性が向上することが判明している（実施例３Ｄを参照）。それゆえ、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素と共存させることは、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼは、補酵素との共存化において、耐熱性が向上することが判明している（実施例３Ｄを参照）。それゆえ、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素と共存させることは、本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの有用な利用方法の一つである。
【0045】
本発明の一実施形態に係る亜リン酸デヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる方法は、上述の亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素とを共存させる工程を有する。補酵素とは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群より選択される１つ以上である。一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素とは、複合体を形成している。一実施形態において、亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素との共存系は、溶液系である。
【0046】
耐熱性が向上するとは、例えば、高温環境下に一定時間曝露された後の残存活性が維持されることである。亜リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素とを共存させた状態で、４５℃にて６０分間静置した後の残存活性は、熱処理前の活性を１００％とすると、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上であってもよい。
【0047】
［２．５．その他］
上述のいずれかの実施形態において、イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンからなる群より選択される１種類以上である。イオンの濃度の下限は、例えば、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１１０ｍＭ以上、１２０ｍＭ以上、１３０ｍＭ以上、１４０ｍＭ以上または１５０ｍＭ以上であってもよい。イオンの濃度の上限は、例えば、１２００ｍＭ以下、１０００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下または２００ｍＭ以下であってもよい。
上述のいずれかの実施形態において、イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンからなる群より選択される１種類以上である。イオンの濃度の下限は、例えば、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１１０ｍＭ以上、１２０ｍＭ以上、１３０ｍＭ以上、１４０ｍＭ以上または１５０ｍＭ以上であってもよい。イオンの濃度の上限は、例えば、１２００ｍＭ以下、１０００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下または２００ｍＭ以下であってもよい。
【0048】
上述のいずれかの実施形態において、有機溶媒は、メタノール、エタノールおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドからなる群より選択される１種類以上である。有機溶媒の濃度の下限は、例えば、５体積％以上、１０体積％以上、１５体積％以上または２０体積％以上であってもよい。有機溶媒の濃度の上限は、例えば、４０体積％以下、３５体積％以下、３０体積％以下または２５体積％以下であってもよい。
【実施例0049】
〔実施例１：ＣｔＰｔｘＤ遺伝子の単離およびクローニング〕
Ralstonia sp. 4506株由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＲｓＰｔｘＤ）のアミノ酸配列をクエリ配列として、ＢＬＡＳＴプログラムにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼホモログを有している細菌種を検索した。その結果、Cyanothece sp. ATCC 51142のゲノムの中に、ホモログと見られるタンパク質（ＣｔＰｔｘＤ）をコードしている遺伝子を見出した。ＲｓＰｔｘＤとＣｔＰｔｘＤとのアミノ酸相同性は、約５９．８％であった。
Ralstonia sp. 4506株由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＲｓＰｔｘＤ）のアミノ酸配列をクエリ配列として、ＢＬＡＳＴプログラムにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼホモログを有している細菌種を検索した。その結果、Cyanothece sp. ATCC 51142のゲノムの中に、ホモログと見られるタンパク質（ＣｔＰｔｘＤ）をコードしている遺伝子を見出した。ＲｓＰｔｘＤとＣｔＰｔｘＤとのアミノ酸相同性は、約５９．８％であった。
【0050】
微生物株保存機関（ＡＴＣＣ）から、Cyanothece sp. ATCC 51142のゲノムＤＮＡを入手した。プライマーＡ（5'-GGCCGCATATGAATCAAAAACCTAAAGTTG-3'：配列番号３）およびプライマーＢ（5'-TTATTCTCGAGTACGATACCATTTACAGCAC-3'：配列番号４）を用いて、ゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅した。このようにして、ＣｔＰｔｘＤ遺伝子を得た。得られた遺伝子を、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ－２１ｂ（Novagen）に挿入した。挿入位置は、制限酵素サイトであるＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間とした。
【0051】
ＲｓＰｔｘＤの発現プラスミドは、先行研究（非特許文献１）において作製されたものを用いた。
【0052】
〔実施例２：組換え亜リン酸デヒドロゲナーゼの発現および精製〕
下記の手順により、ＣｔＰｔｘＤおよびＲｓＰｔｘＤの組換えタンパク質を得た。
１． ＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤの発現プラスミドを用いて、大腸菌Rosetta 2 (DE3) pLysS株（Novagen）を形質転換した。
２． 得られた形質転換株を、１％グルコースを添加した２×ＹＴ培地に植菌して、３７℃にて一晩培養した。２×ＹＴ培地には、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有させた（以下同じ）。
３． 形質転換株を、１００ｍＬの新鮮な２×ＹＴ培地に１％植菌した。
４． 菌体濁度（ＯＤ６００）が０．５になるまで、３７℃にて形質転換株を培養した。
５． 終濃度が０．２ｍＭになるように、培地にＩＰＴＧを加えた。これにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼの発現を誘導した。
６． ２８℃にて６時間、培養を継続した。
７． 遠心分離によって菌体を回収した。
８． １０ｍＬの破砕バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭのＮａＣｌ）に菌体を懸濁させた。次に、超音波処理によって菌体を破砕した。
９． ２０，０００×ｇにて３０分間、菌体破砕液を遠心分離した。
１０． 得られた上清を、HisTrap HP（GE Healthcare）を用いて精製した。
１１． 結合バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび２０ｍＭのイミダゾール）でカラムを平衡化させた。
１２． フィルター濾過した菌体破砕液をカラムにアプライし、結合バッファーで洗浄した。
１３． 溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび５００ｍＭのイミダゾール）をカラムに通して、カラム内にイミダゾールの濃度勾配を形成させた。これにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を溶出させた。
１４． 得られた精製標品および各精製段階におけるフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、精製度を評価した。
下記の手順により、ＣｔＰｔｘＤおよびＲｓＰｔｘＤの組換えタンパク質を得た。
１． ＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤの発現プラスミドを用いて、大腸菌Rosetta 2 (DE3) pLysS株（Novagen）を形質転換した。
２． 得られた形質転換株を、１％グルコースを添加した２×ＹＴ培地に植菌して、３７℃にて一晩培養した。２×ＹＴ培地には、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有させた（以下同じ）。
３． 形質転換株を、１００ｍＬの新鮮な２×ＹＴ培地に１％植菌した。
４． 菌体濁度（ＯＤ６００）が０．５になるまで、３７℃にて形質転換株を培養した。
５． 終濃度が０．２ｍＭになるように、培地にＩＰＴＧを加えた。これにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼの発現を誘導した。
６． ２８℃にて６時間、培養を継続した。
７． 遠心分離によって菌体を回収した。
８． １０ｍＬの破砕バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭのＮａＣｌ）に菌体を懸濁させた。次に、超音波処理によって菌体を破砕した。
９． ２０，０００×ｇにて３０分間、菌体破砕液を遠心分離した。
１０． 得られた上清を、HisTrap HP（GE Healthcare）を用いて精製した。
１１． 結合バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび２０ｍＭのイミダゾール）でカラムを平衡化させた。
１２． フィルター濾過した菌体破砕液をカラムにアプライし、結合バッファーで洗浄した。
１３． 溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび５００ｍＭのイミダゾール）をカラムに通して、カラム内にイミダゾールの濃度勾配を形成させた。これにより、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を溶出させた。
１４． 得られた精製標品および各精製段階におけるフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、精製度を評価した。
【0053】
〔実施例３：ＣｔＰｔｘＤの生化学的性質〕
以降の実施例において、亜リン酸デヒドロゲナーゼの亜リン酸脱水素活性は下記の手順で測定した。ただし、別途記載のある場合は当該記載の条件が優先される。
１． ９９８μＬの反応液を、３７℃にて５分間、プレインキュベートした。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、ならびに１ｍＭの亜リン酸であった（いずれも酵素を加えた後の終濃度）。
２． ２μＬの酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を反応液に加えて、反応を開始させた。
３． ３７℃にてインキュベートしながら、３４０ｎｍの波長における吸光度の上昇量を測定した。これにより、単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を算出した。３４０ｎｍの波長におけるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのモル吸光係数は、６．３×１０３Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍとした。
４． １分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される活性を、１ユニットと定義した。測定されたユニットを使用したタンパク質の質量で除した値を、活性とした。
以降の実施例において、亜リン酸デヒドロゲナーゼの亜リン酸脱水素活性は下記の手順で測定した。ただし、別途記載のある場合は当該記載の条件が優先される。
１． ９９８μＬの反応液を、３７℃にて５分間、プレインキュベートした。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、ならびに１ｍＭの亜リン酸であった（いずれも酵素を加えた後の終濃度）。
２． ２μＬの酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を反応液に加えて、反応を開始させた。
３． ３７℃にてインキュベートしながら、３４０ｎｍの波長における吸光度の上昇量を測定した。これにより、単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を算出した。３４０ｎｍの波長におけるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのモル吸光係数は、６．３×１０３Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍとした。
４． １分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される活性を、１ユニットと定義した。測定されたユニットを使用したタンパク質の質量で除した値を、活性とした。
【0054】
［実施例３Ａ：至適ｐＨ］
以下の４種類のバッファーを利用して、異なるｐＨにおけるＣｔＰｔｘＤの比活性を測定し、至適ｐＨを検討した。
・２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）：ｐＨ６．０～７．０
・モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）：ｐＨ７．０～８．０
・Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ：ｐＨ８．０～９．０
・Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）：ｐＨ９．０～１０．０
以下の４種類のバッファーを利用して、異なるｐＨにおけるＣｔＰｔｘＤの比活性を測定し、至適ｐＨを検討した。
・２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）：ｐＨ６．０～７．０
・モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）：ｐＨ７．０～８．０
・Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ：ｐＨ８．０～９．０
・Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）：ｐＨ９．０～１０．０
【0055】
反応液の組成は、２０ｍＭの各バッファー、０．５ｍＭのＮＡＤ、１．０ｍＭの亜リン酸、２．０μｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤであった。１．０ｍＬの反応液を調製した。３７℃にて３０分間反応させ、経時的なＮＡＤＨの生成量を、３４０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【0056】
結果を図１のＡに示す。同図において、黒四角はＭＥＳ、白四角はＭＯＰＳ、黒丸はＴｒｉｓ、白丸はＣＨＥＳにおける測定結果を表す。同図から、ＣｔＰｔｘＤの至適ｐＨはｐＨ９．０程度であることが分かる。
【0057】
［実施例３Ｂ：ｐＨ安定性］
実施例３Ａで使用した各バッファー中において、２５℃にて１時間、ＣｔＰｔｘＤをインキュベートした。インキュベート後におけるＣｔＰｔｘＤの残存活性を測定した。
実施例３Ａで使用した各バッファー中において、２５℃にて１時間、ＣｔＰｔｘＤをインキュベートした。インキュベート後におけるＣｔＰｔｘＤの残存活性を測定した。
【0058】
結果を図１のＢに示す。同図において、黒四角はＭＥＳ、白四角はＭＯＰＳ、黒丸はＴｒｉｓ、白丸はＣＨＥＳにおける結果を表す。同図から、少なくともｐＨ６．０～１０．０の範囲において、ＣｔＰｔｘＤはｐＨに対して安定であることが分かる。
【0059】
［実施例３Ｃ：至適温度］
異なる温度におけるＣｔＰｔｘＤの比活性を測定し、至適温度を検討した。
異なる温度におけるＣｔＰｔｘＤの比活性を測定し、至適温度を検討した。
【0060】
反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１．０ｍＭの亜リン酸、２．０μｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤであった。１．０ｍＬの反応液を調製した。３０℃、４０℃、５０℃または６０℃にて３０分間反応させ、経時的なＮＡＤＨの生成量を、３４０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【0061】
結果を図１のＣに示す。同図において、黒四角はＣｔＰｔｘＤ、黒丸はＲｓＰｔｘＤの結果を表す。同図から、ＣｔＰｔｘＤの至適温度は４０℃程度であり、ＲｓＰｔｘＤよりは至適温度が低いことが分かる。
【0062】
［実施例３Ｄ：補酵素との結合による耐熱性の向上］
ＮＡＤまたはＮＡＤＰとの複合体化により、ＣｔＰｔｘＤの耐熱性がどのように変化するかを検討した。具体的な手順は下記の通りである。
１． ０．２ｍｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤと、０．５ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰとを、５０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）中で混合した。
２． 得られた溶液を、氷上にて５分間静置した。
３． 溶液を４５℃にてインキュベートした。インキュベート開始から３０分後、６０分後、１２０分後または２４０分後において、１０ｍＬのサンプルを採取した。
４． 反応液にサンプルを加えて、残存活性を測定した。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１．０ｍＭの亜リン酸であった。１．０ｍＬの反応液を調製した。３７℃にて３０分間反応させ、経時的なＮＡＤＨの生成量を、３４０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
ＮＡＤまたはＮＡＤＰとの複合体化により、ＣｔＰｔｘＤの耐熱性がどのように変化するかを検討した。具体的な手順は下記の通りである。
１． ０．２ｍｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤと、０．５ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰとを、５０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）中で混合した。
２． 得られた溶液を、氷上にて５分間静置した。
３． 溶液を４５℃にてインキュベートした。インキュベート開始から３０分後、６０分後、１２０分後または２４０分後において、１０ｍＬのサンプルを採取した。
４． 反応液にサンプルを加えて、残存活性を測定した。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１．０ｍＭの亜リン酸であった。１．０ｍＬの反応液を調製した。３７℃にて３０分間反応させ、経時的なＮＡＤＨの生成量を、３４０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【0063】
結果を図１のＤに示す。同図において、黒丸はＮＡＤと複合体化させてインキュベートした条件、黒四角はＮＡＤＰと複合体化させてインキュベートした条件、黒三角は複合体化させずにインキュベートした条件における結果を表す。同図から、ＮＡＤまたはＮＡＤＰと複合体化させることにより、ＣｔＰｔｘＤの耐熱性が向上することが分かる。その程度は、ＮＡＤとの複合体化による耐熱性の向上の方が、ＮＡＤＰとの複合体化による耐熱性の向上よりも高い。
【0064】
〔実施例４：イオン存在下における活性〕
イオン存在下におけるＣｔＰｔｘＤの活性を測定し、イオンに対する耐性を評価した。具体的な手順は下記の通りである。
１． 反応液を用意した。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭの亜リン酸、および２．０μｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤであった。
２． １ｍＬの反応溶液に、ＣａＣｌ２、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＫＣｌまたはＮａＣｌを加えた。添加量は、それぞれの化合物の終濃度が、０ｍＭ、４ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭまたは２００ｍＭとなる量とした。
３． 反応を開始させ、亜リン酸脱水素活性を測定した。
イオン存在下におけるＣｔＰｔｘＤの活性を測定し、イオンに対する耐性を評価した。具体的な手順は下記の通りである。
１． 反応液を用意した。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭの亜リン酸、および２．０μｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤであった。
２． １ｍＬの反応溶液に、ＣａＣｌ２、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＫＣｌまたはＮａＣｌを加えた。添加量は、それぞれの化合物の終濃度が、０ｍＭ、４ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭまたは２００ｍＭとなる量とした。
３． 反応を開始させ、亜リン酸脱水素活性を測定した。
【0065】
結果を図２に示す。同図から分かるように、ＣｔＰｔｘＤは、少なくとも１００ｍＭまでは、いずれのイオンの存在下でも活性がほとんど低下しなかった。特に、アンモニウムイオン、カリウムイオンまたはナトリウムイオンの存在下では、２００ｍＭに達しても活性はほとんど低下しなかった。これに対し、ＲｓＰｔｘＤは、イオン濃度依存的に活性が低下し、１００ｍＭにおける比活性は、最大でも６０％を割込んでいた。
【0066】
特に高い耐性を見せたアンモニウムイオン、カリウムイオンおよびナトリウムイオンについて、さらに高濃度の領域における耐性を検討した。結果を図３に示す。同図から分かるように、イオン濃度に依存するＣｔＰｔｘＤの活性の低下は、ＲｓＰｔｘＤよりも遥かに緩やかであった。同図において、阻害定数Ｋｉとは、酵素活性が５０％阻害される濃度である。また、右上パネルのＰｓｅＰｔｘＤとは、Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼで、一群の酵素の中で最初に発見されたものである。この酵素も、やはり、イオン濃度が上昇すると速やかに活性が低下することが報告されている。
【0067】
〔実施例５：有機溶媒存在下における活性〕
有機溶媒存在下におけるＣｔＰｔｘＤの活性を測定し、有機溶媒に対する耐性を評価した。具体的な手順は下記の通りである。
１． 反応液を用意した。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭの亜リン酸、および２．０μｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤであった。
２． １ｍＬの反応溶液に、メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたはメタノールを加えた。添加量は、それぞれの有機溶媒の終濃度が、０体積％、１０体積％、２０体積％、３０体積％、４０体積％または５０体積％となる量とした。
３． 反応を開始させ、亜リン酸脱水素活性を測定した。
有機溶媒存在下におけるＣｔＰｔｘＤの活性を測定し、有機溶媒に対する耐性を評価した。具体的な手順は下記の通りである。
１． 反応液を用意した。反応液の組成は、２０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭの亜リン酸、および２．０μｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤであった。
２． １ｍＬの反応溶液に、メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたはメタノールを加えた。添加量は、それぞれの有機溶媒の終濃度が、０体積％、１０体積％、２０体積％、３０体積％、４０体積％または５０体積％となる量とした。
３． 反応を開始させ、亜リン酸脱水素活性を測定した。
【0068】
ＮＡＤまたはＮＡＤＰとの複合体化により、ＣｔＰｔｘＤの有機溶媒耐性がどのように変化するかを検討した。具体的な手順は下記の通りである。
１． ０．２ｍｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤと、０．５ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰとを、５０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）中で混合した。
２． 得られた溶液を、氷上にて５分間静置した。
３． エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたはメタノールを溶液に加えた。添加量は、それぞれの有機溶媒の終濃度が０体積％、１０体積％、２０体積％、３０体積％、４０体積％または５０体積％となる量とした。
４． 溶液を２５℃にて６時間インキュベートした。このようにして、有機溶媒に曝露したサンプルを得た。
５． 反応液にサンプルを加えて、残存活性を測定した。
１． ０．２ｍｇ／ｍＬのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤと、０．５ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰとを、５０ｍＭのＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．３）中で混合した。
２． 得られた溶液を、氷上にて５分間静置した。
３． エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたはメタノールを溶液に加えた。添加量は、それぞれの有機溶媒の終濃度が０体積％、１０体積％、２０体積％、３０体積％、４０体積％または５０体積％となる量とした。
４． 溶液を２５℃にて６時間インキュベートした。このようにして、有機溶媒に曝露したサンプルを得た。
５． 反応液にサンプルを加えて、残存活性を測定した。
【0069】
有機溶媒中における活性を図４に示す。同図から分かるように、ＣｔＰｔｘＤは、メタノールおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの場合は３０体積％まで、エタノールの場合２０体積％まで、活性が低下しなかった。むしろ、これらの濃度領域では、活性の向上が見られた。これに対し、ＲｓＰｔｘＤでは、有機溶媒の存在下における活性の向上は見られなかった。
【0070】
有機溶媒に曝露した後の残存活性を図５に示す。同図から分かるように、ＣｔＰｔｘＤでは、ＮＡＤと複合体化することにより残存活性の向上が見られた。したがって、ＣｔＰｔｘＤとＮＡＤとが複合体化することにより、有機溶媒の曝露に対する安定性が向上すると考えられる。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドにおいては、ＣｔＰｔｘＤとＮＡＤＰとの複合体化による残存活性の向上も見られた。このような残存活性の向上効果は、ＣｔＰｔｘＤにおいて顕著であり、特に矢印で示す濃度では、ＣｔＰｔｘＤの残存活性とＲｓＰｔｘＤの残存活性との間に大きな違いが見られた。
【0071】
〔実施例６：補酵素再生系としての利用可能性〕
ＣｔＰｔｘＤによるＮＡＤまたはＮＡＤＰの再生が、具体的な有用物の生産に応用できることを実証した。具体的には、トリメチルピルビン酸を還元アミノ化してＬ－ｔｅｒｔロイシンを生じる反応において、ＣｔＰｔｘＤをＮＡＤＨ再生系として利用した。生成物であるＬ－ｔｅｒｔロイシンは、医薬、化粧品、食品添加物などの製造における重要な中間体である。この反応は、ロイシンデヒドロゲナーゼにより触媒され、ＮＡＤＨおよびアンモニウムイオンの存在下で進行する。したがって、ＮＡＤの再生を同じ系内で進めようとすると、アンモニウムイオンの存在下でＮＡＤをＮＡＤＨに変換する必要がある。反応系の全体像は、下図の通りである。
ＣｔＰｔｘＤによるＮＡＤまたはＮＡＤＰの再生が、具体的な有用物の生産に応用できることを実証した。具体的には、トリメチルピルビン酸を還元アミノ化してＬ－ｔｅｒｔロイシンを生じる反応において、ＣｔＰｔｘＤをＮＡＤＨ再生系として利用した。生成物であるＬ－ｔｅｒｔロイシンは、医薬、化粧品、食品添加物などの製造における重要な中間体である。この反応は、ロイシンデヒドロゲナーゼにより触媒され、ＮＡＤＨおよびアンモニウムイオンの存在下で進行する。したがって、ＮＡＤの再生を同じ系内で進めようとすると、アンモニウムイオンの存在下でＮＡＤをＮＡＤＨに変換する必要がある。反応系の全体像は、下図の通りである。
【0072】
【化1】
【0073】
下記の手順により、高濃度のアンモニウムイオンの存在下において、ＣｔＰｔｘＤの補酵素再生系としての有効性を検討した。
１． ２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮＨ３、２０ｍＭの亜リン酸、８ｍＭのトリメチルピルビン酸、０．１ｍＭのＮＡＤ、１．０Ｕのロイシンデヒドロゲナーゼおよび０．０５ＵのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤを混合し、反応を進めた。反応容量は、０．２ｍＬであった。反応温度は、３７℃であった。
２． 反応開始０分後から２１０分後まで、３０分ごとに２５ｍＬの反応溶液をサンプリングした。
３． サンプル液を、１ＭのＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）と混合した。さらに、３７．６ｍＭの２，４－ジニトロフルオロベンゼン（４０ｍＬ）と混合し、４０℃にて９０分間反応させた。これにより、Ｌ－ｔｅｒｔロイシンを誘導体化した。
４． １ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）を加えて、誘導体化反応を停止させた。
５． 逆相カラム（ODS-80TM, Tosoh, Tokyo, Japan）により、誘導体化したＬ－ｔｅｒｔロイシンを分離した。次に、ＵＶ検出機を装着したＨＰＬＣ（JASCO）により、誘導体化したＬ－ｔｅｒｔロイシンを検出した。移動相は、０．０９５％トリフルオロ酢酸を用いた。溶離液には、８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を用いた。溶離液による勾配形成により、誘導体化したＬ－Ｔｌｅを分離させた。
１． ２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮＨ３、２０ｍＭの亜リン酸、８ｍＭのトリメチルピルビン酸、０．１ｍＭのＮＡＤ、１．０Ｕのロイシンデヒドロゲナーゼおよび０．０５ＵのＣｔＰｔｘＤまたはＲｓＰｔｘＤを混合し、反応を進めた。反応容量は、０．２ｍＬであった。反応温度は、３７℃であった。
２． 反応開始０分後から２１０分後まで、３０分ごとに２５ｍＬの反応溶液をサンプリングした。
３． サンプル液を、１ＭのＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）と混合した。さらに、３７．６ｍＭの２，４－ジニトロフルオロベンゼン（４０ｍＬ）と混合し、４０℃にて９０分間反応させた。これにより、Ｌ－ｔｅｒｔロイシンを誘導体化した。
４． １ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）を加えて、誘導体化反応を停止させた。
５． 逆相カラム（ODS-80TM, Tosoh, Tokyo, Japan）により、誘導体化したＬ－ｔｅｒｔロイシンを分離した。次に、ＵＶ検出機を装着したＨＰＬＣ（JASCO）により、誘導体化したＬ－ｔｅｒｔロイシンを検出した。移動相は、０．０９５％トリフルオロ酢酸を用いた。溶離液には、８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を用いた。溶離液による勾配形成により、誘導体化したＬ－Ｔｌｅを分離させた。
【0074】
【産業上の利用可能性】
【0075】
本発明は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生を伴うバイオプロセスなどに利用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】