特開 2024-117267 ＦＯＸＯ１阻害剤及び筋萎縮の抑制・改善用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024117267

(43)【公開日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ＦＯＸＯ１阻害剤及び筋萎縮の抑制・改善用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4709 20060101AFI20240822BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/44 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4709

A61K31/506

A61K31/44

A61K31/496

A61P43/00 111

A61P21/00

A61P3/10 ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023023269

(22)【出願日】2023-02-17

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業「転写因子ＦＯＸＯ１を標的とした筋萎縮予防のための新規機能性食品の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(71)【出願人】

【識別番号】509349141

【氏名又は名称】京都府公立大学法人

(71)【出願人】

【識別番号】305027401

【氏名又は名称】東京都公立大学法人

(71)【出願人】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100205914

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越 総明

(74)【代理人】

【識別番号】100162189

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越 真弓

(72)【発明者】

【氏名】三浦 進司

(72)【発明者】

【氏名】守田 昭仁

(72)【発明者】

【氏名】浅井 章良

(72)【発明者】

【氏名】亀井 康富

(72)【発明者】

【氏名】眞鍋 康子

(72)【発明者】

【氏名】出口 真次

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086BC17

4C086BC36

4C086BC50

4C086BC82

4C086CB03

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA10

4C086GA12

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA94

4C086ZC35

4C086ZC41

(57)【要約】

【課題】ＦＯＸＯ１の活性を阻害・抑制することのできるＦＯＸＯ１阻害剤を提供する。
【解決手段】本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、デュベルマチニブ（Ｄｕｂｅｒｍａｔｉｎｉｂ）、アルチラチニブ（Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ）、ダヌサチブ（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物を含有する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、デュベルマチニブ（Ｄｕｂｅｒｍａｔｉｎｉｂ）、アルチラチニブ（Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ）、ダヌサチブ（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物を含有することを特徴とするＦＯＸＯ１阻害剤。

【請求項2】

レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）を含有することを特徴とするＦＯＸＯ１阻害剤。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のＦＯＸＯ１阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物。

【請求項4】

前記筋萎縮が、サルコペニア又は廃用性筋萎縮であることを特徴とする、請求項３に記載の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物。

【請求項5】

前記筋萎縮が、二次性サルコペニアであることを特徴とする、請求項３に記載の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物。

【請求項6】

請求項１又は２に記載のＦＯＸＯ１阻害剤を有効成分として含有することを特徴とするＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患の抑制、改善、予防又は治療剤。

【請求項7】

前記ＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患が、筋萎縮又は糖尿病であることを特徴とする請求項６に記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＦＯＸＯ１阻害剤及びそれを含有する筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

骨格筋の萎縮は、主に神経原性、筋原性及び廃用性の３タイプに分類されているが、近年、加齢による筋萎縮が注目されている。加齢による筋萎縮とは、加齢に伴って少しずつゆっくりと筋肉の量が減少する現象であり、筋萎縮に係る分子機構も上述した３タイプとは異なることが明らかにされている。廃用性や加齢による筋萎縮（サルコペニア）が原因となる運動機能の低下は、ロコモティブシンドロームやフレイルの主要な原因となっているとともに、代謝障害や感染症の合併頻度を高めるなど、生活の質のみならず原疾患の予後をも悪化させる。そのため、超高齢化社会を迎えるにあたり、サルコペニアの予防、抑制、改善又は治療方法の確立は、喫緊の医学的課題である。

【0003】

サルコペニアによる筋萎縮は、加齢に伴う一次性サルコペニアと、不活動、疾病又は薬物の副作用等による二次性サルコペニアとに大別される。このうち、超高齢社会においては、運動機能の衰え、すなわち不活動による二次性サルコペニアも問題視されている。これまで運動機能の維持には、運動トレーニングや適切な栄養素摂取が重要とされてきた。しかし、栄養療法は一貫した有効性が証明されておらず、運動療法については高い脱落率が問題となっている。さらに、わが国において二次性サルコペニアを適応症とする薬剤は存在していない。

【0004】

他方、ＦＯＸＯ１（Forkhead box-containing protein O1）は、ＤＮＡ結合モチーフを形成するフォークヘッドボックスを有するフォークヘッド型転写因子である。ＦＯＸＯ１は、胞巣型横紋筋肉腫において、Ｐａｘ３遺伝子又はＰａｘ７遺伝子と融合する遺伝子転座を起こし、ＦＯＸＯ１－Ｐａｘ３又はＦＯＸＯ１－Ｐａｘ７の融合タンパク質を生ずる遺伝子として同定された。このことから、ＦＯＸＯ１が骨格筋機能に何らかの役割を担っていることが推察された。また、線虫では、ＦＯＸＯ１のオーソログであるＤＡＦ－１６が寿命延長に必須の遺伝子であり、老化・寿命に関与すること、インスリンによる同化作用と拮抗し、代謝反応とも関連していること等が明らかとなっている。

【0005】

発明者らは、廃用性筋萎縮のように、物質の異化反応が亢進することによって引き起こされる筋萎縮には、遺伝子の発現調節が関連していると想定し、骨格筋萎縮モデル（絶食、１型糖尿病、不活動状態）において発現量が変化する転写因子を探索したところ、ＦＯＸＯ１の発現量が骨格筋の萎縮と連動して増加することを見出した（非特許文献１）。そこで、ＦＯＸＯ１が実際に骨格筋萎縮を引き起こすか否か検討するため、骨格筋特異的ＦＯＸＯ１過剰発現マウスを作出したところ、筋タンパク質分解の促進と、廃用性筋萎縮様の症状を認めた（非特許文献２）。

【0006】

さらに、薬物の副作用による骨格筋萎縮である、グルココルチコイド療法に伴う副作用「ステロイド筋症」や、スタチン系薬剤とフィブレート系薬剤の併用による副作用「横紋筋融解症」においても、骨格筋でのＦＯＸＯ１発現増加による筋萎縮が関与することが示されている（非特許文献３、非特許文献４）。また、骨格筋特異的なＦＯＸＯファミリー欠損マウスは、１型糖尿病による筋萎縮が抑制されること（非特許文献５）、ドミナントネガティブＦＯＸＯ１発現による骨格筋ＦＯＸＯ１活性の抑制により、がん悪液質モデルにおける骨格筋量の減少および筋機能低下が抑制されること（非特許文献６、非特許文献７）も報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】FEBS Letters, 2003年, Vol. 536, pp. 232-236

【非特許文献2】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2004年, Vol. 279, No. 39, pp. 41114-41123

【非特許文献3】Cell Metabolism, 2011年, Vol. 13, pp. 170-182,

【非特許文献4】The Journal of Toxicological Sciences, 2021年, Vol. 46, No. 1, pp. 11-24

【非特許文献5】Diabetes, 2019年, Vol. 68, pp. 556-570

【非特許文献6】Cancer Gene Therapy, 2007年, Vol. 14, pp. 945-952

【非特許文献7】The FASEB Journal, 2012年, Vol. 26, No. 3, pp. 987-1000

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述の研究報告によれば、ＦＯＸＯ１の発現増加、すなわちＦＯＸＯ１の活性化が、不活動、疾病又は薬物の副作用等に起因する二次性サルコペニアの発症に関与することが示されている。これらのことから、ＦＯＸＯ１の活性を抑制・阻害することが、寝たきりやベッドレストによる不活動（廃用性）筋萎縮、インスリン機能不全による筋萎縮、１型糖尿病による筋萎縮、グルココルチコイドや脂質異常症改善薬の副作用による筋萎縮、がん悪液質により誘発される筋萎縮等といった二次性サルコペニアの抑制、改善、予防又は治療に有効であることが示唆される。それゆえ、ＦＯＸＯ１の働きを阻害することを作用点とした、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療に資する薬剤が求められている。

【0009】

したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、ＦＯＸＯ１の活性を阻害することのできるＦＯＸＯ１阻害剤を提供することにある。

【0010】

また、本発明の他の目的は、ＦＯＸＯ１の活性を阻害することを作用点とした、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、ＦＯＸＯ１の活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法及びこのスクリーニング方法で得られたヒット化合物の筋萎縮の抑制・改善効果を評価するオリジナルの試験方法を確立した。この試験方法を用いて、化合物ライブラリーより選択した化合物、約３００種についてスクリーニングを行い、ヒット化合物について筋萎縮の抑制・改善効果の評価を行った。この結果、ＦＯＸＯ１活性を阻害する化合物及び筋萎縮を抑制・改善する化合物を見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。

【0012】

上記課題を解決するため、本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、デュベルマチニブ（Ｄｕｂｅｒｍａｔｉｎｉｂ）、アルチラチニブ（Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ）、ダヌサチブ（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物を含有する。

【0013】

上述した化合物を用いることにより、ＦＯＸＯ１の活性を抑制・阻害することができる。これにより、ＦＯＸＯ１活性が関与する病態、症状又は疾患を抑制、改善、予防又は治療するための医薬や、ＦＯＸＯ１の機能解明のための研究開発にこれらの化合物を用いることができる。

【0014】

また、本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）を含有する。これにより、優れた抑制・阻害効果を有するＦＯＸＯ１阻害剤が得られる。

【0015】

また、本発明の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物は、上述したＦＯＸＯ１阻害剤を有効成分として含有することも好ましい。これにより、ＦＯＸＯ１活性を阻害することを作用点とした、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物が得られる。

【0016】

また、本発明の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物に関し、筋萎縮が、サルコペニア又は廃用性筋萎縮であることも好ましい。これにより、ＦＯＸＯ１の活性を阻害することを作用点とした、サルコペニア又は廃用性筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物が得られる。

【0017】

また、本発明の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物に関し、筋萎縮が、二次性サルコペニアであることも好ましい。これにより、ＦＯＸＯ１の活性を阻害することを作用点とした、二次性サルコペニアの抑制、改善、予防又は治療用組成物が得られる。

【0018】

また、本発明のＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患の抑制、改善、予防又は治療剤は、上述したＦＯＸＯ１阻害剤を有効成分として含有する。これにより、ＦＯＸＯ１活性を阻害することを作用点とした、ＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患を抑制、改善、予防又は治療するための剤が得られる。

【0019】

また、本発明のＦＯＸＯ１が関与する病態等の抑制、改善、予防又は治療剤に関し、ＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患が、筋萎縮又は糖尿病であることも好ましい。これにより、筋萎縮又は糖尿病を抑制、改善、予防又は治療するための剤が得られる。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、以下の効果を有する。
（１）ＦＯＸＯ１の活性を阻害するＦＯＸＯ１阻害剤を得ることができる。
（２）ＦＯＸＯ１活性を阻害することを作用点とした、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物を得ることができる。
（３）ＦＯＸＯ１の活性が関与する病態、症状又は疾患を抑制、改善、予防又は治療するための剤を得ることができる。
（４）サルコペニア又は廃用性筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物を得ることができる。
（５）二次性サルコペニアの抑制、改善、予防又は治療用組成物を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】実施例１における、（Ａ）ＦＯＸＯ１活性を阻害する化合物のスクリーニング結果を示すグラフ及び（Ｂ）レバスチニブの濃度依存的ＦＯＸＯ１阻害活性を示すグラフである。

【図2】実施例２における、（Ａ）パルス－チェイス分析の試験方法を示す説明図、（Ｂ）培養２４時間後の細胞内タンパク質中の^３５Ｓ－メチオニン残量を示すグラフ、及び（Ｃ）培養４８時間後の細胞内タンパク質中の^３５Ｓ－メチオニン残量を示すグラフである。

【図3】実施例３における、（Ａ）Ｃ２Ｃ１２骨格筋細胞の免疫蛍光染色結果を示す写真及び（Ｂ）免疫蛍光染色された細胞の筋管直径の測定結果を示すグラフである。

【図4】実施例４における、グルココルチコイド誘発性筋萎縮モデル細胞の筋張力測定結果を示すグラフである。

【図5】実施例５における、がん悪液質誘発性筋萎縮モデル細胞の筋張力測定結果を示すグラフである。

【図6】実施例６におけるＦＯＸＯ１標的遺伝子発現分析の結果を示すグラフであり、（Ａ）ＦＯＸＯ１ ｍＲＮＡ、（Ｂ）ＦＯＸＯ３ａ ｍＲＮＡ、（Ｃ）ａｔｒｏｇｉｎ－１ ｍＲＮＡ及び（Ｄ）Ｇａｄｄ４５ ｍＲＮＡの遺伝子発現結果を示すグラフである。

【図7】実施例７における、タンパク質発現分析の結果を示し、（Ａ）ウェスタンブロットの結果を示す写真並びに（Ｂ）ＦＯＸＯ１タンパク質、（Ｃ）ＦＯＸＯ３ａタンパク質及び（Ｄ）ａｔｒｏｇｉｎ－１タンパク質の発現レベルを示すグラフである。

【図8】実施例８における、タンパク質発現分析の結果を示し、（Ａ）ウェスタンブロットの結果を示す写真、（Ｂ）リン酸化ＦＯＸＯ１（ｐＦＯＸＯ１）タンパク質の発現レベル、（Ｃ）総ＦＯＸＯ１タンパク質の発現レベル及び（Ｄ）総ＦＯＸＯ１に対するｐＦＯＸＯ１のタンパク質発現レベルの比率を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明のＦＯＸＯ１阻害剤について詳細に説明する。本発明におけるＦＯＸＯ１とは、ＦＯＸＯファミリーに属するフォークヘッド型転写因子である。ＦＯＸＯ１は骨格筋の萎縮に関与するほか、インスリンによる同化作用と拮抗し、代謝反応等とも関与することが報告されている。このうち、骨格筋の萎縮に関しては、ＦＯＸＯ１が廃用性筋萎縮やがん悪液質誘発性筋萎縮、グルココルチコイド等の薬物誘発性筋萎縮に関与していることが報告されている。そのため、ＦＯＸＯ１の活性を阻害する化合物は、運動不足や何らかの疾患によって引き起こされる二次的な筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療に有用であると考えられる。

【0023】

本発明におけるＦＯＸＯ１阻害とは、ＦＯＸＯ１の活性を抑制・阻害することをいい、本発明のＦＯＸＯ１阻害剤を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、ＦＯＸＯ１活性が抑制されていることを意味する。より具体的にはＦＯＸＯ１阻害とは、例えば、ＦＯＸＯ１タンパク質分解の促進、ＦＯＸＯ１タンパク質発現レベルの抑制、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現レベルの抑制、ＦＯＸＯ１転写活性の抑制又はＦＯＸＯ１標的遺伝子の遺伝子発現若しくはタンパク質発現レベルの抑制等も含まれる概念である。ここで、本明細書におけるＦＯＸＯ１の活性とは、ＦＯＸＯ１は転写因子であるのでＦＯＸＯ１の転写活性は当然に含まれるが、これに限定されず、ＦＯＸＯ１の働き（作用）や機能全般をいうものとする。また、ＦＯＸＯ１活性は、一例として、後述する実施例１に記載のレポーターアッセイにより容易に測定することが可能である。

【0024】

本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、デュベルマチニブ（Ｄｕｂｅｒｍａｔｉｎｉｂ）、アルチラチニブ（Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ）、ダヌサチブ（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物を含有している。上述した化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。これらの化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、これらの化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。

【0025】

上述した化合物のうち、レバスチニブは、以下化学式に示す化合物（ＣＡＳ番号：１０２０１７２－０７－９）であり、チロシンキナーゼ阻害活性を有する化合物である。後述する実施例１に示すように、レバスチニブはＦＯＸＯ１活性を最も強く阻害しており、優れた阻害作用を有している。さらに、後述する実施例２～８に示すように、レバスチニブはグルココルチコイド誘発性筋萎縮を抑制し、筋収縮力の低下を改善する効果を有するほか、がん悪液質誘発性筋萎縮を抑制し、筋収縮力の低下を改善する効果を有している。このことより、レバスチニブは筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療のために用いることができ、特に、不活動、疾病又は薬物の副作用等による廃用性筋萎縮及び二次性サルコペニアの抑制、改善、予防又は治療のために用いることができる。

【0026】

【化1】

【0027】

また、デュベルマチニブ（ＣＡＳ番号：１３４１２００－４５－０）、アルチラチニブ（ＣＡＳ番号：１３４５８４７－９３－９）、ダヌサチブ（ＣＡＳ番号：８２７３１８－９７－８）及びダサチニブ（ＣＡＳ番号：３０２９６２－４９－８）もいずれもプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物であり、後述する実施例１に示すように、ＦＯＸＯ１活性を阻害する優れた作用を有している。そのため、これら化合物についても、レバスチニブ同様に筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療のために用いられ得る。

【0028】

上述した化合物は、市販されている化合物を用いることも、公知の合成方法で製造して得た化合物を用いることも可能である。

【0029】

本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、上述した化合物、すなわち、レバスチニブ、デュベルマチニブ、アルチラチニブ、ダヌサチブ又はダサチニブを含むものであって、ＦＯＸＯ１活性を阻害する作用を有する。ＦＯＸＯ１阻害剤には、これらの化合物のうちの少なくとも１種が含有されるが、２種以上を組み合わせて含有させることも可能である。また、本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、ＦＯＸＯ１タンパク質分解の促進作用、ＦＯＸＯ１タンパク質発現レベルの抑制作用、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現レベルの抑制作用、ＦＯＸＯ１転写活性の抑制作用、ＦＯＸＯ１標的遺伝子の遺伝子発現又はタンパク質発現レベルの抑制作用の少なくともいずれか１つの作用を有するものであることが好ましく、ＦＯＸＯ１タンパク質分解の促進作用、ＦＯＸＯ１タンパク質発現レベルの抑制作用又はＦＯＸＯ１標的遺伝子の発現レベルの抑制作用を有するものであることがさらに好ましい。本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、ＦＯＸＯ１が関与する様々な機能の解明等を目的とした研究用試薬として用いることができるほか、後述するように、ＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患の抑制、改善、予防又は治療のために使用することができる。本発明に係るＦＯＸＯ１阻害剤の使用濃度としては、適用する細胞、ＦＯＸＯ１発現レベルや目標とする阻害効果に応じて適宜調整可能であるが、一例として、レバスチニブをＦＯＸＯ１阻害剤の有効成分として含有させた場合には、レバスチニブとして０．０１μＭ～１００μＭ程度を使用することが好ましく、０．１μＭ～１０μＭ程度を使用することがより好ましい。

【0030】

また、本発明の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物は、上述したＦＯＸＯ１阻害剤を有効成分として含有している。ＦＯＸＯ１阻害剤にはレバスチニブ、デュベルマチニブ、アルチラチニブ、ダヌサチブ又はダサチニブのうち、少なくとも１種の化合物を用いることができ、２種以上の化合物を組み合わせて用いることも可能である。これらの化合物のうち、レバスチニブが特に好ましく用いられ得る。また、本発明の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物は、ＦＯＸＯ１活性を阻害することを作用点としたものであり、ＦＯＸＯ１活性の阻害に係る作用点は、ＦＯＸＯ１タンパク質分解の促進作用、ＦＯＸＯ１タンパク質発現レベルの抑制作用、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現レベルの抑制作用、ＦＯＸＯ１転写活性の抑制作用、ＦＯＸＯ１標的遺伝子の遺伝子発現又はタンパク質発現レベルの抑制作用の少なくともいずれか１つであることが好ましく、ＦＯＸＯ１タンパク質分解の促進作用、ＦＯＸＯ１タンパク質発現レベルの抑制作用又はＦＯＸＯ１標的遺伝子の発現レベルの抑制作用であることがさらに好ましい。それゆえ、本発明のレバスチニブ、デュベルマチニブ、アルチラチニブ、ダヌサチブ又はダサチニブを含有するＦＯＸＯ１阻害剤によって、筋萎縮に関与するＦＯＸＯ１の活性が阻害されることにより、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療を行うことができる。

【0031】

本発明に係る筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物は、筋萎縮のうち、不活動、疾病又は薬物の副作用等による廃用性筋萎縮及び二次性サルコペニアに対し有用であり、特に、疾病又は薬物の副作用による二次性サルコペニアに対しさらに有用である。二次性サルコペニアには、寝たきりやベッドレスト等の不活動による筋萎縮、インスリン機能不全による筋萎縮、１型糖尿病による筋萎縮、グルココルチコイドや脂質異常症改善薬の副作用による筋萎縮、がん悪液質により誘発される筋萎縮等が含まれる。本発明の筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物は、ヒト又は動物のための医薬品、医薬部外品及び食品として用いることができる。食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含まれる。

【0032】

また、本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、ＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患の抑制、改善、予防又は治療のための剤として用いることができる。ＦＯＸＯ１活性が関与する病態、症状又は疾患には、筋萎縮、糖尿病又はこれらに関連する疾患が含まれる。本発明のＦＯＸＯ１阻害剤は、これらの病態、症状又は疾患の１つ又は複数に対する抑制、改善、予防又は治療等のために用いられる。本発明のＦＯＸＯ１が関与する病態、症状又は疾患の抑制、改善、予防又は治療剤は、ヒト又は動物のための医薬品、医薬部外品及び食品として用いることができ、このうち食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含まれる。

【0033】

本発明に係るＦＯＸＯ１阻害剤及び筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物を、医薬品又は医薬部外品として用いる場合には、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の薬理学的に許容される担体や賦形剤、滑沢剤、分散剤、崩壊剤、緩衝剤、溶剤、増量剤、保存剤、香料又は安定化剤など、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。さらに、この化合物のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、リポソーム製剤、微粉末化又はシクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。

【0034】

本発明に係るＦＯＸＯ１阻害剤及び筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物を、経口投与製剤として用いる場合には、錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等の形態で用いることができるが、消化管からの吸収に適した形態で用いることが好ましい。また、流通性、保存性などの理由により所望される形態での製剤を提供する場合にも従来の製剤技術を用いることができる。また、外用剤等の非経口投与剤として用いる場合には、クリーム、軟膏、貼付剤などの経皮吸収剤のほか、注射剤および坐剤等の形態とすることができる。また、流通性や保存性などの理由から固形製剤を使用時に適当な溶剤で溶解してから用いることもでき、液剤および半固形剤の形態で提供することも従来の製剤技術により可能である。

【0035】

本発明に係るＦＯＸＯ１阻害剤及び筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物の投与量又は有効摂取量は、目標とする治療効果、投与方法、投与対象及び剤形によって変化するため、特に限定されないが、一日の経口投与量としては、例えば、有効成分である各化合物の量として約０．０１μｇ／６０ｋｇ体重～約３０ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、好ましくは、０．０５μｇ／６０ｋｇ体重～約１０ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、これを１～３回に分割して投与することが好ましい。また、一日の非経口的な投与量としては、例えば、有効成分である各化合物の量として約０．０１μｇ／６０ｋｇ体重～１０ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、好ましくは約０．０３μｇ／６０ｋｇ体重～５ｍｇ／６０ｋｇ体重が好ましい。

【0036】

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。

【実施例0037】

［実施例１］
１．ＦＯＸＯ１活性を阻害する化合物のスクリーニング
本実施例では、ＦＯＸＯ１活性を阻害する化合物の探索を行った。スクリーニング対象として、化合物ライブラリーからプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物を選択し、２７０種類の化合物についてスクリーニングを行った。詳細には、ＦＯＸＯ１活性を阻害する化合物のスクリーニングを行うために、次のようなレポーターアッセイを行った。ＦＯＸＯ１とＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域の融合タンパク質（ＧＡＬ４－ＦＯＸＯ１）を細胞内に導入すると、ルシフェラーゼ遺伝子上流のＧＡＬ４結合領域ＵＡＳにＧＡＬ４－ＦＯＸＯ１が結合し、ＦＯＸＯ１の転写活性によりルシフェラーゼが発現する。このレポーターアッセイを利用して、どのような化合物がＦＯＸＯ１の活性を阻害するかスクリーニングした。

【0038】

具体的には、細胞はヒト胚性腎臓細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養には、Ｌ－グルタミン及びフェノールレッドを含むＤ－ＭＥＭ（高グルコース）培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢを添加したものを用い、５％ＣＯ_２通気下、３７℃で培養した。また、プラスミドは、ルシフェラーゼレポータープラスミドであるｐＧＬ４．３５（ルシフェラーゼレポーターｌｕｃ２ｐ“合成ホタルルシフェラーゼ”の上流にＧＡＬ４認識配列であるＵＡＳを組み込んだプラスミド）、ｐＭ－ＦＯＸＯ１（ＧＡＬ４－ＦＯＸＯ１融合タンパク質発現プラスミド）、ｐＮＬ１．１ＰＧＫベクター（コントトールのルシフェラーゼ、補正用ベクター）を用いた。また、スクリーニング対象としたプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社等から購入した。

【0039】

まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに３．２×１０^４個／ウェルとなるよう播種した。このＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、遺伝子導入試薬（リポフェクタミン（登録商標）３０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製品）を用いて、上述したプラスミドｐＧＬ４．３５（２５ｎｇ／ウェル）、ｐＭ－ＦＯＸＯ１（２５ｎｇ／ウェル）及びｐＮＬ１．１ＰＧＫ（０．２ｎｇ／ウェル）をコトランスフェクションした。２４時間培養した後、スクリーニング対象の各化合物をＤＭＳＯに溶解させ、各化合物の液体培地中の最終濃度が０．１％となるように、各ウェルに添加した。また、ＤＭＳＯのみをウェルに添加し、溶媒対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。各化合物を添加してから２４時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。測定には、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社製品）及びＬｕＭａｔｅ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ａｗａｒｅｎｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製品）を用いた。ルシフェラーゼ活性は、コントロールのルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比率として算出した。試験結果のうち、有意にＦＯＸＯ１活性を阻害することが見出された化合物５種と他の化合物の一部の結果を図１（Ａ）のグラフに示す（ｎ＝４、平均値±標準誤差）。横軸は化合物を、縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示す。図１（Ａ）のグラフ中の＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

【0040】

この結果によれば、レバスチニブ（Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、デュベルマチニブ（Ｄｕｂｅｒｍａｔｉｎｉｂ）、アルチラチニブ（Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ）、ダヌサチブ（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）にＦＯＸＯ１活性の阻害作用があることがわかった。このうち、レバスチニブ、デュベルマチニブ及びアルチラチニブには特に優れたＦＯＸＯ１活性の阻害作用が認められ、最も高い阻害作用を示す化合物として、レバスチニブが見出された。

【0041】

そこで、最も高い阻害作用を示したレバスチニブについて、濃度依存的にＦＯＸＯ１活性を阻害するか否かについて、上述と同様の方法で試験を行った。また、陽性対照として、公知のＦＯＸＯ１阻害剤であるＡＳ１７０８７２７及びＡＳ１８４２８５６を用いて同様の試験を行った。なお、ＡＳ１８４２８５６はＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入したものを使用したが、ＡＳ１７０８７２７は公知の合成方法（J Med Chem., Vol. 41 pp.4587-4598）により製造したものを使用した。試験結果を図１（Ｂ）に示す（ｎ＝３、平均値±標準誤差）。横軸は化合物の添加濃度を、縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示す。

【0042】

この結果によれば、レバスチニブは濃度依存的にＦＯＸＯ１活性を抑制した。レバスチニブのＩＣ_５０は０．５９３（μＭ）であった。他方、ＡＳ１７０８７２７のＩＣ_５０は４．５１９（μＭ）であり、ＡＳ１８４２８５６のＩＣ_５０は６１．４４（μＭ）である。レバスチニブのＩＣ_５０はＡＳ１７０８７２７の約７分の１、ＡＳ１８４２８５６の約１０３分の１であり、レバスチニブには非常に優れたＦＯＸＯ１活性の阻害作用があることが明らかとなった。

【0043】

［実施例２］
２．培養骨格筋細胞を用いた筋萎縮抑制効果の検討（１）
本実施例では、上記実施例１において、ＦＯＸＯ１活性を強く阻害することが見出されたレバスチニブについて、グルココルチコイド投与により誘発される筋萎縮を抑制するかどうか、検討を行った。詳細には、マウス骨格筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を筋管細胞に分化後、合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で処理し、レバスチニブを投与した群と投与しなかった群とで、Ｃ２Ｃ１２細胞のタンパク質分解量に変化があるかどうか、パルス－チェイス分析により調べた。

【0044】

具体的には、試験は次のようにして行った。図２（Ａ）に示すように、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を筋管細胞に分化誘導するために、実施例１で用いたＤ－ＭＥＭ（高グルコース）培地組成のうち、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を２％ウマ血清（ＨＳ）に替えた分化培地を調製し、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を４日間培養した。なお、分化培地は２４時間毎に交換した。分化後のＣ２Ｃ１２筋管細胞を、Ｌ－［^３５Ｓ］－メチオニン（３７ｋＢｑ／ｍＬ／ウェル、製品コード：ＮＥＧ００９Ａ、株式会社パーキンエルマージャパン）を添加したＤ－ＭＥＭ（グルタミン、メチオニン及びシステインは非含有、高グルコース）培地で１時間インキュベートし、細胞にＬ－［^３５Ｓ］－メチオニンを取り込みさせた。１時間後、細胞をＤ－ＭＥＭ（グルタミン、メチオニン及びシステインは非含有、高グルコース）培地ですすいで洗浄した。その後、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞を、０．３ｍｇ／ｍＬの非標識のメチオニン、１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び１μＭのレバスチニブを添加したＤ－ＭＥＭ（グルタミン、メチオニン及びシステインは非含有、高グルコース）培地で２４時間又は４８時間培養した（Ｄｅｘ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、デキサメタゾン及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、デキサメタゾンを添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにデキサメタゾンのみを添加した培地（Ｄｅｘ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に２４時間又は４８時間培養を行った。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。２４時間及び４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含有させた細胞可溶化試薬（ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で培養液をホモジナイズして、Ｃ２Ｃ１２細胞のタンパク質を抽出した。抽出した細胞ライセート中の［^３５Ｓ］－メチオニンの残留量を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。

【0045】

培養２４時間の結果を図２（Ｂ）に、培養４８時間の結果を図２（Ｃ）に示す（ｎ＝３、平均値±標準誤差）。放射線量は、デキサメタゾン及びレバスチニブを添加していないコントロール（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）の放射線量に対する比率として算出しており、グラフの縦軸は相対的放射線量を示している。Ｃｏｎｔはデキサメタゾンを添加していない対照群を示し、Ｄｅｘはデキサメタゾンを添加した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。図２（Ｃ）のグラフ中の＊＊はｐ＜０．００１、＊はｐ＜０．０５を示す。

【0046】

この結果によれば、レバスチニブ非添加の対照群及び試験群間において、デキサメタゾン処理による細胞内タンパク質分解は、培養２４時間では有意な差は見られなかったが、培養４８時間ではデキサメタゾン処理によって細胞内タンパク質中の^３５Ｓ－メチオニン量が有意に減少しており（ｐ＝０．０１０）、細胞内タンパク質分解が増加傾向にあることが示された。そこで、培養４８時間でのレバスチニブを添加した対照群及び試験群をみると、デキサメタゾン処理の有無に関わらず、レバスチニブを添加していない溶媒対照と比べて細胞内タンパク質中の^３５Ｓ－メチオニン量が有意に増加しており（ｐ＝０．００２）、細胞内タンパク質分解が抑制されることが示された。これらのことから、デキサメタゾンは細胞内タンパク質分解を促進させたが、レバスチニブはそのタンパク質分解を抑制したことが明らかとなった。

【0047】

［実施例３］
３．培養骨格筋細胞を用いた筋萎縮抑制効果の検討（２）
本実施例においても、実施例２と同様に、レバスチニブがグルココルチコイド投与により誘発される筋萎縮を抑制するかどうか、検討を行った。本実施例では、骨格筋の主要な構造タンパク質であるミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）に着目し、Ｃ２Ｃ１２骨格筋細胞中のＭｙＨＣを免疫蛍光染色して、その直径を測定することにより筋細胞の萎縮について調べた。

【0048】

具体的には、試験は次のようにして行った。上記実施例２と同様の材料及び方法で分化誘導されたＣ２Ｃ１２筋管細胞に対し、１μＭのレバスチニブ及び１μＭのデキサメタゾンを添加し、４８時間培養を行った（Ｄｅｘ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、デキサメタゾン及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、デキサメタゾンを添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにデキサメタゾンのみを添加した培地（Ｄｅｘ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に４８時間培養を行った。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。培養後、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で細胞膜透過処理した。固定した筋管細胞を３％ＢＳＡで６時間インキュベートし、非特異的反応を防ぐためのブロッキング処理を行った。その後、一次抗体として抗ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ、ＭＦ２０、Developmental Studies Hybridoma Bank）を３％ＢＳＡに添加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａ－２１１４４、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製品）を添加し、１時間インキュベートした。引き続いて、対比染色のため、ＤＡＰＩ（＃４０８３、セルシグナリングテクノロジー社製品）を添加し、核を染色した。筋管細胞の観察には、蛍光顕微鏡（ライカマイクロシステムズ株式会社製品）を用い、１００倍の倍率で観察した。その結果を図３（Ａ）に示す。また、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（http://imagej.nih.gov/ij/）を用い、ランダムに選択した６つの視野から合計１２０個（２０個／視野）の免疫蛍光染色された筋管の直径（μｍ）を測定した。その結果を図３（Ｂ）のグラフに示す（ｎ＝３、平均値±標準誤差）。Ｃｏｎｔはデキサメタゾンを添加していない対照群を示し、Ｄｅｘはデキサメタゾンを添加した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。図３（Ｂ）のグラフ中の＊はｐ＜０．０５を示す。

【0049】

これらの結果によれば、レバスチニブ非添加の対照群及び試験群間において、デキサメタゾン処理によって筋管細胞径は有意に減少しており、デキサメタゾン処理により筋萎縮が促進されることが示された。これに対し、レバスチニブを添加した試験群では、デキサメタゾン処理されているにもかかわらず、コントロールと同程度まで筋管細胞径が回復していることが示された。このことから、デキサメタゾンは筋萎縮を促進させたが、レバスチニブはこの筋萎縮を抑制することがわかった。

【0050】

［実施例４］
４．マウス筋サテライト細胞由来骨格筋細胞を用いた骨格筋収縮力の改善効果の検討
上述した実施例では、レバスチニブがグルココルチコイド投与により誘発される筋萎縮を抑制することが明らかとなった。そこで、さらなる評価を得るため、本実施例では、レバスチニブがグルココルチコイド投与により誘発される筋萎縮を抑制することにより、骨格筋収縮力の低下を改善させることができるかどうか、検討を行った。詳細には、デキサメタゾン存在下で培養したマウス筋サテライト細胞由来骨格筋細胞において、レバスチニブが筋萎縮を抑制することにより、骨格筋収縮力を回復させるかどうか、シリコーン上に培養した培養骨格筋の収縮力をシワで評価する筋張力測定方法（Scientific reports, Vol.12：13818、特許第７１４０３２８号等参照）により調べた。

【0051】

具体的には、試験は次のようにして行った。上述した筋張力測定方法に基づき、カバーガラスに塗布したシリコーンにプラズマ照射を行った後、細胞を接着させるためのマトリゲルを塗布してシリコーン基板を調製した。常法に基づき、マウス骨格筋をコラゲナーゼ処理した後、単一筋線維に付着しているサテライト細胞を得た。得られたサテライト細胞をシリコーン基板に播種し、筋管細胞に分化誘導した。分化誘導開始から５日目の培養細胞に、１μＭのレバスチニブ及び１００μＭのデキサメタゾンを添加し、４８時間培養を行った（Ｄｅｘ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、デキサメタゾン及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、デキサメタゾンを添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにデキサメタゾンのみを添加した培地（Ｄｅｘ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に４８時間培養を行った。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。これら処理を行った後、筋管細胞に１Ｈｚ、２０ｍＡの条件の電気刺激を２０ｍｓ付与し、インターバル９８０ｍｓで繰返し同条件での電気刺激を与えて筋管細胞を電気的に収縮させた。収縮時に生じるシリコーン膜のシワの長さは、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて計測して線形化処理した。線形化処理されたチャートにおいて、連続した収縮３回分の曲線下面積を、筋収縮の大きさを示すフォースインデックスとして求めた。

【0052】

結果を図４のグラフに示す（ｎ＝８、平均値±標準誤差）。グラフ縦軸のフォースインデックスは、デキサメタゾン及びレバスチニブを添加していないコントロール（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）の値に対する比率として示している。Ｃｏｎｔはデキサメタゾンを添加していない対照群を示し、Ｄｅｘはデキサメタゾンを添加した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。図４のグラフ中の＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

【0053】

この結果によれば、レバスチニブ非添加の対照群及び試験群間において、細胞をデキサメタゾンで４８時間処理すると、フォースインデックスは対照群の４５％にまで減少し、筋収縮力が大きく弱まることが示された。これに対し、レバスチニブを投与した試験群ではフォースインデックスの減少率を２４％まで抑えることが明らかとなった。

【0054】

［実施例５］
５．がん悪液質誘発性筋萎縮モデル細胞を用いた筋収縮力の改善効果の検討
上述した実施例では、グルココルチコイド投与により誘発される筋萎縮の抑制又は改善効果について検討を行ってきたが、本実施例では、がん悪液質により誘発される筋萎縮についても、レバスチニブが抑制・改善できるかどうか、検討を行った。本実施例では、筋萎縮を誘発するがん悪液質として、ルイス肺癌由来細胞（ＬＬＣ）の培養液を用いた。

【0055】

具体的には、試験は次のようにして行った。ルイス肺癌由来細胞（ＬＣＣ）をＤ－ＭＥＭ（高グルコース）培地に１０％ウマ血清（ＨＳ）を加えた培地で培養し、培養上清を得た。実施例４と同様の材料及び方法により、マウス筋サテライト細胞をシリコーン基板で分化誘導させた後、実施例４でのデキサメタゾンの替わりに、ルイス肺癌由来細胞の培養上清を用いて４日間培養を行った。培養２日目に１μＭのレバスチニブを培地に添加した（ＬＬＣ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、ＬＬＣ培養上清及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＬＬＣ培養上清を添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにＬＬＣ培養上清のみを添加した培地（ＬＬＣ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に４日間培養を行った。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。これら処理を行った後、実施例４と同様にして、筋収縮の大きさを示すフォースインデックスを求めた。

【0056】

結果を図５のグラフに示す（ｎ＝８、平均値±標準誤差）。グラフ縦軸のフォースインデックスは、ＬＬＣ培養上清及びレバスチニブを添加していないコントロール（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）の値に対する比率として示している。ＣｏｎｔはＬＬＣ培養上清で処理していない対照群を示し、ＬＬＣはＬＬＣ培養上清で処理した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。図５のグラフ中の＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊はｐ＜０．０１を示す。

【0057】

この結果によれば、レバスチニブ非添加の対照群及び試験群間において、細胞をルイス肺癌由来細胞の培養上清で処理し、がん悪液質（カヘキシア）誘導性筋萎縮モデル細胞とすると、フォースインデックスは対照群の６９％にまで減少し、筋収縮力が大きく弱まることが示された。これに対し、レバスチニブを投与した試験群ではフォースインデックスの減少率を３０％にまで抑えることが明らかとなった。

【0058】

上述した実施例の結果より、レバスチニブはＦＯＸＯ１活性を強く阻害する作用を有すること、グルココルチコイド投与により誘発される筋萎縮を抑制し、筋収縮力の低下を改善する効果を有すること、がん悪液質により誘発される筋収縮力の低下を改善する効果を有することが示された。このことより、レバスチニブは筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療のために用いることができ、特に、不活動、疾病又は薬物の副作用等による二次性サルコペニアの抑制、改善、予防又は治療のために用いることができることが明らかとなった。

【0059】

［実施例６］
６．レバスチニブがＦＯＸＯ１標的遺伝子発現に与える影響の検討
本実施例では、レバスチニブの作用機序を探るため、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞をデキサメタゾン及びレバスチニブで処理した際の遺伝子発現解析を行い、レバスチニブがグルココルチコイドによるＦＯＸＯ１標的遺伝子発現を抑制するかどうかを検討した。解析対象の遺伝子は、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、筋組織特異的ユビキチンリガーゼであるａｔｒｏｇｉｎ－１及びＧａｄｄ４５とした。具体的には、試験は次のようにして行った。上記実施例２と同様の材料及び方法で分化誘導されたＣ２Ｃ１２筋管細胞に対し、１μＭのレバスチニブ及び１μＭのデキサメタゾンを添加し、２４時間培養を行った（Ｄｅｘ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、デキサメタゾン及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、デキサメタゾンを添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにデキサメタゾンのみを添加した培地（Ｄｅｘ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に２４時間培養を行った。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。培養後、細胞からトータルＲＮＡを単離し、トータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、以下表１に示すプライマーを用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。各遺伝子の発現量は３６Ｂ４の発現量に基づき標準化した。

【0060】

結果を図６に示す（ｎ＝３、平均値±標準誤差）。グラフ縦軸の相対的発現レベルは、デキサメタゾン及びレバスチニブを添加していないコントロール（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）の値に対する比率として示している。Ｃｏｎｔはデキサメタゾンを添加していない対照群を示し、Ｄｅｘはデキサメタゾンを添加した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。図７のグラフ中の＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を示す。

【0061】

【表1】

【0062】

図６（Ａ）がＦＯＸＯ１、図６（Ｂ）がＦＯＸＯ３ａ、図６（Ｃ）がａｔｒｏｇｉｎ－１及び図６（Ｄ）がＧａｄｄ４５のデータを示している。この結果によれば、ＦＯＸＯ１遺伝子は、デキサメタゾン及びレバスチニブのいずれの処理によってもその発現量は有意に変化しないことがわかった（図６（Ａ））。また、ＦＯＸＯ３ａ遺伝子の発現量はデキサメタゾン処理によって有意に増加したが、レバスチニブの添加による影響はなく、発現量に変化はみられなかった（図６（Ｂ））。他方、デキサメタゾンはＦＯＸＯ１標的遺伝子であるａｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子及びＧａｄｄ４５遺伝子の発現を有意に増加させ、レバスチニブはａｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子とＧａｄｄ４５遺伝子の発現を有意に低下させることがわかった（図６（Ｃ）及び（Ｄ））。また、ａｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子とＧａｄｄ４５遺伝子の発現には相互作用が認められ、デキサメタゾン存在下でのレバスチニブ投与によりこれらＦＯＸＯ１標的遺伝子の発現が抑制されることが示唆された。

【0063】

［実施例７］
７．レバスチニブがタンパク質発現に与える影響の検討（１）
上述した実施例６ではＦＯＸＯ１等の遺伝子発現レベルについて検討を行ったが、本実施例ではウェスタンブロット法を用いて、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３及びａｔｒｏｇｉｎ－１のタンパク質発現レベルを解析した。具体的には、試験は次のようにして行った。上記実施例２と同様の材料及び方法で分化誘導されたＣ２Ｃ１２筋管細胞に対し、１μＭのレバスチニブ及び１μＭのデキサメタゾンを添加し、２４時間培養を行った（Ｄｅｘ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、デキサメタゾン及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、デキサメタゾンを添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにデキサメタゾンのみを添加した培地（Ｄｅｘ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に２４時間培養を行った。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含有させた細胞可溶化試薬（ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で培養液をホモジナイズして、Ｃ２Ｃ１２細胞のタンパク質を抽出した。抽出液を４℃、１５０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質２０μｇ分の全細胞溶解液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにアプライした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのタンパク質を膜転写した後、抗ＦＯＸＯ１抗体（＃２８８０、セルシグナリングテクノロジー社製品）、抗ＦＯＸＯ３ａ抗体（＃１２８２９、セルシグナリングテクノロジー社製品）、抗ａｔｒｏｇｉｎ－１抗体（抗Ｆｂｘ３２、ａｂ１６８３７２、アブカム社製品）及び抗アクチン抗体（＃４９７０、セルシグナリングテクノロジー社製品）とインキュベートし、目的のタンパク質と結合させた。二次抗体とインキュベートした後、化学発光試薬（ECL Prime Western Blotting Reagent、ＧＥヘルスケア製品）を用いてバンドを検出し、化学発光スキャナー（Ｃ－ＤｉＧｉｔスキャナー、ＬＩ－ＣＯＲ社製品）を用いて蛍光強度を定量化した。

【0064】

検出されたバンドを図７（Ａ）に、蛍光強度を図７（Ｂ）～（Ｄ）（ｎ＝３、平均値±標準誤差）に示す。グラフ縦軸の相対的発現レベルは、デキサメタゾン及びレバスチニブを添加していないコントロール（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）の値に対する比率として示している。Ｃｏｎｔはデキサメタゾンを添加していない対照群を示し、Ｄｅｘはデキサメタゾンを添加した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。図７のグラフ中の＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を示す。

【0065】

図７（Ｂ）がＦＯＸＯ１、図７（Ｃ）がＦＯＸＯ３ａ及び図７（Ｄ）がａｔｒｏｇｉｎ－１のデータを示している。この結果によれば、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現は、デキサメタゾン処理による有意な変化は見られなかったが、レバスチニブの添加によってＦＯＸＯ１タンパク質レベルが有意に抑制されていることが明らかとなった（図７（Ｂ））。また、ＦＯＸＯ３ａタンパク質レベルは、デキサメタゾン及びレバスチニブのいずれの処理によっても有意に変化しないことがわかった（図７（Ｃ））。また、ａｔｒｏｇｉｎ－１タンパク質のレベルは、デキサメタゾン及びレバスチニブ処理により有意に変化した（図７（Ｄ））。これらのことから、レバスチニブはデキサメタゾン非存在下ではＦＯＸＯ１タンパク質およびａｔｒｏｇｉｎ－１タンパク質のレベルを抑制しないが、デキサメタゾン存在下ではＦＯＸＯ１タンパク質およびａｔｒｏｇｉｎ－１タンパク質のレベルを抑制することがわかった。

【0066】

［実施例８］
８．レバスチニブがタンパク質発現に与える影響の検討（２）
ＦＯＸＯ１の分子機構において、リン酸化されたＦＯＸＯ１（ｐＦＯＸＯ１）は、プロテアソームによって分解されることが知られている。そこで、実施例７で観察されたＦＯＸＯ１タンパク質レベルの減少がＦＯＸＯ１のリン酸化によるものかどうか調べるため、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２の存在下でリン酸化ＦＯＸＯ１（ｐＦＯＸＯ１）のタンパク質レベルをウェスタンブロット法により測定した。試験は次のようにして行った。上記実施例２と同様の材料及び方法で分化誘導されたＣ２Ｃ１２筋管細胞に対し、１μＭのレバスチニブ及び１μＭのデキサメタゾンを添加し、２４時間培養を行った（Ｄｅｘ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）。また、比較対照として、デキサメタゾン及びレバスチニブの両方とも添加していない培地（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）、デキサメタゾンを添加せずにレバスチニブのみを添加した培地（Ｃｏｎｔ／Ｒｅｂａｓｔｉｎｉｂ）、レバスチニブを添加せずにデキサメタゾンのみを添加した培地（Ｄｅｘ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）でも同様に２４時間培養を行った。また、いずれの培地にもプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を１μＭ添加した。なお、溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含有する細胞可溶化試薬（ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で培養液をホモジナイズして、Ｃ２Ｃ１２細胞のタンパク質を抽出した。抽出液を４℃、１５０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質２０μｇ分の全細胞溶解液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにアプライした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのタンパク質を膜転写した後、抗ＦＯＸＯ１抗体（＃２８８０、セルシグナリングテクノロジー社製品）、抗リン酸化ＦＯＸＯ１抗体（Ｓｅｒ２５６、＃９４６１、セルシグナリングテクノロジー社製品）及び抗アクチン抗体（＃４９７０、セルシグナリングテクノロジー社製品）とインキュベートし、目的のタンパク質と結合させた。二次抗体とインキュベートした後、実施例７と同様の材料及び方法によりバンドを検出し、化学発光スキャナーで蛍光強度を定量化した。

【0067】

検出されたバンドを図８（Ａ）に、蛍光強度を図８（Ｂ）、（Ｃ）に、蛍光強度比を図８（Ｄ））に示す（ｎ＝３、平均値±標準誤差）。グラフ縦軸の相対的発現レベルは、デキサメタゾン及びレバスチニブを添加していないコントロール（Ｃｏｎｔ／Ｖｅｈｉｃｌｅ）の値に対する比率として示している。Ｃｏｎｔはデキサメタゾンを添加していない対照群を示し、Ｄｅｘはデキサメタゾンを添加した試験群を示している。また、白抜きのカラムはレバスチニブを添加していない試験群であり、着色されたカラムはレバスチニブを添加した試験群である。

【0068】

図８（Ｂ）がリン酸化ＦＯＸＯ１（ｐＦＯＸＯ１）、図８（Ｃ）が全ＦＯＸＯ１及び図８（Ｄ）が全ＦＯＸＯ１に対するｐＦＯＸＯ１比のデータを示している。この結果によると、デキサメタゾン及びレバスチニブの投与により、ｐＦＯＸＯ１タンパク質レベル及び全ＦＯＸＯに占めるｐＦＯＸＯ１の比に変化は見られなかった。そのため、実施例７で観察されたＦＯＸＯ１タンパク質レベルの減少はＦＯＸＯ１のリン酸化によるものではないことが示された。他方、デキサメタゾン及びレバスチニブは、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２非存在下ではＦＯＸＯ１タンパク質のレベルを低下させたが（実施例７、図７（Ｂ）参照）、プロテアソーム阻害剤存在下ではＦＯＸＯ１タンパク質のレベルは変化しなかった。これらのことから、レバスチニブはプロテアソーム系を介してＦＯＸＯ１タンパク質の分解を促進させ、ＦＯＸＯ１タンパク質レベルを減少させること、ＦＯＸＯ１タンパク質レベルの減少により筋萎縮関連遺伝子の発現レベルが減少する作用機序を有することが示唆された。

【0069】

本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。

【産業上の利用可能性】

【0070】

本発明は、ＦＯＸＯ１の活性を抑制・阻害することができるＦＯＸＯ１阻害剤及び、筋萎縮の抑制、改善、予防又は治療用組成物を提供するものであり、医薬・医療分野の産業において幅広く役立つものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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