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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024117359
(43)【公開日】2024-08-29
(54)【発明の名称】ミクログリア含有大脳オルガノイドの作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240822BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20240822BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/079
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023023418
(22)【出願日】2023-02-17
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(72)【発明者】
【氏名】小高 陽樹
(72)【発明者】
【氏名】舘野 浩章
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA21
4B065BB12
4B065BB19
4B065BB34
4B065BC03
4B065BC07
4B065BC11
4B065BC46
4B065BD15
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】 発達過程を再現し得る大脳オルガノイドを提供する。
【解決手段】 （ａ）多能性幹細胞から胚様体を調製するステップ、（ｂ）前記胚様体を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ、これにより神経化された胚様体が得られ、（ｃ）前記神経化された胚様体を、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養するステップ、これにより初期大脳オルガノイドが得られ、ならびに、（ｄ）前記初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、ミクログリア含有大脳オルガノイドを作製する方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 （ａ）多能性幹細胞から胚様体を調製するステップ、（ｂ）前記胚様体を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ、これにより神経化された胚様体が得られ、（ｃ）前記神経化された胚様体を、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養するステップ、これにより初期大脳オルガノイドが得られ、ならびに、（ｄ）前記初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、ミクログリア含有大脳オルガノイドを作製する方法。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）多能性幹細胞から胚様体を調製するステップ、
（ｂ）前記胚様体を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ、これにより神経化された胚様体が得られ、
（ｃ）前記神経化された胚様体を、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養するステップ、これにより初期大脳オルガノイドが得られ、ならびに、
（ｄ）前記初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップ
を含む、ミクログリア含有大脳オルガノイドを作製する方法。
（ｂ）前記胚様体を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ、これにより神経化された胚様体が得られ、
（ｃ）前記神経化された胚様体を、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養するステップ、これにより初期大脳オルガノイドが得られ、ならびに、
（ｄ）前記初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップ
を含む、ミクログリア含有大脳オルガノイドを作製する方法。
【請求項2】
前記ＢＭＰシグナル経路阻害剤が、ドルソモルフィン、ＬＤＮ－１９３１８９、ノギンおよびＤＭＨ１からなる群から選択され、
前記ＴＧＦβシグナル経路阻害剤が、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ｓｃ－２０３２９４、Ａ８３－０１、ＬＹ３６４９４７およびＳＤ－２０８からなる群から選択され、
前記ＥＧＦシグナル経路活性化剤が、ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子、ベタセルリン、エピジェンおよびエピレグリンからなる群から選択され、
前記ＦＧＦシグナル経路活性化剤が、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦおよびＦＧＦＣからなる群から選択され、
前記ＴＧＦβシグナル経路活性化剤が、ＩＤＥ１、ＩＤＥ２およびＴＧＦ－βからなる群から選択され、
前記Ｍ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤が、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４からなる群から選択され、かつ、
前記ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤が、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３およびＮＴ－４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記ＴＧＦβシグナル経路阻害剤が、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ｓｃ－２０３２９４、Ａ８３－０１、ＬＹ３６４９４７およびＳＤ－２０８からなる群から選択され、
前記ＥＧＦシグナル経路活性化剤が、ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子、ベタセルリン、エピジェンおよびエピレグリンからなる群から選択され、
前記ＦＧＦシグナル経路活性化剤が、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦおよびＦＧＦＣからなる群から選択され、
前記ＴＧＦβシグナル経路活性化剤が、ＩＤＥ１、ＩＤＥ２およびＴＧＦ－βからなる群から選択され、
前記Ｍ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤が、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４からなる群から選択され、かつ、
前記ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤が、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３およびＮＴ－４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップ（ｃ）において、前記神経化された胚様体１個あたり１×１０４～１×１０５個の前記造血前駆細胞が添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記造血前駆細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記多能性幹細胞および前記造血前駆細胞がヒト由来である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法により作製されたミクログリア含有大脳オルガノイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ミクログリア含有大脳オルガノイドの作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、インビトロの生体モデルとして、種々の臓器のオルガノイドが作製されている。特に、ヒト脳組織は入手や培養が困難であることから、ヒト多能性幹細胞由来の脳オルガノイドは、ヒト特有の神経学的発達の研究や疾患の前臨床モデルになり得るものとして期待されている。これまでにも脳オルガノイドの作製方法が多数報告されており、脳オルガノイドにおいて脳組織の層構造を再現できることも報告されている（例えば、非特許文献１）。しかし、これまでに報告された脳オルガノイドの多くは、ミクログリアを含有していない。ミクログリアは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、脳梗塞、てんかん発作、神経障害性疼痛など、中枢神経系疾患の大半に関与していることが知られている。そのため、ミクログリアを含有しない脳オルガノイドは、疾患モデルとしては不十分である。
【0003】
成熟脳オルガノイドと成熟ミクログリアとを共培養することにより、ミクログリア含有脳オルガノイドを作製する方法が報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法では、脳オルガノイドが成熟した後に成熟ミクログリアを添加しているため、生体内の脳発生の過程を再現できない。生体内では、卵黄嚢から発生したミクログリア前駆細胞が発生初期の脳に浸潤し、その後、神経発達と協調的にミクログリアへと分化し、成熟する。ミクログリアは、発達過程の脳内で、成長因子やサイトカインの分泌、シナプスの剪定、アポトーシス細胞の除去などの、神経ネットワークの構築に不可欠な機能を担っている。したがって、忠実な脳オルガノイドを作出するためには、このような生体内の脳発生における神経系細胞とミクログリアとの相互作用を再現できる必要がある。
【0004】
脳発生の過程および中枢神経系疾患を高度にモデル化することができる脳オルガノイドが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２２；１７（１０）：２２２０－２２３８
【非特許文献2】Ａｂｕｄ，ＥＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０１７；９４（２）：２７８－２９３．ｅ９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、大脳を忠実に再現できる大脳オルガノイドを提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意研究の結果、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを誘導する過程において造血前駆細胞を添加することにより、大脳を発生過程から再現した大脳オルガノイドを作出することに成功した。
【0008】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（ａ）多能性幹細胞から胚様体を調製するステップ、（ｂ）前記胚様体を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ、これにより神経化された胚様体が得られ、（ｃ）前記神経化された胚様体を、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養するステップ、これにより初期大脳オルガノイドが得られ、ならびに、（ｄ）前記初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、ミクログリア含有大脳オルガノイドを作製する方法を提供するものである。
【0009】
前記ＢＭＰシグナル経路阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤＮ－１９３１８９、ノギンおよびＤＭＨ１からなる群から選択され；前記ＴＧＦβシグナル経路阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ｓｃ－２０３２９４、Ａ８３－０１、ＬＹ３６４９４７およびＳＤ－２０８からなる群から選択され；前記ＥＧＦシグナル経路活性化剤は、ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子、ベタセルリン、エピジェンおよびエピレグリンからなる群から選択され；前記ＦＧＦシグナル経路活性化剤は、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦおよびＦＧＦＣからなる群から選択され；前記ＴＧＦβシグナル経路活性化剤は、ＩＤＥ１、ＩＤＥ２およびＴＧＦ－βからなる群から選択され；前記Ｍ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤は、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４からなる群から選択され；かつ、前記ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤は、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３およびＮＴ－４からなる群から選択されることが好ましい。
【0010】
前記ステップ（ｃ）において、前記神経化された胚様体１個あたり１×１０４～１×１０５個の前記造血前駆細胞が添加されることが好ましい。
【0011】
前記造血前駆細胞は、多能性幹細胞から誘導されたものであることが好ましい。
【0012】
前記多能性幹細胞および前記造血前駆細胞は、ヒト由来であることが好ましい。
【0013】
また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により作製されたミクログリア含有大脳オルガノイドを提供するものである。
【発明の効果】
【0014】
本発明に係る方法によれば、生体内における脳発生と同様に、大脳オルガノイドの成熟とミクログリアの成熟とが同時に進行する。そのため、本発明に係る方法により作製されたミクログリア含有大脳オルガノイドは、脳発生の研究および中枢神経系疾患の薬剤スクリーニングのための大脳モデルとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図3】図３は、ＨＰＣを添加せずに、またはＨＰＣを種々の濃度で添加して調製された大脳オルガノイド（誘導９日目）におけるＣＤ４３陽性細胞をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。
【図4】図４は、ＨＰＣを添加せずに、またはＨＰＣを種々の濃度で添加して調製された大脳オルガノイド（誘導２５日目）におけるＣＤ４５陽性細胞をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。
【図5】図５は、ＨＰＣを添加せずに調製された大脳オルガノイド（誘導２５日目）の、抗ＩＢＡ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（左上）、抗ＴＵＪ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（右上）、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色像（左下）、およびすべての染色像を重ねた画像（右下）を示す図である。
【図6】図６は、ＨＰＣを添加せずに調製された大脳オルガノイド（誘導４３日目）の、抗ＩＢＡ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（左上）、抗ＴＵＪ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（右上）、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色像（左下）、およびすべての染色像を重ねた画像（右下）を示す図である。
【図7】図７は、ＨＰＣを添加して調製された大脳オルガノイド（誘導２５日目）の、抗ＩＢＡ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（左上）、抗ＴＵＪ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（右上）、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色像（左下）、およびすべての染色像を重ねた画像（右下）を示す図である。
【図8】図８は、ＨＰＣを添加して調製された大脳オルガノイド（誘導４３日目）の、抗ＩＢＡ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（左上）、抗ＴＵＪ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（右上）、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色像（左下）、およびすべての染色像を重ねた画像（右下）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【0017】
本発明は、第一の実施形態によれば、（ａ）多能性幹細胞から胚様体を調製するステップ、（ｂ）前記胚様体を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ、これにより神経化された胚様体が得られ、（ｃ）前記神経化された胚様体を、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養するステップ、これにより初期大脳オルガノイドが得られ、ならびに、（ｄ）前記初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、ミクログリア含有大脳オルガノイドを作製する方法である。
【0018】
本実施形態の方法では、多能性幹細胞から胚様体を調製する（ステップ（ａ））。「多能性幹細胞」には、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、多能性生殖幹（ｍＧＳ）細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法では、いずれの多能性幹細胞を用いてもよいが、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることが好ましく、ｉＰＳ細胞を用いることがより好ましい。
【0019】
本実施形態における多能性幹細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【0020】
多能性幹細胞の調製方法は十分に確立されており（例えば、ｉＰＳ細胞については、Ｃｅｌｌ，２００７；１３１（５）：８６１－８７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９）、当分野において公知の方法にしたがって、任意の組織または細胞から多能性幹細胞を調製することができる。あるいは、すでに樹立されたｉＰＳ細胞株やＥＳ細胞株を、例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究財団（ＣｉＲＡ＿Ｆ）、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから入手してもよい。
【0021】
「胚様体」（ＥＢ）とは、多能性幹細胞の三次元凝集塊をいう。本実施形態における胚様体は、当分野において公知の方法にしたがって、例えば、任意の未分化ＥＳ／ｉＰＳ細胞用維持培地を用いた浮遊培養やハンギングドロップ培養などにより調製されてよい。この際、ＥＢは、以下に記載する分化誘導工程の前に、Ｙ－２７６３２のようなＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で１～２日間培養されることが好ましい。
【0022】
次いで、ＥＢを、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤の存在下で培養する（ステップ（ｂ））。これにより、ＥＢが神経パターニングを受け、神経化されたＥＢが得られる。
【0023】
本実施形態における「ＢＭＰシグナル経路阻害剤」は、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）またはその受容体もしくはその下流のシグナル経路を阻害する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＢＭＰシグナル経路阻害剤は、例えば、ドルソモルフィン、ＬＤＮ－１９３１８９、ノギンおよびＤＭＨ１などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＢＭＰシグナル経路阻害剤は、好ましくはドルソモルフィンであってよく、培地におけるドルソモルフィンの濃度は、好ましくは１μＭ～１０μＭとすることができる。
【0024】
本実施形態における「ＴＧＦβシグナル経路阻害剤」は、ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）またはその受容体もしくはその下流のシグナル経路を阻害する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＴＧＦβシグナル経路阻害剤は、例えば、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ｓｃ－２０３２９４、Ａ８３－０１、ＬＹ３６４９４７およびＳＤ－２０８などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＴＧＦβシグナル経路阻害剤は、好ましくはＳＢ－４３１５４２であってよく、培地におけるＳＢ－４３１５４２の濃度は、好ましくは１μＭ～３０μＭとすることができる。
【0025】
本実施形態の方法のステップ（ｂ）では、任意選択的に、Ｗｎｔシグナル経路阻害剤をさらに添加してもよい。Ｗｎｔシグナル経路阻害剤は、ＢＭＰシグナル経路阻害剤およびＴＧＦβシグナル経路阻害剤によるＥＢの神経化をさらに促進することができる。本実施形態における「Ｗｎｔシグナル経路阻害剤」は、Ｗｎｔファミリータンパク質またはその受容体もしくはその下流のシグナル経路（好ましくは古典的Ｗｎｔ／β－カテニン経路）を阻害する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＷｎｔシグナル経路阻害剤は、例えば、ＸＡＶ－９３９、ＩＷＲ－１（ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ）、５３ＡＨ、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－４およびＷｎｔ－Ｃ５９などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＷｎｔシグナル経路阻害剤は、好ましくはＸＡＶ－９３９であってよく、培地におけるＸＡＶ－９３９の濃度は、好ましくは１μＭ～３０μＭとすることができる。
【0026】
本実施形態の方法のステップ（ｂ）～（ｄ）で使用される基本培地は、神経系細胞の分化誘導に用いられる一般的なものであってよく、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、ＩＭＥＭ／Ｆ－１２培地、Ｎ２培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を混合して用いることができる。本実施形態のステップ（ｂ）では、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６（商標）培地を基本培地として用いることが好ましい。
【0027】
本実施形態のステップ（ｂ）において、ＥＢは、例えば３×１０３～３×１０４／ｍＬの濃度範囲で播種されてよい。ステップ（ｂ）の期間は、例えば６～１１日間であってよく、好ましくは６～８日間であってよい。
【0028】
次いで、神経化されたＥＢを、ＥＧＦシグナル経路活性化剤、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＴＧＦβシグナル経路活性化剤およびＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤の存在下で造血前駆細胞と共培養する（ステップ（ｃ））。これにより、初期大脳オルガノイドが得られる。本実施形態において「初期大脳オルガノイド」とは、脳室様構造が形成され、かつ、造血前駆細胞が浸潤した、発生初期段階の大脳を模倣したオルガノイドをいう。
【0029】
「造血前駆細胞」とは、血球系細胞に分化することができる細胞をいい、ＣＤ４３陽性細胞として定義され得る。本実施形態における造血前駆細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【0030】
本実施形態における造血前駆細胞は、任意の方法により調製されてよく、生体組織から単離されたものであってもよいし、多能性幹細胞から誘導されたものであってもよい。多能性幹細胞を造血前駆細胞へと分化させる方法はすでに確立されており（例えば、Ｈｅｔｅｌ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７；２０（５）：７５３－７５）、当分野において公知の方法にしたがって造血前駆細胞を調製することができる。多能性幹細胞を造血前駆細胞へと分化させるための培地やキットも市販されており、そのような市販品を用いて造血前駆細胞を調製してもよい。
【0031】
本実施形態における「ＥＧＦシグナル経路活性化剤」は、ＥＧＦ（上皮成長因子）受容体またはその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＥＧＦシグナル経路活性化剤は、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ－β、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子 （ＨＢ－ＥＧＦ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、エピジェン（ＥＰＧ）、エピレグリン（ＥＰＲ）などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＥＧＦシグナル経路活性化剤は、好ましくはＥＧＦであってよく、培地におけるＥＧＦの濃度は、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【0032】
本実施形態における「ＦＧＦシグナル経路活性化剤」は、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）受容体またはその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＦＧＦシグナル経路活性化剤は、例えば、ＦＧＦ１ファミリーである酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ（ＦＧＦ１））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ（ＦＧＦ２））およびそれらの組換え体（例えばＦＧＦ－Ｇ３（商標）など）、ならびに線維芽細胞成長因子キメラ（ＦＧＦＣ）などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＦＧＦシグナル経路活性化剤は、好ましくはｂＦＧＦであってよく、培地におけるｂＦＧＦの濃度は、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【0033】
本実施形態における「ＴＧＦβシグナル経路活性化剤」は、ＴＧＦβ受容体またはその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＴＧＦβシグナル経路活性化剤は、例えば、ＩＤＥ１、ＩＤＥ２、ならびにＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３などのＴＧＦβタンパク質などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＴＧＦβシグナル経路活性化剤は、好ましくはＩＤＥ１であってよく、培地におけるＩＤＥ１の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【0034】
本実施形態における「Ｍ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤」は、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）受容体またはその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤は、例えば、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＭ－ＣＳＦシグナル経路活性化剤は、好ましくはＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４の組み合わせであってよく、培地におけるＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４の濃度は、好ましくはそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【0035】
本実施形態のステップ（ｃ）では、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地を基本培地として用いることが好ましく、Ｂ－２７サプリメントなどが適宜添加されていてもよい。造血前駆細胞は、神経化されたＥＢ１個に対して、例えば１×１０４～１×１０５個、好ましくは１×１０４～３×１０４個の比率で添加されてよい。ステップ（ｃ）の期間は、例えば１３～２２日間であってよく、好ましくは１６～１９日間であってよい。
【0036】
次いで、初期大脳オルガノイドを、ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤の存在下で培養する（ステップ（ｄ））。これにより、皮質層が形成され、かつ、ミクログリア前駆細胞がミクログリアに分化し、ミクログリア含有大脳オルガノイドが得られる。
【0037】
本実施形態における「ＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤」は、高親和性ニューロトロフィン受容体ファミリー（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）のうち、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣのいずれか一方もしくは両方またはそれらの下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤は、例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３およびＮＴ－４などであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるＴｒｋＢおよび／またはＴｒｋＣシグナル経路活性化剤は、好ましくはＢＤＮＦおよびＮＴ－３の組み合わせであってよく、培地におけるＢＤＮＦおよびＮＴ－３の濃度は、好ましくはそれぞれ５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【0038】
本実施形態のステップ（ｄ）では、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地を基本培地として用いることが好ましく、Ｂ－２７サプリメントなどが適宜添加されていてもよい。ステップ（ｄ）の期間は、作製されるミクログリア含有大脳オルガノイドの所望の成熟度によって適宜変更され得るが、例えば、少なくとも１４日間であってよく、好ましくは１４～２２日間であってよく、特に好ましくは１６～２０日間であってよい。
【0039】
本実施形態の方法によれば、初期大脳オルガノイドにミクログリア前駆細胞を浸潤させることにより、生体内の脳の発生過程における神経系細胞およびミクログリアの協調的な成熟を再現することができる。そのため、本実施形態の方法によれば、発生過程を含めて大脳を忠実に再現した大脳オルガノイドを作製することが可能である。
【0040】
本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により作製されたミクログリア含有大脳オルガノイドである。
【0041】
上記方法により得られたオルガノイドがミクログリア含有大脳オルガノイドであるかどうかは、例えば、神経細胞特異的マーカーであるＴＵＪ１（別名ＴＵＢＢ３）およびミクログリア特異的マーカーであるＩＢＡ１の発現により確認することができる。本実施形態のミクログリア含有大脳オルガノイドは、上記マーカーに加え、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ＦＯＸＧ１、ＴＢＲ１、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＣＵＸ１、ＭＡＰ２、ＣＤ４５、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、Ｐ２ＲＹ１２などを発現していることが好ましい。マーカーの発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの公知の手法により解析することができる。
【0042】
本実施形態のミクログリア含有大脳オルガノイドは、発生過程を含めて大脳をインビトロにおいて忠実に再現できるものであり、脳発生の研究および中枢神経系疾患の薬剤スクリーニングのための大脳モデルとして有用である。
【実施例0043】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【0044】
＜試薬＞
本実施例において使用した試薬情報（試薬名、製品番号、製造元、略称など）は下記の通りである。
・ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ－ｃＧＭＰ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ＳＴ－１００－０２７６）（以下、「ｍＴｅＳＲ＋培地」と表記）
・ＤＭＥＭ／Ｆ－１２，ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ： １１３３００３２）（以下、「ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地」と表記）
・Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｈＥＳＣ－Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｍａｔｒｉｘ， ＬＤＥＶ－Ｆｒｅｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ： ３５４２７７）（以下、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」と表記）
・Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＥＤＴＡ），０．０２％（Ｌｏｎｚａ： １７－７１１Ｅ＝ＢＥ１７－７１１Ｅ）（以下、「Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液」と表記）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ＡＴ１０４－５００）
・Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬： ０４９－２９７９３）
・ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ １０ｍｍｏｌ／ｌ Ｙ－２７６３２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｎｉｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ－ｆｒｅｅ（富士フイルム和光純薬： ０３９－２４５９１）（以下、「Ｙ－２７６３２」と表記）
・ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ５３１０）
・ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック： ＣＳ－０２－００１）
・Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ： Ａ１５１６４０１）
・ＳＢ－４３１５４２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ： １６１４／１）（以下、「ＳＢ」と表記）
・Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ，≧９８％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ： Ｐ５４９９－５ＭＧ）（以下、「ＤＭ」と表記）
・ＸＡＶ－９３９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ６７５２４４）（以下、「ＸＡＶ」と表記）
・Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ Ｍｅｄｉｕｍ，ｌｉｑｕｉｄ（Ｇｉｂｃｏ： １０８８８０２２）
・Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｎｕｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（５０Ｘ），Ｌｉｑｕｉｄ（Ｇｉｂｃｏ： １２５８７０１０）（以下、「Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」と表記）
・ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ： ３５０５００６１）
・Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，Ｂａｓｉｃ，Ｈｕｍａｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（富士フイルム和光純薬： ０６４－０４５４１）（以下、「ｂＦＧＦ」と表記）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥＧＦ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ２３６－ＥＧ－２００）（以下、「ＥＧＦ」と表記）
・ＩＤＥ１，１０ｍＭ＊１ｍＬ ｉｎ ＤＭＳＯ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ： ＨＹ－１００５３３）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－３４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ２００－３４－１０ｕｇ）（以下、「ＩＬ－３４」と表記）
・Ａｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ＡＦ－３００－２５）（以下、「Ｍ－ＣＳＦ」と表記）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｕｒｉｎｅ／Ｒａｔ ＢＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ４５０－０２）（以下、「ＢＤＮＦ」と表記）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＮＴ－３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ４５０－０３）（以下、「ＮＴ－３」と表記）
・Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ： １１０１５）
・４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フイルム和光純薬： １６３－２０１４５）（以下、「４％ＰＦＡ」と表記）
・ヒドロキシ尿素（富士フイルム和光純薬： ８５０６６５３）
・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ナカライテスク： ３５５０１－１５）
・ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ｓ Ｔｒｉａｌ Ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬： ２９９－７９９０１）
・ｄｅＳｃａｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（富士フイルム和光純薬： ０４１－３４４２５）
・ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２（富士フイルム和光純薬： １９３－１８４５５）
・Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ： ４２２３０２）
・ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ： ３４３２０３）（以下、「ＰＥ標識抗ＣＤ４３抗体」と表記）
・ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ： ３０４０１１）（以下、「ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体」と表記）
・Ａｎｔｉ Ｉｂａ１，Ｒａｂｂｉｔ（ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（富士フイルム和光純薬： ０１９－１９７４１）（以下、「抗ＩＢＡ１抗体」と表記）
・ＡＮＴＩ ＢＥＴＡ－ＴＵＢＵＬＩＮ ＩＩＩ ＩＳＯＦＯＲＭ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ： ＭＡＢ１６３７）（以下、「抗ＴＵＪ１抗体」と表記）
・Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： Ａ－２１２４４）（以下、「Ａｌｅｘａ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体」と表記）
・Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： ＃Ａ－２１１２７）（以下、「Ａｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体」と表記）
・Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ 溶液 （１ｍｇ／ｍｌ Ｈ２Ｏ）（同仁化学研究所： Ｈ３４２）
・ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ： ７４１０６）
・ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ： ＦＳＱ－３０１）
・ ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ： ＱＰＳ－２０１）
本実施例において使用した試薬情報（試薬名、製品番号、製造元、略称など）は下記の通りである。
・ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ－ｃＧＭＰ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ＳＴ－１００－０２７６）（以下、「ｍＴｅＳＲ＋培地」と表記）
・ＤＭＥＭ／Ｆ－１２，ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ： １１３３００３２）（以下、「ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地」と表記）
・Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｈＥＳＣ－Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｍａｔｒｉｘ， ＬＤＥＶ－Ｆｒｅｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ： ３５４２７７）（以下、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」と表記）
・Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＥＤＴＡ），０．０２％（Ｌｏｎｚａ： １７－７１１Ｅ＝ＢＥ１７－７１１Ｅ）（以下、「Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液」と表記）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ＡＴ１０４－５００）
・Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬： ０４９－２９７９３）
・ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ １０ｍｍｏｌ／ｌ Ｙ－２７６３２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｎｉｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ－ｆｒｅｅ（富士フイルム和光純薬： ０３９－２４５９１）（以下、「Ｙ－２７６３２」と表記）
・ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ５３１０）
・ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック： ＣＳ－０２－００１）
・Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ： Ａ１５１６４０１）
・ＳＢ－４３１５４２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ： １６１４／１）（以下、「ＳＢ」と表記）
・Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ，≧９８％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ： Ｐ５４９９－５ＭＧ）（以下、「ＤＭ」と表記）
・ＸＡＶ－９３９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ６７５２４４）（以下、「ＸＡＶ」と表記）
・Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ Ｍｅｄｉｕｍ，ｌｉｑｕｉｄ（Ｇｉｂｃｏ： １０８８８０２２）
・Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｎｕｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（５０Ｘ），Ｌｉｑｕｉｄ（Ｇｉｂｃｏ： １２５８７０１０）（以下、「Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」と表記）
・ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ： ３５０５００６１）
・Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，Ｂａｓｉｃ，Ｈｕｍａｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（富士フイルム和光純薬： ０６４－０４５４１）（以下、「ｂＦＧＦ」と表記）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥＧＦ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ２３６－ＥＧ－２００）（以下、「ＥＧＦ」と表記）
・ＩＤＥ１，１０ｍＭ＊１ｍＬ ｉｎ ＤＭＳＯ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ： ＨＹ－１００５３３）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－３４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ２００－３４－１０ｕｇ）（以下、「ＩＬ－３４」と表記）
・Ａｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ＡＦ－３００－２５）（以下、「Ｍ－ＣＳＦ」と表記）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｕｒｉｎｅ／Ｒａｔ ＢＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ４５０－０２）（以下、「ＢＤＮＦ」と表記）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＮＴ－３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ： ４５０－０３）（以下、「ＮＴ－３」と表記）
・Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ： １１０１５）
・４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フイルム和光純薬： １６３－２０１４５）（以下、「４％ＰＦＡ」と表記）
・ヒドロキシ尿素（富士フイルム和光純薬： ８５０６６５３）
・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ナカライテスク： ３５５０１－１５）
・ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ｓ Ｔｒｉａｌ Ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬： ２９９－７９９０１）
・ｄｅＳｃａｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（富士フイルム和光純薬： ０４１－３４４２５）
・ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２（富士フイルム和光純薬： １９３－１８４５５）
・Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ： ４２２３０２）
・ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ： ３４３２０３）（以下、「ＰＥ標識抗ＣＤ４３抗体」と表記）
・ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ： ３０４０１１）（以下、「ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体」と表記）
・Ａｎｔｉ Ｉｂａ１，Ｒａｂｂｉｔ（ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（富士フイルム和光純薬： ０１９－１９７４１）（以下、「抗ＩＢＡ１抗体」と表記）
・ＡＮＴＩ ＢＥＴＡ－ＴＵＢＵＬＩＮ ＩＩＩ ＩＳＯＦＯＲＭ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ： ＭＡＢ１６３７）（以下、「抗ＴＵＪ１抗体」と表記）
・Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： Ａ－２１２４４）（以下、「Ａｌｅｘａ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体」と表記）
・Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： ＃Ａ－２１１２７）（以下、「Ａｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体」と表記）
・Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ 溶液 （１ｍｇ／ｍｌ Ｈ２Ｏ）（同仁化学研究所： Ｈ３４２）
・ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ： ７４１０６）
・ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ： ＦＳＱ－３０１）
・ ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ： ＱＰＳ－２０１）
【0045】
＜大脳オルガノイドのための基本培地（以下、「ＣＯ培地」と表記）＞
２％ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔおよび１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ培地を、大脳オルガノイドのための基本培地として用いた。
２％ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔおよび１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ培地を、大脳オルガノイドのための基本培地として用いた。
【0046】
＜１．ミクログリア含有大脳オルガノイドの分化誘導＞
（１－１）ｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）（以下、単に「ｉＰＳ細胞」と記載する）は、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣより入手した。ｉＰＳ細胞を、６ウェルプレート上で、ｍＴｅＳＲ＋培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。培地は２日に１回交換した。ｉＰＳ細胞がセミコンフルエントに達したら、以下の手順で継代培養を行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌをメーカー指定の希釈倍率でＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地により希釈し、６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。培地を除去し、Ｄ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（１ｍＬ／ウェル）を添加した。室温で７分間インキュベートした後、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を除去し、ｍＴｅＳＲ＋培地（２ｍＬ）を吹きかけてｉＰＳ細胞コロニーを回収した。回収されたｉＰＳ細胞コロニーの１／５～１／１０量を、新しいＭａｔｒｉｇｅｌコート６ウェルプレートに播種した。
（１－１）ｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）（以下、単に「ｉＰＳ細胞」と記載する）は、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣより入手した。ｉＰＳ細胞を、６ウェルプレート上で、ｍＴｅＳＲ＋培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。培地は２日に１回交換した。ｉＰＳ細胞がセミコンフルエントに達したら、以下の手順で継代培養を行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌをメーカー指定の希釈倍率でＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地により希釈し、６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。培地を除去し、Ｄ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（１ｍＬ／ウェル）を添加した。室温で７分間インキュベートした後、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を除去し、ｍＴｅＳＲ＋培地（２ｍＬ）を吹きかけてｉＰＳ細胞コロニーを回収した。回収されたｉＰＳ細胞コロニーの１／５～１／１０量を、新しいＭａｔｒｉｇｅｌコート６ウェルプレートに播種した。
【0047】
（１－２）造血前駆細胞の調製
（１－２－ｉ）胚様体の調製
培養上清を除去し、ｉＰＳ細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（１ｍＬ／ウェル）を添加した。３７℃で５分間インキュベートした後、ピペッティングにより単一細胞に分散させたｉＰＳ細胞を遠心管に回収した。Ｄ－ＰＢＳ（－）を６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで添加し、ウェルに残るｉＰＳ細胞を回収した。３００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去し、１０μＭのＹ－２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ＋培地によりｉＰＳ細胞を懸濁した（３．６×１０５細胞／ｍＬ）。ｉＰＳ細胞をＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００，２４ウェルプレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種し（ｉＰＳ細胞懸濁液１ｍＬ／ウェル）、プレートを１００×ｇで３分間遠心した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間インキュベートし、胚様体（ＥＢ）を得た。
（１－２－ｉ）胚様体の調製
培養上清を除去し、ｉＰＳ細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（１ｍＬ／ウェル）を添加した。３７℃で５分間インキュベートした後、ピペッティングにより単一細胞に分散させたｉＰＳ細胞を遠心管に回収した。Ｄ－ＰＢＳ（－）を６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで添加し、ウェルに残るｉＰＳ細胞を回収した。３００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去し、１０μＭのＹ－２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ＋培地によりｉＰＳ細胞を懸濁した（３．６×１０５細胞／ｍＬ）。ｉＰＳ細胞をＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００，２４ウェルプレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種し（ｉＰＳ細胞懸濁液１ｍＬ／ウェル）、プレートを１００×ｇで３分間遠心した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間インキュベートし、胚様体（ＥＢ）を得た。
【0048】
（１－２－ｉｉ）ｉＰＳ細胞から造血前駆細胞への分化誘導
ＥＢを回収し、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ａを添加した。Ｍｅｄｉｕｍ Ａで満たしたＭａｔｒｉｇｅｌコート１２ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）に８０個のＥＢを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（０日目）。２日目に培地の半量をＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂにより交換した。以後、２日に１回、培地の半量をＭｅｄｉｕｍ Ｂにより交換した。１１日目に培養上清中に浮遊する単球様の造血前駆細胞（以下、「ＨＰＣ」とも記載する）が確認された。ＨＰＣを回収し、一部をフローサイトメトリー解析に供し（後述）、残りをＢＡＭＢＡＮＫＥＲを用いて凍結保存した。
ＥＢを回収し、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ａを添加した。Ｍｅｄｉｕｍ Ａで満たしたＭａｔｒｉｇｅｌコート１２ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）に８０個のＥＢを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（０日目）。２日目に培地の半量をＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂにより交換した。以後、２日に１回、培地の半量をＭｅｄｉｕｍ Ｂにより交換した。１１日目に培養上清中に浮遊する単球様の造血前駆細胞（以下、「ＨＰＣ」とも記載する）が確認された。ＨＰＣを回収し、一部をフローサイトメトリー解析に供し（後述）、残りをＢＡＭＢＡＮＫＥＲを用いて凍結保存した。
【0049】
（１－３）ミクログリア含有大脳オルガノイドの調製
図１に示す分化誘導工程にしたがってミクログリア含有大脳オルガノイドを調製した。
（１－３－ｉ）胚様体の調製（－１日目）
単一細胞に分散させたｉＰＳ細胞を上記（１－２－ｉ）と同様の手順により調製し、１０μＭのＹ－２７６３２（図１では単に「Ｙ」と表記）を含有するｍＴｅＳＲ＋培地により懸濁した（１×１０６細胞／ｍＬ）。ｉＰＳ細胞懸濁液を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ：７００７）または９６ウェルＶ底プレート（住友ベークライト：ＭＳ－９０９６Ｖ）に添加し（１００μＬ／ウェル）、プレートを１００×ｇで３分間遠心した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間インキュベートし、ＥＢを得た。
図１に示す分化誘導工程にしたがってミクログリア含有大脳オルガノイドを調製した。
（１－３－ｉ）胚様体の調製（－１日目）
単一細胞に分散させたｉＰＳ細胞を上記（１－２－ｉ）と同様の手順により調製し、１０μＭのＹ－２７６３２（図１では単に「Ｙ」と表記）を含有するｍＴｅＳＲ＋培地により懸濁した（１×１０６細胞／ｍＬ）。ｉＰＳ細胞懸濁液を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ：７００７）または９６ウェルＶ底プレート（住友ベークライト：ＭＳ－９０９６Ｖ）に添加し（１００μＬ／ウェル）、プレートを１００×ｇで３分間遠心した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間インキュベートし、ＥＢを得た。
【0050】
（１－３－ｉｉ）ｉＰＳ細胞からミクログリア含有大脳オルガノイドへの分化誘導
・分化ステップ１（０日目）：
培地を、終濃度１０μＭのＳＢ、２μＭのＤＭおよび２．５μＭのＸＡＶが添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地に交換した。３日目にフレッシュな同培地により半量交換し、６日目まで培養を維持した。
・分化ステップ２（６日目）：
培地を、終濃度２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４、２５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦおよび５μＭのＩＤＥ－１が添加されたＣＯ培地に交換し、上記（１－２－ｉｉ）で調製したＨＰＣを添加した（０．３～３×１０４細胞／ウェル）。３～４日ごとにフレッシュな同培地に交換し、２５日目まで培養を維持した。
・分化ステップ３（２５日目）：
培地を、終濃度２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのＮＴ－３が添加されたＣＯ培地に交換した。３～４日ごとにフレッシュな同培地に交換し、４３日目まで培養を維持した。
・分化ステップ１（０日目）：
培地を、終濃度１０μＭのＳＢ、２μＭのＤＭおよび２．５μＭのＸＡＶが添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地に交換した。３日目にフレッシュな同培地により半量交換し、６日目まで培養を維持した。
・分化ステップ２（６日目）：
培地を、終濃度２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４、２５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦおよび５μＭのＩＤＥ－１が添加されたＣＯ培地に交換し、上記（１－２－ｉｉ）で調製したＨＰＣを添加した（０．３～３×１０４細胞／ウェル）。３～４日ごとにフレッシュな同培地に交換し、２５日目まで培養を維持した。
・分化ステップ３（２５日目）：
培地を、終濃度２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのＮＴ－３が添加されたＣＯ培地に交換した。３～４日ごとにフレッシュな同培地に交換し、４３日目まで培養を維持した。
【0051】
＜２．フローサイトメトリー解析＞
（２－１）造血前駆細胞のフローサイトメトリー解析
上記（１－２－ｉｉ）で調製されたＨＰＣ（１×１０６細胞）を氷冷した１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（１００μＬ）により懸濁し、１／２０量のＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４２２３０２）を添加した。１０分間氷上で静置した後に、１／２０量のＰＥ標識抗ＣＤ４３抗体を添加し、さらに６０分間氷上で静置した。４℃、３００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（ベックマン・コールター）により細胞を測定した。
（２－１）造血前駆細胞のフローサイトメトリー解析
上記（１－２－ｉｉ）で調製されたＨＰＣ（１×１０６細胞）を氷冷した１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（１００μＬ）により懸濁し、１／２０量のＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４２２３０２）を添加した。１０分間氷上で静置した後に、１／２０量のＰＥ標識抗ＣＤ４３抗体を添加し、さらに６０分間氷上で静置した。４℃、３００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（ベックマン・コールター）により細胞を測定した。
【0052】
結果を図２に示す。実線はＰＥ標識抗ＣＤ４３抗体で染色された細胞の結果を示し、破線は未染色の細胞の結果（対照）を示す。上記（１－２－ｉｉ）で調製された細胞がＣＤ４３陽性であり、造血前駆細胞であることが確認された。
【0053】
（２－２）ミクログリア含有大脳オルガノイドのフローサイトメトリー解析
上記（１－３）で調製されたミクログリア含有大脳オルガノイド（誘導９日目）をＡｃｃｕｔａｓｅで２０～３０分間処理し、ピペッティングで分散することにより単一細胞懸濁液を得た。４℃、３００×ｇで４分間遠心分離し、回収された細胞（１×１０６細胞）を、上記（２－１）と同様の手順によりフローサイトメトリー解析した。対照として、ＨＰＣを添加しない以外は上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導９日目）を同様の手順により解析した。
上記（１－３）で調製されたミクログリア含有大脳オルガノイド（誘導９日目）をＡｃｃｕｔａｓｅで２０～３０分間処理し、ピペッティングで分散することにより単一細胞懸濁液を得た。４℃、３００×ｇで４分間遠心分離し、回収された細胞（１×１０６細胞）を、上記（２－１）と同様の手順によりフローサイトメトリー解析した。対照として、ＨＰＣを添加しない以外は上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導９日目）を同様の手順により解析した。
【0054】
結果を図３に示す。図中、「ＣＯ」はＨＰＣを添加せずに調製された大脳オルガノイドを、「ＭＧ－ＣＯ」は、記載された数のＨＰＣ（０．３×１０４、１×１０４または３×１０４細胞／ウェル）を添加して調製された大脳オルガノイドを示す。大脳オルガノイドにおけるＣＤ４３陽性細胞（すなわち造血前駆細胞）の比率は、ＣＯでは０．０２４％、ＭＧ－ＣＯ（０．３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）では０．１１％、ＭＧ－ＣＯ（１×１０４ ＨＰＣ／ウェル）では０．６６％、およびＭＧ－ＣＯ（３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）では１．４５％であった。この結果から、大脳オルガノイドに浸潤した造血前駆細胞が、造血前駆細胞の添加量に比例して増大することが確認された。
【0055】
また、上記（１－３）で調製されたミクログリア含有大脳オルガノイド（誘導２５日目）を、ＰＥ標識抗ＣＤ４３抗体に代えてＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体を用いた以外は上記（２－１）と同様の手順によりフローサイトメトリー解析した。対照として、ＨＰＣを添加しない以外は上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導２５日目）を同様の手順により解析した。
【0056】
結果を図４に示す。大脳オルガノイドにおけるＣＤ４５陽性細胞（すなわちミクログリア）の比率は、ＣＯでは０％、ＭＧ－ＣＯ（０．３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）では０．０３８％、ＭＧ－ＣＯ（１×１０４ ＨＰＣ／ウェル）では０．６６％、およびＭＧ－ＣＯ（３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）では０．９３％であった。この結果から、大脳オルガノイドに含有されるミクログリアが、造血前駆細胞の添加量に比例して増大することが確認された。発生期の脳におけるミクログリアの割合は０．５～１．５％程度であることを考慮すると、より正確に脳組織を再現したオルガノイドを調製するためには、１×１０４～３×１０４ ＨＰＣ／ウェル（すなわち、ＥＢ１個あたり１×１０４～３×１０４個のＨＰＣ）を添加することが適切であることが示された。
【0057】
＜３．免疫組織染色＞
ＨＰＣを添加せずに、または添加して（３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）、上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導２５日目および４３日目）を４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳで洗浄した。その後、以下の手順により組織の透明化および免疫蛍光染色を行った。
工程１： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ｓ０液で３７℃、４時間インキュベート
工程２： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２液で３７℃、４時間インキュベート
工程３： ８Ｍ尿素液で３７℃、一晩インキュベート
工程４： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２液で３７℃、４時間インキュベート
工程５： ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ 含有１％ＢＳＡ－ＰＢＳで室温、２時間インキュベート
工程６： １次抗体、０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳに３７℃、一晩インキュベート
工程７： ０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄
工程８： ２次抗体、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１／１０００倍希釈）、０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳに３７℃、一晩インキュベート
工程９： ０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄
工程１０： ４％ＰＦＡで室温、１時間インキュベート
工程１１： ｄｅＳＣＡＬＥ液で１回洗浄し、４℃、３時間インキュベート
工程１２： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２液で３７℃、４時間インキュベート
工程１３： ＴＨＵＮＤＥＲシステム蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で観察
ＨＰＣを添加せずに、または添加して（３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）、上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導２５日目および４３日目）を４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳで洗浄した。その後、以下の手順により組織の透明化および免疫蛍光染色を行った。
工程１： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ｓ０液で３７℃、４時間インキュベート
工程２： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２液で３７℃、４時間インキュベート
工程３： ８Ｍ尿素液で３７℃、一晩インキュベート
工程４： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２液で３７℃、４時間インキュベート
工程５： ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ 含有１％ＢＳＡ－ＰＢＳで室温、２時間インキュベート
工程６： １次抗体、０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳに３７℃、一晩インキュベート
工程７： ０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄
工程８： ２次抗体、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１／１０００倍希釈）、０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳに３７℃、一晩インキュベート
工程９： ０．３３Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄
工程１０： ４％ＰＦＡで室温、１時間インキュベート
工程１１： ｄｅＳＣＡＬＥ液で１回洗浄し、４℃、３時間インキュベート
工程１２： ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２液で３７℃、４時間インキュベート
工程１３： ＴＨＵＮＤＥＲシステム蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で観察
【0058】
１次抗体および２次抗体および希釈倍率を以下に示す。
抗ＩＢＡ１抗体： １／２００
抗ＴＵＪ１抗体： １／５００
Ａｌｅｘａ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体： １／１０００
Ａｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体： １／１０００
抗ＩＢＡ１抗体： １／２００
抗ＴＵＪ１抗体： １／５００
Ａｌｅｘａ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体： １／１０００
Ａｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体： １／１０００
【0059】
ＨＰＣを添加せずに調製された誘導２５日目の大脳オルガノイドの結果を図５に、４３日目の大脳オルガノイドの結果を図６に示す。また、ＨＰＣを添加して調製された誘導２５日目の大脳オルガノイドの結果を図７に、４３日目の大脳オルガノイドの結果を図８に示す。左上図はＩＢＡ１の染色像を示し、右上図はＴＵＪ１の染色像、左下図はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の染色像、右下図はＩＢＡ１、ＴＵＪ１およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の染色像を重ねた画像を示す。ＨＰＣを添加せずに調製された大脳オルガノイドには、神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）は存在したが、ミクログリア（ＩＢＡ１陽性細胞）は存在しなかった。これに対し、ＨＰＣを添加して調製された大脳オルガノイドでは、神経細胞とともにミクログリアがオルガノイド全体に分布していた。
【0060】
さらに、ＨＰＣを添加して調製された誘導２５日目および４３日目の大脳オルガノイドにおけるＩＢＡ１陽性細胞の拡大像を図９に示す。誘導２５日目の大脳オルガノイド（ＭＧ－ＣＯ Ｄａｙ ２５）におけるＩＢＡ１陽性細胞は球状であり、未成熟ミクログリア様の形態であったのに対し、誘導４３日目の大脳オルガノイド（ＭＧ－ＣＯ Ｄａｙ ４３）におけるＩＢＡ１陽性細胞は分岐を有し、成熟ミクログリア様の形態であった。
【0061】
以上の結果から、神経化された胚様体と造血前駆細胞とを共培養することにより調製されたミクログリア含有大脳オルガノイドが、脳発生を再現できるものであることが示された。
【0062】
＜４．ミクログリア含有大脳オルガノイドへのグルココルチコイド曝露＞
グルココルチコイドは、胎生期の脳発達に影響することが知られるホルモンである。そこで、本実施例では、ＨＰＣを添加せずに、または添加して（３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）、上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導２２日目）を、合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）（１μＭ）の存在下で３日間培養した。
グルココルチコイドは、胎生期の脳発達に影響することが知られるホルモンである。そこで、本実施例では、ＨＰＣを添加せずに、または添加して（３×１０４ ＨＰＣ／ウェル）、上記（１－３）の手順により調製された大脳オルガノイド（誘導２２日目）を、合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）（１μＭ）の存在下で３日間培養した。
【0063】
ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔを用いて、ＤＥＸに曝露された大脳オルガノイドからＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒを用いてｃＤＮＡを調製した。以下のプライマーおよびＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘを用いてｑＰＣＲを行い、ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ解析システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により解析を行った。各遺伝子の発現レベルは、内在性コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｑ値でノーマライズしたΔΔＣｔ法により評価した。
【0064】
表１．ｑＰＣＲに使用したプライマーセット
【表1】
【0065】
結果を図１０～１２に示す。図中、「ＣＯ」はＨＰＣを添加せずに調製された大脳オルガノイド（すなわちミクログリアを含有しない従来の大脳オルガノイド）を、「ＭＧ－ＣＯ」はＨＰＣを添加して調製された大脳オルガノイド（すなわちミクログリア含有大脳オルガノイド）を示し、「ＤＥＸ」はＤＥＸに曝露した場合の結果を、「ｃｏｎ」はＤＥＸに曝露しなかった場合の結果を示す。
【0066】
ミクログリア含有大脳オルガノイドでは、ミクログリアを含有しない従来の大脳オルガノイドに比べ、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子の発現が増大していた（図１０）。ＧＲが活性化された場合に発現が上昇することが知られているＦＫＢＰ５については、ミクログリアを含有しない従来の大脳オルガノイドではＤＥＸ曝露による発現量の変化は見られなかったのに対し、ミクログリア含有大脳オルガノイドではＤＥＸ曝露により発現の有意な上昇が見られた（図１１）。また、活性化されたミクログリアから分泌されることが知られる炎症性サイトカインＩＬ－１βおよびＴＮＦα、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０、ならびに増殖因子ＩＧＦ１のいずれも、ミクログリア含有大脳オルガノイドでのみ高い発現か見られ（図１２、ＭＧ－ＣＯ、ｃｏｎ）、これらの発現量はいずれも、ＤＥＸ曝露により低下した（図１２、ＭＧ－ＣＯ、ＤＥＸ）。これらの結果から、ＤＥＸが発生期のミクログリアに対して抑制的に作用することが示された。
【0067】
以上の結果から、神経化された胚様体と造血前駆細胞とを共培養することにより調製されたミクログリア含有大脳オルガノイドが、脳発生を再現するモデルとして有用であることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】